實驗材料與方法

實驗材料
一、 動物材料
實驗材料與方法
豬大動脈血管來自雅勝冷凍食品公司(桃園縣大園鄉)
二、 藥品試劑
(一)下列產品購自美國 Gibco 公司
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Fetal Bovine
Serum (FBS), HAT supplement, penicillin-streptomycin,
Trypsin-EDTA
(二)下列產品購自美國 Sigma 公司
Aminopterin, BSA,AC-DEVD-CHO, BAPTA/AM, cyclosporin A,
Hoechst 33258, Ruthenium Red, thapsigargin (TG),
poly-L-lysine
(三)下列產品購自美國 Molecular probe 公司
Fura-2/AM, Rhod-2/AM, TMRM
(四)下列產品購自瑞典 pharmacia 公司
caspase-3 kit
(五)下列產品購自美國 invitrogen 公司
Nu-PAGE 4-12% Bis-tris gel
SDS-Running Buffer (MOPS / MES)
(六)下列產品購自Amersham pharmacia Biotech 公司
Hybond-P: hydrophobic polyvinylidene difluoride (PVDF)
(七) 下列產品購自美國 Calbiochem 公司
ZVAD-fmk
(八) 下列產品購自美國 clontech 公司
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cytochrome C anti-rabbit antibody,COX4 anti-mouse antibody
(九) 下列產品購自美國 oncogene 公司
α-tubulin anti-mouse antibody
(十)其它藥品皆購自德國 Merck 公司
三、 實驗儀器
(一)螢光光譜儀 : 美國 SPEX 公司或
(二)無菌操作台 : 台灣造鑫公司
英國 Life Science Resources(LSR)
(三)37℃培養箱 : 美國 Forma Scientific 公司
(四)相位差顯微鏡 : 日本 Nikon 公司
(五)桌上型離心機(5415C 型) :美國 Eppendorf 公司
(六)桌上型冷凍離心機(CS-15R 型) : 美國 Beckman 公司
(七)蓋格計數器 : 美國 Techanical Associates 公司
(八)電泳槽及轉染槽:invitrogen 公司
實驗方法:
一、 豬主動脈平滑肌細胞(porcine vascular smooth muscle cell)培養
血管平滑肌細胞(smooth muscle cell, SMC) 培養採用 Dr. Ross(Ross,
1971)所發展以活組織移植於培養皿的方法(explant method)。於屠宰場
取回豬體主動脈後,先將外圍其他組織清除乾淨,再將主動脈剪成數段,
每段血管剪開外翻固定,將其管璧內側的內皮細胞以刀片括去,再以刀片
將中層的平滑肌細胞劃成棋盤狀,將其一小塊慢慢撕下(以撕下層為主,
避免混合表層內皮細胞),以含抗生素的 PBS 清洗數次後,放入培養皿中,
以含培養皿為低葡萄糖的 DMEM,外加 10% FBS,100 unit/ml penicillin
以及 streptomycin 中,並置於 37℃,5%CO2 / 95%air 的培養箱培養。約
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兩週後平滑肌細胞會從組織片中游移至培養皿上,待細胞長至五分滿時去
除組織片繼續培養,細胞長滿後,以 0.05% trypsin/EDTA 處理,將細胞
洗下分盤後繼續培養,約至第三代後可以冷凍保存,以供長期實驗所需。
平滑肌細胞的鑑定,除了其特有的蛋白質 α-smooth muscle cell actin
的抗體,以螢光染色法判定外,同時細胞呈現典型的 hill and valley 的
生長形態,亦是平滑肌細胞的特點。
二、NG108-15 細胞培養
NG108-15 細胞株,培養在含高葡萄糖的 DMEM,並加入 5%FBS,及 100
μM hypoxanthine ,1μM aminopterin ,16 µM thymidine (HAT)。由
液態筒中將細胞取出解凍,細胞代數為 26 代,將細胞培養在 100×20 mm
