إحداث تضاعف كرو٠وزو٠ي لنبات الجاردينا Gardena و ... - جا٠عة ال٠لك فيصل

التقرير النهائي للبحث رقم ٢٣٨/٢٠٠١: بعنوانإحداث تضاعف كروموزومي لنبات الجاردينيا و الانتخاب المبكر للنباتاتالمضاعفة.‏Polyploidisation and early screening of Gardeniaإعدادالأستاذ الدكتور/عبد االله بن صالح الغامدي و الدكتور/‏ غسان بن رشيد عبد االلهقسم البساتينكلية العلوم الزراعية والأغذيةجامعة الملك فيصل١

التقرير النهائي للبحث رقم ٢٣٨/٢٠٠١إحداث تضاعف كروموزومي لنبات الجاردينيا و الانتخاب المبكر للنباتات المضاعفة.‏Polyploidisation and early screening of Gardeniaالأستاذ الدكتور عبد االله بن صالح الغامدي و الدكتور غسان بن رشيد عبد االلهقسم البساتين – كلية العلوم الزراعية والأغذية – جامعة الملك فيصلملخص البحث:‏ تهدف هذه المحاولة لتطوير طريقة التضاعف الكروموسومي للحصول على رباعياتالصيغة الصبغية وتحسين الصفات الزهرية والخضرية لنوعين منالجاردينيا(‏G.jasminoides ,( G.thunbergiaالمستخدمين في التنسيق الداخلي.آانت المعالجة بالكولشيسين أو الأوريزالينآمعيقات للانقسام الخلوي على عقل ساقية،‏ عقل جذرية،‏ عقل ورقية وسلاميات قبل زراعتها على الوسطالمغذي،‏ وآذلك ضمن الوسط المغذي خلال المرحلة الأخيرة لإعادة النمو من الكدب.‏ زراعة العقل الساقيةعلى MS مضافا له1ملجرام/لتر BAP و‎0.5‎ ملجرام/لتر IAA وآذلك الزراعات الثانوية التي أعطتمردود مرتفع من النموات التي تم تجذيرها على MS مضافا لهالحصول عليها على MS مضافا له1 ملجرام ‏/لتر . IAA2 و 0.25أعطت بدورها نموات جديدة على الظلام في وسط MS معالكدب تمملجرام/لترمن NAA وBAP على التوالي،‏ وهذه الكدب2 و0.5 ملجرام/لترمن الزياتين وNAAعلى التوالي بعد الزراعة الثانوية الرابعة للكدب.إن المعالجة بمعيقات الانقسام للعقل الساقية وآذلكإضافتها للوسط في المرحلة الأخيرة لإعادة النمو من الكدب أعطى نموات رباعية الصيغة الصبغية وآذلكنموات شيميرية،‏ بالمقابل لم تؤد المعالجات في مرحلة ما قبل إنتاج الكدب إلى إعطاء أي نوع من تلكالنموات.أعلى نسبة للنموات الرباعية تم الحصول عليها بعد المعالجة بمعيقات الانقسام في المرحلةالأخيرة لإعادة النمو من الكدب مقارنة بتلك الناتجة من العقل الساقية المعالجة.وبشكل عام فإنالأوريزالين آان أآثر سمية للعينات النباتية من الكولشيسين وأآثر قدرة على إحداث الشيميرا،‏ آما إنإمكانية الحصول على النموات المضاعفة آان أقل والتي لعب الكولشيسين الدور الأآبر في إحداثها.‏الكلمات المفتاحيه:‏ الجاردينيا،‏ ألإكثار المخبري،‏ إنتاج الكدب،‏ التعضي،‏ الكروموسوم،‏الشيميراالتضاعف،‏،الكولشيسين،‏ الأوريزالين،‏ قياس التدفق الخلوي.(FCM)٢

المقدمةتعتبر الجاردينيا من النباتات الهامة في التنسيق الداخلي للمنازل حيث تزرع في الداخل وعلىالشرفات وفي الحدائق المنزلية المظللة لأن القليل من الأصناف قادر على العيش خارجيا بسبب حساسيتهالحرارة الصيف العالية وأشعة الشمس المباشرة.‏ وهي ذات أهمية اقتصادية أيضاً‏ نظرا لاستخدامها فيصناعة العطور و الأصبغة لوجود مادة ألفا آروسيتين (γ-Crocetin) المستخدمة آصباغ أصفر للحرير.‏وتعتبر مادة الكروسين (crocin) المستخلصة من ثمار الجاردينيا من مضادات الأآسدة Thanh)وآخرون،( 2000إضافة لذلك فقد تمكنPaik وفريقه(2001) من الحصول على أصبغه زرقاء منثمار الجاردينيا باستعمال بعض المعالجات الكيميائية البسيطة وآان لذلك أهمية آبيرة في مجالات صناعةالأصبغة الطبيعية المنشأ.‏Gardeniaتنتمي أشجار وشجيرات الجاردينيا للعائلة الروبيةو الجنسالذيRubiaceaeG. rothmannia،G. thunbergia ،G. jasminoidesيضم العديد من الأنواعومن أهمها ،G. jasminoidesو G.augusta ويعتبر النوع .واحد من أآثر الأنواع شعبية في الولايات المتحدةوالصين حيث يصل ارتفاع الشجيرة إلى1.5 م وهي دائمة الخضرة وبرائحة شمعية،‏ و تزهر منمنتصف مايو وحتى يونيو ويمكن أن يستمر حتى سبتمبر،‏ معطية أزهار مضاعفة بلون أبيض ورائحةعطرية قوية.‏ تحتاج شجيرات الجاردينيا إلى إضاءة قوية غير مباشرة للإزهار.‏أما النوع G.thunbergiaفاسمه العام شجرة الجاردينيا حيث يصل ارتفاعها حتى3 موالعرض إلى 1.2 م في المناطق الملائمة ‏(الاستوائية).‏ يلائمها التربة الرملية المتوسطة الخصوبةوالطينية الخصبة،آما تحب الأراضي الحمضية والإضاءة العالية.‏ هذه الأشجار نصف ظليلة تزهر فيالخريف معطية أزهار بيضاء اللون بشكل أقحواني ذات أنبوب طويل.‏ خشبها القاسي يستخدم لصنع بعضالأدوات الزراعية في جنوب أمريكا آما تستخدم آأصل لتطعيم شجيرات الجاردينيا عليه مثل الصنفDumanois )،Veitchiiفهي مقاومة للنيماتوداوآخرون.( 1984٣

وتلعب تقنيات زراعة الأنسجة دورا آبيرا وهاما في إآثار العديد من النباتات الاقتصادية الهامةوآذلك الأشجار والشجيرات الصعبة الإآثار بالطرق الخضرية التقليدية ومن بينها الجاردينيا.‏ ولقد آانDumanois وزملائه (1984) أول من استخدم تقنيات زراعة الأنسجة لإآثار الجاردينيا حيث نجح فيتجذير النموات الحديثة الناتجة في الأنابيب وبنسبة ‎75‎‏%متخلصاً‏ من تأثير وقت التجذير على نجاحالإآثار وأيضا من المردودية المنخفضة لطرق الإآثار التقليدية.‏لم يقتصر استخدام تقنية زراعة الأنسجة على إآثار هذا النبات فقط بل اتجهت الأبحاث نحودراسة تغير أنزيم البيروآسيدز أثناء مراحل التشكل النباتي(‏(1990 Shenوالحصول على المادة النباتية، (1993اللازمة لإنتاجالكروسين من الجاردينيا والمستخدمة في الأصبغة )George وآخرونودراسة تأثير مكونات الوسط الغذائي على إنتاج الكروسين من الكدب.(1999 وyang Lai ) (callus)هذا وقد استخدمت ثمار الجاردينيا سابقا من قبل طبيب صيني آمضاد حيوي و مهديء عصبي و مدر. (1992للبول ومسكن للحمى) Hayashi وآخرونومن أجل تحسين آفاءة الإآثار ، فقد بين Serretوآخرون(1997,1996) بأن النبيتات الناتجةمن أنابيب غير محكمة الإغلاق آانت أنجح بالتقسية من تلك المأخوذة من أنابيب محكمة الإغلاق معاختلاف الاستجابة الضوئية لهذه النبيتات حسب ترآيز السكروز المستخدم.‏ آما أدى تناوب استخداممصادر نتروجينية مختلفة في الوسط المغذي إلى زيادة إنتاجية العقلة المخبرية من النموات المورقة في.آل من الجاردينيا والموز(‏ Georgeو(1996 Ravishankarلقد أصبح التضاعف الكروموزومي من اهتمامات مربي النبات لما له من أهمية في تحسينالصفات البستانية لبعض النباتات آالأزهار الكبيرة والأوراق السميكة ذات الخضرة الداآنة وزيادة نسبةالعرض للطول في المسطح الورقي أو إطالة فترة الإزهار أو تأخيره( 1996 Kehr)وGao) وآخرون.( 1996إضافة لذلك يستخدم التضاعف الكروموزومي في النباتات البستانية من أجل إعادة الخصوبةللهجن العقيمة الناتجة عن التهجين بين الأجناس،‏ وآذلك الهجن ثلاثية الصيغة الصبغيةوFrzier Pryot)( 1968و(‏Goldy وآخرون( 1996ومضاعفة النباتات أحادية الصيغة الصبغية للحصول على سلالات٤

نقية جديدة وخصبة(‏Yetisir و( 2003 Sariو(‏Zamani وآخرون2000 ‏).آما يستفاد أيضا منالتضاعف الصبغي في إنتاج نباتات ثلاثية العدد الكروموزومي عقيمة،‏ وذلك بتهجين ثنائي الصيغةالصبغية مع رباعي الصيغة الصبغية،‏وهذا مفيد في النباتات المزروعة في الحدائق حيث من غيرالمرغوب إنتاج الثمار عليها.( 1997 Hancock)يمكن للتضاعف الكروموزومي أن يحدث بشكل طبيعي وخاصة في النباتات أحادية الصيغةالصبغية حيث تعتبر هذه الأخيرة حالة غير طبيعية،‏ أو بشكل اصطناعي باستخدام العديد من الموادالكيميائية مثل الكولشيسيندورا هاماً‏ في حدوث الاندوميتوز(Colchicine)والأوريزالين( Oryzaline)( Endomitos)وغيرها من المواد التي تلعبأثناء الانقسام الخلوي بحيث تعيق الطور الانفصاليبالرغم من حدوث تتضاعف للكروموزومات التي تبقى ضمن نفس الخلية،‏ وبذلك يتضاعف العددالكروموزومي لهذه الخلية.‏ تستخدم هذه المواد بتراآيز مختلفةRedha) وآخرون ( 1998Anderson) وآخرون (1991وآخرونوطرق مختلفة حسب الجزء النباتي المراد مضاعفتهوأزمنة مختلفةPetersen).( 2002تحتاج برامج التحسين النباتي دائما وبشكل متزايد إلى أدوات أآثر فعالية في عمليات التربية،‏وهذا ذو أهمية بقدر أهمية إنتاج الأحاديات المضاعفة لتسريع إنتاج السلالات النقية وبأقل وقت ممكن )(1986DicksonوWallaceوزيادةفعاليتها في تحسين الأصناف.( 1989 وSibi Demarly)وقد بين Delaat وآخرون (1987 ( بأن الطرق التقليدية المستخدمة مباشرة في تقدير العددالكروموزومي وتحديد مستوى التضاعف في النباتات طويلة ومعقدة جدا و تحتاج إلى مخابر جيدةالتجهيز وآادر مدرب وذو خبرة.و تعتمد الطريقة التقليدية على إحصاء العدد الكروموزومي مباشرة فيالنواة أثناء الانقسام الخلوي في وقت معين من النهار وتحت المجهر بعد القيام بالعديد من المراحلالتحضيرية الطويلة،‏ لذلك فالحاجة ماسة لإيجاد طرق غير مباشرة وفعالة في تحديد مستوى التضاعفمثل تحديد حجم الثغور التنفسية وعدد الكلوروبلاست في الخلايا الحارسة Sari) وآخرون،( 1999وبالرغم من فعالية هذه الطريقة،‏ فإنها غير قابلة للتطبيق في بعض الحالات عندما يكون مستوى٥

