Estudo epidemiológico e molecular dos ... - Dr. zacharias calil
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<strong>Estudo</strong> <strong>epidemiológico</strong> e <strong>molecular</strong> <strong>dos</strong> hemangiomas de pacientes trata<strong>dos</strong> no<br />
Hospital Materno Infantil no Estado de Goiás<br />
Camila Hamú<br />
Rafael Souto<br />
Zacharias Calil
Camila Hamú<br />
Rafael Souto<br />
Zacharias Calil<br />
<strong>Estudo</strong> <strong>epidemiológico</strong> e <strong>molecular</strong> <strong>dos</strong> hemangiomas de pacientes trata<strong>dos</strong> no<br />
Hospital Materno Infantil no Estado de Goiás<br />
Projeto a ser apresentado ao Programa de Pós-<br />
Graduação da Universidade Federal Goiás como<br />
requisito parcial à obtenção de vaga para ingresso<br />
em curso strictum sensu: título de Doutor.<br />
Goiânia<br />
2008
TERMO DE ACEITE DE ORIENTAÇÃO<br />
Eu,________________________________________________________, Professor<br />
e Orientador Credenciado junto ao Programa de Pós-Graduação<br />
em__________________________________________________ aceito orientar o(a)<br />
Sr.(a) __________________________________________________________...<br />
durante o seu curso de (doutorado), se a sua matrícula vier a ser efetivada pela<br />
Comissão do Curso de Pós-Graduação em<br />
___________________________________________________________________ .<br />
Declaro ainda ter ciência <strong>dos</strong> Regulamentos e Normas de Admissão do Programa de<br />
Pós-Graduação em ____________________________________________ .<br />
Goiânia, ____... de __________________...de 2008.<br />
Assinatura
Projeto a ser aprovado para ingresso, em ______________ /_____ /_____.,<br />
pela banca examinadora constituída pelos professores:<br />
_________________________________________________<br />
Profª. <strong>Dr</strong>ª. – Orientadora<br />
_________________________________________________<br />
Prof. <strong>Dr</strong>.<br />
_________________________________________________<br />
Profª. <strong>Dr</strong>ª.
À minha família,<br />
em especial. aos meus amigos.
AGRADECIMENTOS<br />
Aos profissionais da unidade do Hospital Maternos Infantil, pelo auxílio a ser<br />
disponibilizado;<br />
Aos pacientes que necessitam do tratamento contra o hemangioma, pessoas<br />
fundamentais para a realização deste estudo. Obrigado por acreditar e participar;<br />
à Deus, que me permitiu o acesso ao conhecimento e à oportunidade de aplicar um<br />
pouco do que aprendi em prol de outras pessoas. Obrigado por colocar em meu<br />
caminho pessoas as quais me orgulho muito de conviver.
Dedico este trabalho a aqueles que amam e incondicionalmente se<br />
utilizam do amor como fonte inspiradora da vida...<br />
assim como o autor a obra.<br />
Àqueles que sempre buscam realizar-se em um novo amor,<br />
Rafael Souto
SUMÁRIO<br />
RESUMO ...................................................................................................................11<br />
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................12<br />
1.1 Aspectos Clínicos e Genéticos <strong>dos</strong> Hemangiomas.........................................14<br />
1.2 Fisiopatologias <strong>dos</strong> Hemangiomas..................................................................17<br />
2 OBJETIVOS..........................................................................................................22<br />
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................23<br />
3.1 População estudada........................................................................................23<br />
3.2 Entrevista e coleta de material biológico.........................................................23<br />
3.3 Avaliação da expressão gênica.......................................................................24<br />
3.3.1 Detecção por Microarrays...............................................................................24<br />
3.3.2 Análise de da<strong>dos</strong>............................................................................................25<br />
4 CRONOGRAMA DE ATIVIDADES.......................................................................26<br />
5 ORÇAMENTO......................................................................................................27<br />
5.1 Orçamento detalhado...........................................................................................27<br />
5.1.1 Equipamentos e Material Permanente.............................................................27<br />
5.1.2 Reagentes e Material de Consumo..................................................................28<br />
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................30<br />
ANEXO.......................................................................................................................32
LISTA DE FIGURAS<br />
1A - Figura Modificada de Chiller et.,al, 2002. Esquema numérico de localização<br />
anatômica usado para classificar os hemangiomas...................................................15<br />
1B - Genes a serem estuda<strong>dos</strong> por clusters H e P com alta similaridade de<br />
expressão no Hemangioma........................................................................................35<br />
1C - Referem somente aos clusters H e P com alta similaridade de expressão no<br />
Hemangioma...............................................................................................................36
LISTA DE QUADROS<br />
1- Modificada de Felmeden et al., 2002. As fases da angiogêneses.........................19
RESUMO<br />
As anomalias vasculares são alterações de etiologia congênita ou adquirida, que<br />
comprometem as estruturas vasculares, conseqüentemente a organização tissular<br />
Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma classificação para as anomalias<br />
vasculares baseada no comportamento biológico das lesões, correlacionando<br />
características celulares às características clínicas e a história natural destas lesões.<br />
Duas principais categorias foram definidas: os hemangiomas e as malformações<br />
vasculares. Hemangiomas são neoplasias propriamente ditas, apresentando<br />
proliferação endotelial pré-natal ou pós-natal. Apresentam crescimento acelerado<br />
durante a infância e regressão espontânea, nunca surgindo na idade adulta.<br />
Malformações vasculares são consideradas erros de desenvolvimento, constituídas<br />
de vasos displásicos revesti<strong>dos</strong> por endotélio quiescente; nunca involuem e<br />
freqüentemente apresentam crescimento progressivo. A prosposta de estudo tem por<br />
objetivo avaliar os fatores <strong>epidemiológico</strong>s, determinar a expressão <strong>dos</strong> principais<br />
genes controladores da angiogênese, bem como as freqüências mutacionais nos<br />
espécimes a serem estuda<strong>dos</strong>. A metodologia a ser disponibilizada para o alcance<br />
das metas estabelecidas é o método de Seqüenciamento, Microarrays associado<br />
com as análises epidemiológicas. Os resulta<strong>dos</strong> dependerão de uma interpolação de<br />
da<strong>dos</strong> gera<strong>dos</strong> e analisa<strong>dos</strong> pelas diversas metodologias.
