ฤทธิ์กันเสียของฝาง(Caesalpinia sappan L.) - Faculty of Pharmacy ...

ฤทธิ์กันเสียของฝาง(Caesalpinia sappan L.)ในผลิตภัณฑอาหารประเภทน้ําพริกนางสาว นฤพร สุทธิสวัสดิ์นางสาว ศุทธินี ธไนศวรรยางกูรโครงการพิเศษนี้เปนสวนหนี่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาเภสัชศาสตรบัณฑิตคณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดลพ.ศ. 2549

Antimicrobial activity of Caesalpinia sappan L. aspreservative in Chilli-pasteMISS NARUEPORN SUTTHISAWADMISS SUTHINEE THANISAWANYANGKURAA SPECIAL PROJECT SUBMITTED IN PARTIAL FULFLIMENTOF THE REQUIREMENT FORTHE BACHELOR DEGREE OF SCIENCE IN PHARMACYFACULTY OF PHARMACYMAHIDOL UNIVERSITY

โตรงการพิเศษเรื่อง ฤทธิ์กันเสียของฝาง(Caesalpinia sappan L.)ในผลิตภัณฑอาหารประเภทน้ําพริก.................................................(นางสาว นฤพร สุทธิสวัสดิ์).................................................(นางสาว ศุทธินี ธไนศวรรยางกูร)................................................(รศ.ดร.มล. สุมาลย สาระยา)อาจารยที่ปรึกษา................................................(รศ. รุงระวี เต็มศิริฤกษกุล)อาจารยที่ปรึกษารวม

กปการศึกษา 2549 โครงการที่ 1ฤทธิ์กันเสียของฝาง(Caesalpinia sappan L.)ในผลิตภัณฑอาหารประเภทน้ําพริกนฤพร สุทธิสวัสดิ์, ศุทธินี ธไนศวรรยางกูรอาจารยที่ปรึกษา : สุมาลย สาระยา* , รุงระวี เต็มศิริฤกษกุล*** ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล** ภาควิชาเภสัชพฤกษศาสตร คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดลคําสําคัญ : ฝาง, Brazilin, Haematoxylinอุตสาหกรรมผลิตอาหารกึ่งสําเร็จรูปในปจจุบันมีการใชสารกันเสียประเภทสารเคมีเพื่อชะลอการบูดเสียของผลิตภัณฑมากขึ้น ซึ่งสารเคมีดังกลาวอาจกอใหเกิดอันตรายตอผูบริโภค หากไดรับเกินปริมาณที่กําหนดและในระยะเวลาตอเนื่องกัน จึงไดมีการคนควาเพื่อหาสารที่ปลอดภัยมาใชทดแทน จากการศึกษาวิจัยพบวาฝางเปนสมุนไพรที่มีฤทธิ์ตานจุลชีพและมีความปลอดภัยตอผูบริโภค พบวามีสารสําคัญอยู 2 ชนิดคือ Brazilin และ Haematoxylin การศึกษานี้เปนการประเมินผลในการยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลชีพชนิดตางๆของสารสกัดของฝาง โดยทดสอบหาคาความเขมขนต่ําที่สุดที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโต (MIC) ของ Caesalpinia sappan L.,Brazilin และ Haematoxylin ตอเชื้อ 4 ชนิด ไดแก S.aureus ATCC 6538 , E.coli ATCC 2592,S.typhimurium ATCC 13311 ซึ่งไดคา MIC ดังนี้ 125, 250, 250 และ 250, 500, 1000 และ62.5, 125, 250 ตามลําดับ สําหรับ C.albicans ATCC 10231 ไมสามารถสังเกตผลได และไดนําผลการทดลองไปประยุกตใชกันเสียในน้ําพริกโดยใชสารสกัดของฝางในปริมาณที่แตกตางกันและตรวจสอบฤทธิ์กันเสียดวยวิธีทางจุลชีววิทยาทุก 1 เดือนเปนเวลา 3 เดือน พบวาสารสกัดของฝางสามารถลดปริมาณของเชื้อไดอยางมีประสิทธิภาพ การวิเคราะหสวนประกอบและปริมาณของสารสําคัญของสารสกัดของฝางโดยวิธี Thin Layer Chormatography (TLC) และspectrophotometry พบสาร Brazilin แตไมสามารถตรวจพบ Haematoxylin ไดเนื่องมาจากอาจมีปริมาณที่ต่ําเกินไปผลการวิจัยนี้สรุปไดวา ฝางสามารถใชเปนสารกันเสียในผลิตภัณฑอาหารกึ่งสําเร็จรูปไดอยางมีประสิทธิภาพ และควรมีการศึกษาเรื่องสวนประกอบและปริมาณของสารสําคัญในการออกฤทธิ์โดยวิธีทางเคมีอยางละเอียดตอไป

ขAcademic year 2006 project 1Antimicrobial activity of Caesalpinia sappan L. as preservativein Chilli-pasteNarueporn Sutthisawad, Suthinee ThanaisawanyangkuraProject advisor: Sumarn Saraya*, Rungravee Temsiriruekkul*** Department of Microbiology, Faculty of Pharmacy, Mahidol University**Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Mahidol UniversityKeyword: Caesalpinia sappan L., Brazilin , HaematoxylinIn food industry, chemical agents have been used to preserve food fromspoilage caused by microorganisms. These agents may cause danger to the consumersafter taking for a long period or overamount use. To avoid the risk, the natural agentshave been used instead of these chemicals. In this project, the antimicrobial activity ofCaesalpinia sappan L. which composed of two major components, Brazilin andHaematoxylin was studied. The minimum inhibitory concentration (MIC) of Caesalpiniasappan L., Brazilin and Haematoxylin against S.aureus ATCC 6538 ,E.coli ATCC 25922,S.typhimurium ATCC 13311 were 125, 250, 250 and 250, 500, 500 and 62.5, 125, 250,respectively. For C.albicans ATCC 10231 could not be observed. The results were thenapplied to use Caesalpinia sappan L. as preservatives in chilli-paste products. Theresults showed that Caesalpinia sappan L. efficiently reduced the amount of bacteriaand fungi during three month study period. By Thin Layer Chromatography (TLC) andspectrophotometric method, the quantity of brazilin was detected but not withHaematoxylin, it may be due to the very small amount of the latter.In conclusion, Caesalpinia sappan L. is effectively for use as preservative agentin food products. Further project should be the study of components and quantity ofactive ingredients, thoroughly.

คกิตติกรรมประกาศโครงการพิเศษนี้ สําเร็จลุลวงดวยดี โดยไดรับความชวยเหลือจากทานอาจารยที่ปรึกษาคือ รศ.ดร.มล.สุมาลย สาระยา ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล และรศ.ดร.รุงระวี เต็มศิริฤกษกุล ภาควิชาเภสัชพฤกษศาสตร คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดลที่ใหคําปรึกษา แนะนํา ในการคนควาขอมูล และการวิจัยตั้งแตตนจนสําเร็จตามความมุงหมายนอกจากนี้ยังไดรับความชวยเหลือจาก ภก.จักรพันธุ พันธุศรีรัตน นักศึกษาปริญญาโทภาควิชาเภสัชเคมี คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล และ คุณชุติมา มะนะมุติ นักศึกษาปริญญาโท ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล ในการทําการวิจัย ผูจัดทําจึงขอขอบพระคุณทุกทานมา ณ ที่นี้ผูจัดทํา

งสารบัญหนาบทคัดยอกAbstractขกิตติกรรมประกาศคสารบัญงสารบัญตารางจสารบัญรูปฉสัญลักษณคํายอชบทนํา 1ทบทวนวรรณกรรม 2วัสดุและวิธีดําเนินการวิจัย 16ผลการวิจัย 30สรุปและวิจารณผลการวิจัย 38เอกสารอางอิง 41

จสารบัญตารางตารางที่ หนา1 ตารางการแปลผล MPN test ในการทดสอบเชื้อ coliform และ E.coli 252 ตัวทําละลายในการทดสอบการละลายของสารสกัดฝาง 273 ชนิดและอัตราสวนของสารที่ใชเปน solvent system 274 แสดงผลการทดสอบฤทธิ์ในการตานเชื้อตัวอยาง S. aureus ATCC 6538, E.coli 31ATCC25922, S. typhimurium ATCC13311 และ C.albicans ATCC102315 จํานวนแบคทีเรียทั้งหมด (x 10 2 cfu/กรัม) ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก 326 จํานวนยีสตและราทั้งหมด (cfu/กรัม) ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก 327 MPNs Coliforms ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก 338 จํานวน E.coli ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก 339 จํานวน S. aureus ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก 3410 จํานวน B. cereus, จํานวน Salmonella และ จํานวน C. perfringen 34ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก11 ชนิดและอัตราสวนของสารที่ใชเปน solvent system 3512 คาการดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 nm และความเขมขนของสารมาตรฐาน Brazilin 3613 ผลการวัดคาดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 nm ของสารสกัดฝาง และปริมาณ Brazilin 37ในสารสกัดฝาง1 มิลลิกรัม(ไมโครกรัม/มิลลิกรัม)

ฉสารบัญรูปรูปที่ หนา1 ฝางและแกนฝาง 42 สารสําคัญในฝาง 43 แสดงการทดลองหาคา MIC โดยวิธี 96-well plate method 194 ลักษณะของน้ําพริกตัวอยางหลังบรรจุเสร็จ 21(กลุมควบคุม, ฝาง 4 เทา, ฝาง 8 เทา, ฝาง 16 เทา)5 แสดงแถบสารที่ไดจากการสกัดแยกโดยวิธี Thin-Layer Chromatography 35(TLC) ใน solvent system Ethyl acetate ใตรังสีอัลตราไวโอเลต ที่ 254 นาโนเมตร6 กราฟมาตรฐานแสดงความสัมพันธระหวางคาการดูดกลืนรังสี UV โดยตรง 37ที่ความยาวคลื่น 505 นาโนเมตร และ ความเขมขนของ Brazilin

ชสัญลักษณและคํายอ% = percentageCH 3 OH = Methyl alcoholCH 2 Cl 2 = DichlorometaneConc. = concentratedg = gramHCl = Hydrochloric acidM = MolarmL = millilitreMeOH = Methyl alcoholmg/mL = milligram per millilitreN = NormalNaOH = Sodium HydroxideNH 4 OH = Ammonium Hydroxidenm = nanometerUV = ultraviolet-visibleµg = microgramµg/mL = microgram per millilitreµL/mL = microlitre per millilitrev/v = volume by volumew/v = weight by volumeλ = wave lengthλ max = maximum wave length