Flowالتضاعف منخفضاً‏لهذا يتوجب استخدام تقنية أخرى مثل)Delaat وآخرون 1987) (.( Cytometryلقد أستخدمBrown وآخرون(1991) طرق مختلفة لتحديد عدد الكروموزوماتوتحديد مستوى التضاعف في العديد من الأنواع النباتية واقترحوا استخدام الآطريقة ناجحة وفعالة لذلك،‏ وبعدهمFlow CytometrySari وآخرون 1999) (قاموا بمقارنة الطريقة المباشرة ‏(إحصاءالعدد الكروموزومي)‏ بالطرق غير المباشرة بتقدير:‏ حجم الثغور التنفسية،عدد الكلوروبلاست في الخلاياالحارسة،‏ الاختلافات الشكلية واستخدام جهازالFlow Cytometry لتحديد درجة التضاعف فيالبطيخ الأحمر،‏ حيث بينوا إمكانية استخدام آافة الطرق السابقة الذآر في حين آان استخدام جهاز الFlow Cytometryأآثر قابلية للتطبيق بشكل عملي ومكثف.‏إن استخدامجهازال Flow Cytometry هي طريقة متكاملة لتقدير ال DNA النووي للنباتاتلأنها تسمح بتقديرات حساسة ودقيقة لكثافة الحزم الضوئية لأعداد آبيرة من النوى الملونة خلال ثوانيو(1991 Earleهذه الطريقة استخدمت بنجاح على البطيخ الأصفر(‏CunyArumuganat)SariوSari Yetisirوآخرون2003) وعلى البطيخ الأحمر)،1992 Abak وآخرون ،1996وآخرونوعلى النوعSaito) Hemerocallisوآخرون(2003‏،آما أستخدم أيضاً‏ في آشف(1999الشيميرا( Chimiras)في النباتات الناتجة من تربية الموز داخل الأنابيبRoux )وآخرون.(2001يهدف هذا البحث إلى تطوير وتحسين آفاءة الإآثار النسيجي للجاردينيا،‏وإيجاد طريقة مناسبةوفعالة لإحداث تضاعف آروموزومي في النبات الناتجة والتي تساعد في الحصول على بعض الصفاتالزهرية و الخضرية الجديدة التي لم تكن موجودة سابقا في النباتات الأم حيث أن الصيغة الصبغية(Ploidy) للجاردينيا هي ثنائية وفيها ٢٢ آروموزوم (22=2n Ma) ( وآخرون 1984)، بالإضافة إلىاستخدام طرق حديثة في الكشف المبكر عن التغير في العدد الكروموزومي للنباتات الناتجة عن استخدامالمواد المعيقة للانقسام الخلوي وتحديد درجة هذا التغير.‏٦

مواد وطرق البحثنفذ هذا البحث بقسم البساتين في آلية العلوم الزراعية والأغذية بجامعة الملك فيصل في الفترة ماG.jasminoides2003 م و 2001 بينوذلك على نوعين من الجاردينيا:‏وG.thunbergia ، حيثاستخدم لهذه الغاية عشر نباتات من آل نوع مزروعة في البيت الزجاجي آأمهات في أصص تحتوي علىخلطة زراعية مؤلفة من رمل و بتموس وتربة زراعية بنسبة 1:1:1 وتم ريها بمحلول غذائي مخفف منٍ وSkoog (1962الأملاح المعدنية(‏بين فترة وأخرى ، بهدف الحصول على نمواتMurashigeحديثة بشكل مستمر لإمداد الزراعة النسيجية بالأجزاء النباتية اللازمة.‏إنتاج النبيتات مخبريا:‏فصلت النموات الحديثة من النباتات الأم وتم غسلها بالماء العادي ثم مسحها بالكحول الإيثيلي% 70 ترآيزوتقطيعها إلى أجزاء بطول 3-2 سم ويحتوي آل منها على عقدة ساقية واحدة فقط لتكونالجزء المستخدم في الزراعة الأولية.‏ طهرت هذه الأجزاء بغمرها في محلول من الكلوروآس التجاري%30 بترآيزوالمضاف له عدة نقاط من التوين(20– (Tween آمادة ناشرة لمدة 35 دقيقة ثم غسلتالأجزاء النباتية ثلاث مرات بالماء المقطر والمعقم لمدة ثلاث دقائق في آل مرة.‏زرعت الأجزاء النباتية المختارة بعد تعقيمها في أنابيب اختبار بشكل رأسي بمعدل عقلة ساقيةواحدة في آل أنبوب تحت جهاز العزل الجرثومي(Hood)آزراعة أولية،‏ثم وضعت في غرفة حضانةمكيفة وتحت شدة ضوئية مقدارها 5000 لوآس لمدة 16 ساعة يوميا وعلى درجة حرارةدرجة ± 24 2مئوية نهاراً‏ و ± 22 2درجة مئوية ليلاً.‏أما في مرحلة الزراعة الثانوية،‏ فقد تم أخذ النموات المخبرية الناتجة عن الزراعة الأوليةوتجزئتها إلى عقل ساقية مخبرية دقيقة وزراعتها ضمن أوساط جديدة من المحاليل الغذائية التي نجحتعليها الزراعة الأولية،‏ في حين تمت إعادة زراعة العقل الساقية الأولية بعد أخذ النموات الحديثة منها٧

صغيرة من البيتموس المضغوط القابل للتحلل والحاوية على خلطة زراعية معقمة حرارياً‏ ومؤلفة منبتموس و فيرميكولايت بنسبة ١:٣.رويت النبيتات بمحلول مغذي مخفف من الأملاح المعدنية(1962يحتوي على مضاد فطريبنلايت )بنسبة ١%)،وتمت تغطيتها بطبقةMurashige and Skoog)رقيقة من البولي إثيلين الأبيض الشفاف وذلك بشكل ناقوس لتأمين قدر عال من الرطوبة الجوية وهي فيالبيت الزجاجي.‏ تم فتح الغطاء بعد شهر من الزراعة ومتابعة العناية بالنباتات الجديدة من ري وتسميدومكافحة ثم نقلت إلى أصص بلاستيكية أآبر حجماً.‏أستخدم في هذه التجارب التصميم الكامل العشوائية بأربع مكررات يضم آل منها ‎20‎أنبوباختبار،‏ ثم أخذت القراءات حول تأثير المعاملات على النسبة المئوية لتفتح البراعم الجانبية،‏و عددالنموات المورقة ‏/العقلة العقدية،‏ ومتوسط طول النموات بعد 6 أسابيع من الزراعة الأولية أو الثانويةماعدا مرحلة التجذير فقد أخذت القراءات بعد أربعة أسابيع.‏ ثم حللت البيانات إحصائيا على الحاسوبباستخدام البرنامجCostatو تحليل التباين ANOVAلحساب أقل فرق معنوي (L.S.D.) بين متوسطاتتأثير المعاملات على الصفات المدروسة على المستوى Gomez) و 1984). Gomez(% 5)إنتاج الكدب (Callus) وإعادة النمو(‏Regeneration‏)‏تم في هذه المرحلة استخدام العديد من الأجزاء النباتية الناتجة مخبريا(‏ سلاميات،‏ أوراقوجذور).‏ حيث زرعت المادة النباتية على بيئة زراعية تحتوي على المحلول المعدني (MS) مضافا لهالمحلول الفيتامينيNavarro) وآخرون ،(197530 جرام/لتر سكاروز و8 جرام‏/لتر آجار-‏ آجار0.25)بالإضافة إلى تراآيز مختلفة من (0 NAA ،2 ، 1 ، 0.5 ، 0.25 ملجرام/لتر)‏ و BAPملجرام/لتر)‏ ووضعت الزراعات في الظلام وبعد ستة أسابيع تم أخذ القراءات لتحديد النسبة المئويةلتشكل الكدب.‏ومن أجل إعادة النمو(Regeneration)فقد تم زراعة الكدب (Callus) الناتجة سابقا بمختلفأنواعها على وسط مغذي يختلف عن الذي نتجت فيه،‏ برفع نسبة السكر إلى 4% واستخدام الزياتين٩

، 1 2 ، ملجرام/لتر)‏ و ) NAA( Zeatine)بتراآيز مختلفة0.5 ملجرام/لتر)‏ على الظلام أو0.5)بوجود 16 ساعة ضوء يوميا وبعد شهر من الزراعة يتم فحص العينات بمساعدة مكبرة ضوئية مزدوجة(Stereomicroscope) لتحديد عدد العينات التي أعطت براعم عرضية وعدد البراعم العرضيةالمتشكلة في آل عينة.‏ وقد استمرت هذه المرحلة أربعة أشهر حيث أجريت عدة زراعات ثانوية للكدببمعدل واحدة آل شهر حيث استطاع الكدب الجنيني إعطاء براعم عرضية و نموات ساقية متطورة.‏أستخدم في هذه التجارب التصميم العاملي آامل العشوائية (Completely Randomized(Factorialبخمسة مكررات آل منها طبق بتري15) ‎100‎مم x (يحتوي على سبع عينات نباتية لكلمعاملة ويتم مقارنة المتوسطات باستخدام تحليل التباين ANOVAلحساب أقل فرق معنوي(L.S.D.)بين متوسطات المعاملات على المستوى.(% 5)معاملات وقف الانقسام الخلويAntimitoticsتم في هذه المرحلة استخدام أجزاء نباتية مختلفة ناتجة ضمن الأنابيب vitro) (In من نوعين منالجاردينيا thunbergia) :(G.jasminoides, G.عقل ساقيةفيها اثنين منالبراعم الجانبية،‏عقلورقية،‏عقل جذريةوسلامياتساقية،‏حيث تم معاملة هذه الأجزاء النباتية بتراآيز مختلفةلمواد معيقةللانقسام الخلوي:‏ الكولشيسينColchicine) ( 125) 500 ،250 ، و 1000ملجرام/لتر)‏أو اوريزالينملجرام/لتر (ولمدة زمنية مختلفة،2) 8 ،4 يوم)‏ .(Oryzalin) 5) 20 ،10 ، و 40MSومن أجل ذلك وضعت العقل الساقيةفي وسط سائل يحتوي علىالوسطمضافا لهDimethylsulfoxide%1.5(Orizaline)آولشيسين Colchicine) (أو اوريزالينبوجودمنالذي يساعد على دخول مادة التضاعف إلى داخل الأنسجة النباتية،‏أما شاهد التجربة( DMSO )فيحتوى على الوسط الغذائي و‎%1.5‎ DMSO فقط،‏وذلكفي دورق(‏ (Erlenmeyerعلى جهازهزاز بسرعة(‏( rpm 60في غرفة حضانة مكيفة بعيدا عن الضوء وعلى درجة حرارةدرجة ± 24 2مئوية نهارا و ± 22 2درجة مئوية ليلا .١٠