1.0 INTRODUÇÀO<br />
As anomalias vasculares são alterações de etiologia congênita ou adquirida, que<br />
comprometem as estruturas vasculares, conseqüentemente a organização tissular<br />
(Goldenberg et al., 2001).<br />
Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma classificação para as anomalias<br />
vasculares baseada no comportamento biológico das lesões, correlacionando<br />
características celulares às características clínicas e história natural destas lesões.<br />
Duas principais categorias foram definidas: os hemangiomas e as malformações<br />
vasculares. Hemangiomas são neoplasias propriamente ditas, apresentando<br />
proliferação endotelial pré-natal ou pós-natal. Apresentam crescimento acelerado<br />
durante a infância e regressão espontânea, nunca surgindo na idade adulta.<br />
Malformações vasculares são consideradas erros de desenvolvimento, constituídas<br />
de vasos displásicos revesti<strong>dos</strong> por endotélio quiescente; nunca involuem e<br />
freqüentemente apresentam crescimento progressivo (Mulliken & Glowacki, 1982;<br />
Gontijo et al., 2003; Gontijo et al., 2004; Miika,2007).<br />
A Sociedade Internacional para o <strong>Estudo</strong> de Anomalias Vasculares (ISSVA)<br />
modificou essa classificação em 1996 e optou por dividir as lesões vasculares em<br />
malformações vasculares (capilar, venosa, linfática, arterial e combinada) e tumores<br />
vasculares (Miika, 2007).<br />
Estes últimos têm como característica marcante a proliferação das células<br />
endoteliais e são dividi<strong>dos</strong> em hemangioma, hemangioma congênito rapidamente<br />
12
involutivo, hemangioma congênito não involutivo, granuloma piogênico,<br />
hemangioendotelioma kaposiforme e angioma em tufos (Della nina et al.,2006).<br />
Hemangioma é o tumor benigno mais comum da infância, e sua freqüência é<br />
estimada em 10-12% das crianças durante o primeiro ano de vida. Ocorre mais<br />
freqüentemente no sexo feminino e em prematuros, sendo observado em 23-30%<br />
das crianças com peso ao nascimento inferior a 1.000g (Goldenberg et al., 2001;<br />
Della nina et al.,2006). Pode ocorrer em qualquer raça, mas parece haver propensão<br />
por pessoas de pele clara (Della nina et al.,2006). As lesões são únicas em 80% <strong>dos</strong><br />
casos, e as áreas mais acometidas são cabeça e pescoço (60%), tronco (25%) e<br />
extremidades (5%) [Goldenberg et al., 2001, Della nina et al., 2006].<br />
A aparência clínica do hemangioma varia de acordo com a profundidade de<br />
acometimento do tumor. Os hemangiomas da infância são dividi<strong>dos</strong> em superficiais,<br />
profun<strong>dos</strong> e combina<strong>dos</strong>. Os superficiais acometem a derme superficial e são vistos<br />
clinicamente como lesões elevadas, bem delimitadas, de cor vermelho-vivo, com<br />
pele normal ao redor e pouco compressíveis à palpação. Os hemangiomas<br />
profun<strong>dos</strong> acometem a derme profunda e o tecido subcutâneo, poupando a derme<br />
papilar. Apresentam-se como nódulos da cor da pele ou azula<strong>dos</strong>, compressíveis,<br />
podendo apresentar telangiectasias em sua superfície e vasos de drenagem na<br />
periferia (Della nina et al., 2006).<br />
13
1.1 Aspectos Clínicos e Genéticos <strong>dos</strong> Hemangiomas<br />
O hemangioma é um <strong>dos</strong> tumores mais comuns da mucosa bucal. <strong>Estudo</strong>s em<br />
1.308 lesões deste tipo demonstraram que a região de cabeça e pescoço é<br />
acometida entre 50 a 60% <strong>dos</strong> casos (Della nina et al., 2006).<br />
O hemangioma <strong>dos</strong> teci<strong>dos</strong> moles da boca é semelhante ao hemangioma da<br />
pele: aparece vermelho ou vermelho-azulado, geralmente não se apresenta bem<br />
circunscrito, podendo ser uma lesão plana ou elevada. Quando profundo na<br />
cavidade bucal (teci<strong>dos</strong> moles), apresenta uma superfície lisa ou produz uma massa<br />
nodular, mas não aparece sob forma de pólipo ou pedúnculo. A localização mais<br />
comum é nos lábios, na língua, na mucosa jugal e no palato. É chamado de nevo<br />
flâmeo quando seu sítio é em palato ou pele e apresenta-se de forma plana. Já na<br />
gengiva, sua forma é nodular e de coloração vinhosa. Intra-oral, pode ainda ocorrer<br />
na mandíbula ou maxila sob forma intra-óssea, outras localizações estão descritas<br />
na figura abaixo (Martins da Silva et al., 2000, Chiller et.,al 2002; Taksande &<br />
Vilhekar, 2008).<br />
14
Figura 1A. Modificada de Chiller et.,al, 2002. Esquema numérico de localização anatômica<br />
usado para classificar os hemangiomas. A lista parcial na parte B se aplica às partes A e B<br />
representando a localização anatômica que não poderia ser ilustrada (adequadamente) sobre o<br />
esquema.<br />
Histologicamente é formado por inúmeros capilares pequenos revesti<strong>dos</strong> por<br />