1บทนําการขยายตัวของอุตสาหกรรมผลิตอาหารกึ่งสําเร็จรูปในปจจุบัน กอใหเกิดการแขงขันกันทางธุรกิจ มีการนําสารกันเสียประเภทสารเคมีหลายชนิดมาใชเปนสวนผสมในผลิตภัณฑโดยพิจารณาตามความเหมาะสม เชน กรดเบนโซเอต เกลือเบนโซเอต พาราเบน กรดโพรพิโอนิกเกลือโพรพิโอเนต กรดซอรบิก เกลือซอรเบต เปนตน เพื่อชะลอการบูดเสีย และยืดอายุในการเก็บรักษาผลิตภัณฑ ซึ่งสารเคมีดังกลาวอาจสะสมในรางกาย กอใหเกิดอันตรายตอผูบริโภคหากไดรับเกินปริมาณที่กําหนดและในระยะเวลาตอเนื่องกัน จึงมีการคนควาเพื่อหาสารที่ปลอดภัยมาใชทดแทน จากการศึกษาวิจัยพบวาสมุนไพรและเครื่องเทศหลายชนิดมีฤทธิ์ยับยั้งปองกัน หรือทําลายจุลินทรียบางชนิดได เชน อบเชย กานพลู เปนตนฝางเปนพืชสมุนไพรพื้นเมืองของประเทศไทยที่มีการนํามาใชประโยชน เปนสวนผสมในยาแผนโบราณในตํารับยาบํารุงโลหิต ยาฝาดสมาน ยาแกทองเสีย ไดมีผูศึกษาใชสารสกัดสมุนไพรไดแก สะทอน พะยอม คูน และฝาง เปนสารกันเสียในผลิตภัณฑอาหารประเภทน้ําพริก พบวาสารสกัดฝางมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลชีพไดดี ในความเขมขนที่เหมาะสมและไมทําใหกลิ่น และรสเปลี่ยนแปลงไปจากเดิม จากการศึกษาพบวาฝางมีสารสําคัญอยูหลายชนิดดวยกัน ไดแก Brazilin, Haematoxylin สารกลุมฟลาโวนอยด เปนตน ซึ่งมีการศึกษาวามีฤทธิ์ในการตาน Beauveria bassiana สารกลุมแนพโทควิโนนมีฤทธิ์ในการยับยั้ง Lactobacilluscasei และ Clostridium perfringens จึงไดนําสารสกัดฝางมาศึกษาฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของ จุลชีพเปรียบเทียบกับ Brazilin และ Haematoxylin และนํามาวิเคราะหชนิดและปริมาณของสารสําคัญในสารสกัดฝาง ดวยวิธีThin Layer Chromatography (TLC) และวิธีspectrophotometry ซึ่ง TLC เปนวิธีที่นิยมใชในการวิเคราะหเชิงคุณภาพเพื่อพิสูจนเอกลักษณของสาร สําหรับ spectrophotometry เปนวิธีที่สามารถวิเคราะหไดทั้งเชิงคุณภาพและปริมาณ แตนิยมใชวิเคราะหเชิงปริมาณมากกวา อยางไรก็ตามในปจจุบันยังไมมีกําหนดวิธีมาตรฐานในการวิเคราะหสมุนไพรแตละชนิด เนื่องจากสมุนไพรแตละชนิดมีองคประกอบทางเคมีที่หลากหลายและมีความแตกตางกันสูง รวมทั้งมีสารอื่นที่เจือปนในธรรมชาติ อันอาจมีผลตอการวิเคราะหไดหากการใชฝางเปนสารกันเสียในผลิตภัณฑอาหารมีประสิทธิภาพ จะกอใหเกิดประโยชนในหลายๆ ดาน ลดการใชสารกันเสียประเภทสารเคมีเปนสวนผสมในผลิตภัณฑซึ่งจะชวยเพิ่มความปลอดภัยใหแกผูบริโภค อีกทั้งยังเปนการเพิ่มมูลคาและสงเสริมการใชสมุนไพรไทยใหแพรหลายมากขึ้น

2ทบทวนวรรณกรรมฝางชื่ออื่น ฝางสม(กาญจนบุรี), งาย(กาญจนบุรี), ฝางเสน (กลาง), หนามโคง(แพร), โซบั๊ก(จีน)ชื่อวิทยาศาสตร Caesalpinia sappan Linnชื่อสามัญ sappan treeวงศ Leguminosaeสวนที่ใชเปนยาเนื้อไมและแกนแกนฝาง (Sappan wood) มีสารสีชมพูสมถึงแดง (ขึ้นกับปริมาณ) ชื่อ Brazilin แกนฝางมีรสขื่นขม ฝาด ใชตมน้ํากินเปนยาบํารุงโลหิตสตรี แกปอดพิการ ขับหนอง ขับเสมหะ ทําโลหิตใหเย็น แกโรคหืด แพทยชนบทใชตมน้ํากินแกอาการทองรวง ธาตุพิการ รอนใน แกโลหิตออกทางทวารหนักและทวารเบาเนื้อไม ใชแกทองเสีย แกบิด ทําใหประจําเดือนมาเปนปกติ แกไข รักษาโรคทั่วไปนอกจากนี้สวนเปลือก ลําตนและเนื้อไมสามารถใชตมรับประทานรักษาวัณโรค ทองเสียและอาการอักเสบในลําไสเปนยาฝาดสมานและรักษาแผลจากขอมูลรายงานการทดลองตาง ๆ ที่มีอยูไมพบขอมูลการยับยั้งเชื้อ MRSA(MethicillinResistant Staphylococcus aureus) ของฝาง ทราบแตเพียงวาสาร Brazilin ในแกนฝางที่กลาวถึงขางตนนั้น เมื่อผานการตม สาร Brazilin จะเปลี่ยนเปนสาร Brazilein ซึ่งมีสีแดงซึ่งสมัยกอนใชในการยอมผาหรือแตงสีขนมและทําน้ํายาอุทัยคุณสมบัติทางยาของเนื้อไมและเปลือกไมฝางเกิดจากกลุมของสาร phenol ที่มีชื่อเรียกวา homoisoflavonoids ลําตนและใบมีสาร alkaloid และ phytosterol อยูในปริมาณมากปจจุบันมีรายงานการทดลองของสารทั้ง Brazilin และ Brazilein ดังนี้- แกอักเสบ: สาร Brazilin ที่สกัดไดจากแกนฝางมีฤทธิ์ระงับการอักเสบไดดี การที่ฝางเสนมีสารระงับการอักเสบนี้อยูจึงทําใหมีผลระงับอาการหอบหืดไดดวย- ระงับเชื้อโรค: การนําพืชที่มีสาร Brazilin (รวมทั้งฝางเสน) มาแชในแอลกอฮอลจะทําใหไดน้ํายาสกัดแอลกอฮอลที่มีสาร Brazilin ละลายอยู น้ํายานี้สามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรียที่ทําใหเกิดไขสูง โรคทองรวงระบาด เชื้อ Staphylococcus ได นอกจากนี้ในแกนฝางยังพบวามีสารอีกชนิดหนึ่งที่ระงับเชื้อโรคไดเชนกันคือสารSappanin- แกทองเสีย: แกนและเปลือกฝางเสนมีสาร Tannin อยูมากโดยเฉพาะสวนเปลือกฝางจึง

ใชตมกินแกทองเสียหรือบิดอยางออนได- ปองกันหืด: สาร Brazilein สามารถยับยั้งไมใหรางกายสรางสารHistamine ได จึงนาจะชวยปองกันโรคหืดไดฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาของฝางนอกจากตานเชื้อแบคทีเรียแลว ยังสามารถตานเชื้อรา ไวรัสยีสต ลดการอักเสบ ยับยั้งเนื้องอก กระตุนภูมิคุมกันและยั้บยั้งการแพไดดวยการใชประโยชนทางดานอื่นๆทําสียอม ซึ่งฝางแบงเปน 2 ชนิดใหญๆ คือ ชนิดหนึ่งแกนสีแดงเขม เรียกวา ฝางเสน อีกชนิดหนึ่งแกนสีเหลือง เรียกวา ฝางสม นํามาตมสกัดสาร Haematoxylin ใชยอมสี Nuclei ของเซลล หรือตมใหสีแดงที่ เรียกวา sappanin ซึ่งเปนสารใหสีประเภท Brazilin ใชทําน้ํายางอุทัยผสมน้ําดื่ม สีผสมอาหารและชาวบานนิยมนํามายอมสีผาไหม ผาฝายและผาขนสัตว3

4รูปที่ 1 ฝางและแกนฝางรูปที่ 2 สารสําคัญในฝางเชื้อจุลชีพที่ใชในการทดลอง1. Staphylococcus aureusเปนแบคทีเรียแกรมบวก ลักษณะ colony บนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เปนวุน คือ กลม ขอบเรียบทึบแสงมีสีเหลือง เจริญเติบโตที่อุณหภูมิ 10-40 °C แตอุณหภูมิที่พอเหมาะคือ 37°C เจริญในสภาวะที่มี หรือไมมีออกซิเจนก็ไดสามารถยอยสลายโปรตีน ไขมันมีชีวิตอยูในสภาวะที่ pH เปนกรดหรือดาง ความชื้นต่ําๆได สามารถอยูในอากาศที่แหงแลงไดนานเปนเดือน สามารถเจริญเติบโตในน้ํามูก บนผิวหนัง และอาหารหลาย ๆ ชนิด การใชความรอนที่อุณหภูมิ 60 °C ใน

ูเวลา 60 นาที สามารถทําลายเชื้อ S. aureus ได เชื้อนี้ยังทนตอยาฆาเชื้อ และดื้อตอยาปฏิชีวนะหลายชนิดS. aureus สรางเอนไซมและสารพิษหลายชนิด ไดแก- Coagulase เปนเอนไซมที่ทําใหพลาสมาแข็งตัว- Hyarulonidase เปนเอนไซมที่ยอยกรด hyaluronidic เปนสารที่เชื่อมเซลลตอเซลล- Phytokinase เปนเอนไซมที่ทําลายเลือดที่แข็งตัว- Nuclease (Dnase) เปนเอนไซมที่ทําลาย DNA- Lipase เปนเอนไซมที่ยอยไขมัน ชวยใหเชื้อเจริญบนผิวหนังที่มีไขมันไดดี- Penicillinase เปนเอนไซมที่ยอยเพนนิซิลิน ทําใหเชื้อดื้อตอยาเพนนิซิลิน- Hemolysin เปนสารพิษที่ทําใหเม็ดเลือดแดงแตกสลาย- Leukocidin เปนสารพิษที่ทําใหเม็ดเลือดขาว neutrophil และmacrophage แตก- Exfoliative toxin ทําใหผิวหนังหลุดลอกออกเปนแผนๆ- Enterotoxin เปนสารพิษที่ทนความรอนโรคอาหารเปนพิษ S. aureus บางสายพันธุสรางสารพิษที่เรียกวา enterotoxin ขึ้น สารนี้มีคุณสมบัติทนความรอน การสลายสารพิษตองใชอุณหภูมิ 100 °C เปนเวลานานอยางนอยครึ่งชั่วโมง S. aureus ที่ติดอยูกับมือของผ ประกอบอาหาร เปนตัวการที่ทําใหเกิดโรค โดยปนเปอนไปในอาหาร พบวา ในเวลาเพียง 3 – 5 ชั่วโมง S. aureus ก็สามารถสรางสารพิษขึ้นมามาก พอที่จะทําใหเกิดอาการได อาหารหลายชนิดที่สัมผัสกับมือโดยตรง เชน ขาวขาหมูขนมปงสังขยา อาจเปนสาเหตุของโรคอาหารเปนพิษได หลังจากไดรับสารพิษเขาไป ประมาณ 6– 8 ชั่วโมง จะมีอาการเฉียบพลัน คลื่นไส อาเจียน อุจจาระรวง ผูปวยมักจะหายเองได ในเวลาประมาณ 24 ชั่วโมง2. Escherichia coliเปนเชื้อแบคทีเรียแกรมลบ รูปรางเปนทอนขนาดประมาณ 0.5 – 3.0 µm โดยปกติมักอาศัยอยูในลําไสคนและสัตวเลือดอุน ในการตรวจอุจจาระอาจตรวจพบเชื้อนี้จํานวนมาก โดยไมทําใหกอโรคแตฉวยโอกาสกอโรคไดในกรณีที่ภูมิคุมกันบกพรอง E.coli สามารถปรับตัวไดงายตามถิ่นที่อยูอาศัย เจริญเติบโตไดดีในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกลูโคสอยางเดียว และเปลี่ยนกลูโคสใหกลายเปนองคประกอบที่ใชในการสรางเซลล สามารถเจริญเติบโตไดทั้งภาวะที่มีออกซิเจนและไม5