وبعد انتهاء زمن المعالجة يتم غسل الأجزاء النباتية ثلاث مرات بماء مقطر ومعقم ثم تعاد0.5زراعتها في أطباق بتري تحتوي على بيئة صلبهمؤلفة منMS مضافا لهو‎1‎ ملجرام‏/لتر منIAA و BAP على التوالي لتشجيع نمو وتطور البراعم الجانبية إلى نموات جديدة،‏ وذلك بمعدل 6أطباق بتري لكل معاملة ويحتوي آل منها على5 عقل ساقية.‏آمايتم فصل بعض البراعم الجانبية(‏( من الأنسجة وفحصها تحت المكبرة لتحديد النسبة المئويةلموتالبراعم تحت تأثيرadjacent budsترآيز المواد المستخدمة لوقف الانقسام الخلوي.‏ وبعد8 أسابيع من الزراعة تخضع النموات الناتجة إلىاختبار التضاعف.‏إضافة لذلكوفي المرحلة الأولية لإنتاج الكدبفقد تم معالجة بعض الأجزاء النباتية‏(أوراق،‏20،10)500سلاميات ساقية وعقل جذرية)‏ (250،بالكولشيسينملجرام/لتر)‏والأوريزالين2 و 0.254ملجرام/لتر)‏ ، 2و ولمدة8 يوم قبل زراعتها على وسطMS مضافا لهملجرام/لتر لكلمن NAA وBAP على التوالي لتحريض تشكل الكدب حيث أستخدم لكل معاملة6 مكررات ممثلةبأطباق بتري يحتوي آل منها على سبع عينات نباتية،‏وتحديد النسبة المئوية لتشكل الكدبوبعد6 أسابيع من الزراعة يتم فحص العينات.ومن أجل إعادة النمو فقد تم زراعة الكدب الناتجة عن السلاميات الساقية ولعدة زراعاتثانويةZeatine و0.52على وسطMS مضافا لهملجرام و‏/لتر لكل منNAA على التوالي وذلكبمعدل زراعة آل شهر،‏ وبعد ذلكنقلت الكدب الجنينية بعمر ثلاثة أشهر على نفس الوسط مضافا له8 يوم)‏20 ملجرام/لتر)‏ 2) ، 4،، 10)500 ملجرام/لتر)‏الكولشيسين 250) ،الأوريزالين أوولمدة7وذلك في المرة الأخيرة للزراعة الثانويةقبل إعادة النمو و بمعدل5 أطباق بترييحتوي آل منهاآدبلكل معاملة.‏2(pH= 5.5)آل ضبطتالأوساط المستخدمة علىرقم هيدروجينيقبل إضافة‏/لتر جرامفيتاجيل (Phytagel) مارآة(Sigma) وعقمت لمدة20 دقيقة على الدرجة‎121‎ مئوية بواسطة المعقم١١

الرطب، (Autoclave)أما الكولشيسين فقد ذوب في ماء مقطر والأوريزالين في آحول ترآيزوآلا المحلولين تم تعقيمهما بالفلتره وإضافتهما للوسط بعد تعقيمه.‏،%٧٠(Ploidy level)تحديد تم لقدمستوى الصيغة الصبغيةأوالتغيرات الناتجة في النمواتFlowالمخبرية عناستخداممعيقات الانقسام الخلوي‏(الكولشيسين والأوريزالين)‏جهاز بواسطةPA) ( من شرآة Partec وباستخدام محاليل عالية التوضيح لل DNA في نواة الخليةCytometry(Partec 05-5002 )( High Resolution DNA Kit Type P)إنتاج شرآة بارتك أيضا‏،حيثيؤخذ جزء من ورقة بمساحة– 0.5‎1‎سم‎٢‎ وتقطع بواسطة شفرة حلاقة ضمن 0.4 مل من محلول لعزلوتترك لمدة5 دقائق ثم تلون الأنوية بإضافة1.6 مل منالأنوية buffer) ( Nucleic extractionمحلول ملون buffer) ( Stainingالذي يوضح بشكل عالي لمجموع ال DNA داخل النواة،‏ثم يمررالمحلول عبر فلتر من خيوط النايلون بقطر 50 ميكرومول.‏ أما الإشعاع الضوئي النسبي لمجموع DNAالنواة فيتم تحليله بواسطة جهاز قياس التدفق الضوئي الخلوي عبر فلتر ضوئي متوافق مع الملونالمستخدم،(Partec 05-5002 )وفي آل مرة يتم فحص ال DNAلحوالي 5000 نوية.‏تظهر النتائج على شكل خطوط بيانية موضحة بقمة (Peak) واحدة أو قمتين أو أآثر حسب حالةالانقسام الخلوي من جهة ودرجة التغير أوالتضاعف من جهة ثانية بالإضافة إلى عدد الخلايا المختبرةCount) (Total والمتوسط(Mean) ومعامل التباين.(CV%)عندما يكون عدد النموات المختبرة والناتجة عن البراعم الجانبية أو الناتجة من الكدب( Callus)آافية يتم استخداملتحديد1989) التباين بحساب أقل فرق معنوي علىSAS)SAS/STATالمستوى.(5%)١٢

نفإأولاً-‏ الإآثار المخبريالنتائج والمناقشةلدى دراسة الشروط المخبرية والبيئات اللازمة لإآثار الجاردينيا تبين بأن النسبة المئوية المثلى1.5 و‎2‎لتفتح البراعم الجانبية في الزراعة الأولية آانت بوجود التراآيز العالية من BAP،1 )ملجرام/لتر)‏حيث لا يوجد فرق معنوي بين تأثير الترآيز ين1 و1.5 ملجرام/لتر في حين يتفوق عليهماالترآيز 2 ملجرام/لتر في آلا النوعين المدروسين.‏ في حين أن الترآيزالتراآيز عدا الترآيز2 ملجرام/لتر1.5 ملجراممتفوق على آافة‏/لتر من حيث تأثيره على متوسط عدد النموات الناتجة بالعقلة.‏ أمابالنسبة إلى طول النموات فقد تفوق آل من الشاهد و التراآيز المنخفضة على التراآيز العاليةملجرام/لترآما هو موضح في الجدول رقم(‏‎1‎ ).جدول1.5 و‎2‎رقم (١):تأثير ترآيز السيتوآينين( BAP)%ترآيزBAP(mg/l)لتفتح البراعمGardeniathunbergiaGardeniajasminoidesفي الوسط المغذي على نجاح الزراعة الأولية.‏متوسطمتوسططول النمو ‏/سمعدد النموات ‏/العقلةGardeniathunbergiaGardeniajasminoidesGardeniathunbergiaGardeniajasminoides1.9 a1.7 a1.7 a1.3 ba1.1 bc0.5 cL.S.D على2.4 a2.1 ba2.0 ba1.7 bc1.5 c0.8 d1.1 d1.6 c2.3 b2.6 ba2.9 a3.1 a1.2 e1.7 d2.1 c2.3 cb2.4 b2.7 a19.1 d22.5 d58.4 c80.1 b86.2 ba89.9 a25.3 d33.8 d60.4 c86.7 b93.3 ba100.0 a0.000.250.501.001.502.00المعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار.% 5 المستوىتعطي العقدةالساقية عادة العديد من النموات المورقة ‏،نتيجة تفتح البراعم الجانبية الثانوية حسبما ذآره Altmanو) 1978) أو نتيجة التفرع الثانوي حسب مشاهدةNozeran وآخرون(‏ (1983Gorenوحسب .(1988) Gaspar تأثير ترآيز السيتوآينين قليل جدا على مستوى القمة النامية الساقية من(1978)أجل الإآثار ضمن الأنابيب،‏ وقبله أوضح KodaوOkazawaبأن تكون السيتوآينين يتم فيمستوى القمة النامية الجذرية،‏ لذلك فإن العقلة الساقية تتطلب ترآيز معين من السيتوآينين المضاف إلىالوسط المغذي لتطورها.‏ وهكذا يمكن إآثار الجاردينيا بمعزل عن استخدام الأوآسين ولكن بنسبة نجاح١٣

منخفضة حيث أن استخدام بنزيل آمينو بورين(BAP)بمفرده يؤمن نسبة تفتح عالية للبراعم الجانبيةولكن مع وجود بعض التدني في نوعية النموات الناتجة وطولها لذلك آان لابد من استخدام الأوآسينبالمشارآة لمؤازرة دور السيتوآينين في الإآثار وآذلك تحسين نوعية النموات الناتجة.‏ وتوضح القيمالمدونة في الجدول(2) عدموجود فروق معنوية بين تأثير عدم وجود الأوآسين أ و وجوده بتراآيز0.5منخفضة من أندول أسيد أسيتيكملجرام/لتر)‏في حين لعبت التراآيز العاليةIAA) ( 0.25) و0.75) و 1ملجرام ‏/لتر)‏ دوراً‏ سلبياً‏ على تفتح البراعم مع تشكل الكدب على قواعد العقل.‏ أما متوسطعدد النموات فقد تناقص مع وجود الأوآسين حيث تفوق الشاهد على آافة التراآيز،‏ لكن متوسط طولالنموات قد ازداد بوجود الأوآسين في الوسط المغذي وآان أفضلها على 0.5و0.75 ملجرام ‏/لترحيث لا يوجد فرق معنوي بينهما في حين تفوقا معنويا على آل من الشاهد و0.25ومن هنا . ملجرام/لترنستنتج ضرورة وجود السيتوآينين و الأوآسين معا في الوسط المغذي،‏ حيث آان أفضلها عند مشارآة)BAP و ( IAA على التراآيز 1 و 0.5 ملجرام/لتر على التوالي،‏ للحصول على أفضل النتائج فيمرحلة الإآثار وعلى الأخص نوعية النموات الناتجة والصالحة للتجذير.‏جدولتأثير ترآيز الأوآسين(IAA)رقم (٢):بوجود ‎١‎ملغ/لتر من . BAP%GardeniajasminoidesترآيزIAA(mg/l)لتفتح البراعمGardeniathunbergiaفي الوسط المغذي على نجاح الزراعة الأوليةمتوسطعدد النموات ‏/العقلةGardeniajasminoidesGardeniathunbergiaGardeniajasminoidesمتوسططول النمو ‏/سمGardeniathunbergia1.3 c1.8 c3.5 a3.1 ab2.6 b1.7 d3.0 c4.1 a3.8 ab3.4 bc2.6 a2.5 ab2.3 b1.6 c1.5 c2.3 a1.8 b1.8 b1.7 cb1.6 c73.3 b80.1 a86.3 a84.3 a77.2 ab86.7 a88.3 a93.3 a75.0 b63.3 c0.000.250.500.751.00المعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.D علىالمستوى .% 5ونذآر هنا بأن قاعدة النموات المورقة الناتجة هي أآثر حيوية من المناطق الوسطى والعليا،‏ لذلكاستخدمت التقنية بقص هذه النموات بعد ترك قواعدها على العقلة الأولية)العقلة الأم)‏ والتي أعيدتزراعتها على وسط جديد يحتوي علىو0.5 ملجرام/لتر(‏ ،( IAAوالذي سمح1 ملجرام/لتر BAP) (١٤

