Caracterização de Microcápsulas Contendo Caseína e ... - Ital

AUTORES
AUTHORS
Renata MUKAI-CORREA
Ana Silvia PRATA
Izabela Dutra ALVIM
Carlos GROSSO
Departamento de Alimentos e Nutrição,
Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas,
Rua Monteiro Lobato, 80 - Cidade Universitária
13083-862 – Campinas, SP, Brasil
Tel.: (19) 3788-4079 – Fax: (19) 3788-4060
grosso@fea.unicamp.br
PALAVRAS-CHAVE
KEY WORDS
Microencapsulação; Gelificação iônica; Dieta
para larva de peixe.
Microencapsulation; Ionic gelation; Fish
larvae feed.
RESUMO
Caracterização de Microcápsulas Contendo
Caseína e Gordura Vegetal Hidrogenada
Obtidas por Gelificação Iônica
Characterisation of Microcapsules
Containing Casein and Hydrogenated
Vegetable Fat, Obtained by Ionic Gelation
Microcápsulas contendo caseína e gordura vegetal hidrogenada foram produzidas
por meio de gelificação iônica com íons cálcio, utilizando alginato, goma gelana e pectina
como materiais de revestimento ou de parede. Essas matrizes apresentam restrições quanto à
retenção de compostos hidrofílicos de baixa massa molar, requerendo a inclusão adicional de
compostos hidrofóbicos para controlar a liberação do material hidrofílico. Em contrapartida,
algumas características funcionais dessas matrizes como alto conteúdo de água, baixa
solubilidade aquosa e ter seu tamanho e forma física facilmente ajustados, podem possibilitar
o desenvolvimento de tais matrizes como dieta para alimentação de larvas de peixe.
As porcentagens de encapsulação protéica obtidas foram altas, variando de 78,8% para
as microcápsulas produzidas com goma gelana a 95,4% para as microcápsulas produzidas com
alginato, apresentando-se insolúveis em água, com boa flutuabilidade quando suspensas em
coluna de água, distribuição de tamanho unimodal e tamanho médio em torno de 150 µm. A
morfologia das microcápsulas úmidas bem como a distribuição e localização da gordura e da
proteína foram bem definidas por meio das microscopias óptica e confocal (MVLC), mostrandose
aproximadamente esféricas e multinucleadas quanto à distribuição das gotas de gordura. As
microcápsulas liofilizadas foram observadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e
mantiveram parcialmente sua estrutura. A digestibilidade protéica aparente, medida por meio
da queda do pH do sistema, mostrou que a proteína encapsulada foi acessível ao sistema
enzimático utilizado, sugerindo sua avaliação em sistemas in vivo. No entanto, a otimização
do conteúdo de recheio em bases nutricionais mais adequadas é requerimento fundamental
para que esse tipo de microcápsula possa ser empregado como dieta na alimentação de
larvas de peixe.
SUMMARY
Microcapsules containing casein and hydrogenated vegetable fat were produced by
ionic gelation using alginate, gellan gum and low methoxylated pectin as wall materials. To
control the release of the low molecular mass hydrophilic compounds used as core materials
in these matrices, the addition of hydrophobic compounds such as lipids was also required.
On the other hand, these microcapsules presented some functional properties such as a very
high water content and very low water solubility, and they could be produced in different sizes
and shapes. These characteristics could make their use possible in fish larvae feeding.
Protein encapsulation yields were high, varying from 78.8 to 95.4% for gellan gum
and alginate microcapsules, respectively. The microcapsules were water insoluble, showing
good buoyancy in a column of water. The size of the microcapsules was about 150 µm and the
size distribution was unimodal. The morphology of the moist microcapsules and the location
and distribution of the protein and fat were clearly observed using optical and laser confocal
microscopy (LCM), the fat droplets being approximately spherical and multinucleated. The
freeze dried microcapsules were observed by scanning electronic microscopy (SEM), showing
a partially maintained structure. The apparent digestibility, evaluated from the pH drop of the
system, showed that the encapsulated protein was accessible to the enzyme system used,
suggesting its evaluation using in vivo assays. However, the optimisation of the nutritional
balance of the core material is an essential requirement for the use of this type of microcapsule
in fish larvae feeding.
