Hoofdstuk 4

Hoofdstuk 4
Moleculaire Spectrometrie
• UV/VIS
• de Wet van Beer (zuivere stoffen, mengsels)
• afwijkingen van de Wet van Beer
• instrumentatie
• toepassingen
• foto-acoustische detectie
• Moleculaire Luminiscentie
• fluorescentie
•fosforescentie
• chemoluminiscentie

UV/VIS spectrometrie
• transmissie en absorbantie metingen
P0
A = log10
= ε bc
P
b: absorptiepad [cm]
c: concentratie [mol/L]
ε: molaire extinctie coefficiënt
[L/mol/cm]
A: absorbantie
T: transmissie
P
A log logT
P
0 = = −

Wet van Beer: Mengsels
• Wet van Beer
– één component
–meerderecomponenten
A
=
A
1
+
A
+ ... +
A
= ε bc + ε bc + ... + ε bc
1
1
2
2
2
n
n
dP
P
P0
abc
A = −logT
= log = = εbc
P ln10
n
=
P
=
P
=
−(
ac)
Pdx
0
e
−abc
dP = −(
a c
− ... − ( a
P
0
e
1
1
−∑
a
) Pdx
i i bc
n
c
n
−
( a
2
) Pdx
c
2
) Pdx

Wet van Beer: beperkingen
• bijna altijd: A ∝ b
• niet altijd proportionaliteit tussen c en A
– fundamentele afwijkingen
– instrumentele afwijkingen
– chemische afwijkingen (bij hoge c, > 0.01 M)
• ε wordt c-afhankelijk (brekingsindex)
• afhankelijkheid van te bepalen stof
• afhankelijkheid van andere componenten (electrolyt)
• pH-geïnduceerde kleurveranderingen (HIn ↔ H + + In- )

Polychromatische bestraling
• steeds bestraling met eindige ∆λ
• simultane bestraling bij λ’ (P 0’) en λ’’ (P 0”)
0
–bijλ’: A′ = = ε′ bc bij λ”:
–simultaan:
enkel indien ε’ ≈ ε’’
A m
P′
P0′
′
log A′ ′ = log = ε ′
bc
P′
P′
′
( P0′
+ P0′
′ )
( P0′
+ P0′
′ )
A m = log = log − e′
bc −e′
′
( P′
+ P′
′ ) ( P′
10 + P′
′ 10
≈
ε′ bc
0
0
bc
)

Analyse van mengsels
• mengsel van bestanddelen M en N
–2 metingenbij
absorptiemaxima
van M en N
⎧
⎨
⎩
A′
= ε′
M
A′
′ = ε′
′
M
bc
bc
M
M
+ ε′
Nbc
+ ε′
′ bc
– bepaling van ε M , ε N
bij λ’, λ” : uit ijkcurves
(standaarden)
N
N
N

• stralingsbronnen
Instrumentatie
–UV-gebied(200-400 nm) D2-lamp (met kwarts venster)
– VIS/NIR-gebied (350-2500 nm) W-filament lamp (2870 K)
constante voedingsspanning nodig
W-filament/halogeen lamp
Wg + I2 → WI2 → Ws (langere levensduur)
– Xe-boog lampen (200-1000 nm, λ max ≈ 500 nm)
meer intense straling
• monsterhouders
– kwarts, kwartsglas: UV transparant, tot 3000 nm (IR)
– gewoon glas: 350-2000 nm
–wanden loodrecht op stralingsrichting (reflectie)

Instrumentatie
• 4 grote types
– enkele bundel
– parallelle
dubbele bundel
– alternerende
dubbele bundel
– multikanaals

Multikanaals spectrometer
• parallelle meting van absorbantie
in breed golflengte gebied
geen bewegende
onderdelen