بتطور جيل جديد من البراعم الجانبية إلى نموات مورقة على هذه القواعد،‏ والتي قادت إلى تحقيق زراعةمتكررة للعقلة الأم على وسط جديد 6 أسابيعآل‏(دورة زراعية)‏ واستمرت حتى9 دورات.‏وهذهسمحت بالحصول على ما يسمى أرومة إآثار حقيقية من الدورة الثالثة بالإضافة إلى رفع مردود العقلة منالنموات المورقة،‏ حيث تقطع النموات الصالحة للتجذير وتترك قواعدها على العقلة التي يعاد زراعتها آل6 أسابيع.‏وهكذا فإن متوسط ما تنتجة العقلة الواحدة من النموات المورقة الصالحة للتجذير حوالي22 نموبالنسبة للنوعو22.6 للنوع G.thunbergiaفي الدورة السابعة حيث لا يوجدG. jasminoidesفروقات معنوية بين الدورات الثلاثة الأخيرة (7 و‎8‎ و‎9‎‏).‏ في حين توجد فروقات معنوية واضحة بينالدورات من الأولى وحتى السابعة،‏ لذلك ينصح بتجديد الزراعة المخبرية بعد الدورة السابعة أي بعدحوالي 10 أشهر من الزراعة الأولية الشكل رقم.(1)الشكل(‏‎١‎‏)‏ تأثير عدد دورات الاآثار على مردودية العقلة الأولية منالنموات الحديثة المورقة1302342520567عدد النموات1510895TotalRootingTotalRooting0G.thunbergiaالأنواعG.jasminoides١٥

ولومن اجل الحصول على نباتات قادرة على الحياة خارج الأنابيب من جهة والحصول على الجذورالمخبرية التي ستستخدم في الحصول على الكدب اللازمة لإجراء التضاعف لاحقاً‏ من جهة ثانية،‏ فقدزرعت النموات ‏(بطول ‎3‎سم)‏ الناتجة عن مرحلة الإآثار بعد إزالة الأوراق السفلية عن قاعدتها علىوسط للتجذير يختلف عن الوسط السابق الذي نتجت عليه بتخفيض ترآيز العناصر الكبرى إلى النصفوآذلك السكاروز إلى20 جرام/لتر ووجود الأوآسين (IAA) على تراآيز مختلفة.‏يوضح لناالشكل (2)تأثير تراآيز الأوآسين IAA على النسبة المئوية للتجذير.‏ لقد تفوق0.750.5الأوآسينبكافة تراآيزه على الشاهد آما لم يكن هناك فرق معنوي بين الترآيزينو1.5ملجرام/لتر.‏ و لكنهما تفوقا على الترآيز 0.25ملجرام/لتر،‏ في حين التراآيز العالية(1 و ملجرام‏/لتر)‏ متفوقة على التراآيز الأخرى دون وجود فرق معنوي بينهما،‏ وبذلك يكون الترآيز‏/لتر 1 ملجرامو‎88.9‎ %من الأوآسين هو الأفضل حيث نسبة التجذير.% 98.3للنوعG.jasminoides للنوع. G.thunbergiaوقدحظ تضخم الجذور على التراآيز العالية(1 و 1.5 ملغ/لتر)،‏ لذلك استخدامالفحم النشط بترآيز2ملجرام ‏/لتر،‏ والذي قلل من عدد الجذور ومن تضخمها مع تطور الجذور الثانوية.‏الشكل (٢) تأثير ترآيز الأوآسين IAA على النسبة المئويةللتجذيرG.jasminoidesG.thunbergia1201008060402001.510.750.50.250IAA (mg/l)١٦

ثانيا-‏ إنتاج الكدب(‏Callus‏)‏تم في هذا المرحلة دراسة الشروط اللازمة للحصول على الكدب من أجزاء نباتية مختلفة و الناتجةضمن الأنابيب،‏ حيث زرعت المادة النباتية في أطباق بتري تحتوي على المحلول المعدنيله تراآيز مختلفة من نفتالين حمض الخليك(‏NAA‏)‏ ووتشير النتائج المدونة في الجدول(MS) مضافا0.25ملجرام/لتر من بنزيل آمينو بورين.(BAP)(3)إلى أن الأجزاء النباتية المستخدمة متفاوتة في استجابتها لتشكيلالكدبفقد تفوقت آل من الأوراق والجذور على السلاميات في آلا النوعين،‏ آما إن تأثير منظمات النموتناسب طرديا مع زيادة الترآيز،‏ فالتراآيز العالية للأوآسين (1 والنتائج بوجود2 ملجرام0.25 ملجرام‏/لتر من.(BAP)من آدب الجذور والسلاميات.‏ و إن مشارآة منظمات النمو‏/لتر)‏ هي من أعطى أفضلوقد آانت آدب الأوراق أآثر قدرة على التكاثر والتطورNAA) (BAP, بترآيز(‏‎2‎ و 0.25ملجرام/لتر)‏ على التوالي قد أعطى أعلى نسبة لتشكل الكدب.‏ وستشكل هذه الكدب الناتجة المادة النباتيةاللازمة لاحقا لإحداث التضاعف والحصول على نباتات مضاعفة العدد الكروموزومي في نوعين منالجاردينيا.‏ وبذلك فإن مشارآة الأوآسين بتراآيز أعلى بكثير من السيتوآينين في الوسط آان له الدورالكبير في تشكل الكدب،‏ وهذا متفق مع آل منو(1992) Ohtani على الجاردينيا .Nawaرقم(‏‎٣‎‏):‏ جدولتأثير ترآيز(NAA)على تشكل الكدب(Callus)بوجودملجرام/لترمنالمتوسط00.022.649.579.697.0٠٫٢٥.(BAP)النسبة المئوية لتشكل الكدب(%)Gardenia thunbergiaGardenia jasminoidesترآيز(NAA)mg/L0.000.250.501.002.00المتوسطسلاميات00.018.238.960.297.645.803.2أوراق00.021.552.578.9100.058.704.5جذور00.020.550.188.5100.059.903.4سلاميات00.019.542.579.689.157.705.6أوراق00.025.657.384.298.466.406.6جذور00.030.255.686.396.767.204.5L.S.D.5%١٧

ثالثا-‏ إعادة النمو من الكدب (Regeneration)تم في هذه المرحلة زراعة الكدب الناتجة سابقا من أجزاء نباتية مختلفة على وسط مغذي مختلف عنالوسط السابق الناتجة عنه بنسبة السكروز(‏ %4) ووجود آل من الزياتين و .NAA وبعد أربعة زراعاتثانوية بمعدل واحدة آل شهر على الظلام أو بوجود 16 ساعة ضوء يوميا،‏ أمكن الحصول على براعم ونموات جديدة من الكدب وبنسبة نجاح مختلفة حسب نوع الكدب المستخدمة وترآيز منظمات النمووطريقة الزراعة.‏وتبين النتائج في الجدول(4)بأن إعادة النمو من الكدب الناتج عن السلاميات يتأثر بوجودمنظمات النمو في الوسط الزراعي،‏ حيث من الضروري وجود السيتوآينين فقد أمكن الحصول على نسبةمئوية مرتفعة من الكدب القادرة على إعطاء براعممع الشاهد،‏ ولكن عند مشارآة الأوآسينوصلت النسبة إلى( %54 )بوجود2 ملجرام(NAA) بترآيز0.5 ملجرام/لتر مع الزياتين‏/لتر زياتين فقط بالمقارنة(2 ملجرام/لتر)‏% 67.7في النوعG.jasminoides مقابل % 55.8في النوعG.thunbergiaNAAعلى الظلام وآذلك زادت من متوسط عدد البراعم في الكدب(4 براعم/آدب)،‏آما إن لمشارآةوالزياتين في الوسط دور فعال في زيادة النسبة المئوية لإعادة النمو وعدد البراعم المتشكلة على الضوءأيضا وفي آلا النوعين،‏ ولكن بشكل أقل مما هو علية على الظلامتشكل الكدب بوجود الضوء ولكن بشكل محدود جدا.‏.إذا هناك تأثير لمنظمات النمو علىآما وجدنا أيضا بأن استجابة الكدب لإعطاء البراعم تحت تأثير الضوء آان أقل بكثير من استجابتهاعلى الظلام حيث أن أعلى نسبة للكدب المشكلة للبراعم على الضوء لم يتجاوزالبراعم في الكدب لم يتجاوز% 92). G.thunbergiaومتوسط عددبرعم)‏ هذا بالنسبة للنوع .G.jasminoides وأقل من ذلك بالنسبة للنوع١٨

جدول تأثير ترآيز NAA) (Zeatine , على إعادة النمو(‏Regeneration‏)‏ من آدب السلاميات .ظلامضوء ‏(‏‎١٦‎ساعة)‏عدد البراعم/‏ الكدب لتشكل البراعم عدد البراعم/‏ الكدب لتشكل البراعمZeat+ NAAmg/lG.jasminoides0.0 + 0.00.5 + 0.01.0 + 0.02 .0+ 0.00.5 + 0.51.0 + 0.52 .0+ 0.5L.S.D. 0.05G.thunbergia0.0 + 0.00.5 + 0.01.0 + 0.02 .0+ 0.00.5 + 0.51.0 + 0.52 .0+ 0.5L.S.D. 0.0500.003.632.654.523.859.867.79.2300.001.921.325.120.122.555.808.3%0.01.11.62.42.03.14.02.10.01.81.92.62.83.74.21.90.00.06.28.50.00.06.65.10.00.02.67.90.01.21.64.2%:(٤)0.00.01.22.00.00.01.81.60.00.01.61.90.02.02.11.4أما عن استجابة الكدب الناتجة عن آل من الأوراق والجذور لتشكل البراعم على الظلام فقد آانتضعيفة جدا مقارنة باستجابة آدب السلاميات حيث تشير النتائج في الجدول رقم (5)لتشكل البراعم على الكدب الورقي آان أفضلها بوجودوملجرام/لتر لكل من الزياتين وبأن النسبة المئوية(NAA)% 7.60.52على التوالي،‏ حيث وصلت إلى % 27.7الجذرية القادرة على إعطاء البراعم بمعدلومتوسط عدد البراعم (2.9 برعم)‏ مقابل‏/آدب في النوعمن الكدب،G.jasminoides هذه الفروق1.6 برعممابين أصل الكدب لوحظ أيضا في النوع G.thunbergia حيث آانت استجابة الكدب الجذرية لإعادةالنمو أقل بكثير من استجابة الكدب الورقية لذلك.‏ وقد نقلت الكدب التي أعطت البراعم إلى إضاءة لمدة١٦ ساعة يوميا من أجل تطور هذه البراعم إلى نموات مورقة ضمن الأنابيب.‏١٩