Braz. J. Food Technol., v.8, n.1, p. 73-80, jan./mar., 2005 73 Recebido / Received: 30/07/2004. Aprovado / Approved: 14/02/2005.

1. INTRODUÇÃO
Dietas microencapsuladas estão sendo largamente
utilizadas no cultivo de algumas espécies de peixes, porém
a completa substituição do alimento vivo tem se mostrado
limitada em conseqüência da baixa assimilação e digestão
dessas dietas (KOLKOVSKI & TANDLER, 1995; YÚFERA et al.,
1999; KOLKOVSKI, 2001).
Os maiores problemas apresentados por dietas
microparticuladas para alimentação de larvas de peixe incluem
a aceitabilidade, a digestibilidade, o tamanho, a flutuabilidade,
a lixiviação de nutrientes e a equivalência nutricional, com
relação à composição do alimento vivo (TESHIMA et al., 2000;
ÖNAL & LANGDON, 2000; CAHU & ZAMBONINO-INFANTE,
2001; LANGDON, 2003; WALFORD & LAM, 1992; HAMRE et
al., 2001).
O processo de produção de microcápsulas por gelificação
iônica é simples e de baixo custo, ocorrendo quando uma solução
polimérica contendo os nutrientes é gotejada sobre uma solução
iônica em concentrações adequadas, podendo-se obter razoáveis
níveis de recheio e cápsulas de diferentes formas e tamanhos
(WILLAERT & BARON, 1996). Dietas microencapsuladas
produzidas com agar, carragena ou alginato, por meio de
gelificação iônica utilizando íons cálcio como agente de
reticulação, apresentaram-se estáveis em água, sendo quebradas
e digeridas por algumas espécies de peixes de água doce
(LOPEZ-ALVARADO et al., 1994; GUTHRIE et al., 2000). Larvas
de Pennaeus japonicus alimentadas com microcápsulas à base
de carragena, contendo caseína como principal fonte protéica,
apresentaram resultados de crescimento e sobrevivência similares
aos de larvas alimentadas com artemias e rotíferos (KOSHIO et
al., 1989, apud KOVALENKO et al., 2002).
Experimentos in vitro têm-se mostrado adequados
para avaliações preliminares de proteínas usadas em dietas
microencapsuladas para larvas de peixe (ALARCON et al.,
1999; GARCIA-ORTEGA et al., 2000), apresentando boa
correlação com valores da digestibilidade in vivo (LAZO et
al., 1998; BRUNSON et al., 1997). Entre os métodos in vitro
para estimar a digestibilidade protéica, o método de queda
de pH vem sendo bastante utilizado (ALARCON et al., 1999;
YÚFERA et al., 2000; SHIPTON & BRITZ, 2002). Esse método
tem como vantagem a facilidade e rapidez da estimativa da
taxa de hidrólise da proteína, entretanto a queda de pH durante
o período de digestão pode interferir na atividade da enzima
(EZQUERRA et al., 1998).
No presente estudo foram produzidas microcápsulas
contendo caseína e gordura vegetal hidrogenada por gelificação
iônica com íons cálcio, usando alginato, pectina de baixo teor
de esterificação e goma gelana, como materiais de parede. As
microcápsulas foram avaliadas quanto à solubilidade em água,
flutuabilidade, distribuição do tamanho de partículas, morfologia
e digestibilidade relativa in vitro para verificar a acessibilidade
da proteína encapsulada por enzimas proteolíticas. A secagem
das microcápsulas foi testada por liofilização como alternativa
para extensão de sua vida útil.