的培養皿,置於 37℃,5%CO2 / 95%air,溼度 100%的培養箱,每隔 1–2
天更換培養液。待長滿後,將細胞一分為五,分代後的細胞為 27 代,依
此類推。實驗用的細胞代數 (passage) 在 27–37 之間。
三、胞內鈣離子濃度測定
LSR system
24mm cover glasses 以 poly-L-lysine coating 10-15 min,再將
NG108-15 細胞培養在其上,待 20-24 小時後,開始作實驗。先以裝填溶液
(loading buffer, LB:150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2,
5 mM glucose, 10 mM Hepes, pH 7.4 )洗一次,再加入含 5 µM Fura-2/AM
以及 0.1%BSA 的裝填溶液,在 37℃靜置 20 分鐘後,洗去 Fura-2,換成
含裝填溶液,再靜置 10 分鐘。取出 cover glasses slip 用雙面膠固定在
chamber 上,每次選取 40X 物鏡下視野約 8-10 個 NG108-15 細胞測量之。
SPEX system
SMC 以 0.05%trypsin/EDTA 於 37℃作用 3 分鐘,以等體積含有 0.1%BSA
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的 loading buffer 終止 trypsin/EDTA 作用,1500rpm 離心1分鐘後,除
去上清液,以裝填溶液洗一次,加入含 5 µM Fura-2/AM 以及 0.1%BSA 的
裝填溶液,在 37℃搖晃水浴 30 分鐘後,洗去 Fura-2,換成裝填溶液,再
靜置於冰上待用,實驗前 5 分鐘將細胞置於比色管中回溫,每次以 1-2×
10 5 cell 細胞測量之。
上述兩測量方法,皆於指定時間內加入不同刺激物後,測量由 340 nm
和 380 nm 兩個激發波長,在 505 nm 發散波長所產生螢光強度的改變情
形,並以 340nm 及 380nm 波長下的螢光比值 ( F340 / F380 ) 轉化為胞
內鈣濃度。以下面公式計算得胞內鈣濃度(Grynkiewicz et al., 1985)。
[Ca 2+
]i = kd×(Sf2/Sb2)×[(R-Rmin)/(Rmax-R)]
kd : Fura-2 對鈣離子的解離常數,135nM。
R : 340nm 與 380nm 的螢光強度比值
Rmin : 在鈣離子濃度趨近於零時,340nm 與 380nm 的螢光強度比值。
Rmax : 在鈣離子濃度趨近於飽和時,340nm 與 380nm 的螢光強度比值。
Sf2/Sb2 : 在鈣離子濃度趨近於零時,380nm 的螢光與在鈣離子濃度趨近
於飽和時,380nm 的螢光強度比值。
四、細胞死亡率測量: trypan blue 染劑排除法
將 SMC 以 1.5-2×10 5
cell/well 的密度培養在 6 well plate 中,24-48
小時之後,加入刺激物,於實驗終了,收集上清液,以 0.05%trypsin/EDTA
於 37℃作用 3 分鐘,再以等體積含有 0.1%BSA 的 loading buffer 終止
trypsin/EDTA 作用,收集所有混合液以 1500rpm 離心 10 分鐘,除去上清
液,並以無鈣裝填溶液打散細胞,取適當稀釋後的細胞,加入等體積 0.4%
trypan blue 混合後,以血球計數器 (hemacytometer)在光學顯微鏡下觀
察;將排除 trypan blue 呈白色者視為存活細胞,藍色則為 trypan blue
positive 而視為死亡細胞,計數並紀錄其 trypan blue postive 之百分
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率 , 做 為 細 胞 死 亡 率 之 指 標 ( 細 胞 死 亡 率 = trypan blue positive
cell/total cell number X100%)。
五、細胞死亡(apoptosis)率測量: Hoechst 33258 染色法
先將 24mm cover glasses 以 poly-L-lysine coating 10-15 min,再
將 NG108-15 細胞培養在其上,待 20-24 小時後,先以裝填溶液洗一次,
加入刺激物,於實驗終了,除去上清液,以 3%paraformaldehyde 靜置室