uma camada única de células endoteliais sustentada por tecido conjuntivo. Os<br />
hemangiomas cutâneos podem ser classifica<strong>dos</strong> em capilares, cavernosos e mistos<br />
(Martins da Silva et al., 2000).<br />
15
O hemangioma capilar existe já no nascimento ou aparece durante o primeiro<br />
mês de vida como uma lesão bem definida na face. Com freqüência, aumenta<br />
rapidamente de tamanho e, quando submetido à palpação, pode apresentar<br />
característica de lesão pulsátil. Usualmente, ocorre regressão espontânea que deixa<br />
marcas, mas poderá ser necessário o tratamento cirúrgico por motivos estéticos,<br />
fisiológicos, regressão demorada ou, até mesmo, a não regressão da lesão. Um tipo<br />
específico, tipo moriforme, cresce rapidamente nos primeiros meses de vida, porém<br />
80% <strong>dos</strong> casos regridem totalmente até os cinco anos de idade (Eerola et al., 2003).<br />
O hemangioma cavernoso é menos circunscrito e tende a estender-se mais<br />
profundamente pelos teci<strong>dos</strong> subcutâneos. Pode ocorrer nos lábios, na língua e nos<br />
ossos. Seu crescimento é mais lento. O misto, descrito por Regezi & Sciubba, é uma<br />
combinação de ambos, tendo proliferações de vasos com lesões definidas e áreas<br />
difusas, podendo encontrar-se, inclusive, infiltrado nos teci<strong>dos</strong> ósseos adjacentes.<br />
Berg e colaboradores através de seus estu<strong>dos</strong> demonstraram a perda de<br />
heterosigosidade (LOH) no hemangioma, em especificico no cromossoma 5q (17),<br />
sugerindo que a perda de função contribui para o desenvolvimento do tumor<br />
(Marchuk, 2001).<br />
<strong>Estudo</strong>s recentes têm demonstrado que a angiogênese é estritamente regulada<br />
pela relação entre genes promotores e inibidores da angiogênese. Assim, sugere<br />
que a LOH nas regiões gênicas contendo inibidores da angiogênese no cromossoma<br />
5q pode ser um estímulo ao desenvolvimento tumoral, em analogia os hemangiomas<br />
(Marchuk, 2001).<br />
16
1.2 Fisiopatologias <strong>dos</strong> Hemangiomas<br />
A formação do sistema vascular é obtida basicamente por três processos.<br />
Durante a embriogênese ocorre a diferenciação das células embrionárias<br />
mesênquimais (células precursoras do endotélio ou angioblastos). Estas células<br />
precursoras são recrutadas de áreas de mesoderma adjacentes ao embrião e/ou,<br />
originadas por divisão celular local, organizado ilhotas sangüíneas e estabelecendo<br />
um plexo vascular primordial (vasculogenese) [Ruiter et al., 1992].<br />
O Segundo refere-se à angiogênese na formação de novos vasos sangüíneos o<br />
evento dá-se pelo “brotamento”, ou seja, desenvolvimento de pequenos vasos pré-<br />
existentes no adulto e teci<strong>dos</strong> embrionários (angiogênese por brotamento) ou pela<br />
subdivisão intravascular. O processo angiogênico é regulado por diversos fatores<br />
ativadores incluindo o bFGF (fibroblast growth factor – basic, ou, type – 2), o VEGF-<br />
A (vascular endothelial growth factor – Type A) além de outros membros da família<br />
VEGF. Estes fatores interagem com as glicosaminoglicanas (GLG) e proteoglicanas,<br />
tais como HSPG’s (Heparan Sulfate Proteoglycans) presente na matriz extracelular,<br />
na lâmina basal e em receptores da superfície celular, regulando o crescimento, a<br />
proliferação, a migração, a diferenciação e a sobrevivência das células endoteliais<br />
entre uma variedade de tipos celulares (Solimene et al., 1999; Chipperfield et al.,<br />
2002).<br />
17
Uma hipótese atual é que sulfatos de heparana de HSPG orientam a ligação de<br />
FGF a regiões de ligação especifica em receptores de FGF (FGFRs), formando<br />
complexo de ativação de alta afinidade (Nuggent & Iozzo, 2000).<br />
Os vasos que surgem podem ser transforma<strong>dos</strong> por processos <strong>molecular</strong>es de<br />
ajustes finos e precisos que auxiliam na remodelagem do novo vaso. Nesse<br />
contexto, é sugerido que polissacarídeos estruturalmente análogos poderiam ligar<br />
fatores de crescimento a regiões específicas de receptores competentes, modulando<br />
ou antagonizando as respostas ao formar complexos de maior afinidade do que<br />
aqueles endogenamente media<strong>dos</strong> por sulfato de heparana.<br />
O terceiro processo é definido com de proliferação rápida de vasos colaterais<br />
pré-existentes. A angiogênese demonstra ser órgão específico um processo<br />
relevante no estágio microvascular. Assim, a angiogênese parece desempenhar um<br />
papel importante na fisiopatologia de várias doenças, recentes tentativas têm sido<br />
feitas para utilizar o conhecimento no desenvolvimento de novas abordagens<br />
terapêuticas. A exemplo, os inibidores de angiogênese que têm sido utiliza<strong>dos</strong> no<br />
combate ao crescimento de tumores, espalhamento de metástase bem como nas<br />