มีออกซิเจน ปจจุบันมี E.coli ที่กอโรคมากกวา 700 ชนิด โดยแยกออกเปน O,H และ K แอนติเจนโรคที่เกิดจาก E. coli มีหลายโรค ไดแก1. โรคอุจจาระรวง จะพบในกลุมคน 2 กลุม กลุมแรกเปนเด็กเล็ก เรียกโรคที่เกิดขึ้นวา infantile diarrhea สวนใหญเกิดจากเชื้อ Enteropathogenic เด็กไดรับเชื้อปนมากับน้ํา นม อาหาร อีกกลุมหนึ่งเปนโรคอุจจาระรวงจาก E. coli คือ ผูใหญที่เดินทางไปตางถิ่นเรียกโรคนี้วา traveler’s diarrhea เกิดจากเชื้อ Enteropathogenic E. coli ระยะฟกตัว 5 -15 วัน อาการ ถายอุจจาระเปนน้ํา มีไขต่ํา ๆ คลื่นไส อาเจียน2. โรคติดเชื้อในทางเดินปสสาวะ มักมีสาเหตุมาจากเชื้อที่อาศัยอยูในลําไสของผูปวยเอง การติดเชื้อพบบอยในผูหญิง เนื่องจากทอปสสาวะคอนขางจะสั้นและตรง เขาสูกระเพาะปสสาวะ จึงทําใหเกิดโรคการติดเชื้อที่ กระเพาะปสสาวะ เกิดกระเพาะปสสาวะอักเสบ ซึ่งอาจจะลุกลามไปยังไตไดดวย3. โรคติดเชื้ออื่น ๆ ที่เกิดจากเชื้อ E. coli เชน เยื่อหุมสมองอักเสบในเด็กเกิดใหม ปอดบวม แผลติดเชื้อ และโลหิตเปนพิษ มักเกิดเนื่องจากการผาตัด การใชเครื่องชวยหายใจ การใชสายสวนทอปสสาวะ3. Bacillusแบคทีเรียในสกุล Bacillus มีอยูมากมายทั่วไปทุกหนทุกแหงในโลก สวนมากดํารงชีวิตแบบอิสระ ไมตองพึ่งพาอาศัยสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ตองการใชออกซิเจนในการเจริญเติบโต แตสารอาหารมีความตองการแตกตางกันไปในแตละเชื้อสาย ถิ่นที่อยูอาศัยอยูตามธรรมชาติ คือในดิน สปอรถูกสรางขึ้นในดินมักไปปนกับฝุนละออง และฟุงกระจายอยูทั่วไป ติดตามรางกายคนและสัตวหรือปนเปอนลงสูแหลงน้ํา มีเพียง 2 เชื้อที่ทําใหเกิดโรค คือ B. anthracis ทําใหเกิดโรคแอนแทรกซและ B. creus ทําใหเกิดโรคอาหารเปนพิษBacillus anthracis เปนแบคทีเรียรูปรางทอน ปลายตัดตรง สปอรอยูตรงกลางเซลล แตเมื่ออยูในรางกายคนและสัตวไมเคลื่อนที่เนื่องจากไมมีแฟลกเจลลา ไมสรางสปอรเจริญไดในอาหารเลี้ยงเชื้อธรรมดา ไมสลายในเม็ดเลือดแดง colony มีสีขาว ขนาดคอนขางโตโรคที่ทําใหเกิดคือ แอนแทรกซ เปนโรคระบาดในสัตวพวกแพะ แกะ มา วัวควาย ในคนพบไมบอยนักBacillus cereus เปนแบคทีเรียที่มักมีการปนเปอนลงไปในอาหารที่ปรุงสุกแลวโดยสปอรปนไปกับฝุนละออง อากาศ เชื้อจะเจริญเติบโตไดอยางรวดเร็ว ในอาหารที่วางทิ้งไวใน6

ตูกับขาว แลวสรางสารพิษ (enterotoxin ) ออกมา สารพิษมีฤทธิ์ทําใหเกิดอาการของโรคอาหารเปนพิษ คือ คลื่นไส อาเจียน ปวดทอง อุจจาระรวง อาการมักดีขึ้น และหายไดเองใน 24ชั่วโมง เมื่อสารพิษนั้น ๆ หมดฤทธิ์ไป4. Clostridium spp.เชื้อในสกุลนี้มีประมาณเกือบ 100 เชื้อสาย พบอยูตามดิน กองขยะ มูลสัตว พืชผัก ในลําไสคนและสัตว Clostridium มีรูปรางเปนทอน ติดสีแกรมบวก สรางสปอรได สปอรมีรูปรางและตําแหนงแตกตางกันไปตามเชื้อสาย การทําใหเกิดโรคเนื่องจากสารพิษ โรคที่เกิดจาก Clostridiumแบงได 2 กลุม คือ1. โรคติดเชื้อที่ผิวหนัง ไดแก โรคแผลเนามีแกส โรคติดเชื้อในลําไสซึ่งเปนผลมาจากการไดรับยาปฏิชีวนะติดตอกันเปนเวลานาน2. โรคอาหารเปนพิษ จากการไดรับสารพิษของเชื้อ3. โรคอาหารเปนพิษ โรคอาหารเปนพิษจาก Clostridium แบงออกเปน 2 ชนิดก. Perfringens food poisoning เกิดจากเชื้อ C. perfringens สปอรของเชื้อปะปนลงไปในอาหาร สปอรงอกเปนเซลลปกติ แบงเซลล แลวสรางสารพิษ (enterotoxin) ทําใหเกิดอาการปวดทอง อุจจาระรวง คลื่นไส ระยะฟกตัวของโรคประมาณ 8 –24 ชั่วโมงข. Botulinum food poisoning หรือ botulism เกิดจากการบริโภคอาหารกระปอง หรืออาหารอื่นใดที่มีสารพิษของเชื้อ C. botulinum เชื้อนี้พบอยูทั่วไปในดิน น้ํา และลําไสใหญของสัตว สปอรของเชื้อปะปนลงไปในอาหาร5. Salmonella spp.เปน noncoliforms ที่ทําใหเกิดโรค มีหลายเชื้อสาย รูปรางเปนทอน ติดสีแกรมลบ เจริญไดโดยที่มีและไมมีออกซิเจน ไมสรางสปอรมีแฟลกเจลลารอบตัว เคลื่อนที่ได มีชีวิตอยูนอกโฮสตไดนานพอสมควรเชื้อสายที่สําคัญที่สุดของ Salmonella คือ S. typhi ทําใหเกิดโรคไขไทฟอยด (typhoidfever) สวนที่เหลือคือแอนติเจน- S. cholerae- suis เปนโรคติดตอจากหมู ( zoonosis of swine )- S. enteritidis จําแนกยอยไดอีกประมาณ 17,000 serotypes โดยจําแนกตาม7

ไขไทฟอยด ระยะฟกตัว 2 สัปดาห เชื้อเขาสูรางกายโดยการกินเขาไปพรอมกับอาหารหรือน้ํา S. typhi มีความสามารถในการกอโรค คือ สามารถมีชีวิตในเม็ดเลือดขาวและเพิ่มจํานวนมากขึ้นในเซลล ที่ผนังเซลลของเชื้อก็มี endotoxin ซึ่งทําใหเกิดอาการตางๆอาการ เริ่มแรกเปนไขสูง ปวดศีรษะ สัปดาหที่ 2 หรือ 3 จะมีอาการอุจจาระรวง และไขเริ่มลดลง ในรายที่อาการรุนแรง แผลที่ลําไสอาจทะลุหรือเปนฝที่ทางเดินปสสาวะและตับ6. Candida albicansเปนเชื้อราเซลลเดี่ยวที่เปนสาเหตุของโรค Candidosis (Candidiasis) และโรคอื่นๆ เชนoral thrush, vulvovaginal candidiasis ซึ่งเชื้อ Candida albicans สืบพันธุโดยการแตกหนอ(budding) เจริญเติบโตไดดีใน Sabouraud medium หรือ bacteriological media เชน bloodagar ที่อุณหภูมิ 25 – 37 องศาเซลเซียส และ incubate เปนเวลา 1-2 วัน ลักษณะของเชื้อจะมีรูปรางคอนขางกลมหรือรูปไข สีครีมคลายนม และนูนCandida albicans พบเปน normal flora ที่พบได40-80% ในมนุษยซึ่งมักในบริเวณเยื่อบุปาก, ทางเดินอาหาร และชองคลอด โดยอยูในรูปของ yeast form เมื่อมีปจจัยสงเสริมที่เหมาะสม จึงจะทําใหเกิดโรคขึ้น โดยตัวเชื้อจะเปลี่ยน form เกิดมีทั้ง yeast, hyphae และpseudohyphae กอโรคโดยผลิต endotoxin ไปทําลาย mucous membrane และรุกล้ําเขาไปยังกระแสเลือด แตโดยปกติจะไมกอโรค ยกเวนในผูที่มีปจจัยเสี่ยง เชน ภูมิคุมกันบกพรอง ไดรับยาcorticosteroid เปนเวลานาน เปนตนการวิเคราะหสมุนไพรโดยวิธี Thin-Layer Chromatographyโครมาโทกราฟ เปนขบวนการแยกและทําสารใหบริสุทธิ์โดยอาศัยความแตกตางของการกระจายตัวของสารระหวางเฟส 2 เฟสที่ไมผสมกัน คือ เฟสอยูกับที่(stationary phase) และเฟสเคลื่อนที่(mobile phase) โดยเฟสเคลื่อนที่จะเปนตัวพาสารใหเคลื่อนที่ไปอยูบนเฟสอยูกับที่Thin-Layer Chromatography เปนโครมาโทกราฟที่ใชแยกสารที่มีปริมาณนอย ๆ เปนไมโครลิตร โดยการหยดสารลงบนเฟสอยูกับที่ ที่เปนแผนบางอยูกับแผนรองรับ(supporter)จากนั้นถูกนําโดยเฟสเคลื่อนที่ ซึ่งเคลื่อนที่ดวยแรงดึงดูดแคพิลารทําใหเกิดการแยกสารประกอบตาง ๆ ออกจากกันโดยหลักการแยกสวน(partition) และดูดซับ(adsorption)8