溫固定 10 分鐘,以 PBS 洗兩次,避光加入 10μM Hoechst 33258,取出
cover glasses slip 用雙面膠固定在 chamber 上,以螢光光譜儀(LSR)
350nm 激發光下,以肉眼隨機選取 5 個區域,共計數 100 個細胞。記錄具
有 DNA fragmentation 的細胞數目,並計算其百分率做為細胞死亡
(apoptosis)的指標。
六、粒線體鈣離子濃度測定
將 SMC 以 0.05%trypsin/EDTA 取下後,以裝填溶液洗一次,加入含 3µM
Rhod2/AM 以及 0.1%BSA 的裝填溶液,在 37℃搖晃水浴 45 分鐘後,洗去
Rhod2,換成含裝填溶液,再靜置 10 分鐘後,每次取 1-2×10 5
cell 細胞測
量之,紀錄經由 540 nm 激發波長,在 585 nm 發散波長所產生螢光強度的
改變情形。
七、粒線體膜電位測定
將 SMC 以 0.05%trypsin/EDTA 取下後,以裝填溶液洗一次,加入含1
µM TMRM 以及 0.1% BSA 的裝填溶液,在 37℃搖晃水浴 15 分鐘後,再靜置
10 分鐘後,每次取 1-2×10 5
cell 細胞測量之,紀錄經由 548 nm 激發波長,
在 580 nm 發散波長所產生螢光強度的改變情形。
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八、細胞質分離與西方墨點法測定
將SMC(1.5-2×10 6 cell)以 0.05%trypsin/EDTA 取下後,以 100μl 冰
的低張溶液(25mM Tris and 5mM MgCl2, pH 7.4),經1ml 26G 針筒溫和
的將細胞通過約 20-30 次,使細胞打破。以 16,000g, 4℃離心 5 分鐘,收
集上清液為細胞質部分,以 40μl 低張溶液將 pellet 打散,視為富含粒
線體的部分。以 Bio-Rad protein assay 的方法將兩各部分的蛋白質定量,
再取相同 15μg 總蛋白質量的細胞萃取液進行 SDS-PAGE 分析(Nu-PAGE
4-12% bis-tris gel, 150mV 1hr with MOPS/MES Running buffer)。接
著將 SDS-PAGE 膠轉印到 PVDF membrane 上,以 25mV的電流轉印 1.5 小時
後。將 PVDF 用含 5 % 脫脂奶粉的 PBST ; 在室溫中 blocking 1 小時或 4
℃放至隔夜。再用含 primary Ab (1: 1000)、5 % 脫脂奶粉的 PBST 搖晃
浸泡室溫 1 小時,再用 PBST 清洗三次。用 secondary Ab (1:3000)搖
晃浸泡室溫 45 分鐘。之後以 PBST 清洗三次後,避光以 ECL 顯影,並用 X
光片感光。
九、Caspase 3 活性測定:
將 5×10 5
細胞(NG108-15)植入 6 cm dish 或 1.5-2×10 5
cell (SMC) /6
well plate 中,隔日取出做實驗。吸除培養液,以裝填溶液洗一次後加藥,
於指定時間將細胞取下離心 ( 1,500 rpm,5 min),去除上清液,以裝填
溶液沖洗細胞一次,離心 ( 1,500 rpm,5 min),去除上清液,沉澱物加
入 500μl (NG108-15)或 300μl(SMC)細胞瓦解溶液 ( lysis buffer )
經30 分鐘,取50μl(NG108-15)或 100μl(SMC)細胞殘骸溶液 ( lysate )
與 10μl Hepes buffer 及 10μl caspase3 的受質 DEVD-AMC 混合,在 37
℃混和水浴反應 1 小時後,即可取出加入 1 毫升的裝填溶液後測量,以螢
光 光 譜 儀 (SPEX ) 測 激 發 波 長 為 380 nm 之 發 散 光 譜 ( emission
spectrum ),其發散波長掃瞄範圍為 400 nm–500 nm,當 caspase 活性越
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高時,產物 AMC 在發散波峰 440nm 的螢光強度越高,以此來判別 caspase
活性。
十、統計分析
實驗結果中的數值以平均值±標準差(mean±standard deviation)方式
表示,統計資料以 sigmaplot 軟體之 t-test 進行分析。
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