Braz. J. Food Technol., v.8, n.1, p. 73-80, jan./mar., 2005 74
MUKAI-CORREA, R. et al. Caracterização de Microcápsulas
Contendo Caseína e Gordura Vegetal
Hidrogenada Obtidas por Gelificação
Iônica
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Alginato de sódio, Manugel-DMB (alto peso molecular,
alto conteúdo de ácido gulurônico, lote 500771) e goma gelana
(alto peso molecular lote 9L0020A) fornecidos pela Nutrasweet
Kelco/Monsanto (São Paulo); pectina cítrica de baixo teor de
esterificação (BTM, tipo 8002/R, grau de metoxilação de 26-
30%, grau de amidação de 15-21%, lote 11655), doada pela
Ind. Braspectina S.A. (Limeira, SP); gordura vegetal hidrogenada
comercial, produzida a partir de óleo de soja, comprada no
comércio local; caseína comercial (# 60, Narden, Ucrânia, 82,4%
de proteína), fornecida pela M. Cassab Ind. Ltda. (São Paulo);
hidróxido de sódio e ácido clorídrico fornecido pela Vetec (São
Paulo); cloreto de cálcio dihidratado (CaCl 2.2H 2O, lote 64271)
fornecido pela Merck (São Paulo); isotiocianato de fluoresceína
(FITC, lote 90K5316) , Nile Red (lote 47H3445), tripsina porcina
(lote T7409), base Trizma para preparo-tampão tris-HCl (lote
T1503) provenientes da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
USA); e isolado protéico de soja fornecido pela Solae Company
(94,7% de proteína, Esteio, RS).
2.2 Métodos
2.2.1. Produção de microcápsulas contendo proteína
e gordura vegetal hidrogenada
Microcápsulas foram preparadas conforme descrito por
MUKAI-CORREA et al. (2004). As soluções poliméricas aquosas
foram preparadas à concentração de 1% (p/p), ao passo que o
material de recheio consistiu em uma mistura de 60% de gordura
vegetal hidrogenada (fundida a 70 °C) e 40% de uma solução
aquosa de caseína (pH 9, 11,5% p/p). A solução polimérica e
o material de recheio na proporção de 9:1 foram mantidos a
65 °C e homogeneizados em Ultra Turrax T50 (IKA, Works do
Brasil, RJ) a 10.000 rpm, durante 1 minuto. Essa solução foi
pulverizada em uma solução de CaCl 2 (1% p/p), mantida a 23 °C
com agitação lenta constante, com o auxílio de um pulverizador
capilar de vidro com pressão de ar de 0,90 kgf/cm 2 e altura entre
o pulverizador e o banho de 18 cm. As microcápsulas foram
mantidas no banho iônico por 30 minutos, e então separadas
em peneira (0,125 mm) e lavadas com 700 mL de água. Todas
as preparações foram feitas em triplicata. O pH das soluções
poliméricas foi medido imediatamente antes da formação das
microcápsulas.
2.2.2. Secagem das microcápsulas
As microcápsulas foram inicialmente congeladas
(–18 °C), e transferidas à câmara de secagem do liofilizador
(Edwards Pirani 501), onde a temperatura foi abaixada a –40 °C,
sob uma pressão de 0,1 mmHg para liofilização. O material
seco foi passado por peneira, e frações entre 0,60 e 0,125 mm
foram misturadas e mantidas em dessecador com sílica gel à
temperatura ambiente para uso posterior.

2.2.3. Composição das microcápsulas
As microcápsulas foram caracterizadas quanto ao
conteúdo de nitrogênio total pelo método de Kjeldahl (AOAC,
1998), quanto à umidade (AOAC, 1998) e quanto à eficiência de
encapsulação, a qual foi calculada por meio da determinação da
proteína (N% x 6,25) que permaneceu nas microcápsulas, após o
processo de cura, comparada com a quantidade inicial presente
na solução formadora das microcápsulas, sendo expressa em
porcentagem (%).
2.2.4. Solubilidade
A solubilidade das microcápsulas em água foi avaliada
utilizando método similar ao descrito por PEDROZA-ISLAS
et al. (2000). Foram pesados 3 g de microcápsulas de cada
tratamento, transferindo-as para tubos contendo água destilada
(25±1 °C). Um tubo de cada tratamento foi retirado do banho
aos 15, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos, sendo o material filtrado
a vácuo em papel Whatman nº 40. O papel então foi seco em
estufa com circulação forçada de ar (60 °C) até peso constante.
A porcentagem de solubilidade foi obtida pela diferença entre os
pesos secos finais e iniciais. Para essa avaliação as microcápsulas
utilizadas foram produzidas sem a adição da proteína e da
gordura vegetal hidrogenada.