ขอดีของ Thin-Layer Chromatography คือ ทําไดงาย สะดวก รวดเร็ว ใชสารปริมาณนอย (ประมาณ 20 ng) คาใชจายคอนขางต่ํา สามารถแยกและพิสูจน ทั้งในรูปสารเดี่ยว สารผสมในยาสําเร็จรูป และสารจากธรรมชาติการวิเคราะหสารสําคัญในสมุนไพรดวย TLC อาจทําโดยการตรวจหาสารกลุมใหญ ๆ ที่พบในพืช เชน กลุมแอลคาลอยด(alkaloid) ฟลาโวนอยด(flavonoid)องคประกอบของ TLC1. เฟสอยูกับที่ (stationary phase)ประกอบดวยสารดูดซับ(adsorbtion) เคลือบเปนแผนบางบนแผนรองรับ(supporter) ที่เปนแกว พลาสติก หรือโลหะ โดยทั่วไปแลวแผนรองรับมักมีขนาดมาตรฐาน คือ20x20 หรือ 20x10 cm และมีความหนาของสารดูดซับประมาณ 0.1-0.3 mm โดยสารดูดซับหลายชนิดมีการใชที่แตกตางกันขึ้นกับคุณสมบัติของสารที่ตองการแยกและเฟสเคลื่อนที่ สารดูดซับที่นิยมมากไดแก Silica gel ซึ่งขะมีขนิดตาง ๆ เชน Silica gel GF 254 หมายถึง silica gel ที่มีgypsum เปน binder และเรื่องแสงที่ 254 nm2. เฟสเคลื่อนที่ (mobile phase)อาจเปนตัวทําละลายตัวเดียว หรือเปนสารผสมขึ้นกับสารที่จะทําการแยกโดยสิ่งสําคัญของการเลือกเฟสเคลื่อนที่ คือ ราคาถูก บริสุทธิ์ มีความคงตัว สามารถนําออกจากแผนเคลือบไดงาย ไมเปนพิษ และไมเกิดปฏิกิริยากับสารที่ตองการแยก3. สารมาตรฐานเปนสารที่ใชเปรียบเทียบ เพื่อพิจารณาวามีสารนี้เปนองคประกอบหนึ่งในสารที่ตองการแยกดวย TLC หรือไม โดยตองเตรียมสารมาตรฐานใหมีความเขมขนพอเหมาะวิธีการวิเคราะหสารประกอบเคมีในสมุนไพรโดยวิธี TLCนําแผน TLC ที่ spot สารสกัดและสารเปรียบเทียบซึ่งมีความเขมขนเหมาะสมประมาณ 0.1-1% และควรทําให spot มีคาเทากัน คือมีจุดศูนยกลางประมาณ 0.2-0.5 mmจากนั้น จุมแผน TLC ที่ spotสารสกัดแลวลงไปในระบบเฟสเคลื่อนที่ ที่อิ่มตัวเพียงพอในchamber แลว โดยใหเฟสเคลื่อนที่ เคลื่อนที่เปนระยะทาง 8-12 cm เมื่อขจัดเฟสเคลื่อนที่บนแผนTLC ดวยลมรอนแลวจึงนําแผน TLC ไปตรวจสอบดวยแสง ultraviolet หรือพน reagent ที่เหมาะสมการตรวจหาสารเคมีบน TLC1. การตรวจสอบคุณสมบัติในการดูดกลลืนแสง UV แบงเปน 2 ชวง9

− ชวงคลื่นสั้น (254 nm) สารจะดูดกลืนแสงทําใหเกิดจุดมืด (darkzone) บนแผนเรืองแสงสีเขียว โดยสารกลุมนี้จะมี double bond จํานวน 2 หรือมากกวา− ชวงคลื่นยาว (365 nm) โดยสารที่มี conjugated double bondจํานวนมาก เชน quamarin, flavonoid, alkaloid บางชนิดจะเกิดการเรืองแสง2. ปฏิกิริยาการเกิดสีโดยการพนน้ํายาที่เหมาะสมลงบนแผน TLC สีอาจเกิดขึ้นทันทีหรือหลังจากใหความรอน เชน Iodine vapour ใหสีน้ําตาลกับสารที่มี conjugated double bond 50%H 2 SO 4 in MeOH มักใหสีกับสารพวก terpene, lignan, steroidDragendoff reagent ใหสีสมกับ alkaloidการวิเคราะหเชิงคุณภาพRf values เปนคาที่ใชไนการเปรียบเทียบสารตาง ๆ กับสารมาตรฐานเพื่อระบุชนิดของสารนั้น ๆRf = ระยะทางที่สารเคลื่อนที่จากจุดเริ่มตน / ระยะทางที่ตัวทําละลายเคลื่อนที่จากจุดเริ่มตนRf values มีคาตั้งแต 0.0-1.0 โดยเราอาจแสดงดวยคา hRf ซึ่งเทากับ Rf x 100แทนระยะทางการเคลื่อนที่ของสาร จะวัดจากจุดกึ่งกลางของ spot แตถาchromatogram ที่ไดเปนทางยาว จะวัดจากจุดกึ่งกลางของตําแหนงที่มีความเขมมากที่สุดการสกัดดวยตัวทําลายการสกัดดวยตัวทําละลาย (solvent extraction) เปนกระบวนการสงผานสารจากตัวทําละลายหนึ่งไปยังตัวทําละลายอีกตัวหนึ่งที่ไมเปนเนื้อเดียวกัน โดยอาศัยคุณสมบัติทางกายภาพทางเคมีของสารที่จะวิเคราะหรวมถึงความแตกตางในการละลายของสารในตัวทําละลายทั้งสองเมื่อนํามาสัมผัสกันจนกระทั่งเกิดสมดุตามหลักอุณหพลศาสตร(thermodynamics) ซึ่งเมื่อพิจารณาในแตละตัวทําละลายจะพบวาสารจะเกิดการกระจายตัว (partition หรือ distribution)หรือละลายอยูในตัวทําละลายทั้งสอง และมีอัตราสวนของความเขมขนของสารในตัวทําละลายทั้งสองคงที่หลักการเลือกตัวทําละลายที่จะใชทําการสกัด1. สารที่จะวิเคราะห ควรละลายไดดีในตัวทําละลายที่จะใชทําการสกัด(ตามหลัก like dissolve like) มากกวาตัวทะลายที่ใชละลายสาร10

12Spectrophotometryการวิเคราะหสารเคมีตางๆสามารถแบงออกเปน 2 ประเภทใหญ ๆ ตามผลของการวิเคราะห คือ1. คุณภาพวิเคราะห (qualitative analysis) เปนการวิเคราะหโดยมีวัตถุประสงค เพื่อตองการตรวจสอบวามี สารชนิดนั้น ๆ อยูในตัวอยางที่สงตรวจหรือไมผลการวิเคราะหจึงมักรายงานเปน ผลบวก หรือผลลบแตบางครั้งอาจมีการจัดลําดับขั้นของผลบวกออกเปนชองกวาง ๆ ตามปริมาณของสารที่มีอยูในสารตัวอยางคือ 1 + , 2 + , 3 + และ 4 +วิธีวิเคราะหใหไดผลประเภทนี้มีใชอยูไมมากนัก แตก็มีประโยชนมากในการตรวจสอบเบื้องตน (screening test) จึงเปนที่นิยมใชกันทั่วไป เนื่องจากวิธีวิเคราะหประเภทนี้มักทําไดงายรวดเร็ว และประหยัด2. ปริมาณวิเคราะห (quantitative analysis) เปนวิธีที่ใชกันมากโดยเฉพาะอยางยิ่งในการวิเคราะหสารเคมี โดยอาศัยปฏิกิริยาทางเคมี เนื่องจากการวิเคราะหประเภทนี้ใหผลเปนปริมาณของสารนั้น ๆ ดังนั้นวิธีวิเคราะหจึงตองใชเครื่องมือเปนเครื่องชวยในการวิเคราะหเพื่อใหไดผลการวิเคราะหที่ถูกตองแมนยําเครื่องมือทางวิทยาศาสตรที่นํามาใชประโยชนในการวิเคราะหสารเคมีในรางกายนั้น มีอยูมากมายหลายชนิด และมีหลักการวิเคราะหที่แตกตางกันไป อยางไรก็ตาม หลักการตรวจวิเคราะหที่ใชมากก็คือ สเปกโทรโฟโตเมตรีของการดูดกลืนแสง (absorption spectrophotometry) และสเปกโทรเมตรีของการคายคลื่นแสง (emission spectrophotomety)สเปกโทรโฟโตเมตรีของการดูดกลืนแสงเปนการเปรียบเทียบสีที่เกิดขึ้นจากตัวอยางสงตรวจกับสีของน้ํายามาตรฐาน สีที่เปรียบเทียบนี้อาจเปนสีของตัวอยางสงตรวจเอง หรือสีที่เกิดขึ้นจากปฏิกิริยาทางเคมีก็ได โดยความเขมของสีที่เกิดขึ้นนั้น จะเปนปฏิภาคกับปริมาณของสารนั้น ๆที่มีอยูในตัวอยางสงตรวจการเปรียบเทียบตามความเขมของสีนั้น อาศัยหลักของการดูดกลืนแสง (absorbtion)ในชวงคลื่นบางขนาด อาทิเชน การที่เราเห็นสารละลายบางชนิดมีสีน้ําเงินก็เพราะสารละลายนั้นดูดกลืนเอาแสงที่มีความยาวคลื่นในชวยของแสงสีเหลือง สม แดง ไปและยอมใหแสงที่มีสีน้ําเงินลอดผานไปไดเราจึงเห็นสารละลายนั้นมีสีน้ําเงิน ยิ่งสารละลายนั้นดูดกลืนแสงสีเหลืองและแดงไปมากเทาใด เราก็จะเห็นสารละลายนั้นมีสีน้ําเงินเขมยิ่งขึ้น ปริมาณการดูดกลืนแสงดังกลาวนี้จึง

ขึ้นกับความเขมของสีที่ปรากฏในสารละลายนั้นๆ กลาวคือ ยิ่งมีสารที่มีสีมาก ก็จะดูดกลืนแสงในบางชวงคลื่นไดมากดวย13Complementary ColorWavelength (nm) Color Absorbed Color Observed400 violet yellow - green435 blue yellow495 green purple560 yellow blue650 orange greenish blue800 red bluish greenดังนั้น เมื่อใหลําแสงผานเขาไปในสารละลายที่มีสี จํานวนแสงที่ถูกดูดกลืนไปจะแสดงถึงปริมาณของสารที่มีสีในสารละลายนั้น โดยเฉพาะอยางยิ่ง เมื่อใชลําแสงที่มีความยาวคลื่นแสงในชวงที่สารมีสีนั้นดูดกลืนไดมากที่สุดเครื่องมือทางวิทยาศาสตรที่อาศัยหลักการเปรียบเทียบสีโดยอาศัยการดูดกลืนแสงที่ใชบอยในการวิเคราะหสารเคมีในรางกาย คือ โฟโตมิเตอรที่ใชกระจกกรองแสง (filter photometer)สเปกโทรโฟโตมิเตอร (spectrophotometer) และฟลูออโรมิเตอร (fluorometer)นอกจากเครื่องมือที่กลาวมานี้ ยังมีเครื่องมืออื่น ๆ ที่เกี่ยวของกับการวิเคราะหสารเคมีในรางกายอีกมากมายหลายชนิด แตละชนิดมีหลักการวิเคราะหแตกตางกันมากมายจนไมอาจกลาวไดหมด เชน อะตอมมิกแอบซอรพชันสเปกโทรโฟโตมิเตอร (atomic absorptionspectrophotometer) อินฟราเรดสเปกโทรโฟโตมิเตอร (IR spectrophotometer) เนฟโลมิเตอร(nephelometer) โครมาโตกราฟ (chromatography) อิเล็กโทรโฟรีซีส (electrophoresis) ฯลฯ