جدول (٥): تأثير ترآيزالظلام.‏آدب جذريةعدد البراعم/‏ الكدب لتشكل البراعمو (NAA) على إعادة النمو من آدب الأوراق والجذور علىZeat+ NAAmg/lG.jasminoides0.0 + 0.00.5 + 0.01.0 + 0.02.0 + 0.00.5 + 0.51.0 + 0.52.0 + 0.5L.S.D. 0.05G.thunbergia0.0 + 0.00.5 + 0.01.0 + 0.02.0 + 0.00.5 + 0.51.0 + 0.52.0+ 0.5L.S.D. 0.05آدب ورقيةعدد البراعم/‏ الكدب لتشكل البراعم0.000.0012.6014.5011.6013.8027.7003.230.00.010.314.110.112.525.80.43%0.000.001.101.401.202.102.900.960.000.001.201.601.901.702.200.68(Zeatine)%0.00.000.00.003.21.102..51.300.00.003.11.008.61.601.20.480.00.000.00.003.61.004.91.200.00.002.11.006.42.202.10.26٢٠

رابعا-‏ معاملات وقف الانقسام-١في البراعم الجانبية للعقل الساقيةعقل ساقية مخبرية آانت قد عوملت بالكولشيسين والأوريزالين بتراآيز مختلفة فترات زمنيةمختلفة ثم زرعت ضمن أطباق بتري تحتوي على أوساط غذائية صلبة ملائمة لتطور البراعم الجانبية إلىنموات مورقة،‏ وقد وجد بأن التراآيز العالية من الكولشيسين(‏‎1000‎ ملجرام ‏/لتر)‏و الأوريزالين40 )ملجرام ‏/لتر)‏ والزمن الطويل للمعالجة) 8 يوم)‏تؤدي إلى موت نسبة عالية من الأنسجة النباتية وعلىالأخص البراعم الجانبية% 46.7 ( ولكل منG.jasminoidesوG.thunbergia على%53 )التوالي بوجود الكولشيسين في حين آان التأثير أآثر بوجود الأوريزالين % 63.3 و‎56.7‎ % (لكل من)على التوالي وهذا ما يوضحه الجدولين6 و .7G.thunbergia و G.jasminoidesجدول (٦): تأثير ترآيز الكولشيسين (Colchicine) وزمن المعالجة على النسبة المئوية لموت العقلالساقية المخبرية للجاردينيا.‏المتوسط(ترآيز الكولشيسين زمن المعالجة‏(يوم)‏15.6a10.014.722.012.2a08.011.317.3100040.046.753.336.740.046.743.9d50006.716.730.003.313.323.315.6cP= 0.055.494.253.47mg/l)25003.310.120.000.003.313.308.3b1250.00.06.70.00.03.31.7a0.0G.jasmioides0.020.040.08G.thunbergia0.020.040.080.0a(L.S.D)المتوسطأقل فرق معنويبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5إن الترآيز السمي لمعيقات الانقسام تجلى بوضوح مع زيادة الترآيز وزيادة زمن المعالجة،‏ آماإن التراآيز المنخفضة للكولشيسينوالأوريزالين(5 ملجرام/لتر)‏لم يختلف تأثيرها(125 ملجرام/لتر)‏عن الشاهد.‏ أما بالنسبة لزمن المعالجة فقد تفوقت المعالجة لمدة 8 أيام على آل من2 و4 أيام حيث أن هذه٢١

الأخيرة لا يوجد فروق معنوية بينها في حالة الكولشيسين في حين آان هناك فروق معنوية بين الأزمنةالثلاثة عند استخدام الأوريزالين ‏(جدول.( 7التحمل لهذه المواد المستخدمة آل على حده.‏ولم توجد أي فروق معنوية بين النوعين المدروسين في مدىجدول (٧): تأثير ترآيز الأوريزالين (Orizaline) وزمن المعالجة على النسبة المئوية لموت العقلالساقية المخبرية للجاردينيا.‏المتوسط(ترآيز الأوريزالين زمن المعالجة‏(يوم)‏17.33a08.6718.0025.3315.33a07.3316.0022.674023.350.063.320.046.756.743.33d2013.320.026.713.316.726.719.44cP= 0.057.625.94.82mg/l)1006.716.620.03.313.316.712.77bc500.003.316.600.003.313.36.11ab0.0G.jasmioides0.020.040.08G.thunbergia0.020.040.080.0a(L.S.D)المتوسطأقل فرق معنويبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5بالإضافة لذلك فقد آان لهذه المواد تأثير على مردود هذه العقل من النموات المورقة القابلة للحياةآما هو موضح في الجدولين8 و 9واللذين بينا أن مرود العقلة من النموات قد أنخفض مع زيادة ترآيزالمواد المستخدمة،‏ فقد تفوق الشاهد معنويا على آافة التراآيز عند استخدام أي من المواد المعيقة للانقسام،‏آما تفوقت التراآيز المنخفضة على التراآيز المرتفعة.‏ أما بالنسبة لزمن المعالجة فقد آان للزمنتأثير سلبي على المردود مقارنة بالأزمنةالمستوى8 أيام2 و% 5بين الأزمنة‎2‎ و4 أيام.‏4 أيام حيث تفوقا عليه،‏ في حين لا توجد فروق معنوية علىآما توجد فروقات معنوية بين مردود الأنواع المستخدمة بغضالنظر عن المادة المستخدمة وترآيزها حيث تفوق النوع(4.21 G.thunbergia و 3.94 نمو/عقلة)‏ علىالنوعو3.1 نمو/عقلة)‏بوجود الكولشيسين أو الأوريزالين على التوالي.‏3.25) G.jasminoides٢٢

جدول (٨): تأثير ترآيز الكولشيسين (Colchicine) وزمن المعالجة على متوسط مردود العقل الساقيةالمخبرية للجاردينيا من النموات المورقة ‏(نمو ‏/العقلة).‏المتوسط(ترآيز الكولشيسين زمن المعالجة‏(يوم)‏3.25a3.453.322.974.21b4.494.333.8110002.552.152.033.573.422.672.73a5002.622.422.284.224.123.333.16bP= 0.050.410.320.26mg/l)2503.582.922.754.304.104.073.62c1254.224.103.574.934.804.374.33d0.04.284.984.235.435.204.634.79eG.jasmioides248G.thunbergia248المتوسطأقل فرق معنوي L.S.Dبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5جدول (٩): تأثير ترآيز الأوريزالين (Oryzalin) وزمن المعالجة على متوسط مردود العقل الساقيةالمخبرية للجاردينيا من النموات المورقة ‏(نمو/العقلة).‏المتوسط(ترآيز الأوريزالين زمن المعالجة‏(يوم)‏3.10a3.243.202.873.94b4.274.113.42402.352.071.883.223.052.332.48a202.552.472.123.653.482.882.86aP= 0.050.450.350.28mg/l)103.172.802.554.234.133.373.38b53.853.703.574.834.703.904.09c0.04.284.984.235.435.204.634.79dG.jasmioides248G.thunbergia248المتوسطأقل فرق معنوي L.S.Dبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5٢٣

ABCالشكل(‏‎٣‎‏)‏ خطوط بيانيه لتحليل DNA النواة في الجاردينيا،‏ المحور الأفقي يمثل آمية ال DNAالنووي ( والمحور العمودي يوضح عدد الأنويه:‏ (A) النبات الأم الشيميرمضاعف العدد الصبغي(‏،Chimer(B) 2n.( TetraploidRFI )( C )٢٤

بعد 8 أسابيع من زراعة العقل المعالجة بمعيقات الانقسام تم فحص النموات الناتجة بواسطة جهاز( Flow Cytometry)لتحديد مستوى الصيغة الصبغية لهذه النموات وقد تبين بأن هناك ثلاث أنواع منالنموات آما هو موضح في الشكل:( 3)الأولى (A ( تمثلت بظهور قمة واحدة في الخط البيانيموقعهامماثل لموقع قمة النبات الأم على المحور الأفقي الممثل لكمية ال DNA النووي RFI) )، وهذه لم يحدثبها أي تغير على مستوى التضاعفB) ( الثانية ،تمثلت بوجود قمتين الأولى موقعها مطابق لموقع قمةالنبات الأم والثانية في موقع على مسافة مضاعفة على المحور RFI وهذه عبارة عن نموات شيميريه( Chimers)أي حدث تغير أو تضاعف العدد الكروموزومي في عدد محدد من الخلايا،‏ والفئة الثالثةC)(تمثلت بظهور قمة واحدة في الخط البياني لكن موقعها على مسافة مضاعفة من موقع قمة النبات الأم علىالمحور الأفقي الممثل لكمية ال DNA النووي( RFI).( Tetraploid)وهذه عبارة عن نموات مضاعفة الصيغة الصبغيةلقد لعب الكولشيسين دورا فعالاً‏ في إحداث تضاعف في العدد الكروموزومي إذا ما قارنا ذلك معالشاهد حيث تفوقت آافة التراآيز على الشاهد في عدد النموات المضاعفة غير أن هذه التراآيز يقل تأثيرهاعلى التراآيز العالية (1000 500 , ملجرام/لتر)‏ في حين تفوق الترآيز 250 ملجرام/لتر معنويا على آافةالتراآيز الأخرى125) 1000 ، 500 ، ملجرام/لتر)‏والتي لم تلاحظ أي فروق معنوية بينها وهذا مايوضحه الجدول رقم(‏‎10‎ ).آذلك لعب الأوريزالين دوراً‏ واضحا في إحداث التضاعف في النموات الناتجة عن العقل الساقيةالمعالجة،‏وقد وضح الجدول رقم( 11)وجود فروق معنوية بين التراآيز المستخدمة والشاهد وآذلك(40 ملجرام/لتر)‏5) و 10في حين تفوقتفوق التراآيز المنخفضة ملجرام/لتر)‏ على التراآيز المرتفعةالترآيز(‏‎10‎ ملجرام/لتر)‏ معنويا على آافة التراآيز الأخرى وأعطى أعلى نسبة للتضاعف ) % 7.86(على مستوى النوعين وآافة الأزمنة المستخدمة معاً.‏إن استخدام معيقات الانقسام آان له الدور الواضح في إحداث نسب من النموات المضاعفةتتفاوت فيما بينها حسب التراآيز في آلا النوعين المستخدمين،‏في حين بين التحليل الإحصائي عدم وجود٢٥