2.2.5. Flutuabilidade
A flutuabilidade foi medida em uma cubeta de quartzo
(4,0 x 2,0 x 23,0 cm), contendo água destilada (24±1 °C). Foram
pesados aproximadamente 2 g de microcápsulas úmidas, e
estas colocadas na superfície da coluna de água da cubeta.
Um registro de imagens foi realizado ao longo do tempo, com
câmera Pentax K-1000 (lente macro100 mm), em intervalos
predeterminados: t = 0 (imediatamente após as microcápsulas
serem colocadas na superfície da coluna de água), 0,75, 1, 5, 10,
30 e 60 minutos. O experimento foi conduzido em triplicata.
2.2.6. Morfologia
A morfologia geral das microcápsulas quando úmidas
foi feita em microscópio óptico Nikon (Eclipse E800 – Japan)
utilizando objetivas de 10x e 20x. As imagens foram registradas
e salvas utilizando o software Image Pro Plus 4.0 (Media
Cibernetics, USA).
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Jeol mod.
JMS – T300, Japan) foi usada a 5 e 10kV para observar as
microcápsulas liofilizadas. As partículas foram fixadas em “stubs”
de alumínio sobre fitas de cobre adesivas, com dupla face, e
posteriormente recobertas com uma fina camada de ouro em
evaporador Balzer (Baltec SCD50, Liechtenstein, Alemanha), a
40 mA/150 segundos.
A morfologia no interior das microcápsulas úmidas foi
também observada em microscópio de varredura laser confocal
Olympus LSM (Olympus, Tóquio, Japão). O laser foi ajustado
para o modo de fluorescência verde/vermelho, que produziu
dois comprimentos de onda de excitação (488 e 514 nm).
Imagens fluorescentes verde e vermelha foram obtidas a partir
de dois canais separados e posteriormente foram superpostas.
Braz. J. Food Technol., v.8, n.1, p. 73-80, jan./mar., 2005 75
MUKAI-CORREA, R. et al. Caracterização de Microcápsulas
Contendo Caseína e Gordura Vegetal
Hidrogenada Obtidas por Gelificação
Iônica
Foram também coletadas imagens utilizando o modo Differential
Interfacial Contrast (DIC). Para todas as observações, a altura de
captação das imagens foi ajustada para a metade da altura das
cápsulas. As imagens foram analisadas utilizando o software
Fluoview versão 3.2.5 (Olympus, Tóquio, Japão). Para esta
técnica a solução protéica foi colorida com FITC, de acordo
com metodologia descrita por LAMPRECHT et al. (2000), com
modificação da concentração (50 µL/2,5 g de proteína). Após
a adição do corante à solução protéica, a solução resultante
foi agitada lentamente por 1 hora a 40 °C, antes do uso. Em
paralelo, a gordura vegetal hidrogenada foi corada com Nile
Red (1 mg/30 g de substância hidrofóbica), também de acordo
com metodologia proposta por LAMPRECHT et al. (2000). Após
o tempo necessário para corar a proteína, o procedimento
de fabricação das microcápsulas foi o mesmo descrito
anteriormente. Após a cura e a lavagem das microcápsulas
foi feita a observação confocal destas, suspensas em água,
utilizando lâmina e lamínula.
2.2.7. Tamanho médio e distribuição de tamanho das
partículas úmidas
O tamanho médio e a distribuição de tamanho das
microcápsulas úmidas foram determinados em Laser Light
Scattering Analyzer LA-900 (Horiba Instruments, Inc., Japan).
A quantidade de amostra foi ajustada a um nível adequado de
refração para se obter leitura no aparelho.
