Metoder för att mäta lätta kedjor i urin och serum

Metoder för att mäta lätta
kedjor i urin och serum
Lätta kedjor
Fria lätta kedjor
Anders Larsson

• Major Kriterier
Myeloma Diagnostik
(1 major+1 minor or 3 minor)
– Plasmacytom i biopsi
– 30% plasmaceller í
märgen
– M-protein
• 35 g/L IgG
• 20 g/L IgA
• 1g/24 h urin Bence
Jones
• Minor kriterier
– 10-29% plasmaceller i
märgen
– M-protein
• Mindre än till vänster
• Skelettuppklarningar
– Sänkta Ig nivåer
• IgM

Structures of antibodies
4 IgG subklasser
2 IgA subklasser
1 IgM subklass
(mono o pentamer)
1 IgD subklass
1 IgE subklass
2 lätta kedjor
Kappa
Lamda

Isotyper, Immunoglobulin

IgM och IgA molecyler, multimerer.

[Estimate]

Anti-kappa antikropp görs genom immunisering med ett
antal renade kappakedjor (>3). Detta kallas för
immunogen.
En kappa kalibrator innehåller ett antal renade lätta
kedjor eller polyklonalt IgG.
Liknar kalibrator eller patientprov immunogenet får man
en stark signal. Är likheten låg så får vi en svag signal.
Olika kalibratorer i Sverige. Renade kedjor eller
polyklonalt IgG,

För fria lätta kedjor desorberar man bort antikroppar
som känner igen intakt antikropp tex med hjälp av IgGsepharos.
Innebär antikroppsförluster – högre pris
Svårare att standardisera

Önskemål på en lätt kejde test:
Låg reaktivitet mot variabla regioner
Samma reaktivitet mot olika typer av tung kedja.
Detekterar även fragment av lätta kedjor.
Alla kalibratorer skall vara lika.
I plasma skall testet inte detektera intakt antikropp.
Lätt kedja har en molekylvikt på 22 kDa. Fritt filtrerbar
genom njuren. Återresorberas i tubuli.

Lätt kedje diagnostik / BenceJones proteinuri.
Definitionsmässigt är det en fri lätt kedja.

Bence Jones Protein Test
Principle. Bence-Jones protein is soluble in urine at room and body
temperature. When the urine is heated to 40°C, a white cloud appears and
at 60°C, a distinct precipitate forms. The precipitate disappears on
boiling but reappears on cooling. Excessive amounts of acid or salt will
prevent the appearance of the precipitate.
Reagent. Acetic Acid, approximately 10% aqueous solution.
Procedure. Add urine to a 6-inch test tube until it is about two-thirds
full. Place in a water bath and heat slowly. Do not allow the bottom of
the test tube to touch the bottom of the beaker, as it may become hotter
than the rest of the water. Suspend a thermometer in the water bath. Note
the temperature and the appearance of the urine every few minutes,
especially between the temperatures of 40°C - 60°C. If a slight cloud
appears when the urine is heated to the boiling point, 100°C, add a few
drops of acetic acid. This will dissolve any phosphates that have
separated out. If a precipitate forms at the boiling point, it is due to
albumin. Boil the urine with a few drops of dilute acetic acid, filter
rapidly, and repeat the test on the cooled filtrate.

Myeloma: Durie-Salmon Staging
Stage I
• Hemoglobin >10 g/dL
• Normal calcium
• No lytic bone lesions
• Low M-protein
– IgG 50 g/L
– Bence Jones >12 g/24h
A) Creatinine 2

Analys av lätta kedjor
Påvisande av Bence Jones proteinuri
Typning av M-komponenter
Tubuliskador och akut njursvikt

Påvisande av Bence Jones proteinuri
Agaros elfores –både lätt och tung kedja
Kvantifiering av lätta kedjor urin (bunden och
fri)
Fria lätta kedjor
Jag prioriterar stabilitet i kvantifiering över tid!

Typning av M-komponenter
Immunfixation – både lätt och tung kedja
Kvantifiering av lätta kedjor i urin (bunden och
fri) + tung kedja i plasma.
Fria lätta kedjor + tung kedja i plasma
Snabbare och billigare om vi slipper begära
urin??

Tubuliskador och akut njursvikt
Skadan beror på fria kedjor urinen.
Bör vara lätta kedje analys
Kräver dagliga analyser under 3-5 dagar för att
styra behandlingen.

Lätta kedjor (fri + bunden)
Varje patient är unik. Stora skillnader mellan individer
Överensstämmelse mellan leverantörer för samma patient
Dålig! TotalCV inom Sverige ca 35%. Kommer troligen ej
förbättras
Överensstämmelse över tid för samma leverantör
Osäkert hur stor batchskillnaden är

Fria Lätta kedjor
Stora förhoppningar om god överensstämmelse då det bara
var en leverantör
Nu är det 2 leverantörer
Varje patient är unik. Stora skillnader mellan individer
Överensstämmelse mellan leverantörer för samma patient
Troligen dålig!
Överensstämmelse över tid för samma leverantör
Verkar vara hög, men svårt att veta om någon är bättre
Reagensen dyra – Måste tillföra något i diagnostiken!

ProSpec
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Binding Site, 2007
P-Lambda fritt
y = 1.1515x - 3.9688
R 2 = 0.9807
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ProSpec Lund

ProSpec
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Binding Site, 2007
y = 1.375x - 1.575
R 2 = 0.9745
P-Kappa fritt
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
ProSpec Lund

Binding Site, 2007
Samma prover på Immage
2/20 prover falskt låga

Freelite/Cobas C
50
40
30
20
10
0
Binding Site- Siemens, 2012
Fri
y = 0,8537x - 0,1927
R 2 = 0,9432
0 10 20 30 40 50
Siemens/BN Prospec

Freelite/Cobas C
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Binding Site- Siemens, 2012
Fri
y = 1,2322x + 85,863
R 2 = 0,6758
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Siemens/BN Prospec

Freelite/Cobas C
60
50
40
30
20
10
0
Binding Site- Siemens, 2012
Fri
y = 0,3277x + 4,9138
R 2 = 0,8871
0 10 20 30 40 50 60
Siemens/BN Prospec

Freelite/Cobas C
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Binding Site- Siemens, 2012
Fri y = 1,2409x - 9,1497
R 2 = 0,1396
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Siemens/BN Prospec

Fria Lätta kedjor
Binding Site eller Siemens??
Priset ungefär lika mellan leverantörerna.
Binding Site har längre erfarenhet och är fokuserade på lätta
kedjor. Gjort utveckling i flera steg för att minska skillnader i
utslag mellan olika lätta kedjor. Monoklonal antikropp.
Batch till batch skillnader.
Siemens nyare. Kortare erfarenhet av fria lätta kedjor men lång
erfarenhet av andra immunoassays än fria lätta kedjor.
Dedicerade instrument. Stark organisation/stora resurser.
Batch till batch skillnader?
Uppsala kör Binding Site på Cobas. Rätt val??

Frågor?