Foto-akoustische spectroscopie
• bestraling van afgesloten gasvolume
– absorptie → drukverschil → geluid
– bestraling met ’chopped beam’
(akoustische frequentie)
→ gevoelige microfoon als detector
• PAS van vaste materialen
– monster + lucht in afgesloten cel
–lichte opwarming→drukgolf (gas)
–enkel bij absorptie→geluid – reflectie/strooiing → geen effect
A-E: diverse
(poly)aromatische
verbindingen

Moleculaire Luminiscentie
• drie analoge methoden
–Moleculaire fluorescentie
–Moleculaire fosforescentie
– Chemoluminiscentie
• gemeenschappelijke aspecten
– excitatie van moleculen
–emissievan karakteristiek spectrum
→ kwalitatieve en kwantitatieve analyse

Fluorescentie & Fosforescentie
• absorptie van fotonen
– emissie straling: λ emissie > λ excitatie
• fluorescentie
– electronische transitie, ∆S = 0
– snelle relaxatie (< 10-5 s)
•fosforescentie
– relaxatie gaat gepaard met ∆S
– emissie van straling lange tijd ná bestraling

Chemoluminiscentie
• geëxciteerd species
– gevormd tijdens chemische reactie
– uitzenden van emissie spectrum
• indirecte metingen
– oxidatie van te analyseren product (O3 , H2O2 )
+ chemoluminiscentie van geoxideerde vorm
– remmen/katalyseren door te analyseren product
van reactie die aanleiding geeft tot
chemoluminiscentie

Moleculaire Luminiscentie
• meting van foto- of chemoluminiscentie
– kwantitatieve bepaling van diverse
organische/anorganische bestanddelen
– vooral fluorimetrische toepassingen
• belangrijkste voordeel: gevoeligheid
– 10-1000 x lagere DL-waarden dan bij absorptie
– DL in ppb gebied
– fotoluminiscentie: groot lineair gebied
– fluorescentie detectoren in
vloeistof chromatografie/capillaire electroforese
• belangrijkste nadeel: niet bij alle moleculen

Moleculaire Fluorescentie
• fluorescentie
– excitatie/absorptie:
bvb. Na 3s → 3p 5896 Å + 5890 Å
– resonante fluorescentie:
bvb. Na 3p → 3s, na 10 -5 -10 -8 s
• moleculaire systemen
– vele vertonen resonante fluorescentie
– meer frequent: Stokes shift
λ emissie > λ excitatie
Ε emissie < E excitatie

Singlet en Triplet toestanden
• molecule met enkel gepaarde electronen
– singlet toestand (S=0, 2S+1=1)
– geen opsplitsing in magneetveld
• geëxciteerde molecule
– anti-parallelle spins: Singlet
– parallelle spins: Triplet, S=1
– triplet-toestand stabieler dan singlet-toestand
• molecule in Singlet vs. in Triplet toestand
– sterk verschillende eigenschappen
– singlet: diamagnetisch; triplet: paramagnetisch
– bij excitatie: P(singlet → triplet) « P(singlet → singlet)
– bij relaxatie: P(singlet ← triplet) « P(singlet ← singlet)
→ lange leeftijd van triplet-toestand: 10 -4 –10 s

Triplet toestanden
• populatie van triplet toestand vanuit singlet
toestand
absorptieband 1 (λ 1 )
absorptieband 2 (λ 2 )
fluorescentieband 3 (λ 3 )
fosforescentieband 4 (λ 4 )
”verboden” absorptie
absorptie:
binnen 10 -14 -10 -15 s
fluorescentie:
10 -7 -10 -9 s (hoge ε)
10 -6 -10 -5 s (lage ε)
fosforescentie:
10 -4 -10 s

Wanneer fotoluminiscentie ?
• bij ontbreken van (snellere)
stralingsloze relaxatie mogelijkheden
→ bij beperkt aantal moleculaire structuren
• vibrationele relaxatie
– botsing van geëxciteerd
moleculen met solvens
– zeer snel: 10 -12 s
→ kleine ∆T solvent
→ Stokes shift
– overlap tussen
absorptie en emissie spectrum
enkel bij λ resonantie
Kinine-oplossing