2.2.8. Digestibilidade relativa in vitro
Os ensaios de digestibilidade foram conduzidos para
as amostras úmidas, utilizando o método de queda de pH, de
acordo com LAZO et al. (1998). Microcápsulas úmidas foram
dispersas a uma concentração de proteína de 312,5 mg/100 mL
de água destilada. O pH da solução foi corrigido para 8,0, com
a adição de NaOH ou HCl (0,1N). A suspensão foi mantida sob
agitação em béquer encamisado, mantendo-se a temperatura
da solução em 37±1 °C. A seguir foram adicionados 5 mL
de solução de tripsina (tampão Tris-HCl 50 mM CaCl 2, pH
8,0 e 1,5 mg/mL) e o monitoramento do pH feito durante
10 minutos. O valor do pH, após esse tempo de reação, foi
medido e comparado com o valor obtido para caseína livre em
solução (3,12 mg de proteína/mL, pH 8,0). Os ensaios foram
feitos em triplicata. O valor da digestibilidade foi calculado
de acordo com a Equação 1. Embora tenham sido mantidas
as mesmas relações enzima/substrato, para todos o ensaios
efetuados, o método sofreu uma adaptação quanto ao volume
de água utilizado, em razão da dificuldade para suspender as
microcápsulas rapidamente. Caseína e isolado protéico de soja
(3,12 mg/mL, pH 8,0) foram também avaliados e os resultados
obtidos foram comparados com os valores observados por
LAZO et al. (1998).
% D
onde:
∆pHamostra
= . 100
Equação 1
∆pH
caseína
∆pH amostra = variação de pH da amostra
∆pH caseína = variação de pH da caseína

2.2.9. Análise estatística
O programa Statistica® 5.5 (Statsoft, Tulsa, OK, USA)
foi utilizado para a análise de variância (ANOVA) e o teste de
Tukey foi utilizado para determinar diferenças significativas entre
os valores obtidos para a medida de digestibilidade entre as
diferentes microcápsulas (p

3.4. Morfologia das microcápsulas
As microcápsulas apresentaram forma aproximadamente
esférica, multinucleadas, com distribuição das gotas de gordura
por todo o seu volume. Variações de tamanho entre as gotas
foram também observadas. A morfologia das microcápsulas,
incluindo o tamanho e a distribuição das gotas de gordura, foi
facilmente observável por meio de microscopia óptica, como
apresentado na Figura 2a, por intermédio de uma microcápsula
de goma gelana, caseína e gordura. Entre os sistemas estudados,
as microcápsulas produzidas com goma gelana mostraram-se
ligeiramente mais transparentes que as obtidas com pectina
ou alginato. Ainda na Figura 2(b), pode ser observada uma
microcápsula contendo alginato, caseína e gordura, por meio
de microscopia confocal no modo DIC obtida na metade da
altura da microcápsula. Nesse modo de captação, o recurso
de fluorescência não é utilizado, sendo possível observar a
distribuição e o tamanho das gotas de gordura ao longo
da área ocupada pela microcápsula. Embora apresentando
resultados semelhantes aos observados na microscopia óptica,
a microscopia confocal é mais cara comparativamente.
Microcápsulas obtidas por gelificação iônica contendo
gordura vegetal hidrogenada, apesar de apresentarem boas
propriedades funcionais como a liberação controlada da
proteína, contêm um alto teor de umidade e, portanto, podem
apresentar uma vida útil curta. A secagem das microcápsulas
pode aumentar sua durabilidade, estocagem e facilidade de
manuseio, no entanto a manutenção da estrutura, em razão do
alto conteúdo de água, é um problema ainda a ser resolvido. As
microcápsulas liofilizadas usadas neste trabalho apresentaram
considerável reidratação após o contato com água, o que
pode facilitar a ingestão simulando o alimento vivo. Altas taxas
de reidratação foram observadas para microcápsulas secas
de alginato e alginato-quitosana, que readquiriram 75% do
diâmetro original, após 30 minutos de imersão (POLK et al.,
1994) .
Braz. J. Food Technol., v.8, n.1, p. 73-80, jan./mar., 2005 77
MUKAI-CORREA, R. et al. Caracterização de Microcápsulas
Contendo Caseína e Gordura Vegetal
Hidrogenada Obtidas por Gelificação
Iônica
FIGURA 1. Flutuabilidade de microcápsulas de pectina, caseína e gordura vegetal hidrogenada em cubeta de quartzo com dimensões
de 4 x 2 x 23,0 cm.