ความรูเบื้องตนเรื่อง เทคนิคทาง Spectrophotometerเปนการศึกษาดานการกระทํารวม (Interaction) ระหวางคลื่นแมเหล็กไฟฟา หรือคลื่นแสงกับสสาร เชน อะตอม (atom) หรือโมเลกุลของสาร (molecule)Interaction ระหวางคลื่นแสงกับสสาร1. การดูดกลืนคลื่นแสง (Absorbtion) สสารสามารถดูดกลื่นคลื่นแสงในชวงคลื่นเฉพาะ2. การคายคลื่นแสง (emission) การที่สวนหนึ่งของพลังงานภายในของสสารถูกเปลี่ยนเปนพลังงานแสง3. การกระจาย (Scatter) หรือการสะทอนกลับ (Reflection)กฎของเบียร และแลมเบิรต (Beer and Lambert’s Law)กฎของเบียร และแลมเบิรต เกี่ยวกับการดูดกลืน ของแสงกับความหนาของเหลวที่มีสี กลาววาที่แตละชั้นของความหนาที่เทากันจะดูดกลืนแสงที่ผานในเศษสวนที่เทากัน นั่นคือเมื่อลําแสงของแสงโมโนโครมาติก (Monocromatic Light ) ฉายผานตัวกลางที่ดูดกลืน (Absorbmedium) ซึ่งก็คือสารละลายที่มีสี ความเขมขนของแสงจะลดลงในรูปของฟงคชั่นเอกซโพแนนเชียล ในขณะที่ความยาวของตัวกลางมากขึ้น“อัตราของแสงที่ถูกดูดกลืนไว จะผันแปรเปนสัดสวนโดยตรงกับความเขมขน และระยะทางที่แสงนั้นสองผาน”เมี่อใดที่สารละลายที่มีสีเปนไปตามกฎนี้ ก็ถือวาเปนไปตามกฎของแลมเบิรต มีขอควรสังเกต คือ สารละลายที่ใชกฎขอนี้ได ตองเปนสารละลายที่มีเนื้อเดียวกันตลอดความรูนี้มีประโยชนมากในการใชปรับความหนาของชั้นที่ดูดกลืนแสง หรือความหนาแนนของตัวอยาง ซึ่งอยูในหลอดแกวใส เรียกวา เซลล (cell) หรือ คิวเวตต (cuvette) เพื่อลดสีใหถึงระดับในชวงที่สามารถใชเตรียมอนุกรมของสารละลายมาตรฐาน เพื่อใชทําโคงมาตรฐาน(standard curve) หรือเพื่อที่จะใชกับสเปคโตรโฟโตมิเตอรไดหลักการของ Spectrophotometerเครื่องชนิดนี้มี photoelectric cell เปน sensing element กระแสที่เกิดโดย photoelectric cell จะถูกเปลี่ยนไปเปนเปอรเซนตทรานสมิชชั่น หรือคาแอบสอบแบนซ โดยเครื่องกัลวานอมิเตอร (Galvanometer) แหลงกําเนิดแสงเปนหลอดไฟธรรมดา คือหลอดทังสเตน(tungsten lamp) และแสงโมโนโครมาติก (Monocromatic Light ) ที่ไดจากการ ใหลําแสงสองผานแกวปริซึม หรือดิฟแฟรกชั่นเกรตติง (Diffraction grating) อยางใดอยางหนึ่งเพื่อใหได แสงโมโนโครมาติก (Monocromatic Light ) ที่มีความยาวคลื่นในชวงแสงที่มองเห็นได นอกจากนี้14

เครื่องมือชนิดนี้ยังสามารถใหแสงในชวงอัลตราไวโอเลต(Ultraviolet) และชวงใกลอินฟาเรด(nearinfrared) ได และในการขั้นตอนการวิเคราะหสามารถประยุกตใชวิธีทางเคมีไดเพื่อใหเหมาะสมกับสารนั้น ๆ ได เชน วิธีวัดความเขมขนของธาตุหรือสารประกอบ เชน cation anion รวมทั้งธาตุอาหารพืช โดยการเติมชุดของสารเคมีลงในสารละลายสกัด เพื่อทําใหเกิดสีที่เฉพาะ ถาสีเขมมากแสดงวา ความเขมขนของสารมากขั้นตอนการวิเคราะหดวย Spectrophotometer- เตรียมสารละลายตัวอยาง และสารละลายมาตรฐาน- เลือกความยาวคลื่นที่ตองการ- วัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายมาตรฐาน และสารละลายตัวอยาง- สรางกราฟมาตรฐานระหวางคาการดูดกลืนคลื่นแสงกับความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน- อานคาความเขมขนของสารละลายตัวอยางจาก กราฟมาตรฐาน15

16วัสดุและวิธีดําเนินการวิจัยขั้นตอนการดําเนินงาน แบงออกเปน 2 สวน คือ การทดลองทางจุลชีววิทยา และการทดลองทางเคมีวิเคราะหการทดลองทางจุลชีววิทยาอุปกรณและเครื่องมือวิจัย1. Incubator 37 °C2. Autoclave3. Micropipette ขนาด 10-50 µL, 50-100 µL, 100-1000 µL4. Micropipette tip5. 96-well plate Culture Cruster Round bottom with lid (Coster ® )6. Aluminium foil7. Erlenmeyer flask ขนาด 250 และ 500 mL8. Beaker ขนาด 50 และ 100 mL9. pipette ขนาด 10 mL10. Petri dish ขนาดเสนผานศูนยกลาง 10 cm11. Aluminium loop12. Forcep13. Automatic pipette14. ตะเกียงแอลกอฮอล15. ไมจิ้มฟน16. ภาชนะบรรจุแกว และพลาสติก17. สําลีและผากอซอาหารเลี้ยงเชื้อ1. Muller Hinton Broth (MHB) : Lot 1110003, Exp 06/2009, Difco ® ,France2. Tryptic Soy Agar (TSA) : Lot 5285367, Exp 12/2008, Difco ® ,France

3. Sabouraud Dextrose Agar (SDA) : Lot 405201, Exp 05/2008, Lab scanAsia Co.Ltd,Thailand4. Sabouraud Dextrose Broth (SDB) : Lot 4335990, Exp 06/200817สารเคมี1. Haematoxylin : Lot & filling code 446086/1 30704291 Fluka Chemie,Switzerland.2. Brazilin : CI 75280 Catalog # 860, Anatech LTD. Lot 29563. McFarland No. 0.54. Sterile water5. 70% ethyl alcohol1. การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ (media)1.1 วิธีการเตรียม Tryptic Soy Agar (TSA)การเตรียม เตรียมตามวิธีที่ระบุบนฉลากดังนี้ ชั่งอาหารเลี้ยงเชื้อหนัก 40 กรัม ตอน้ํากลั่น 1 ลิตร ตมจนอาหารเลี้ยงเชื้อใส จากนั้นนําไปทําใหปราศจากเชื้อโดยใช autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด 15 นาที ตั้งทิ้งไวใหอุณหภูมิลดเหลือประมาณ45 องศาเซลเซียส นําอาหารเลี้ยงเชื้อไปเทลง plate ที่ผานการทําใหปราศจากเชื้อโดยใชautoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด 15 นาที ใหมีปริมาตรอาหารเลี้ยงเชื้อในแตละ plate ประมาณ 15-20 มิลลิลิตร โดยเทภายในตู Laminar air flow เพื่อปองกันการปนเปอน1.2 วิธีการเตรียม Muller Hilton Broth (MHB)การเตรียม เตรียมตามวิธีที่ระบุบนฉลากดังนี้ ชั่งอาหารเลี้ยงเชื้อหนัก 40 กรัม ตอน้ํากลั่น 1 ลิตร เขยาจนอาหารเลี้ยงเชื้อใส จากนั้นตวงอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไดใสหลอดที่มีฝาจุกเกลียวหลอดละ 9 มิลลิลิตร จากนั้นนําไปทําใหปราศจากเชื้อโดยใช autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด 15 นาที1.3 วิธีการเตรียม Sabouraud Dextrose Agar (SDA)การเตรียม เตรียมตามวิธีที่ระบุบนฉลากดังนี้ ชั่งอาหารเลี้ยงเชื้อหนัก 65 กรัม ตอน้ํากลั่น 1 ลิตร ตมจนอาหารเลี้ยงเชื้อใส จากนั้นนําไปทําใหปราศจากเชื้อโดยใช autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด 15 นาที ตั้งทิ้งไวใหอุณหภูมิลดเหลือประมาณ

45 องศาเซลเซียส นําอาหารเลี้ยงเชื้อไปเทลง plate ที่ผานการทําใหปราศจากเชื้อโดยใชautoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด 15 นาที ใหมีปริมาตรอาหารเลี้ยงเชื้อในแตละ plate ประมาณ 15-20 มิลลิลิตร โดยเทภายในตู Laminar air flow เพื่อปองกันการปนเปอน1.4 วิธีการเตรียม Sabouraud Dextrose Broth (SDB)การเตรียม เตรียมตามวิธีที่ระบุบนฉลากดังนี้ ชั่งอาหารเลี้ยงเชื้อหนัก 30 กรัม ตอน้ํากลั่น 1 ลิตร เขยาจนอาหารเลี้ยงเชื้อใส จากนั้นตวงอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไดใสหลอดที่มีฝาจุกเกลียวหลอดละ 9 มิลลิลิตร จากนั้นนําไปทําใหปราศจากเชื้อโดยใช autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด 15 นาที1.5 วิธีการเตรียม McFarLand No. 0.5เตรียมโดยการผสม 0.048 M ของ BaCl 2 (1.75 % w/v ของ BaSo 4 .H 2 O) 0.5มิลลิลิตร กับ 0.36 N H 2 SO 4 1% v/v ปริมาณ 99.5 มิลลิลิตร2. การเตรียมเชื้อที่ใชทดสอบBacteria : S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 25922, S. typhimuriumATCC 13311 เตรียมโดย subculture เชื้อลงใน TSA ที่เตรียมไว โดยแยก 1 plate : เชื้อ 1 ชนิดนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นนํา loop ที่ sterile เขี่ยเชื้อจากplate มาใสใน MHB ที่เตรียมไวจากขอ 1.2 แลวนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24ชั่วโมง เพื่อใหได stock solution ของเชื้อทั้ง 3 ชนิดFungi : C. albicans ATCC 10231 เตรียมโดย subculture C. albicans ลงใน SDA ที่เตรียมไวนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง หลังจากนั้นนํา loop ที่sterile เขี่ยเชื้อจาก plate มาใสใน SDB ที่เตรียมไวจากขอ 1.4 แลวนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง เพื่อใหได stock solution ของ C. albicans3. การหาคา Minimal Inhibitory Concentration ของสารสกัดสมุนไพร:ฝางโดยวิธี Microdilution broth method3.1 เพาะเชื้อ S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 25922 Salmonellatyphimurium ATCC 13311 ลงบน TSA และ Candida albicans ATCC 10231 บน SDAเพื่อใหได colony เดี่ยว3.2 นําเชื้อที่ไดมาปรับความขุนใหได 0.5 Mcfarland โดยวัดคาดูดกลืนแสงที่625 นาโนเมตร ใหมีคาอยูระหวาง 0.08-0.118

3.3 นําเชื้อแบคทีเรียที่ปรับความขุนแลวมาเจือจาง 1:10003.4 เตรียม 2-fold serial dilution ของสารสกัดสมุนไพรฝาง ในอาหารเลี้ยงเชื้อMHB และ SDB ใน 96 well plate3.5 เติมเชื้อที่ปรับความขุนแลว ลงใน 96 well plate ที่เตรียมไว โดยแบคทีเรียเติมลงไป 10 ไมโครลิตร และยีสต 100 ไมโครลิตร3.6 สําหรับแบคทีเรียบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง สวนยีสตบมนาน 48 ชั่วโมง3.7 อานผลที่ไดโดยดูจากตะกอนของเชื้อที่อยูกนหลุมของ 96 well plate ถามีเชื้ออยูแสดงวาที่ความเขมขนนั้นไมยับยั้งเชื้อ อานคา MIC จากหลุมที่มีความเขมขนต่ําสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อ3.8 ทดลองหาคา MBC ตอ โดยแตะจากหลุมที่ใสมาลงบนอาหาร TSAสําหรับแบคทีเรียและบน SDA สําหรับยีสต บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง สวนยีสตบมนาน 48 ชั่วโมง3.9 อานคา MBC จากคาความเขมขนต่ําสุดที่ไมพบเชื้อเจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ192-fold serial dilutionPositive controlNegative controlรูปที่ 3 แสดงการทดลองหาคา MIC โดยวิธี 96-well plate method