artrites reumatóides sempre que o objetivo for diminuir a infiltração das células<br />
inflamatórias e <strong>dos</strong> mediadores solúveis (Felmeden et al., 2002).<br />
18
Eventos Chaves da Angiogênese<br />
Fases Eventos Chaves<br />
Células endoteliais e ativação de pericito<br />
Degradação da membrana basal<br />
Migração de células endoteliais<br />
Proliferação de Células Endoteliais<br />
Diferenciação de células endoteliais<br />
Reconstituição da membrana basal<br />
Maturação vascular e estabilização<br />
Alterações morfológicas das células endoteliais<br />
conduzem para a proliferação e secreção, local<br />
vasodilatação, aumento da permeabilidade<br />
vascular, acúmulo de fibrina extravascular<br />
Estímulos angiogénicos resultam na degradação<br />
proteolítica da membrana vascular<br />
Factores quimiotático produzi<strong>dos</strong> por<br />
fibroblastos, monócitos e plaquetas induzem a<br />
células endoteliais a migração e brotos<br />
A produção de mitôgenos locais induz a células<br />
endoteliais a síntese de DNA e<br />
consequentemente a mitose<br />
A diminuição da proliferação de células<br />
endoteliais e o re-estabelecimento do contado<br />
célula-célula leva ao brotamento de estrutura no<br />
lúmen<br />
A maturação <strong>dos</strong> vasos realiza<strong>dos</strong> pela<br />
reconstituição da membrana basal e sintetizada<br />
pelas células endoteliais e do pericito<br />
Remodelação capilar por estabilização e<br />
regressão<br />
Quadro 1. Modificada de Felmeden et al., 2002. . As fases da angiogêneses<br />
Para melhor compreensão do complexo processo de angiogênese é<br />
fundamental o estudo <strong>dos</strong> elementos genéticos controladores deste evento, bem<br />
como identificar os papeis característico de genes relaciona<strong>dos</strong> à morfofisiologia do<br />
processo. Assim é salutar o estudo de determina<strong>dos</strong> genes como descritos<br />
posteriormente e relaciona<strong>dos</strong> à proliferação, diferenciação e migração de células<br />
endoteliais (Yu et al., 2001, Dandras et al., 2004).<br />
A importância na atividade especifica angiogênica de VEGF e a interação de<br />
receptores no processo de proliferação de célula endoteliais, diferenciação,<br />
19
migração e crescimento foram consideravelmente reforçadas através de estu<strong>dos</strong> em<br />
camundongos o padrão de anormalidade observa<strong>dos</strong> fornecem algumas evidências<br />
para o função de VEGF e receptores Flt-1, KDR e Flt-4, juntamente com Tie-2/Tek e<br />
seus ligantes angiopoietinas 1 e 2 (Risau & Flamme, 1995; Berard et al., 1997; Risau<br />
1997; Risau 1998; Yu et al., 2001, Dandras et al., 2004, Anfonsso et al., 2006).<br />
Certamente, to<strong>dos</strong> os quatro receptores são essenciais para a vasculogênese,<br />
assim, mutações em loci de qualquer <strong>dos</strong> gene que codifica para estes receptores<br />
leva a letalidade embrionária devido a falhas na linhagem de células hematopoiética<br />
e endoteliais (Yu et al., 2001).<br />
As mutações em genes que codificam para VEGF ou seus receptores tornam-se<br />
evidentes os diferentes defeitos fenotípicos. A homozigose de genes VEGF<br />
defectivos resultam na morte embrionária e podem favorecer o encontro de<br />
indivíduos heterozigotos para VEGF na população (Risau & Flamme,1995; Berard et<br />
al., 1997; Risau, 1997; Risau, 1998; Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004; Anfonsso<br />
et al., 2006).<br />
Existem também diferentes padrões decorrentes <strong>dos</strong> receptores mutantes. Ao<br />
contrário KDR, Flt-1 não afecta apenas proliferação e diferenciação de células<br />
endoteliais, mas também na construção <strong>dos</strong> vasos sanguíneos como demonstrado<br />
por certas mutações em Flt-1 responsável por provocar letalidade embrionária<br />
devido à inadequada associação <strong>dos</strong> vasos sangüíneos (Risau & Flamme,1995;<br />
Berard et al., 1997; Risau, 1997; Risau, 1998; Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004;<br />
Anfonsso et al., 2006).<br />
20
Após inativação do gene Flt-4, a vasculogênese e angiogênese ocorre, mas os<br />
grandes vasos sanguíneos desenvolvem de forma irregular e desorganizada levando<br />
a alterações cardiovasculares (Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004; Anfonsso et al.,<br />
2006).<br />
No entanto, mutações nos genes para angiopoietina e receptores, resultam na<br />
quebra da estrutura do vaso e funções capilares diminuída levando a hemorragias<br />
(Yu et al., 2001).<br />
Os resulta<strong>dos</strong> obti<strong>dos</strong> em estu<strong>dos</strong> sugerem que na vasculogênese embrionárias,<br />
KDR é mediado por processos que precedem Flt-1. KDR está envolvido na formação<br />
de células endoteliais, proliferação e migração na fase inicial do vasculogênese,<br />