أي فروق معنوية بين أزمنة المعالجة في تأثيرها على النسبة المئوية للتضاعف في آلا النوعين النباتيينمعاً‏ وآذلك عدم وجود فرق معنوي بين الأنواع المستخدمة في استجابتها للتضاعف تحت تأثير آل منالكولشيسين أو الأوريزالين.‏جدول (١٠): تأثير ترآيز الكولشيسين (Colchicine) وزمن المعالجة على النسبة المئوية للنمواتالرباعية الصيغة الصبغيةالمتوسط(ترآيز الكولشيسين زمن المعالجة‏(يوم)‏5.10a4.565.275.473.50a3.323.603.5910004.345.713.572.943.222.123.65 b5006.754.914.164.092.802.594.22 bP= 0.052.361.831.61mg/l).( Tetraploids)2507.767.5913.636.205.048.498.12 c1253.968.136.003.376.944.765.53 b0.00.00.00.00.00.00.00.0 aG.jasmioides248G.thunbergia248المتوسطأقل فرق معنوي L.S.Dبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5جدول (١١): تأثير ترآيز الأوريزالين (Orizaline) وزمن المعالجة على النسبة المئوية للنمواتالرباعية الصيغة الصبغيةالمتوسط(ترآيز الأوريزالين زمن المعالجة‏(يوم)‏4.04 a4.263.644.233.56 a3.503.263.93403.700.000.002.270.000.001.00 a207.583.394.265.213.413.134.49 bP= 0.051.991.541.26mg/l).( Tetraploids)1006.5906.5811.2906.5605.5610.597.86 c53.458.265.613.457.355.945.68 b0.00.00.00.00.00.00.00.0 aG.jasmioides248G.thunbergia248المتوسطأقل فرق معنوي L.S.Dبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5٢٦

لم يقتصر تأثير ترآيز معيقات الانقسام على إعطاء نموات مضاعفة الصيغة الصبغية بل آان لهادور أخر تجلى بإعطاء نموات شيميرية اختلفت نسبتها حسب المادة المستخدمة وترآيزها،‏ والتي ظهرتبشكل قمتين على محور حساب العدد الكروموزومي في الشكل.( 3)ويوضح لنا الجدول رقمبان 12) (للكولشيسين تأثير مختلف على النسبة المئوية للنموات الشيميرية حسب الترآيز المستخدم،‏ فعند أخذ آافةالمعاملات معا بعين الاعتبار نحد بأن الترآيز(‏‎1000‎ ملجرام/لتر)‏ قد تفوق على آل من الشاهدوالترآيز(‏‎125‎ ملجرام/لتر)‏ في حين لا توجد أية فروقا معنوية بين التراآيز العالية بتأثيرها على إنتاجالنموات الشيميرية،‏ أما عن الفرق بين الأنواع في استجابتها لمعيقات الانقسام فقد تفوق النوعG.thunbergia على النوع G.jasminoides حيث وصل متوسط النموات الشيميرية للنوع الأول(% 9.54)مقابل(% 6.43)، للنوع الثانيفي حين لا توجد أي فروق معنوية بين أزمنة المعالجة الثلاثةالمستخدمة.‏ هذه النتائج آانت مشابهة جدا لتأثير الأوريزالين على إنتاج النموات الشيميرية،‏ فقد تفوقالترآيز العالي(40 ملجرام/لتر)‏معنويا على آافة التراآيز الأخرى حيث وصلت النسبة إلى( % 15.79)مقابل(8.23 %) عند الترآيز (5 %)، وآذلك تفوق النوع G.thunbergia معنويا على النوعG.jasminoides في إنتاج النموات الشيميرية،‏ في حين لم يتفوق أي من أزمنة المعالجة الثلاثة8 يوم)‏ في تأثيرها على إنتاج هذا النوع من النموات آما هو موضح في الجدول رقم، 4 ، 2).( 13)وبشكل عام نجد بأن معيقات الانقسام آان لها دور واضح بتأثيرها على نسبة النموات الرباعيةالصيغة الصبغية وآذلك نسبة النموات الشيميرية،‏ آما إن الترآيز العالية آان لها الدور الأآثر تفوقا فيإنتاج النموات الشيميرية وعلى العكس من ذلك في إنتاج النموات الرباعية حيث تفوقت التراآيز الدنيا،‏ آمالم نلحظ أي دور للنوع النباتي في استجابته للتضاعف في حين تجلى هذا الدور في إنتاج النمواتالشيميرية،‏ أما عن أزمنة المعالجة فلم نلحظ أي تأثير لها على إنتاج النموات الشيميرية أو المضاعفة.‏٢٧

جدول (١٢): تأثير ترآيز الكولشيسين (Colchicine) وزمن المعالجة على النسبة المئوية للنمواتالشيميريةالمتوسط(ترآيز الكولشيسين زمن المعالجة‏(يوم)‏0 9.45b08.9510.3709.0306.43a06.4406.8306.01100010.3214.6317.0008.1111.8112.7012.43c50013.5912.6610.6110.8508.4006.6010.45bcP= 0.053.412.622.16mg/l)25012.1613.1110.4207.3807.4806.499.51bc.( Chimeric)12508.7011.4307.1405.8806.5404.267.31b0.00.00.00.00.00.00.00.0aG.jasmioides248G.thunbergia248المتوسطأقل فرق معنوي L.S.Dبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5جدول (١٣): تأثير ترآيز الأوريزالين (Oryzalin) وزمن المعالجة على النسبة المئوية للنمواتالشيميريةالمتوسط(ترآيز الأوريزالين زمن المعالجة‏(يوم)‏10.58b10.9311.0709.7407.89a08.0407.7507.874016.2116.5119.112.9713.2416.8315.79c2015.3813.1611.2911.4809.2608.2411.47bP= 0.053.652.832.31mg/l)1013.6413.5610.6409.3809.0907.8110.7b.( Chimeric)509.4112.127.6906.5507.1406.458.23b0.00.00.00.00.00.00.00.0aG.jasmioides248G.thunbergia248المتوسطأقل فرق معنوي L.S.Dبين التراآيزبين الأزمنةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في العمود الواحد أو الصف الواحد ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.Dعلى المستوى %. 5٢٨

-٢في الكدب و النموات الناتجة عنها:‏لقد استخدمت معيقات الانقسام في هذا الجزء من البحث بشكلين:الشكل الأول بمعالجة العيناتالنباتية بمعيقات الانقسام قبل زراعتها على الوسط المشجع لتشكل الكدب،‏ والشكل الثاني بإضافة معيقاتالانقسام لوسط الزراعة في المرحلة ما قبل النهائية من إعادة النمو.‏ هذا وقد لعبت معيقات الانقسامالمستخدمة قبل الزراعة دوراً‏ سلبياً‏ في تشكل الكدب حيث آانت نسبة السلاميات المعالجة بها و التيأعطت الكدب بعد الزراعة على MS أقل من تلك السلاميات التي أقتصر محلول المعالجة فيها على الماءالمقطر و DMSO بنسبة 1.5. ويبين لنا الجدول(14)بأن المعالجة بالكولشسين مهما آان الترآيز قدأدت إلى انخفاض نسبة الكدب المتشكلة مقارنة بالشاهد حيث تفوق الترآيز 0 ملجرام/لتر على آل منالترآيزين250 و500 ملجرام/لتر والتي لا توجد أي فروق معنوية بينها،‏ هذا التفوق انطبق أيضا علىالنسبة المئوية للكدب التي أعطت نموات جديدة وآذلك متوسط عدد النموات في الكدب الواحد في آلاالنوعين المدروسين ما عدا متوسط عدد النموات في آدب النوعG.thunbergia حيث يقل المتوسط معزيادة الترآيز فقد تفوق آل من الشاهد و‎250‎ ملجرام/لتر على الترآيز‎500‎ ملجرام/لتر.‏أما بالنسبةلأزمنة المعالجة فلم نجد أي فروق معنوية بينها من حيث تأثيرها على النسبة المئوية لتشكل الكدب والنسبةالمئوية للكدب المعطية للنموات ولا متوسط عدد النموات،‏ وآذلك لا توجد فروق معنوية بين الأنواعالمدروسة في استجابتها لتشكل الكدب وآذلك متوسط عدد النموات في حين تفوق معنويا النوعG.jasminoides على النوع G.thunbergia بالنسبة المئوية للكدب القادرة على إعطاء نموات فقط.‏أما الأوريزالين فقد ازداد تأثيره بازدياد الترآيز والذي تجلى بتناقص النسبة المئوية لتشكل الكدبوآذلك نسبة الكدب المنتجة للنموات ومتوسط عدد النموات في الكدب،‏ حيث تفوق معنويا الترآيز‎20‎ملجرام/لتر على الشاهد وآذلك على الترآيز‎10‎ ملجرام/لتر الذي تفوق بدوره على الشاهد أيضا بالنسبةلكافة الدراسات وعلى مستوى النوعين المدروسين،‏ هذا بالنسبة لتأثير ترآيز الأوريزالين،‏ أما عن تأثيرزمن المعالجة فلا توجد أي فروق معنوية بين الأزمنة الثلاثة المستخدمة في تأثيرها على آافة الدراسات،‏وآذلك لا توجد فروق أيضا بين الأنواع النباتية المستخدمة في استجابتها للأوريزالين إلا فقط على مستوى٢٩

النسبة المئوية لتشكل الكدب حيث تفوق النوع G.jasminoides على النوعيوضحه الجدول رقم، G.thunbergia( 14)وهذا ماوالذي يبن لنا أيضا بأن سمية الأوريزالين على الأنسجة النباتية المستخدمةآانت عالية وخاصة على التراآيز العالية حيث انخفضت النتائج إلى أآثر من النصف عند الترآيز‎20‎ملجرام/لتر مقارنة بالترآيز‎10‎ ملجرام/لتر وأآثر من ذلك بكثير إذا ما قورنت بالشاهدولكن نتيجة فحص النموات الناتجة باستخدام جهاز ال(0 ملجرامFlow Cytometry‏/لتر).‏لم تبين وجود أي تغير فيهذه النموات فقد ظهرت آلها بقمة واحدة على محور آمية ال DNA في موقع مماثل لموقع النبات الأم،‏ ويعزى ذلك إلى أن هذه النموات ناتجة عن مجموعة من الخلايا التي لم يحدث فيها تغير وخاصة وإن هذهالنموات نتجت بعد عدة زراعات ثانوية للكدب وصلت إلى أربعة بمعدل واحدة آل شهر.‏جدول رقمالمادةبدون:(١٤)تأثير معيقات الانقسام على تشكل آدب Callus) ‏)السلاميات وإعادة النمو(‏Regeneration (عند إضافة معيقات الانقسام في المراحل الأولى لتشكل الكدبالترآيزنسبة تشكلالزمن الكدبيوم G.thunbergiaG.jasminoides92.4b87.380.574.980.9a88.282.267.879.4a1.9610.613.992.4c76.979.676.577.7b34.532.532.833.3a2.2138.253.8-248mg/l-250نسبة الكدبمع نموات62.2b60.656.353.856.9a60.359.148.355.9a3.836.226.6662.2c53.953.850.252.6b29.518.50.016a2.935.8612.63متوسط عددالنموات4b3.93.63.53.7a3.93.73.73.8a0.20.370.084c3.23.13.43.2b2.51.20.01.2a0.1952.091.149colchicineمتوسطمتوسط2 50048L.S.D. 5% تراآيزبدونبين البين أزمنة المعالجةبين الأنواعنسبة تشكلالكدبنسبة الكدبمع نمواتمتوسط عددالنموات4.1b 55.2b 89.1b4.2 51.2 81.34.0 49.9 78.63.8 46.3 69.94b 49.1a 76.6a3.6 55.3 82.23.4 50.1 78.23.8 41.3 65.83.6a 48.9a 75.4a4.1c 55.2c 89.1c3.5 50.0 51.23.2 49.5 66.82.8 44.2 70.13.2b 47.9b 62.7b2.3 25.4 32.60.0 0.0 29.50.0 0.0 30.10.8a 8.5a 30.7aOryzalinمتوسطمتوسط2 10482 2048L.S.D. 5% بين التراآيز*بين أزمنة المعال جةبين الأنواعالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في نفس العمود ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.D على المستوى.% 5٣٠