4. การทดสอบฤทธิ์กันเสียของสารสกัดฝางในน้ําพริก เปนการทดลองเพื่อประเมินฤทธิ์กันเสียของฝาง4.1 เตรียมตัวอยางของน้ําพริก4.1.1 กลุมควบคุม น้ําพริก 2 กิโลกรัม เติมน้ําสะอาด 50 มิลลิลิลิตร4.1.2 ฝาง 4 เทาคา MIC น้ําพริกเปยก 2 กิโลกรัม เติมฝาง 2 กรัม ที่ละลายในน้ําสะอาด 50 มิลลิลิตร4.1.3 ฝาง 8 เทาคา MIC น้ําพริกเปยก 2 กิโลกรัม เติมฝาง 4 กรัม ที่ละลายในน้ําสะอาด 50 มิลลิลิตร4.1.4 ฝาง 16 เทาคา MIC น้ําพริกเปยก 2 กิโลกรัม เติมฝาง 8 กรัม ที่ละลายในน้ําสะอาด 50 มิลลิลิตร( หมายเหตุ คาความเขมขนต่ําสุด (MIC) ที่ใชคํานวณ คือคาความเขมขนต่ําสุด (MIC) ที่สามารถยับยั้งเชื้อทั้ง 3 ชนิดได )4.2 แบงบรรจุในภาชนะ 2 ชนิด คือ แกวและพลาสติก โดยภาชนะที่เปนแกวลวกขวดและฝา ดวยน้ําเดือดกอน คว่ําขวดจนแหงและเปาดวยลมรอน สําหรับภาชนะพลาสติกเปาดวยลมรอนกอนบรรจุ รวมจํานวนตัวอยางทั้งหมดมี 8 ตัวอยาง ดังนี้กลุมควบคุมบรรจุภาชนะแกว (cp)กลุมควบคุมบรรจุภาชนะพลาสติก (cg)ฝาง 4 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (4p)ฝาง 4 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (4g)ฝาง 8 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (8p)ฝาง 8 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (8g)ฝาง 16 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (16p)ฝาง 16 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (16g)ตัวอยางการคํานวณปริมาณฝางคา MIC ของสารสกัดฝางตอเชื้อทั้ง 3 ชนิดที่สูงสุด (ไมรวมคา MIC ของC. albicans เนื่องจากไมสามารถอานคาได) คือ 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งคิดเทียบเทาเปน250 ไมโครกรัม/กรัม หมายความวา น้ําพริก 1 กรัม ตองใสสารสกัดฝาง 250 ไมโครกรัม จึงจะสามารถยั้บยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อทั้ง 3 ชนิดได20

ดังนั้น 4 เทาของคา MIC จะเทากับ 4 x 250 = 1000 ไมโครกรัม ถาใสในน้ําพริก2000 มิลลิกรัม ตองใชสารสกัดฝางปริมาณ 2000 x 1000 = 2000000 ไมโครกรัม หรือเทากับ 2 กรัม21น้ําพริกหลังบรรจุเสร็จกลุมควบคุม ฝาง 4 เทาฝาง 8 เทาฝาง 16 เทารูปที่ 4 ลักษณะของน้ําพริกตัวอยางหลังบรรจุเสร็จ กลุมควบคุม ฝาง 4 เทา ฝาง 8 เทา และฝาง 16 เทา

225. การตรวจคุณภาพทางจุลชีววิทยามาตรฐาน (กรมวิทยาศาสตรการแพทย)1. Total Aerobic Count < 10 6 CFU/กรัม2. MPN Coliforms < 500 MPN/กรัม3. MPN E.coli < 3 MPN/กรัม4. Staphylococus aureus < 100 CFU/กรัม5. Bacillus cereus < 100 CFU/กรัม6. Salmonella หามพบ /25 กรัม7. Clostridium perfringen หามพบ / 0.01 กรัมวิธีการตรวจสอบคุณภาพทางจุลชีววิทยา1. Aerobic Plate Count1.1 ชั่งน้ําพริก 10 กรัมลงใน Butterfield's phosphatebuffereddilution water ( ฺBPW) 90 มิลลิลิตร เขยาใหเขากันดี1.2 นํามา 1 มิลลิลิตรลงใน BPW 9 มิลลิลิตร (ทํา dilutionตั้งแต 10 -2 ถึง 10 -6 )1.3 จากความเจือจางตาง ๆ นํามา 1 มิลลิลิตร pour plate กับอาหาร TSA (ทํา 2 ซ้ํา)1.4 บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง1.5 นับโคโลนี โดยเลือกนับในเพลทที่มีโคโลนี 25 – 250 โคโลนีบันทึกผลและคิดคา CFU/กรัมCFU/กรัม = จํานวนโคโลนี / (ปริมาตร × ความเจือจาง)ToTal Fungi count ทําการทดลองเชนเดียวกับ Aerobic Plate Countแตใชอาหาร SDA แทน และบมที่ 25 องศาเซลเซียส นาน 5 วัน2. MPN coliforms and E. coli2.1 ใชตัวอยางที่ทํา dilution จากการทดลองที่ 1 ตั้งแต 10 -1 -10 -32.2 นํามา 1 มิลลิลิตร ใสลงในอาหาร LST 10 มิลลิลิตร ที่มีหลอดดักกาซอยู โดยทําความเจือจางละ 3 หลอด บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง

2.3 ดูผลการเกิดกาซ สําหรับหลอดที่ไมเกิดกาซใหบมตออีก 24ชั่วโมงการยืนยันผล coliforms and E. coli- จากหลอดที่เกิดกาซ นํามา 1 loop ลงใน EC broth (ที่มีหลอดดักกาซ)- บม 45.5 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง- ดูผลการเกิดก็าซ ถามีแสดงวาเปน Coliforms นับจํานวนหลอดที่ขุนและเกิดกาซ (ถาไมเกิดกาซบมตออีก 24 ชั่วโมง) แลวเทียบคากับตารางที่ 1- จาก EC broth ที่เกิดกาซ นํามา streak บน L-EMBagar เพื่อดูวามี E.coli หรือไม- บม 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง- เลือกโคโลนีที่สงสัยมาทดสอบทางชีวเคมีเพื่อยืนยันตอไป3. Staphylococcus aureus Plate count3.1 ใชตัวอยางที่ทํา dilution จากการทดลองที่ 1 ตั้งแต 10 -1 -10 -63.2 นํามา 0.1 มิลลิลิตร spread ลงบนอาหาร Baird-parkeragar (ทํา 2 ซ้ํา)3.3 บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 45-48 ชั่วโมง3.4 เลือกนับเพลทที่มีโคโลนีทั้งหมด 20-200 โคโลนี3.5 นับเฉพาะโคโลนีที่มีลักษณะเปน S. aureus คือ สีดํา กลมเรียบ นูน ชื้น3.6 เลือกมา มากกวา 1 โคโลนี ทดสอบ coagulase ตอ ถาเกิดการ clot แสดงวาเปน S. aureus3.6.1 ผสมอาหารเลี้ยงเชื้อ TSB กับ plasma ในอัตราสวน 1:1 หรือใช plasma อยางเดียว จากนั้นเขี่ยเชื้อที่ตองการทดสอบ 1 loop ลงไป3.6.2 บมที่ 37 องศาเซลเซียส 12-18 ชั่วโมง3.7 บันทึกผลและคิดคา CFU/กรัม4. Bacillus cereus Plate count4.1 ใชตัวอยางที่ทํา dilution จากการทดลองที่ 1 ตั้งแต 10 -1 -10 -623

4.2 นํามา 0.1 มิลลิลิตร spread ลงบนอาหาร Mannitol-eggyolk-polymyxin (MYP) agar (ทํา 2 ซ้ํา)4.3 บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 45-48 ชั่วโมง4.4 เลือกนับเพลทที่มีโคโลนีทั้งหมด 15-150 โคโลนี4.5 นับเฉพาะโคโลนีที่มีลักษณะ แหง ขรุขระ และมีการตกตะกอนของไขรอบ ๆ โคโลนี แลวอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนเปนสีชมพู4.6 เลือกโคโลนี และลงบน NA slant และนํามาทดสอบทางชีวเคมีตอไป5. การตรวจหา Salmonella5.1 ตัวอยางน้ําพริก 10 กรัมลงใน Buffer peptone water 225มิลลิลิตร5.2 นํามา 1 มิลลิลิตร ลงใน Selenite cystine (SC) brothและ Tetrathionate (TT) broth 10 มิลลิลิตร5.3 บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง5.4 จาก SC และ TT broth นํามา Streak ลงบนอาหาร Xyloselysine desoxycholate (XLD) agar, Bismuth sulfite (BS) agar และ SS agar บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง5.5 เลือกโคโลนีที่สงสัยมาทดสอบทางชีวเคมี246. Clostridium perfringens6.1 ใชตัวอยางที่ทํา dilution จากการทดลองที่ 1 ที่ความเจือจาง10 -1 6.2 นํามา 10 มิลลิลิตร ใสลงในอาหาร RCM และอีก 10มิลลิลิตรนําไปใหความรอนที่ 80 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที และจึงนํามาใสลงในอาหาร RCM 90มิลลิลิตร เททับดวย paraffin บม 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง6.3 นํามาเพาะเชื้อลงบนอาหาร Columbia agar ที่ผสมgentamycin และบมใน anaerobic jar ที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง6.4 ถาพบเชื้อขึ้นใหนํามาเพาะเชื้อตอบนอาหาร Columbiaagar และแยกบมทั้งแบบ aerobicและบมใน anaerobic jar ที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง

6.5 ถาพบเชื้อขึ้นในสภาวะ anaerobe ใหนํามายอมแกรมดูรูปราง และทดสอบ catalase ถาใหผลแกรมบวกและมีรูปรางทอนปลายตัด และ catalase testใหผลลบ แสดงวาเปน C. perfringensตารางที่ 1 ตารางการแปลผล MPN test ในการทดสอบเชื้อ coliform และ E.coliPos. tubes MPN/g Conf. lim. Pos. tubes MPN/g Conf. lim.0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High0 0 0 1100 420 --25

26การทดลองทางเคมีวิเคราะหอุปกรณและเครื่องมือวิจัย1. แผน Silica gel GF 2542. TLC chamber3. เครื่อง Spectrophotometry4. เครื่อง Ultrasonic Bath5. Syringe 100 ไมโครลิตร6. เครื่อง Densitometer7. Volumetric Flask ขนาด 50, 100 มิลลิลิตร8. Beaker ขนาด 50, 100,250 มิลลิลิตร9. Dryerสารเคมี1. Haematoxylin : Lot & filling code 446086/1 30704291 Fluka Chemie,Switzerland.2. Brazilin : CI 75280 Catalog # 860, Anatech LTD. Lot 29563. Ethyl Acetate : analytical reagent AR Code No.A3513 J, BatchNo.04080097, Lab scan Asia Co,Ltd4. Acetone : code No. A3501 J, Batch No. 02021110, Lab scan AsiaCo,Ltd5. Methanol : analytical reagent AR Code No. A3513 J, BatchNo.01/07/1051, Lab scan Asia Co,Ltd6. Dichlorometane7. Concentrated Hydochloric acid8. Aluminium Alum9. Hydrochloric acid (1:100)10. Sodium Hydroxide (1M)11. Glacial acetic acid