enquanto Flt-1 desempenha um papel vascular embrionários na diferenciação de<br />
células endoteliais (Risau & Flamme,1995; Berard et al., 1997; Risau, 1997; Risau,<br />
1998; Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004; Anfonsso et al., 2006).<br />
Até mesmo em um estágio posterior Flt-4 está envolvida na organização de<br />
grandes vasos linfáticos, e a emergente formação de vasos linfáticos, mas que<br />
precede a formação angiopoietina e seus receptores (Yu et al., 2001; Dandras et al.,<br />
2004; Anfonsso et al., 2006).<br />
21
2.0 OBJETIVOS<br />
- Avaliar os fatores <strong>epidemiológico</strong>s relaciona<strong>dos</strong> à incidência, prevalência,<br />
mortalidade, sobrevida, cura e recidiva <strong>dos</strong> hemangiomas, sob a óptica do<br />
tratamento que utiliza a "associação do acetato de triancinolona 40mg com o<br />
nitrato de prata a 0,5% no tratamento <strong>dos</strong> hemangiomas e <strong>dos</strong><br />
linfohemangiomas por infiltração intralesional em crianças”, método<br />
devidamente registrado no Instituto Nacional de Propriedade Industrial sob<br />
número Pio 2000827-0;<br />
- Determinar a expressão <strong>dos</strong> principais genes controladores da angiogênese<br />
em pacientes diagnostica<strong>dos</strong> previamente pelo corpo clínico do Hospital<br />
Materno Infantil no Estado de Goiás com indicações clínicas de<br />
hemangiomas, porém anterior ao tratamento que utiliza "associação do<br />
acetato de triancinolona 40mg com o nitrato de prata a 0,5% no tratamento<br />
<strong>dos</strong> hemangiomas e <strong>dos</strong> linfohemangiomas por infiltração intralesional em<br />
crianças”, método devidamente registrado no Instituto Nacional de<br />
Propriedade Industrial sob número Pio 2000827-0;<br />
- Determinar as freqüências mutacionais <strong>dos</strong> genes controladores da<br />
angiogênese em pacientes com hemangiomas bem como os impactos que<br />
22
possíveis alterações venham causar no desenvolvimento da referida patologia<br />
bem como no organismo humano.<br />
3.0 MATERIAL E MÉTODOS<br />
3.1- População estudada<br />
A população a ser estudada é constituída de pacientes, advindo de diversas<br />
regiões do Brasil, em especifico, do Estado de Goiás onde o serviço clínico de<br />
Diagnóstico e tratamento de hemangiomas é realizado. O número determinístico de<br />
pacientes a ser analisa<strong>dos</strong> poderá chegar a 950 pessoas, porém, devido aos altos<br />
custos das análises este não ultrapassará 80 indivíduos estuda<strong>dos</strong>. Sendo 40<br />
haplótipos de cada tipo de hemangiomas, plano e cavernoso.<br />
Os pacientes serão convida<strong>dos</strong> a participar do presente estudo, sendo<br />
seleciona<strong>dos</strong> os pacientes ausentes de qualquer tratamento prévio e devidamente<br />
diagnosticado com hemangiomas. A respectiva proposta de estudo será<br />
encaminhada ao Comitê de Ética da Superintendência Leide das Neves para avaliar<br />
os aspectos éticos e legais do estudo.<br />
3.2- Entrevista e coleta de material biológico<br />
As entrevistas serão realizadas pela equipe do Hospital Materno Infantil do<br />
Estado de Goiás, durante os meses de Janeiro e dezembro de 2009, após<br />
consentimento <strong>dos</strong> responsáveis pelas unidades, bem como <strong>dos</strong> pacientes e de<br />
23
seus responsáveis legais. Será utilizado um questionário padronizado (em anexo), o<br />
qual foi elaborado para obtenção <strong>dos</strong> da<strong>dos</strong> sócio-demográficos <strong>dos</strong> pacientes e<br />
fatores clínicos, famílial e genéticos <strong>dos</strong> hemangiomas.<br />
Em seguida, a coleta de material biológico, ou seja, teci<strong>dos</strong> representativos da<br />
lesão serão realiza<strong>dos</strong> pelo corpo clínico do hospital e seguirão para o<br />
processamento e armazenamento <strong>dos</strong> fragmentos tissulares e posteriormente para<br />
as análises genéticas <strong>molecular</strong>es. Os materiais serão alíquota<strong>dos</strong> e conduzi<strong>dos</strong><br />
para serem manti<strong>dos</strong> em cultura 37º C até a realização <strong>dos</strong> testes.<br />
3.3 - Avaliação da Expressão Gênica<br />
Para detectar a expressão <strong>dos</strong> genes referenda<strong>dos</strong> no estudo serão utiliza<strong>dos</strong><br />
a técnica de extração de Áci<strong>dos</strong> Ribonucléicos (RNA) e Retro-transcrição para<br />
construção de cDNA (DNA complementar), em seguida, tais produtos deverão ser<br />
encaminha<strong>dos</strong> para Microarrays. Os genes a serem estuda<strong>dos</strong> estão descritos em<br />
anexo nas figuras 2 e 3.<br />
3.3.1 - Detecção por Microarrays<br />
O RNA total será isolado de hemangioma em proliferação utilizando o<br />
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) seguindo as instruções do fabricantes.<br />
