P1 蛋白質分離與定量

Protein Isolation and Quantitative Analysis
P1 蛋 白 質 分 離 與 定 量
莊 榮 輝
雞 蛋 的 卵 白 中 , 含 有 胰 蛋 白 (trypsin) 的 專 一 性 抑 制 劑 – 雞 卵 粘 多 醣 蛋 白
(chicken ovomucoid protein, CHOM)。 本 實 驗 以 丙 酮 沈 澱 CHOM, 離 心 取 得 蛋 白 質 並
乾 燥 後 , 以 Bradford method 測 定 其 蛋 白 質 含 量 。 所 得 的 CHOM 將 用 在 下 一 個 實 驗
P2, 作 為 親 和 層 析 法 的 專 一 性 配 體 , 以 便 釣 取 胰 蛋 白 ; 並 且 將 在 膠 體 電 泳 實 驗 P3
檢 查 其 純 度 。 鴨 蛋 蛋 白 中 也 有 類 似 的 黏 多 糖 蛋 白 DKOM, 除 了 可 以 結 合 trypsin 之 外 ,
也 可 與 chymotrypsin 結 合 , 其 抽 取 純 化 方 法 與 CHOM 相 同 。
1.1 背 景 知 識
本 實 驗 將 展 示 : (1) 蛋 白 質 的 丙 酮 沈 澱 法 、(2) 高 速 離 心 法 、(3) 蛋 白 質 脫 鹽 , 以 及
(4) Bradford 蛋 白 質 定 量 法 ; 在 以 上 各 步 驟 操 作 同 時 , 也 要 學 習 (5) 微 量 吸 管 的 校 正
與 其 正 確 操 作 方 法 , 以 便 奠 定 生 化 實 驗 精 確 定 量 的 基 石 。
1.1.1 蛋 白 質 沈 澱 法
在 各 種 分 離 方 法 當 中 , 沈 澱 法 最 常 用 在 前 面 的 幾 個 步 驟 , 尤 其 有 許 多 方 便 的 沈
澱 方 法 , 可 以 有 效 地 把 蛋 白 質 自 粗 抽 取 液 中 分 離 出 來 。
a) 硫 酸 銨 沈 澱 法 : 每 個 蛋 白 質 的 分 子 表 面 上 , 都 分 布 有 若 干 比 例 的 非 極 性 區 域 ,
會 凝 集 許 多 水 分 子 以 便 溶 入 水 溶 液 中 ; 若 在 此 水 溶 液 加 入 大 量 硫 酸 銨 , 則 因 為
硫 酸 銨 的 高 度 水 合 能 力 , 搶 走 聚 集 在 蛋 白 質 表 面 的 水 分 子 , 使 得 蛋 白 質 表 面 的
非 極 性 區 域 暴 露 出 來 , 相 互 以 疏 水 性 引 力 結 合 , 並 成 為 聚 合 體 而 沈 澱 下 來 。
b) 等 電 點 沈 澱 法 : 若 把 蛋 白 質 溶 液 的 pH 調 到 其 等 電 點 , 則 此 蛋 白 質 所 帶 的 淨 電
荷 為 零 , 分 子 間 的 排 斥 力 因 而 下 降 , 得 以 互 相 吸 引 成 聚 合 體 而 沈 澱 。
c) 有 機 溶 劑 沈 澱 法 : 當 蛋 白 質 水 溶 液 加 入 大 量 有 機 溶 劑 , 水 分 子 濃 度 被 稀 釋 ,
蛋 白 質 的 溶 解 度 便 迅 速 下 降 , 因 而 得 以 沈 澱 下 來 。 但 因 為 有 機 溶 劑 與 水 混 合
後 會 產 生 熱 , 容 易 造 成 蛋 白 質 的 變 性 , 因 此 要 在 極 低 溫 下 操 作 。 常 用 的 有 機 溶
劑 有 丙 酮 或 甲 醇 , 在 沈 澱 後 也 常 用 乙 醚 來 帶 走 丙 酮 , 以 加 速 乾 燥 。
生 物 化 學 實 驗 P1-1

蛋 白 質 分 離 與 定 量
P1
d) 另 外 , 三 氯 醋 酸 (trichloroacetic acid, TCA) 是 很 強 的 蛋 白 質 變 性 劑 , 許 多 蛋 白
質 遇 到 TCA 都 會 變 性 沈 澱 , 無 法 再 恢 復 原 態 。 因 此 ,TCA 對 皮 膚 有 很 強 的 腐
蝕 性 , 不 小 心 接 觸 後 要 馬 上 沖 水 。 通 常 TCA 並 不 被 用 在 純 化 蛋 白 質 的 步 驟 中 ,