إن إضافة معيقات الانقسام للوسط الزراعي MS) ( في المرحلة الأخيرة لإعادة النمو،‏ آان لهتأثير على النسبة المئوية للكدب المعطية للنموات من جهة وآذلك على النسبة المئوية للنموات المضاعفة والشيميرية من جهة ثانية.‏ لقد وضحت النتائج في الجدول رقم(15)تفوق الشاهد معنويا على المعاملاتالتي تحتوي على الكولشيسين في إنتاج الكدب المعطي للنموات،‏ ولكن لا توجد فروقا معنوية بين ترآيزيالكولشيسين(250 و 500 ملجرام‏/لتر)‏ المستخدمين بتأثيرهما على النسبة المئوية للكدب المنتجة للنموات،‏في حين تفوق الترآيز 500 ملجرام/لتر على الترآيز‎250‎ ملجرام/لتر وعلى الشاهد بإنتاج النمواتالمضاعفة الصيغة و النموات الشيميرية،‏ في حين لم تلحظ أي فروق معنوية بين أزمنة المعالجة بتأثيرهاعلى آافة المعايير المدروسة.‏لقد أبدى الأوريزالين فاعلية أقوى من الكولشيسين حيث أن النسبة المئوية للكدب المنتجة تناقصتآثيرا عند الترآيز‎20‎ ملجرام ‏/لتر والتي وصلت إلىمقابل %1663 و % 67.7 عند الترآيز 10 و 0ملجرام/لتر على التوالي،‏ وبذلك فقد تفوق الشاهد(‏‎0‎ ملجرام/لتر)‏ معنويا على آل من الترآيزينملجرام/لتر وآذلك تفوق الترآيز10 و 2010ملجرام/لتر معنويا على الترآيز‎20‎ ملجرام/لتر بالنسبة للكدب المنتجةللنموات.‏ أما بالنسبة لإنتاج النموات المضاعفة فقد تفوق الترآيز 10 ملجرام/لتر معنويا على آل من الشاهدوالترآيز20 ملجرام‏/لتر الذي تفوق بدوره على الشاهد،‏ في حين لا توجد فروق معنوية بين ترآيزيالأوريزالين المستخدمين واللذين تفوقا معنويا على الشاهد بإنتاج النموات الشيميرية،‏ آذلك لا توجد أيفروق بين أزمنة المعالجة بتأثيرها على آل من النسبة المئوية للكدب المنتجة للنموات والنسبة المئويةللنموات الشيميرية وآذلك المضاعفة.‏٣١

G.jasminoidesجدول رقم (١٥):المادةتأثير معيقات الانقسام على إعادة النمو(‏Regeneration ( من آدب سلامياتونسبة النموات المضاعفة الصيغة والشيميرية عند إضافة معيقات الانقسام في المراحل الأخيرة لإعادة النمو%0a22.6b25.9c1.1629.380a31.3b31.9b1.3540.62%الترآيزالزمنيومنسبة الكدبمع نمواتعدد النمواتالمختبرةعدد النمواتالرباعيةعدد النمواتالشيميرية02019185714221652009221445060900150a20.2b32.3c1.0536.70a25c14.9b0162015511129256500618123603040071009288722527765592011006145381442225004767.7b60.655.250.155.6a61.255.649.855.5a2.3913.4667.7c50.172.368.763.7b29.518.500.016a-248248-248248mg/l-250500-1020بدونcolchicineL.S.D. 5%بين التراآيزبين الأزمنةبدونOryzalinمتوسطL.S.D. 5%بين التراآيزبين الأزمنةالمعاملات التي تحمل أحرف متشابهة في نفس العمود ليس بينها أي فرق معنوي على اختبار L.S.D علىالمستوى .% 51.4432.111.5542.46**٣٢

الاستنتاج والخلاصةلقد لعب الإآثار الخضري للجاردينيا باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة دورا فعالا في زيادة إنتاجالعقلة الساقية من النموات الخضرية المورقة و القابلة للتجذير،‏ وذلك بوجودو0.5 ملجرام/لتر من1BAP و IAA على التوالي في وسطالإآثار . MSوآان هناك دور واضحللزراعات الثانوية والتيوصل عددها إلى9في زيادة مردود هذه العقل من النموات المورقة التي تم تجذيرها مخبريا في وسط MSمضافا له1 ملجرام/لتر من IAA، حيث وصلت نسبة التجذير إلىو% 88 لكل من النوعين% 98.3G.jasminoides وG.thunbergia على التوالي.‏لقد استخدمت أجزاء نباتية مختلفة للحصول على الكدب،‏ غير أن هذه الأجزاء اختلفت فياستجابتها لتشكيل الكدب حتى ضمن النوع الواحد،‏ حيث أن نسبة النجاح آانت مختلفة،‏ وقد تفوقت الأوراقعلى آل من السلاميات والجذور في قدرتها على تشكيل الكدب.‏ آما اختلفت تراآيز الأوآسين المستخدمةضمن الوسط الزراعي في تأثيرها على تشكل الكدب حيث آان للتراآيز العالية الدور الأآبر في زيادة نسبةالنجاح،‏ وقد آان للمشارآة ما بينNAA و BAP في وسط إنتاج الكدب بالترآيز2 و 0.25 ملجرام/لترلكل منها على التوالي الدور الأآبر في نجاح الحصول على الكدب والتي وصلت إلى أعلاهاجذور وأوراق النوع(%100).G.jasminoidesفيإن زراعة الكدب الناتجة سابقا ولعدة زراعات ثانوية في وسط ملائم لإعادة النموRegeneration) ( ساعد في الحصول على نموات جديدة بعد الزراعة الرابعة،‏ وقد بينت النتائج بأن آدبالسلاميات آانت أآثر قدرة من آدب الأوراق والجذور على إعادة النمو من جديد،‏ آما إن الوسط الزراعيMS المضاف له الزياتين وNAA بترآيز‎2‎ و‎0.5‎ ملجرام/لتر على التوالي قد أعطى أفضل نسبة منالكدب القادرة على إعادة النمو،‏ والتي وصلت إلى% 67.5 وفي النوعينG.thunbergia و% 55.8G.jasminoides على التوالي.‏ وقد أظهر النوع النباتي دورا في ذلك فقد آانت استجابة النوعG.jasminoides لإعادة النمو من الكدب أعلى من النوع،G.thunbergiaآذلك الشروط الفيزيائية آان٣٣

لها دور في ذلك،‏ فقد آان للزراعة على الظلام فعالية أفضل من الزراعة تحت تناوب ضوئي بمعدل16ساعة يوميا،‏ وذلك على مستوى النسبة المئوية للكدب المعطية للنموات ومتوسط عدد البراعم فيها.‏لقد آانت هذه النتائج متفقة مع ما توصل إلية Almeida وآخرون عام 2003 م في أبحاثهم علىالحمضيات حيث بينوا بنتائجهم الدور البارز لزيادة نسبة السيتوآينين على الأوآسين في الوسط المستخدملإعادة النمو من الكدب وآذلك الدور الأآثر فعالية للزراعة على الظلام من الزراعة تحت التناوب الضوئيبمعدل 16 ساعة يوميا.‏إن لمعيقات الانقسام تأثير واضح على الانقسام الخلوي والذي يمنع تشكل الجدار الخلوي في الطورالانفصالي وهذا ما يؤثر بدوره على العدد الكروموسومي في نواة الخلية الجديدة،‏ وقد تنوع دور هذه الموادفي هذا البحث حسب المادة المستخدمة وترآيزها وزمن المعالجة بها.‏ وقد تجلى ذلك بزيادة موت البراعمالجانبية للعقل الساقية المعالجة مع زيادة ترآيز المادة المستخدمة من جهة وزيادة زمن المعالجة من جهةثانية.‏ آذلك آان لنوع المادة المستخدمة دور في ذلك فقد تفوق الأوريزالين على الكولشيسين بتأثيره علىنسبة موت الأنسجة المعالجة والتي وصلت إلى% 46.7 و % 53لكل منG.jasminoides وG.thunbergia على التوالي عند المعالجة بالكولشيسين وإلى %و% 56.7 لكل من63.3G.jasminoides والأطول من المعالجةG.thunbergia على التوالي عند المعالجة بالأوريزالين وذلك عند استخدام الزمن8) أيام)‏ ،في حين لم تظهر الأنواع النباتية فرقا في تأثرها بسمية هذه الموات والتيتجلت بموت البراعم الجانبية في العقل الساقية.‏ آما لعبت المعالجة بالتراآيز العالية لمعيقات الانقسام دوراسلبيا على مردود العقل الساقية من النموات حيث انخفض هذا المردود آثيرا بالمقارنة مع العقل المعالجةبالتراآيز المنخفضة ومع الشاهد(بدون معالجة).‏إن معالجة العقل الساقية المخبرية بمعيقات الانقسام إضافة لما سبق فقد ساعد في الحصول علىنموات ذات تغير في العدد الكروموسومي الخلوي فمنها الرباعية الصيغة الصبغية ومنا الشيميرية وبنسبمختلفة حسب المادة المستخدمة وترآيزها،‏ فقد أعطت المعالجة بالكولشيسين بترآيز منخفض250)ملجرام/لتر)‏ أعلى نسبة من النموات الرباعية الصيغة الصبغية في حين أعطت المعالجة بالترآيز العالي٣٤