Dez microgramas de RNA de cada tecido será utilizado para transcrição<br />
reversa em cDNA marca<strong>dos</strong> com [α-33P] dCTP e hibridizado separado em filtro<br />
GeneFilter GF211 (ResGen/Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA). Padrões de<br />
24
expressão serão reveladas por imagens fosfóricas (Cyclone,Molecular Dynamics,<br />
Sunnyvale, CA) e analizada pelo software (ResGen/Invitrogen Corp).<br />
3.3.2 - Análises <strong>dos</strong> da<strong>dos</strong><br />
Os da<strong>dos</strong> das entrevistas e os resulta<strong>dos</strong> obti<strong>dos</strong> <strong>dos</strong> microarrays serão<br />
analisa<strong>dos</strong> pelo software (ResGen/Invitrogen Corp) e os da<strong>dos</strong> estatísticos,<br />
<strong>epidemiológico</strong>s pelo programa EpiInfo versão 6.04 (Centers for Disease Control and<br />
Prevention, Atlanta, GA). Prevalência e estimativas de risco serão calculadas com<br />
intervalo de confiança de 95%. Fatores de risco associa<strong>dos</strong> ao hemangioma será<br />
determinada pela análise univariada e análisa<strong>dos</strong> por regressão logística múltipla<br />
através do programa EpiInfo 2000 (Centers for Disease Control and Prevention,<br />
Atlanta, GA).<br />
25
4.0 Cronogramas de Atividades<br />
A presente proposta de estudo poderá ser executada em 3 anos, com início em Janeiro/2009 e término previsto para<br />
janeiro/2012. O Quadro a seguir descreve as etapas principais envolvidas na execução do projeto, indicando período provável<br />
destinado a elas.<br />
Etapas do Projeto 2009/ 2010/ 2011/ 2012<br />
Pesquisa bibliográfica; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
<strong>Estudo</strong> e nivelamento de conhecimentos e condutas;<br />
Preparo de materiais para coleta de da<strong>dos</strong>, início de treinamento do grupo e<br />
♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
determinação <strong>dos</strong> códigos a serem usa<strong>dos</strong> para garantir caráter confidencial ♦ ♦<br />
<strong>dos</strong> participantes;<br />
Aquisição do material permanente e de consumo; ♦ ♦<br />
Organização física <strong>dos</strong> ambulatórios para a realização do projeto; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
Testes <strong>dos</strong> equipamentos utiliza<strong>dos</strong> para as análises <strong>dos</strong> pacientes<br />
♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
participantes do grupo;<br />
Início <strong>dos</strong> atendimentos aos pacientes participantes do grupo; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
Inicio da Realização <strong>dos</strong> Exames Laboratoriais; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
Discussão semanal sobre o andamento do projeto com seminários mensais<br />
sobre um tema relevante ao projeto;<br />
♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦<br />
Análise estatística <strong>dos</strong> resulta<strong>dos</strong> obti<strong>dos</strong> no projeto; ♦ ♦<br />
Elaboração de palestras e construção de pôsteres para a apresentação <strong>dos</strong><br />
resulta<strong>dos</strong> e conclusões para a comunidade científica nacional e internacional.<br />
♦ ♦<br />
26
5.0 Orçamento<br />
Elemento de Despesa Total (R$)<br />
Equipamentos e Material Permanente 198.509,00<br />
Material de Consumo 134.940<br />
Total (R$) 333.449,00<br />
O quadro acima ilustra o orçamento resumido para o desenvolvimento do referido<br />
projeto.<br />
5.1 Orçamento Detalhado<br />
5.1.1 Equipamentos e Material Permanente<br />
Quantidad<br />
e<br />
01<br />
03<br />
Forno de hibridizacao<br />
Discriminação<br />
Camara rotatoria para forno de hibridizacao<br />
Estimativa de Custo<br />
(R$)<br />
Unitário Total<br />
7.660,00 7.660,00<br />
1.568,00 4.704,00<br />
02 Camara de hibridizacao SureHyb 848,00 1.696,00<br />
01<br />
01<br />
02<br />
Axon GenePix ® 4400A Scanners<br />
Setting The Standard For High Resolution,<br />
High Uniformity, and Sample Type Flexibility<br />
Câmera Digital SLR Canon EOS 450 – Rebel<br />
XSi, 12.1 Megapixels ( Corpo de Câmera e<br />
lentes )<br />
Notebook Completo Dell: Processador Intel®<br />
Core 2 Duo T8300 (2.40 GHz, 3 MB L2<br />
Cache, 800 MHz FSB) com 250 GB de disco<br />
rígido (7200 RPM sensor de queda livre), Placa<br />
Gráfica Nvidia GeForce® 8400M GS de 128MB<br />
(64 Bit), ram 4GB, Gravador de DVD 8X +/-<br />
RW, kit multimídia e placa de rede Dell Wireless<br />
360 Bluetooth Interno para Windows Vista,<br />
Miniplaca 4965AGN Wireless-N sem fio da Intel<br />
, com monitor anti-reflexo LCD 15.1”, Webcam<br />
de 2.0 Megapixels e Microfone Integrado,<br />
Mouse sem fio laser, Leitor de Impressões<br />
Digitais e Software UPEK® Protector Suíte,<br />
Módulo Trusted Platform 1.2 com Software de<br />
Gerenciamento de Segurança Infineon,<br />
Windows Vista® Ultimate SP1 Original em<br />