而 是 用 來 沈 澱 或 移 除 大 部 分 蛋 白 質 。
1.1.2 高 速 離 心 法
離 心 是 分 離 固 態 與 液 態 最 方 便 的 方 法 , 因 此 蛋 白 質 以 上 述 方 法 沈 澱 下 來 後 , 接
著 便 可 用 高 速 離 心 法 , 把 形 成 固 態 或 半 固 態 的 蛋 白 質 分 離 出 來 。 這 樣 的 離 心 都
要 在 低 溫 下 進 行 , 以 免 離 心 時 產 生 高 溫 , 也 可 保 持 蛋 白 質 免 於 變 性 。 在 生 化 實
驗 室 中 , 高 速 離 心 機 是 較 危 險 的 儀 器 , 一 定 要 注 意 離 心 管 是 否 正 確 平 衡 , 離 心
轉 速 是 否 設 定 正 確 。 第 一 次 操 作 任 何 離 心 機 時 , 一 定 要 有 熟 練 的 人 員 在 旁 監
督 , 以 免 發 生 危 險 。
1.1.3 蛋 白 質 脫 鹽
脫 鹽 是 一 種 重 要 的 生 化 操 作 , 可 以 把 小 分 子 與 巨 分 子 分 離 開 來 , 是 生 化 實 驗 常
用 的 步 驟 , 通 常 脫 鹽 效 果 的 好 壞 , 對 下 一 步 實 驗 有 決 定 性 的 影 響 。 有 下 面 幾 種
方 法 可 以 應 用 :
a) 透 析 袋 : 是 最 常 用 的 方 法 , 透 析 袋 有 各 種 大 小 不 同 的 網 目 , 可 以 分 開 分 子 量
不 同 的 大 小 分 子 。 常 見 的 透 明 年 糕 紙 , 也 有 近 似 透 析 袋 的 作 用 ; 而 香 腸 的 腸 衣
也 正 是 一 種 透 析 膜 , 可 以 透 出 水 分 及 小 分 子 。
b) 膠 體 過 濾 法 : 可 以 依 照 分 子 量 大 小 不 同 來 進 行 分 離 , 利 用 膠 體 小 球 內 的 孔 道 ,
使 小 分 子 進 入 而 被 延 滯 在 膠 球 內 , 大 分 子 則 得 以 迅 速 流 出 , 因 而 去 除 了 鹽 類 ,
達 成 脫 鹽 的 效 果 。
c) 超 微 薄 膜 過 濾 : 超 微 薄 膜 是 一 層 具 有 極 小 孔 俓 的 薄 膜 , 可 以 區 別 分 子 的 大 小 ,
小 分 子 如 鹽 類 可 以 通 過 微 膜 , 大 分 子 則 被 留 住 , 因 而 去 除 鹽 類 ; 通 常 使 用 超 微
薄 膜 過 濾 都 需 加 壓 , 以 增 加 小 分 子 通 過 的 速 率 。
1.1.4 蛋 白 質 定 量
蛋 白 質 定 量 是 最 基 本 的 生 化 操 作 , 方 法 也 很 多 , 但 其 原 理 都 還 是 根 基 於 蛋 白 質
分 子 的 基 本 構 造 。 早 先 使 用 Biuret method, 是 根 據 蛋 白 質 骨 架 與 銅 離 子 結 合 ,
利 用 所 產 生 的 還 原 力 呈 色 ; 而 Lowry method 是 以 Biuret method 為 基 礎 , 再 加
上 蛋 白 質 中 Tyr 側 基 的 呈 色 , 使 得 分 析 更 為 靈 敏 。 最 近 則 使 用 染 料 Coomassie
Brilliant Blue G-250 (CBG) 的 蛋 白 質 結 合 試 劑 ; 當 蛋 白 質 與 CBG 結 合 之 後 ,
CBG 由 茶 色 變 成 藍 色 , 呈 色 濃 淡 與 蛋 白 質 量 成 正 比 , 稱 為 Bradford method。
蛋 白 質 的 定 量 方 法 實 在 是 太 基 本 了 , 因 此 會 重 複 出 現 在 很 多 相 關 課 程 中 。
P1-2 Biochemistry Laboratory

蛋 白 質 分 離 與 定 量
P1
1.1.5 使 用 微 量 吸 管
微 量 吸 管 (micropipet) 可 說 是 生 化 實 驗 工 作 者 最 重 要 的 貼 身 小 型 武 器 , 良 好 的
操 作 習 慣 必 須 確 實 養 成 。 微 量 吸 管 絕 不 可 掉 到 地 面 , 也 要 經 常 校 正 ( 見 下 段 ),