1.2.2 เท solvent system ลงใน chamber แลวทิ้งไว 30 นาที เพื่อใหchamber อิ่มตัว1.2.3 นําแผน TLC ที่ spot สารสกัดฝางและสารมาตรฐานในchamber อิ่มตัวดวย mobile phase1.2.4 develop TLC จนถึง solvent front ที่กําหนด1.2.5 ประเมินหา system ที่เหมาะสม1.3 ศึกษาลักษณะโครมาโตกราฟฟใน Solvent system ที่เหมาะสม โดยใชเครื่อง Densitometer1.3.1 นําสารสกัดฝางมา spot บนแผน TLC ที่มี Silica gel GF 254 เปนเฟสคงที่โดยแตละแผนจะประกอบดวย spot ของสารสกัดฝาง สารมาตรฐาน Brazilin และHaematoxylin ทําซ้ํา 3 ครั้ง1.3.2 ทําการ run TLC ใน chamber ที่อิ่มตัวดวยเฟสเคลื่อนที่ที่เหมาะสม1.3.3 เมื่อเฟสเคลื่อนที่เคลื่อนที่ถึงตําแหนงที่ตองการจึงนําแผน TLCออกมาใหความรอนเพื่อไลเฟสเคลื่อนที่ดวย dryer1.3.4 นําไปตรวจสอบโดยการสองภายใตแสง UV ที่ความยาวคลื่น254 นาโนเมตร1.3.5 เปรียบเทียบคา Rf value2 การตรวจสอบชนิดและปริมาณสารสําคัญในสารสกัดฝางดวยวิธีspectrophotometry2.1 การตรวจหาความยาวคลื่น (λ) ที่ใหคาการดูดกลืนรังสี UV สูงสุด (λmax) ของ Brazilin2.1.1 ชั่งสารมาตรฐาน Brazilin 50 มิลลิกรัม ใสใน volumetric flaskขนาด 50 มิลลิลิตร2.1.2 เติม Ammonium Alum 2 กรัม เติมน้ํากลั่น 30 มิลลิลิตร เขยาดวยเครื่องอัลตราโซนิคเปนเวลา 10 นาที2.1.3 ปรับปริมาตรดวยน้ํากลั่นจนครบ 50 มิลลิลิตร นําไปวัดคาการดูดกลืนรังสีอัลตราไวโอเลตในชวงความยาวคลื่น 200 – 800 นาโนเมตร28

2.1.4 บันทึกสเปกตรัมการดูดกลืนรังสี UV ของสารมาตรฐาน Brazilinที่ใหคาดูดกลืนรังสี UV สูงสุด2.2. การสรางกราฟมาตรฐาน2.2.1 เตรียมสารละลายมาตรฐาน Brazilin 7 ความเขมขน โดยใหมีความเขมขนดังตารางที่122.2.2 นําไปวัดคาดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 nm (จากผลการทดลองขอ2.1) และบันทึกผลการทดลอง2.2.3 หาความสัมพันธระหวางคาการดูดกลืนรังสี UV กับความเขมขนของสารละลาย Brazilin292.3 การเตรียมสารละลายตัวอยางของสารสกัดฝาง2.3.1 ชั่งสารสกัดฝาง 50 มิลลิกรัม ใสใน vol. flask ขนาด 50 มิลลิลิตรที่มี Ammonium alum 2 กรัม2.3.2 เติมน้ํากลั่นปริมาตร 30 มิลลิลิตร เขยาใหเขากัน นําไปทําละลายดวยเครื่องอัลตราโซนิค เปนเวลา 10 นาที จากนั้นปรับปริมาตรดวยน้ํากลั่นใหได 50 มิลลิลิตร2.3.3 นําไปวัดคา Absorbance (λ = 505 nm) ทําซ้ํา 3 ครั้ง บันทึกผล2.3.4 นําผลการทดลองไปวิเคราะหหาปริมาณ Brazilin (ไมโครกรัม)ในสารสกัดฝาง 1 มิลลิกรัม (ไมโครกรัม/มิลลิกรัม)

30ผลการวิจัยผลการทดลองทางจุลชีววิทยา1. ผลการทดสอบฤทธิ์ในการตานเชื้อตัวอยาง 4 ชนิดดวยการหาคา MIC และ MBCจากผลการทดลองจะเห็นวา สารสกัดฝางมีคาความเขมขนในการยับยั้งการเจริญ เติบโตของเชื้อ (MIC) ตอเชื้อ 4 ชนิด ไดแก S.aureus ATCC 6538, E.coli ATCC 2592,S.typhimurium ATCC 13311 ซึ่งไดคา MIC ดังนี้ 125, 250, 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรตามลําดับ Haematoxylin ไดคา MIC ดังนี้ 62.5, 125, 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ และBrazilin ไดคา MIC ดังนี้ 250, 500, 1000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ สําหรับคาความเขมขนในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ (MIC) ตอ C.albicans ATCC 10231 ไมสามารถสังเกตผลไดหลังจากนํามาทดลองหาคาความเขมขนต่ําสุดที่สามารถทําลายเชื้อได (MBC) ตอเชื้อ 4ชนิด ไดแก S.aureus ATCC 6538, E.coli ATCC 2592, S.typhimurium ATCC 13311,C.albicans ATCC 10231 ไดผลดังนี้ สารสกัดฝางมีคา MBC ดังนี้ 125, 500, 500 และ 16000ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ Haematoxylin มีคา MBC ดังนี้ 125, 250, 500 และ 4000ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ และ Brazilin มีคา MBC ดังนี้ 250, 1000, 1000 และ 8000ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ จากผลการทดลองพบวา Haematoxylin มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อดีที่สุด รองลงมาคือ สารสกัดฝาง และ Brazilin ตามลําดับ ดังแสดงในตารางที่ 4

ตารางที่ 4 แสดงผลการทดสอบฤทธิ์ในการตานเชื้อตัวอยาง S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 25922, S. typhimurium ATCC 13311 และ C. albicansATCC 1023131เชื้อที่ใชทดสอบสารที่ใชทดสอบHaematoxylin สารสกัดฝาง BrazilinMIC MBC MIC MBC MIC MBC(µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml)S. aureus ATCC 6538 62.5 125 125 125 250 250E. coli ATCC 25922 125 250 250 500 500 1000S. typhimurium ATCC 13311 250 500 250 500 1000 1000C. albicans ATCC 10231 อานผลไมได 4000 อานผลไมได 16000 อานผลไมได 8000หมายเหตุ อานผลไมไดเนื่องจากสารมีสีเขม และมีตะกอนของสารที่กนหลุม(µg/ml = ไมโครกรัม/มิลลิลิตร)

2. ผลการทดสอบฤทธิ์กันเสียของฝางในน้ําพริกตัวอยางจากการตรวจสอบตามเกณฑมาตรฐานของกรมวิทยาศาสตรการแพทยที่เวลา วันที่เริ่มเก็บน้ําพริกตัวอยาง เดือนที่ 1, 2 และ 3 ไดผลการทดลองดังแสดงในตารางที่ 5ตารางที 5 จํานวนแบคทีเรียทั้งหมด ( x 10 2 cfu/กรัม) ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก32เดือน* ตัวอยางcp cg 2p 2g 4p 4g 8p 8g0 59 77 86 66.5 85.5 68 88 861 125 101.5 51 60.5 69 28.5 44 342 107 99 68 70 48 70 44 683 84.5 93.5 59.5 41 44 73.5 48 60ตารางที่ 6 จํานวนยีสตและราทั้งหมด (cfu/กรัม) ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริกเดือน* ตัวอยางcp cg 2p 2g 4p 4g 8p 8g0 360 840 545 660 680 645 755 8151 245 60 165 180 40 95 50 2852 595 570 410 270 350 370 265 5103 150 360 125 95 195 80 85 55* กลุมควบคุมบรรจุภาชนะแกว (cp) ฝาง 8 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (8p)กลุมควบคุมบรรจุภาชนะพลาสติก (cg) ฝาง 8 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (8g)ฝาง 4 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (4p)ฝาง 16 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (16p)ฝาง 4 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (4g) ฝาง 16 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (16g)

33ตารางที่ 7 MPN Coliforms ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริกเดือน* ตัวอยางcp cg 2p 2g 4p 4g 8p 8g0

34ตารางที่ 9 จํานวน S.aureus (cfu/g) ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก* ตัวอยางเดือนcp cg 2p 2g 4p 4g 8p 8g0 - - - - - - - -1 - - - - - - - -2 - - - - - - - -3 - - - - - - - -ตารางที่ 10 จํานวน B.cereus (x), จํานวน Salmonella (y), จํานวน C. perfringen (z) ที่ตรวจพบในตัวอยางน้ําพริก*samcp cg 2p 2g 4p 4g 8p 8gx y z x y z x y z x y z x y z x y z x y z x y zเดือน0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -* กลุมควบคุมบรรจุภาชนะแกว (cp) ฝาง 8 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (8p)กลุมควบคุมบรรจุภาชนะพลาสติก (cg) ฝาง 8 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (8g)ฝาง 4 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (4p)ฝาง 16 เทาคา MIC บรรจุภาชนะแกว (16p)ฝาง 4 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (4g) ฝาง 16 เทาคา MIC บรรจุภาชนะพลาสติก (16g)

ผลการตรวจสอบสารดวยวิธี spectrophotometryเนื่องจากการตรวจสอบดวยวิธี Thin Layer Chromatography (TLC) ไมสามารถตรวจพบ Haematoxylin ได ในการตรวจสอบดวยวิธี spectrophotometry จึงวิเคราะหปริมาณของBrazilin เพียงชนิดเดียว1. ผลการทดลองหา λ ที่ใหคาการดูดกลืนรังสี UV สูงสุด ( λ max) ของBrazilinความยาวคลื่นที่ใหคาการดูดกลืนรังสีอัลตราไวโอเลตสูงสุด (λ max) ของBrazilin เทากับ 505 นาโนเมตร2. การสรางกราฟมาตรฐานของ Brazilinจากการนําสารละลายมาตรฐานที่เตรียมไดไปวัดคาดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 nmไดผลดังแสดงในตารางที่ 12 นําผลที่ไดไปสรางกราฟมาตรฐาน แสดงความสัมพันธระหวางการดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 nm และความเขมขนของ Brazilin จะไดกราฟมาตรฐานดังแสดงในรูปที่ 6ตารางที่ 12 คาการดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 nm และความเขมขนของสารมาตรฐาน Brazilin36Brazilin (mg/ml)00.0002880.0003900.0005260.0006460.0007880.000900Absorbance (λ = 505 nm)0.0000.3330.5080.6480.8170.9981.095

371.2กราฟมาตรฐานแสดงความสัมพันธระหวางคาการดูดกลืนรังสีอัลตราไวโอเลตโดยตรงที่ความยาวคลื่น 505 nm และความเขมขนของ Brazilinคา Absorbance ที่ 505 nm10.80.60.40.2y = 1285.6x - 0.0154R 2 = 0.997100 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008 0.0009ความเขมขนของ Brazilinรูปที่ 6 กราฟมาตรฐานแสดงความสัมพันธระหวางคาการดูดกลืนรังสี UV โดยตรงที่ความยาวคลื่น 505 nm และความเขมขนของ Brazilin0.168 %3. ผลการวิเคราะหปริมาณ Brazilin ในสารสกัดฝางดวยวิธี spectrophotometryจากการวิเคราะห สารสกัดฝาง 1 กรัม มีปริมาณของ Brazilin 1.68 ไมโครกรัม คิดเปนการทดลองคาดูดกลืนรังสี UV(λ = 505 nm)ความเขมขนของ Brazilinในสารสกัดฝาง (mg/ml)ปริมาณ Brazilin ในสารสกัดฝาง 1 mg (µg)ครั้งที่ 1 0.442 0.000332 1.61ครั้งที่ 2 0.455 0.000342 1.71ครั้งที่ 3 0.477 0.000359 1.72คาเฉลี่ย 1.68ตารางที่ 13 ผลการวัดคาดูดกลืนรังสี UV ที่ 505 นาโนเมตร ของสารสกัดฝาง และปริมาณBrazilin ในสารสกัดฝาง 1 มิลลิกรัม (ไมโครกรัม/มิลลิกรัม)