FIGURA 2. a) Microcápsula de goma gelana contendo caseína e
gordura observada por microscopia óptica (barra = 50 µm) e b)
microcápsula de alginato contendo caseína e gordura observada
por microscopia confocal no modo DIC (barra = 100 µm).

A morfologia das microcápsulas secas por liofilização,
observada por microscopia eletrônica de varredura (Figura
3a), aparentemente indicou um alto grau de aglomeração,
o que pode promover a perda da forma das partículas,
FIGURA 3. Micrografias obtidas por MEV para microcápsulas
de alginato contendo proteína e gordura vegetal hidrogenada
secas por liofilização: a) Vista geral (100x); b) Microcápsulas
(800x); c) Detalhe da parede (2.000x).
Braz. J. Food Technol., v.8, n.1, p. 73-80, jan./mar., 2005 78
MUKAI-CORREA, R. et al. Caracterização de Microcápsulas
Contendo Caseína e Gordura Vegetal
Hidrogenada Obtidas por Gelificação
Iônica
independentemente do material de parede utilizado. Entretanto,
quando um aumento maior de observação foi utilizado (Figura
3b), pode ser observado que algumas microcápsulas mantiveram
um contorno próximo do esférico, com esferas internas bem
definidas, correspondendo às gotas de gordura incrustadas
no material de parede. A integridade da microcápsula parece
ter se mantido pela presença da gordura vegetal hidrogenada
na matriz, produzindo microcápsulas com propriedades
interessantes para a liberação controlada da proteína, conforme
observado anteriormente por MUKAI-CORREA et al. (2004).
A microscopia confocal das microcápsulas úmidas
contendo proteína e gordura complementa as observações
morfológicas efetuadas neste trabalho. A técnica permite
observar o interior das amostras, sem danificar a matriz
gelificada. Na Figura 4a, a proteína foi corada com FITC, ao
passo que, na Figura 4b, a gordura vegetal hidrogenada foi
corada com Nile Red. Na Figura 4c, as imagens anteriores são
superpostas pelo software do aparelho, permitindo observar
toda a superfície da microcápsula, sendo possível observar a
localização, forma física e distribuição de tamanho das gotas
de gordura ligadas ao Nile Red, apresentando cor vermelha, ao
longo da superfície interna utilizada para a captação da imagem.
A proteína ligada ao corante FITC, apresentando cor verde na
micrografia, distribuiu-se uniformemente por toda a superfície
de captação, observando-se também que a microcápsula é
aproximadamente esférica.
3.5. Tamanho das partículas
A distribuição do tamanho das partículas, como
ilustrado na Figura 5, para as microcápsulas produzidas com
goma gelana, mostrou-se unimodal como também observado
para microcápsulas produzidas com outros materiais de
parede contendo proteína e gordura vegetal hidrogenada. O
tamanho médio das microcápsulas ficou em torno de 150 µm.
O ajuste para outros tamanhos de microcápsula é relativamente
simples e pode ser obtido por meio do ajuste do diâmetro do
capilar do sistema de aspersão. Entretanto, a polidispersidade
apresentada em muitos casos por polissacarídeos, pode conferir
alguma aglomeração entre as microcápsulas, o que por sua vez
pode representar alguma dificuldade na correta determinação
do tamanho das microcápsulas, por meio da técnica do laser
scattering.
3.6. Digestibilidade relativa in vitro
A digestibilidade in vitro foi avaliada por intermédio do
acompanhamento da queda do pH. O resultado é expresso com
relação à digestibilidade medida para a caseína, considerada
referência em virtude da sua alta digestibilidade in vivo, ao
redor de 99%, conforme determinado para camarões Penaeus
vannamei (AKIYAMA et al., 1989, apud LAZO et al., 1998), e de
100% e 96% para salmão do Atlântico e truta, respectivamente
(GLENCROSS et al., 2004).
A Tabela 1 apresenta os valores de digestibilidade
relativa in vitro das microcápsulas contendo caseína e gordura
vegetal hidrogenada obtidas com os materiais poliméricos
estudados. Microcápsulas produzidas com alginato ou com
pectina BTM não apresentaram diferença significativa entre si

(p

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