注 意 吸 管 與 樣 本 頭 (tip) 之 間 的 密 合 情 形 , 以 及 兩 段 式 擠 壓 樣 本 的 操 作 方 式 。
每 個 人 對 微 量 吸 管 的 操 作 能 力 , 由 其 所 做 出 的 蛋 白 質 定 量 標 準 線 可 大 略 評 估 ,
操 作 不 良 者 大 多 無 法 得 到 完 美 直 線 。
簡 便 校 正 法 :
找 到 一 台 可 靠 的 電 子 天 平 , 在 秤 量 區 放 一 個 小 型 塑 膠 秤 量 盤 後 歸 零 , 以 微 量 吸
管 吸 取 其 最 大 取 樣 容 量 之 純 水 ( 如 1 mL 或 200 μL), 小 心 注 入 秤 量 盤 後 讀 取 秤
量 值 , 其 重 量 顯 示 應 為 1.00 g 或 200 mg, 誤 差 在 1% 以 上 者 須 送 修 , 也 有 可
能 是 你 的 操 作 方 法 有 問 題 。
1.1.6 實 驗 大 綱
P1 蛋 白 質 抽 取 與 定 量
TCA 沉 澱
第 一 次 沉 澱
第 二 次 沉 澱
成 品 檢 定
雞 蛋
上 清
透 析 液
蛋 清
丙 酮 沉 澱
丙 酮 沉 澱
P3
膠 體 電 泳 法
TCA 沉 澱
離 心
透
析
離 心
蛋 白 質 定 量
離 心
沉 澱
沉 澱
CHOM
上 清
水 溶 液
乾 燥
P2
親 和 層 析 法
圖 P1-1 由 卵 白 抽 取 CHOM 或 DKOM 流 程
第 一 週 由 卵 白 中 抽 出 粗 蛋 白 , 並 以 丙 酮 沈 澱 , 取 沈 澱 以 水 溶 解 後 , 在 透 析 袋 中 透 析 至
第 二 週 , 取 出 溶 液 再 次 以 丙 酮 沈 澱 , 收 集 沈 澱 乾 燥 後 即 得 成 品 。
生 物 化 學 實 驗 P1-3

蛋 白 質 分 離 與 定 量
P1
1.2 以 丙 酮 沈 澱 法 分 離 CHOM
本 實 驗 之 操 作 分 成 兩 大 部 分 :(1) CHOM 沈 澱 分 離 及 (2) Bradford 蛋 白 質 定 量 法 ;
分 在 兩 週 內 操 作 。 每 次 操 作 前 , 請 檢 查 所 有 試 劑 及 儀 器 , 確 實 瞭 解 其 使 用 原 理 及 操
作 方 式 。 雖 然 本 文 的 抽 取 對 象 是 CHOM, 但 可 完 全 應 用 在 DKOM 的 純 化 。
1.2.1 儀 器 設 備
a) 燒 杯 (500 mL) 若 干 個 。
b) 電 磁 攪 拌 器 及 攪 拌 子 。
c) 冰 桶 ( 及 碎 冰 )。
d) 離 心 管 、 離 心 轉 陀 及 雙 皿 天 平 。
e) 高 速 冷 凍 離 心 機 。
f) 透 析 用 大 燒 杯 (2 L)。
g) 透 析 袋 及 透 析 夾 。
h) 其 他 儀 器 : 微 量 天 平 、 酸 鹼 度 試 紙 。
1.2.2 藥 品 試 劑
a) 卵 白 : 雞 蛋 2 個 可 收 約 50 mL 卵 白 。
b) TCA- 丙 酮 (0.5 M TCA : 丙 酮 = 1 : 2, v/v): 可 把 卵 白 中 的 雜 質 以 沈 澱 移 除 。
c) 丙 酮 : 高 濃 度 的 冰 凍 丙 酮 可 以 把 CHOM 蛋 白 質 沈 澱 下 來 。
1.2.3 操 作 步 驟
卵 白 以 TCA 沈 澱 :
1) 準 備 雞 蛋 2 個 , 取 出 卵 白 50 mL, 置 入 一 個 500 mL 燒 杯 中 。
2) 加 入 50 mL TCA- 丙 酮 , 邊 加 邊 攪 拌 , 漸 漸 成 為 白 色 泡 狀 , 攪 拌 1 min。
◆ 注 意 TCA 對 皮 膚 有 腐 蝕 性 。
3) 離 心 10 min (6,000 g) 後 取 上 清 , 加 入 2 倍 體 積 的 冰 凍 丙 酮 , 生 成 沈 澱 ; 在 4℃
下 靜 置 10 min。
◆ 離 心 的 時 候 , 請 排 隊 聽 從 助 教 的 指 揮 , 以 便 順 利 上 離 心 機 。