170.200,00 170.200,00<br />
3.200,00 3.200,00<br />
4.635,00 9.270,00<br />
27
01<br />
Português, McAfee Security Center 2008 com<br />
VirusScan, Anti- Spyware, Firewall, SpamKiller,<br />
Controle de Privacidade em Português - 30 dias<br />
MCFE30P<br />
Impressora HP Multifuncional Color LaserJet<br />
CM1312nfi MFP<br />
1779,00 1.779,00<br />
Total N/A 198.509,00<br />
5.1.2 Reagentes e Material de Consumo<br />
Quantidade<br />
Discriminação<br />
01 Kit de completo de extração de RNA e Retrotranscrição<br />
– Para p/250 testes<br />
23 Laminas de vidro customizada – 15.000 Spots<br />
gênicos<br />
05 Aparato de vedacao p/ câmara de hibridizacao (c/5 de<br />
8X15K)<br />
10 Reagentes p/ microarrays Quick Amp 20 reacoes<br />
10 Cianina CTP-1 cor (20 reacoes)<br />
02 Reagentes p/ controle "RNA Spike-In one color"<br />
10 Conj. de reag. p/ hibridação de cRNA fluorescentes<br />
10 Tampao para lavagem "Gene Expression" (Buffer 2-<br />
4L)<br />
10 Solucao de lavagem e estabilizacao para microarrays<br />
Estimativa de Custo<br />
(R$)<br />
Unitário Total<br />
8.250,00 8.250,00<br />
2.000,00 46.000,00<br />
352,00 1.760,00<br />
2.340,00 23.400,00<br />
2.000,00 20.000,00<br />
1.210,00 2420,00<br />
450,00 4.500,00<br />
352,00 3.520,00<br />
192,00 1.920,00<br />
03 Luvas cirúrgicas descartáveis – cx c/ 1000 143,00 429,00<br />
15<br />
Ponteiras plásticas p/ microp. – 10 ml (4 pacotes de<br />
50)<br />
57,00 855,00<br />
10<br />
Ponteiras plásticas p/micropipeta -1000µl (10 pct. de<br />
1000)<br />
241,00 2.410,00<br />
10<br />
Ponteiras plásticas p/ microp. – 200 e 20µl (10 pct. De<br />
1000)<br />
241,00 2.410,00<br />
05 Ponteiras plásticas para micropipeta - 2µl 369,00 1.845,00<br />
50 Tubos Ependorf – 2 ml 20,00 1.000,00<br />
50 Tubos Ependorf – 0.5 ml 18,00 900,00<br />
20 Tubos para PCR – US-1402-3500 114,00 2.280,00<br />
05 Tubos cônicos de plásticos c/ tampa - 15ml 158,00 790,00<br />
28
05 Tubos cônicos de plásticos c/ tampa - 50ml 158,00 790,00<br />
04 Taq DNA polimerase (1000 U), Pharmacia Biotech 400,00 1.600,00<br />
05 Tubos cônicos de plásticos c/ tampa - 50ml 158,00 790,00<br />
01 Ácido Cítrico – lL 50,00 50,00<br />
05 Ácido Bórico - 1Kg 10,00 50,00<br />
01 Citrato de Sódio – 1Kg 50,00 50,00<br />
10 Etanol – lL 10,00 100,00<br />
05 Isopropanol – lL 20,00 100,00<br />
01 Na2EDTA – 1Kg 50,00 50,00<br />
01 Iodeto de Sódio, 1Kg 220,00 220,00<br />
01<br />
Primers – conjunto completo para a amplificação de<br />
150,00 6.000,00<br />
Genes da Angiogenese<br />
10 litros Etanol (95%) 24,50 240,00<br />
5 litros Éter 35,20 176,00<br />
1 litro Ácido Clorídrico 35,00 35,00<br />
Total N/A 134.940<br />
29
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS<br />
1. Anfosso L, Efferth T, Albini A, Pfeffer U. Microarray expression profiles of<br />
angiogenesis-related genes predict tumor cell response to artemisinins. The<br />
Pharmacogenomics Journal, (2006), 6, 269–278.<br />
2. Berard M, Sordello S, Ortega N, Carrier J L, Peyri N, Wassef M, Bertrand N,<br />
Enjolras O, <strong>Dr</strong>ouet L, Plouett J. Vascular Endothelial Growth Factor Confers a<br />
Growth Advantage in Vitro and in Vivo to Stromal Cells Cultured from Neonatal<br />
Hemangiomas. American Jounial of Pathology, (1997), 4,150.<br />
3. Chiller KG, Passaro D, Frieden IJ. Hemangiomas of infancy: clinical<br />
characteristics, morphologic subtypes, and their relationship to race, ethnicity, and<br />
sex. Arch Dermatol, (2002), 138, 1567-76.<br />
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5. Dandras S S, North P E, Bertoncini J, Mihm M C, Detmar M. Infantile<br />
hemangiomas are arrested in an early developmental vascular differentiation state.<br />
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6. Della Nina B I, Prado de Oliveira Z N, Rivitti Machado M C M, Macéa J M.<br />
Apresentação, evolução e tratamento <strong>dos</strong> hemangiomas cutâneos – Experiência do<br />
Ambulatório de Dermatologia Infantil do Hospital das Clínicas da Faculdade de<br />
Medicina da Universidade de São Paulo. Anais Brasileiros de Dermatologia, (2006),<br />
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Vanwijck R, Miikka V. Capillary Malformation–Arteriovenous Malformation, a New<br />
Clinical and Genetic Disorder Caused by RASA1 Mutations. The American Society of<br />
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8. Felmeden D C, Blann A D, Lip G Y H.. Angiogenesis: basic pathophysiology and<br />
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9. Goldenberg DC, Cristofani LM, Almeida MTA, Filho VO, Ferreira MC. Tratamento<br />
<strong>dos</strong> hemangiomas cutâneos. Pediatria (São Paulo), (2001), 23, 45-51.<br />
10. Gontijo B, Silva CMR, Pereira LB. Hemangioma da infância. Anais Brasileiro<br />
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30
11. Gontijo B, Silva CMR, Pereira LB. Malformações vasculares. Anais Brasileiros de<br />