Fluorescentie en structuur
• vooral bij π* →πovergangen • vooral bij aromatische systemen met
kleine π* →πovergang – simpele heterocyclische
ringen: geen fluorescentie
– aantal ringen ↑, condensatiegraad ↑
→ verhoogde fluorescentie-efficiëntie
– vooral in rigide
structuren (ook chelaten):
bvb. bij fluoreen 6x meer
fluorescentie dan bij biphenyl

Fluorescentie en concentratie
• Uitgezonden fluorescentie vermogen F
F
– evenredig met
geabsorbeerd vermogen
– Wet van Beer: P = P
=
K′
P
0
−ln10ε
bc
F = K′
−
( P0
– benadering exp(-x) ≈ (1-x)
enkel geldig indien x < 0.05
–bij hogere c: geen lineare relatie meer
– andere effecten: zelf-demping, zelf-absorptie
0
10
− A
( 1−
e ) ≈ K′
P0
=
P
0
10
ln10
P)
−εbc
−ln10ε
bc
= P0e
ε
bc
=
Kc

• E: excitatie spectrum
E, F & P spectra
–identiek aan absorptie spectrum
–variatie van λ excitatie, meting van (totale) luminiscentie int
• F: fluorescentie spectrum
P: fosforescentie spectrum
– excitatie met
vaste λ excitatie
– meting van luminiscentie
in functie van λ emissie
λ excitatie
fenantreen

• Fluorimeters
– ’double-beam’ optics
– meting onder 90o (minimale strooiing
van primaire straal)
– P0 normalisatie
Instrumentatie
• Spectrofluorimeters
– twee monochromatoren
voor λexcitatie en λemissie 1
2

• stralingsbronnen
Instrumentatie
–meestal: Hg damp-lamp (lage druk, SiO 2 -venster)
→ lijnen bij 254, 302, 313, 546, 578, 691, 773 nm
–soms: Xe boog lamp, lasers
• filters, monochromatoren
• transducers
–grote versterkingsfactor nodig
– PMT-buizen (in foton-tel mode, gekoeld)
– diode-arrays (parallele detectie), CCD’s

Instrumentatie
• Parallelle meting van alle λ excitatie/λ emissie
combinaties
voor analyse van
mengsels
van fluorescerence
componenten

Fluorimetrie toepassingen
• bepaling van anorganische bestanddelen
via vorming van fluorescerende chelaten
8-hydroxyquinoline
– transitie metalen: frequente
desactivatie van fluorescentie
– niet-transitie metalen:
weinig desactivatie

Toepassingen
• bepaling van organische bestanddelen
– meer dan 200 verschillende producten
– organische reagentia, enzymes, co-enzymes,
steroïden, vitaminen, …
– vooral bij voedsel-, farmaceutische analyse,
analyse van natuurproducten
•fosforimetrie
– metingen bij vloeibare stikstof temperatuur
(minimaliseren van desactivatie door botsingen)
– metingen na ’spotten’ op filtreerpapier

Chemoluminiscentie
• chemische reactie produceert
electronisch geëxciteerde moleculair species
– emissie van straling bij relaxatie
A + B → C* + D
C* → C + hν
– energie-transfer
naar ander species
– in biologische systemen
(vuurvlieg etc.)
• CL intensiteit
ICL = φCL
dC
dt
φ CL: CL quantum opbrengst
typische waarden: 0.01-0.2
– luminiscentie metingen: PMT
tijd na mengen van reagentia

• detectielimieten
Toepassingen
– lage lichtintensiteiten eenvoudig te meten
– ppm-ppb bereik
• atmosferische polluenten
–NO+ O3 → NO2 * + O2 NO2 * → NO2 + hν (600-2800 nm)
– lineair bereik van 1 ppb tot 10000 ppm
•luminol
– in oplossingen
+ oxidans + katalysator
O 2, H 2O 2, … Co 2+ , Cr 3+ , Cu 2+ , …
blauw licht
(λ = 425 nm)