4) 儘 量 倒 去 上 清 , 沈 澱 再 次 離 心 10 min (6,000 g), 挖 出 沈 澱 溶 於 純 水 (10 mL),
pH 大 約 為 4.5, 然 後 在 4℃ 下 對 1 L 純 水 透 析 。
5) 每 天 換 一 次 4℃ 純 水 , 至 少 換 兩 次 。 第 一 週 實 驗 先 做 到 這 一 步 。
P1-4 Biochemistry Laboratory

蛋 白 質 分 離 與 定 量
P1
以 丙 酮 沈 澱 出 CHOM:
6) 透 析 後 若 產 生 沈 澱 , 要 離 心 10 min (6,000 g) 去 除 之 。
7) 加 入 4 倍 體 積 的 冰 凍 丙 酮 , 應 該 會 產 生 大 量 沈 澱 , 可 放 在 -20℃ 冰 箱 靜 置 。
8) 高 速 離 心 10 min (10,000 rpm) 後 倒 去 上 清 , 白 色 沈 澱 的 表 面 小 心 以 丙 酮 洗 過 數
次 ( 可 以 再 用 少 量 乙 醚 洗 過 ), 置 排 煙 櫃 中 使 沈 澱 稍 微 乾 燥 。
9) 加 入 5 mL 蒸 餾 水 輕 輕 震 盪 溶 解 , 以 一 個 新 的 15 mL 試 管 裝 起 , 標 明 CHOM 及
組 別 、 日 期 , 交 給 助 教 冷 藏 保 管 , 後 面 的 實 驗 要 用 到 , 首 先 要 以 Bradford method
測 量 其 蛋 白 質 濃 度 。
1.3 以 Bradford 法 定 量 蛋 白 質
Bradford dye-binding method 是 利 用 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) 可 與 蛋 白
質 結 合 而 變 色 的 特 性 來 定 量 (Bradford, 1976); 若 試 樣 中 的 蛋 白 質 量 較 多 , 則 結 合 到
蛋 白 質 而 變 色 的 CBG 也 多 , 因 而 呈 色 較 深 。 下 例 是 以 一 組 標 準 蛋 白 質 為 對 象 , 製
作 一 條 蛋 白 質 量 與 吸 光 度 的 標 準 校 正 線 。
1.3.1 儀 器 用 具
a) ELISA 光 度 計 (Dynatech) 可 在 30 s 內 測 完 一 片 滴 定 盤 。
b) 微 量 滴 定 盤 (96-well microtiter plate) 及 微 量 試 管 。
1.3.2 藥 品 試 劑
a) 磷 酸 緩 衝 液 (phosphate buffered saline, PBS) 10 mL。
b) BSA 標 準 品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL) 2 mL。
c) CHOM 樣 本 溶 液 : 由 1.2 純 化 所 得 的 CHOM 水 溶 液 ( 未 知 濃 度 )。
d) Dye Reagent (Bio-Rad 500-0006) 先 以 水 稀 釋 四 倍 後 備 用 , 每 組 5 mL。
◆ 以 染 料 Coomassie Brilliant Blue G-250 配 製 的 定 量 專 用 溶 液 , 勿 與 膠 體 電 泳 染 色 用
的 CBR-250 混 淆 , 兩 者 各 有 其 使 用 上 的 限 制 , 不 要 混 用 。
1.3.3 樣 本 溶 液 及 標 準 品
樣 本 溶 液 :
表 1-1 以 上 述 CHOM 樣 本 溶 液 (c) 準 備 兩 種 濃 度 :
Label 樣 本 溶 液 (c) Buffer P Final Conc.
X1 250 μL 0 μL ? μg/mL 混 合 均 勻
X2 125 μL 125 μL ? μg/mL 混 合 均 勻
生 物 化 學 實 驗 P1-5

蛋 白 質 分 離 與 定 量
P1
標 準 品 系 列 :
表 1-2 使 用 小 試 管 準 備 一 組 BSA (b) 標 準 品 的 系 列 稀 釋 :
Label BSA (b) Buffer P Final Conc.