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12. Marchuk D A. Pathogenesis of hemangioma. The Journal of Clinical<br />
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13. Martins da Silva F, Moacir F B A, de Figueiredo P J. HEMANGIOMA. Faculdade<br />
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14. Miikka V. Angiogenomics: towards a genetic nosology and understanding of<br />
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15. Mulliken JB, Glowacki J. Hemangiomas and vascular malformations in infants<br />
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17. Risau W, Flamme I. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol, (1995), 11, 73–91.<br />
18. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature, (1997), 386, 671–4.<br />
19. Risau W. Angiogenesis Is Coming of Age. Circulation Research, (1998), 82, 926-<br />
928.<br />
20. Ruiter MC; De Poelmann E, Mentink, MMT; Vaniperen L; Gittenberger-de-Groot<br />
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21. Solimene ACC, Boscardin SB, Ferraz MGC, Chammas R. Angiogenesis in solid<br />
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22. Taksande A M, Vilhekar KY. Cavernous hemangioma of the buccal mucosa in<br />
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23. Yu Y, Varughese J, Brown L F., Mulliken J B., Bischoff J. Increased Tie2<br />
Expression, Enhanced Response to Angiopoietin-1, and Dysregulated Angiopoietin-2<br />
Expression in Hemangioma-Derived Endothelial Cells. American Journal of<br />
Pathology, (2001), 159, 6.<br />
31
Anexo I<br />
ANEXOS<br />
<strong>Estudo</strong> <strong>epidemiológico</strong> e <strong>molecular</strong> <strong>dos</strong> hemangiomas<br />
de pacientes trata<strong>dos</strong> no Hospital Materno Infantil no<br />
Estado de Goiás<br />
1. Unidade:___________________________________________ Unid.( )<br />
2. Número: RC__________ Data: ___/___/_____ R ( )<br />
3. Nome:___________________________________________________________<br />
4. Endereço residencial<br />
Rua: ______________________________________________________________<br />
Bairro:________________________ Município:___________________________<br />
Telefone para contato:_____________________<br />
5. Idade:________________________________ Age ( )<br />
6. Sexo: Feminino ( ) Masculino ( ) Sex ( )<br />
7. Naturalidade:__________________________ Nat ( )<br />
8. Estado Civil<br />
Solteiro (1) Casado (2) Amasiado (3) Viúvo (4) Separado (5) E. Civil ( )<br />
9. Grau de instrução<br />
1º Grau (1) 2º Grau (2) Inst.( )<br />
3º Grau (3) Nenhum (4)<br />
10. Renda Familiar<br />
≤ 1 salário (1) 2 a 5 salários (3) R. familiar ( )<br />
6 a 10 salários (2) > 10 salários (4)<br />
32
11. Profissão: ______________________________________________________<br />
12. Já teve alteração nas veias, artéria ou circulação diagnosticada por outro<br />
médico?<br />
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Hep. ( )<br />
13. Algum caso de hemangioma na família?<br />
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Fam. Hep. ( )<br />
Em caso afirmativo, grau de parentesco:<br />
Cônjuge (1) Mãe (2) Pai (3) Irmão (4) Outros (5)<br />
14. Já recebeu tratamento anteriormente ?<br />
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Tratament ( )<br />
Em caso afirmativo, Qual:____________________<br />
1 vez (1) 2 a 5 vezes (2) N. Tratament ( )<br />
6 a 10 vezes (3) > 10 vezes (4)<br />
15. Quando foi o primeiro tratamento ?______________ (Ano)<br />
16. Já sofreu alguma cirurgia?<br />
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Cir. ( )<br />
17. A criança nasceu com a lesão relatada?<br />
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Lesão. ( )<br />
18. O aparecimento da lesão deu-se após o nascimento?<br />
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Lesão.após ( )<br />
19. Doença de base ou Genética :_____________________________ D.base ( )<br />
33
20. Testes laboratoriais<br />
Anti-Fosfolípides ( )SNR ( )SR ..... Anti-fosfol. ( )<br />
Anti trombina ( )SNR ( )SR .. Anti-trombin( )<br />
Fibrinólise ( )SNR ( )SR Fibrinólise ( )<br />
Fator VII ( )SNR ( )SR ... Fator VII ( )<br />
Inibidor ativador de plasminogênio ( )SNR ( )SR I. A. Plasm.( )<br />
21. Testes por Imagem<br />
Rx ( )SNR ( )SR .................................... Rx . ( )<br />
Tomografia ( )SNR ( )SR ......................... TM . ( )<br />
Ressonância ( )SNR ( )SR ......................... RE.. ( )<br />
22. Outros Testes<br />
34
Anexo II<br />
Figura 1B. Modificada de Carmen M. Barne´ s*, 2005. Genes a serem estuda<strong>dos</strong> descritos na figura abaixo<br />
Referem somente aos clusters H e P com alta similaridade de expressão no Hemangioma.<br />
35
Figura 1C. Modificada de Carmen M. Barne´ s*, 2005. Referem somente aos clusters H e P com alta similaridade<br />
de expressão no Hemangioma.<br />
36