38สรุปและวิจารณผลการวิจัยสรุปผลการทดลองจากการทดลอง ในสวนของการทดลองทางจุลชีววิทยา สารที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งและฤทธิ์ในการฆาเชื้อจุลชีพดีที่สุด คือ Haematoxylin รองลงมาไดแก สารสกัดของฝาง และ Brazilinตามลําดับ และการใชสารสกัดของฝางเปนวัตถุกันเสียในน้ําพริกตัวอยาง พบวาสามารถลดปริมาณแบคทีเรียและเชื้อราไดอยางมีประสิทธิภาพ โดยไมทําใหสีและกลิ่นของน้ําพริกตัวอยางเปลี่ยนแปลง ดังนั้นจึงสามารถนําสารสกัดฝางมาใชเปนวัตถุกันเสียในผลิตภัณฑอาหารสําเร็จรูปประเภทน้ําพริกไดสําหรับในสวนของการทดลองทางเคมีวิเคราะห ดวยวิธี Thin-Layer Chromatographyโดยใช Silica gel GF 254 เปน stationary phase ทําละลายสารสกัดของฝาง ใน methanol ผสมกับconcentrated hydrochloric acid ในอัตราสวน 3:0.7 และใช ethyl acetate เปน solventsystem พบวา สารสกัดของฝางดังกลาว ให chromatogram เพียง 1 แถบ ซึ่งเมื่อพิจารณาจากคาRf value แลวไดผลวาเปน Brazilin และไมสามารถตรวจพบ Haematoxylin จึงเปนไปไดวาในสารสกัดดังกลาวนาจะมี Brazilin เพียงอยางเดียว หรืออาจมีปริมาณของ Haematoxylin นอยเกินกวาที่จะตรวจพบได ซึ่งหลังจากนํามาตรวจสอบดวยวิธี spectrophotometry พบวา Brazilinมีการดูดกลืนรังสีอัลตราไวโอเลตสูงสุดที่ 505 นาโนเมตร และมีปริมาณของ Brazilin ในสารสกัดของฝาง คิดเปน 0.168%วิจารณผลการทดลอง1. จากการทดลองหาคาความเขมขนต่ําสุดของ C. sappan ที่สามารถยับยั้งเชื้อจุลชีพ(MIC) ดวยวิธี well method ไมสามารถอานผลของ Candida albican ได เนื่องจากสารตัวอยางมีความเขมขนมาก ไมสามารถละลายในตัวทําละลายไดหมด และสารตัวอยางมีสีเขมจัดหลังจากนํา well ไป incubate ที่ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชั่วโมง แลวนํามาอานผล พบตะกอนขุนอยูที่กนหลุมใน หลุมที่ 1-6 ประกอบกับสารละลายมีสีเขม จึงไมสามารถบอกไดวาสารตะกอนดังกลาวเปนเชื้อจุลินทรียที่เกิดขึ้นหรือคือผงของสารที่ละลายในตัวทําละลายไดไมหมด ซึ่งเมื่อนําไปทดลองหาคาความเขมขนต่ําสุดของ C. sappan ที่สามารถทําลายเชื้อได (MBC) ดวยวิธี

plate method ซึ่งสังเกตผลไดงายเนื่องจาก agar มีลักษณะใส ไดผลการทดลองดังที่ระบุไวในผลการทดลอง ซึ่งไมสอดคลองกับคา MIC อาจเปนผมาจากสารตัวอยางทั้ง 3 ชนิด มีความเขมขนมาก ไมสามารถละลายในตัวทําละลายใหเปนสารละลายเนื้อเดียว เมื่อนําไปเจือจางใน well แบบ2-fold serial ทําใหความเขมขนของสารในหลุมเปลี่ยนแปลงไป2. ในการวิเคราะหสวนประกอบในสารสกัดฝาง โดยละลายสารใน methanol :conc.hydrochloric acid และใช ethyl acetate เปน solvent system พบวายังเกิด tailing อยูบาง อาจเนื่องมาจาก solvent system ยังไมเหมาะสม และไมพบแถบสีของสาร Haematoxylin ซึ่งอาจเปนเพราะไมมีสารดังกลาวในสารสกัดฝาง หรือสารมีปริมาณนอยเกินกวาที่จะสามารถตรวจสอบได3. เนื่องจากสาร Brazilin เปนสารที่ถูกออกซิไดซไดงาย ดังนั้นในการวิเคราะหสวนประกอบและปริมาณของ Brazilin ในสารสกัดฝาง ดวยวิธี spectrophotometry ตองทําfreshy prepare และใส ammonium alum เพื่อปองกันการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชั่น โดยจะไปจับกับ Brazilin เกิดเปน complex ที่ stableขอเสนอแนะ1. ในการทดลองหาคาความเขมขนต่ําสุดของสารสกัดฝาง ที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลชีพทั้ง 4 ชนิดได อาจเปลี่ยนแปลงวิธีการทดลอง เปนการทดสอบในหลอดทดลอง ซึ่งอานผลไดชัดเจน อาจทําการเปลี่ยนตัวทําละลาย หรือใสสารชวยทําละลาย เพื่อใหสารละลายไดดียิ่งขึ้น และเปนเนื้อเดียวกัน2. อาจทําการทดลองเพื่อหาตัวทําละลาย และ solvent system ที่เหมาะสมมากยิ่งขึ้นเพื่อลดการเกิด tailing ในการทดสอบดวยวิธี Thin-Layer Chromatography3. ในการวิเคราะหชนิดและปริมาณของสารสําคัญในสารสกัดฝาง ดวยวิธี Thin-LayerChromatography และ spectroscopy อาจมีความละเอียดไมเพียงพอ จึงอาจเลือกใชวิธีวิเคราะหอื่นที่มีความละเอียดมากยิ่งขึ้น เชน High Performance Liquid Chromatography แทนเพื่อใหไดผลการทดองที่ถูกตอง แมนยํา นอกจากนี้อาจพบสารอื่น ๆ ที่สามารถนํามาวิเคราะหและพัฒนาตอไป4. จากขอมูลที่ไดศึกษาและคนควา พบวายังมีพืชสมุนไพรที่นาสนใจและมีฤทธิ์ในการตานเชื้อจุลชีพอีกหลายชนิด ซึ่งควรมีการนํามาศึกษาเพื่อนํามาใชพัฒนาผลิตภัณฑตอไป39

5. ในการสรางกราฟมาตรฐาน ควรมีการกําหนดคา concentration ของสารกอน โดยทําการประเมินคราว ๆ ใหอยูในชวง 0.2-0.8 เพื่อความสะดวกในการ plot graph6. สําหรับการนําพืชสมุนไพรมาใชเปนสารกันเสียในผลิตภัณฑ ตองมีการตรวจสอบเทคโนโลยี และ ไดรับการรับรองจากองคการอาหารและยา7. เพื่อความมั่นใจไดวา ผลิตภัณฑน้ําพริกที่นํามาใชในการวิจัย ไมมีการใสสารกันเสียมากอน ซึ่งจะทําใหผลการวิจัยทั้งหมดคลาดเคลื่อนไปนั้น ผูทําการวิจัยควรเตรียมน้ําพริกที่ใชในการทดสอบขึ้นเอง40

เอกสารอางอิง1. Mi-Youn Lim,et.al. Antimicrobial activity of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinoneisolated from Caesalpinia sappan toward intestinal bacteria Food Chemistry,100, 3, 2007, 1254-12582. Y.W. Xie, D.S. Ming, H.X. Xu, H. Dong and P.P. But, Vasorelaxing effects ofCaesalpinia sappan involvement of endogenous nitric oxide, Life Sci 67 (2000),pp. 1913–1918.3. N.I. Baek, S.G. Jeon, E.M. Ahn, J.T. Hahn, J.H. Bahn and Js. Jang et al.,Anticonvulsant compounds from the wood of Caesalpinia sappan L, Arch PharmRes 23 (2000), pp. 344–348.4. F.C. de Oliveira Luiz, G.M. Edwards Howell, S. Velozo Eudes and M. Nesbitt,Vibrational spectroscopic study of brazilin and brazilein, the main constituents ofbrazilwood from Brazil, Vib Spectrosc 28 (2002), pp. 243–249.5. H.X. Xu and S.F. Lee, The antibacterial principle of Caesalpina sappan,Phytother Res 18 (2004), pp. 647–6516. H. Hikino, T. Taguchi, H. Fujimura and Y. Hiramatsu, Antiinflammatory principlesof Caesalpinia sappan wood and of Haematoxylon campechianum wood, PlantaMed. 31 (1977), pp. 214–220.7. V.L., Ravikanth, V., Jansi Lakshmi, V.V.N.S., Suryanarayan Murty, U. andVenkateswarlu, Y., 2003. Inhibitory activity of homoisoflavonoids fromCaesalpinia sappan against Beauveria bassiana. Fitoterapia 74, pp. 600–602.8. Asif Saeed, M., Sabir, A.W.Antibacterial activity of Caesalpinia bonducella seeds(2001) Fitoterapia, 72 (7), pp. 807-809.9. Bahia, M.V., Dos Santos, J.B., David, J.P., David, J.M. Biflavonoids and otherphenolics from Caesalpinia pyramidalis (Fabaceae) Journal of the BrazilianChemical Society 16 (6 B), pp. 1402-140510. Indrayan, A.K., Sharma, A., Guleria, B.S., Gupta, C.P. Antimicrobial activity ofdye from Caesalpinia sappan (Patang/Brazilwood) Indian Journal ofMicrobiology 42 (4), pp. 359-360.41

11. Ali, M.S., Azhar, I., Amtul, Z., Ahmad, V.U., Usmanghani, K. Antimicrobialscreening of some Caesalpiniaceae (1999) Fitoterapia, 70 (3), pp. 299-304.12. Guleria, B.S., Manav, A.K., Indrayan, A.K. Isolation and Extraction of MedicinallyUseful Dye from the Heartwood of Caesalpinia sappan Linn. using DifferentSolvents (1997) Asian Journal of Chemistry, 9 (4), pp. 816-818.13. Oh, S.R., Kim, D.S., Lee, I.S., Jung, K.Y., Lee, J.J. and Lee, H.K., 1998.Anticomplementary activity of constituents from the heartwood of Caesalpiniasappan. Planta Medica 64, pp. 456–458.14. โยธิน คําอุดม, รชตะ ปาระดี. โรคผิวหนังจากเชื้อราและความไวของเชื้อสาเหตุตอสารสกัดชุมเห็ดเทศ. [โครงการพิเศษปริญญาเภสัชศาสตรบัณฑิต]. กรุงเทพฯ: คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัย มหิดล; 2543.15. รุงระวี เต็มศิริฤกษกุล, สุมาลย สาระยา, ยุวดี วงษกระจาง, นงลักษณ เรืองวิเศษ, วงศสถิต ฉั่วสกุล. การศึกษาวัตถุกันเสียจากสมุนไพรเพื่อยืดอายุผลิตภัณฑน้ําพริกชุมชน. วารสารอาหารและยา 2549; 2(13): 34-45.16. ฤทัยวรรณ นพเกา, ลินดา ประทุมทอง. การศึกษาลักษณะทางโครมาโทกราฟของสารสกัดจากพืชจําพวกมะระและคุณสมบัติในการตานออกซิเดชั่นของสารสกัด.[โครงการพิเศษปริญญาเภสัชศาสตรบัณฑิต]. กรุงเทพฯ. คณะเภสัชศาสตรมหาวิทยาลัยมหิดล; 2546.17. สมฤทัย บูรพาศิริวัฒน, สุภัชชา หมื่นแกว. การศึกษาฤทธิ์ตานแบคทีเรียของยาตานจุลชีพตอเชื้อ Escherichaiae coli ในหลอดทดลอง. [โครงการพิเศษปริญญาเภสัชศาสตรบัณฑิต]. กรุงเทพฯ. คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล; 2547.42