(1000 ملجرام/لتر)‏أعلى نسبة من النموات الشيميرية،‏ آذلك الأوريزالين فقد آانت النسبة المرتفعةللنموات المضاعفة عند المعالجة بالترآيز المنخفضعند المعالجة بالترآيز المرتفع(10 ملجرام/لتر)‏(40 ملجرام/لتر).‏والنسبة العالية للنموات الشيميريةوبشكل عام لعب الأوريزالين دور أآثر فاعلية بإعطاءالنموات الشيميرية مقارنة بالنموات المضاعفة الذي لعب الكولشيسين دورا أآبر بإعطائها في العقلالساقية،‏ آذلك فإن النسبة العامة للنموات المضاعفة آانت أقل من نسبة النموات الشيميرية بين النمواتالكلية الناتجة.‏ هذه النتائج متقاربة مع النتائج التي حصل آل من Petersen وآخرون عام2002 علىالنوعMiscanthus sinensis واللذين نصحوا باستخدام معيقات الانقسام مع زراعة الأنسجة للحصولعلى تضاعف آروموسومي.‏لم يقتصر استخدام معيقات الانقسام على معالجة العقل الساقية قبل زراعتها في الوسط المغذي بلىتعدى ذلك إلى معالجة الأجزاء النباتية المعدة لإنتاج الكدب( Callus)وإعادة النمو منها قبل الزراعة أوفي الوسط الزراعي المستخدم لإعادة النمو من الكدب.‏ إن استخدام هذه المواد لمعالجة الأجزاء النباتيةخارج الوسط الزراعي وقبل الزراعة لم يكن له أي دور في إنتاج النموات المضاعفة أو النموات الشيميريةحيث لم نحصل على أي منها،‏ في حين آان له تأثير سلبي واضح على النسبة المئوية لتشكل الكدب تجلىبانخفاض آبير عند الأجزاء النباتية المعالجة مقارنة بالأجزاء غير المعالجة،‏ وقد طال هذا التأثير السلبيأيضا آل من النسبة المئوية للكدب القادرة على إعطاء النموات ومتوسط عدد النموات في الكدب.‏إن استخدام معيقات الانقسام في الوسط المغذي المستخدم لإعادة النمو من الكدب في المرحلةالأخيرة آان له الدور الواضح والإيجابي في الحصول على النموات المضاعفة ‏(الرباعية)‏ وآذلكالشيميرية،‏ فقد وصلت نسبة النموات الرباعية إلىالمغذي مقابلإلى% 32%25.9مقابل % 25بوجود 500 ملجرام من الكولشيسين في الوسطمن النموات الشيميرية على نفس الترآيز،‏ في حين وصلت نسبة النموات الرباعية% 31.3من النموات الشيميرية بوجود 10 ملجرام/لتر من الأوريزالين في الوسطالمغذي وهذا يوضح الدور الأقوى للأوريزالين في إحداث الشيميرا Chimeras) ( عنه في إحداث٣٥

التضاعف.‏ آما آان لمعيقات الانقسام في الوسط المغذي تأثير سلبي على النسبة المئوية للكدب القادرة علىإعادة النمو وإعطاء النموات،‏ حيث انخفضت نسبتها مع زيادة ترآيز المادة المستخدمة.‏وبشكل عام فإن استخدام معيقات الانقسام من آولشيسين و أوريزالين آان له الدور السلبي علىحياة الأجزاء النباتية وآذلك على مردود العقل الساقية من النموات وعلى النسبة المئوية لتشكل الكدبوقدرتها على إعادة النمو خاصة على التراآيز العالية،‏ وإن الأوريزالين آانت له درجة سمية أعلى منالكولشيسين،‏ وبشكل مخالف فإن ترآيز الكولشيسين بين 25 و‎1250‎ µM آانت سامة على العيناتالورقية في الكيوي بدرجة أآبر من الأوريزالين بين 5 و Legave ) µM 30و،( 1996, Chalakفيحين أن نتائجنا تتفق معWan وآخرون 1991) (اللذين وضحوا بأن الأوريزالين يقلل من نسبة نموالكالس وتلك القادرة على إعطاء النموات في الذرة،‏ وآذلك في هجن الجنسAllium فقد آان لإستخدامالكولشيسين التأثير السلبي على حياة الكدب وقدرتها على إعادة النموSong) وآخرون ، 1997 .(أما فيما يخص مدة المعالجة بمعيقات الانقسام على مختلف أنواعها ومختلف الطرق المستخدمة فلميكن لها أي تأثير على النسبة المئوية للنموات الشيميرية أو الرباعية الناتجة حيث لم تسجل أي فروقا معنويةبينها،‏ آذلك لم تكن هناك أي تأثير معنوي للأنواع النباتية المستخدمة في إنتاج النموات الشيميرية أوالمضاعفة من الكدب حيث لم تسجل أي فروق معنوية بينها في استجابتها للتضاعف أو الشيميرا.‏٣٦

الشكل رقم(‏‎٤‎‏):‏ نبات الجاردينيا مزهرالشكل رقم (٥): طرق الزراعة النسيجية ضمن الأنابيب ‏(فوق)‏ و أطباق بتري ‏(تحت)‏٣٧

(٦): الشكل رقمالإآثار بالعقلة الساقية المخبرية ضمن أطباق بتري٣٨

(٧): الشكل رقمالحصول على الكدبمن السلاميات وإعادة النمو(Regeneration)(callus)٣٩

المراجعAbak, K.; Sari, N.; Paksoy, M.; Yilmaz, H.; Aktas, H.; and Tunali, C. 1996. Genotyperesponse to haploid embryo induction with pollination by irradiated pollens in melon,obtaining of dihaploid lines determination of haploid and diploid plants by differenttechniques. Tr. J. Agric. Forestry, 20(5): 425 – 430.Almeida, W.A.B.; Mour, F.A.A.; Filho, O.; Pino, L. E.; Boscariol, R.L.; Rodriguez,A.P.M. and Mendes, B.M.G. 2003. Genetic transformation and plant recovery frommature tissues of Citrus sinensis L. Osbeck. Plant Science 164 (2): 203-211.Anderson J.A.; Mousset D.C.; Williams, E.G. and Taylor, N.L. 1991. An in vitrochromosome doubling method for clovers (Trifolium spp.). Genome 34 (1), 1-5.Arumuganthan, K. and Earle, E.; 1991. Estimation of nuclear DNA content of plants byflow cytometry. Plant Mol. Biol. Reporter, 9: 221 – 231.Brown, S.C.; Devaux, P.; Marie, D.; Bergounioux, C.; and Petit, P.X. 1991. Cytometriéen flux: Application à l'analyse de la ploidie chez les végétaux. Biofuture 105: 2 – 16.Chalak, L. and Legav, J.M. 1996. Oryzalin combined with adventitious regeneration for anefficient chromosome doubling of trihaploid Kiwifruit. Plant Cell Report 16: 97-100.Craven LA; Rouse JL 1989. Rhododendron leucogigas 'Hunstein's Secret'. American-Rhododendron Society Journal, 43: 4, 186-189.Cuy, F.; Dumas de Vaulx, R.; Longhi, B. and Siadous, R. 1992. Analyse des plantes demelon (Cucumis melo L.) issues de croisements avec du pollen irradié à différenttesdoses. Agronomie, 12: 623 – 630.De Laat, A.M.M.; Gohde, W.; and Vogelzang, M.J.D.C. 1987. Determination of ploidy ofsingle plants and plants population by flow cytometry. Plant Breeding 99: 303 – 307.Demarly, Y. and Sibi, M. 1989. Amélioration des plantes et Biotéchnologies. John Libbey,Paris.Dickson, M.H. and Wallace, D.H. 1986. Cabbage breeding. In Bassatt, M.J.(Ed). BreedingVegetable Crops. Avi. Publ. Comp., Westpart, CT,:395 – 432.Dumanois, CH.; Godin, B.; Lebofuf, J. and Bigo, C. 1984 Multiplication vegetative invitro de Gardenia jasminoides Ellis. P.H.M.Revue Horticole n 249, 19- 30Gao, S.L., D.N. Zhu., Z.H. Coi and D.R. Xu. 1996. Autotetraploid plant from colchicinetretedbud culture of Saluia miltiorrhiza. Plant cell Tissue culture, 47: 37 – 77.George J; Ravishankar GA. 1996 Development of modified plant tissueculture media usingalternate sources of nitrogen and vitamins for micropropagation. Indian-Journal-of-Experimental-Biology., 34: 2, 163-170٤٠

George PS; Ravishankar, GA. 1995 Induction of crocin and crocetins in callus cultures ofGardenia jasminoides Ellis. Food Biotechnology, 9: 1-2: 29-38.Goldy, R.G. and P.M. Lyrene. 1984. In vitro colchicine tretment of 4X bluebessie,Vaccinium SP.J.Amer. Soc. Hort. Sci. 109:336 – 338.Hancock, J.F., 1997. The Colchicine Story. HortScience. 32: 1011-1012.Kehr, A.E. 1998. Woody plant polyploidy . Am. Nurseryman. 183 (3): 38-47.Kehr, A.E. 1976. Breeding for purpose. Quart Bull . Am. Rhodod Sec. 20: 130 – 141Ma, X.H., Qin, R.L., and Xing, W.B. 1984. Chromosome observations of some medicalplants in Xinjiang. Acta Phytotax. Sin. 22: 243-249.Murashige, T. and Skooge, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays withtabacoo tissue culture. Physiol. Plant.,15: 473-497.Nawa, Y.; and Ohtani, T. 1992. Induction of caluus from flesh of gardenia jasminoides Ellisfruit and formation of yllow pigment in the callus. Bioscience, biotechnology andbiochemistry. 56 (11): 1732 – 1736.Petersen, K.K.; Hagberg, P. and Kristiansen, K. 2002. In vitro chromosome doubling ofMisconthus sinensis. Plant Breeding 121, 445-450.Pryor, R.C. and L.C. Frazier. 1968. Colchicine induced tetraploid azaleas. HortScience, 3:283 – 286.Redha, A.; Attia, T.; Buter, B.; Saisingtong, S.; Stamp, P. and Schmid J.E. 1998.Improved Production of doubled haploid by colchicine application to wheat (Triticumaestivum L.).Plant cell reports 17 (12), 974-979.Roux, N.; Dolezel, J.; Swennen, R. and Zapata-Arias, F.J. 2001. Effectiveness of threemicropropagation techniques to dissociate cytochimeras in Musa spp. Plant cell, tissueand organ culture, 66 (3): 187 – 197.Saito, H.; Mizunashi, K.; Tanaka, S.; Adachi, Y. and Nakano, M. 2003. Ploidy estimationin Hemerocallis species and cultivars by flow cytometry. Scientia Horticulturae, 97:185 – 192.Sari, N.; Abak, K. and Pitrat, M. 1999. Comparison of ploidy level screening methods inwatermelon (Citrullus lanatus Thunb) Matsum and Nakai. Scientia Horticulturae, 82:265 – 277.Serret, MD; Trillas, MI; Matas, J; Araus, JL. 1997. The effect of different closure types,light, and sucrose concentrations on carbon isotope composition and growth ofGardenia jasminoides plantlets during micropropagation and subsequent acclimationex vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 47, (3): 217-230٤١

Serret, MD; Trillas, MI; Matas, J; Araus, JL. 1996 Development of photoautotrophy andphotoinhibition of Gardenia jasminoides plantlets during micropropagation. Plant-Cell,-Tissue-and-Organ-Culture, 45: (1): 1-16.Sas Institute Inc, 1989. SAS/STAT User's Guide, Version 6, 4 th edn, Vol. 2 SAS Institue,Inc., Cary.Song, P., Kang, W. and Peffey, E.B. 1997. Chromosome doubling of Allium fistulosum xA.cepa interspecific F 1 hybrids through colchicine treatment of regeneration callus.Euphytica 93: 256-262.Wan, Y.; Duncan, D.R.; Rayburn, A.L.; Petolino, J.F. and Widholm, J.M. 1991. The useof antimicrotubule herbircides of the production of doubled haploid plants fromanther-derived maizecallus. Theor.Appl.Genet. 81:205-211.Yetisir, H. and Sari, N.2003. Anew method for haploid muskmelon (Cucumis melo L.)dihaploidization. Scientia Horticulturae 98: 277 – 283.Zamani, G.; Kovacs, E.; Gouli-Vavdinoudi, D.; Roupakias, G. and Barnabas, B. 2000.Regeneration of fertile doubled haploid plants from colchicine-supplemented media inweat anther culture. Plant Breeding, 119: 461-465.٤٢