#5 250 μL 0 μL 100 μg/mL 混 合 均 勻
#4 200 μL 50 μL 80 μg/mL 混 合 均 勻
#3 150 μL 100 μL 60 μg/mL 混 合 均 勻
#2 100 μL 150 μL 40 μg/mL 混 合 均 勻
#1 50 μL 200 μL 20 μg/mL 混 合 均 勻
#0 0 μL 250 μL 0 μg/mL 混 合 均 勻
◆ 配 製 一 定 要 精 準 , 否 則 校 正 直 線 不 會 準 確 ; 各 種 試 劑 的 添 加 , 若 自 稀 往 濃 取 樣 ,
則 可 以 不 用 換 吸 管 頭 。 請 儘 量 節 省 吸 管 頭 、 微 量 離 心 管 等 塑 膠 用 具 。
一 般 樣 本 :
a) 通 常 由 PBS 所 溶 解 的 樣 本 , 都 可 直 接 進 行 蛋 白 質 定 量 分 析 ; 但 若 其 中 含 有 某 干
擾 因 子 ( 如 Triton), 或 樣 本 濃 度 太 濃 , 都 必 須 將 樣 本 稀 釋 後 再 測 。
b) 同 一 樣 本 若 使 用 不 同 的 稀 釋 濃 度 , 則 所 測 出 來 的 最 終 蛋 白 質 濃 度 可 能 會 有 差
異 , 通 常 是 以 稀 釋 度 大 者 較 為 準 確 。
1.3.4 方 法 步 驟
1) 每 槽 先 加 好 50 μL 標 準 品 (#0, #1 .... #5) 或 未 知 樣 本 (X1, X2), 以 二 重 複 加 入
96 孔 滴 定 盤 中 , 如 圖 P1-2 所 示 。
200 μL CBG Dye
(d)
50 μL Sample
(f or g)
( 混 合 均 勻 )
blank for ELISA reader
in duplicate
1 2 3
A X
B X
C X
D X
E X
F X
G X
H X
#5
#4
#3
#2
#1
#0
X1
X2
圖 P1-2 微 量 滴 定 盤 的 配 置 與 使 用 方 法
2) 每 槽 再 加 入 200 μL Dye-Reagent (d), 在 全 部 樣 本 槽 加 完 前 , 不 要 中 斷 添 加 ; 同
時 小 心 避 免 氣 泡 產 生 。
◆ 本 步 驟 是 實 驗 成 敗 的 關 鍵 ! 加 完 後 必 須 混 合 均 勻 , 否 則 定 量 不 會 準 確 。
3) 輕 拍 滴 定 盤 一 側 , 使 添 加 的 各 成 份 均 勻 混 合 , 注 意 Dye-Reagent 密 度 較 大 , 很
P1-6 Biochemistry Laboratory

蛋 白 質 分 離 與 定 量
P1
容 易 沉 積 在 下 方 而 分 層 。 若 還 有 小 氣 泡 , 小 心 以 大 頭 針 刺 破 。
4) 靜 置 室 溫 10 min 後 , 以 ELISA reader 測 量 570 nm ( 或 595 nm) 的 吸 光 值 。
1.4 結 果 與 報 告
1.4.1 蛋 白 質 分 離
a) 以 條 列 方 式 , 把 你 的 分 離 過 程 及 步 驟 , 照 實 況 寫 下 , 勿 直 接 抄 襲 1.2.3 節 。
b) 請 說 明 在 你 操 作 過 程 中 , 可 能 的 任 何 問 題 , 以 及 所 觀 察 的 特 殊 現 象 。
1.4.2 蛋 白 質 定 量
a) 在 作 圖 紙 上 畫 出 標 準 品 的 校 正 線 , 並 決 定 樣
本 溶 液 的 濃 度 ( 如 圖 P1-3)。
b) 請 說 明 本 分 析 方 法 的 原 理 , 並 特 別 以 蛋 白 質
構 造 來 說 明 。
c) 一 般 緩 衝 液 或 試 劑 中 , 何 種 添 加 物 會 影 響
Bradford 法 的 呈 色 ?
Absorbance, 570 nm
d) 請 列 出 本 分 析 方 法 的 各 操 作 步 驟 中 , 哪 些 會
影 響 分 析 的 準 確 度 ?
e) 還 有 哪 些 蛋 白 質 的 定 量 方 法 ? 並 請 比 較 其
優 劣 點 。
0
Protein
圖 P1-3 繪 製 標 準 品 校 正 線
1.5 參 考 文 獻
莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 116, 140, 193
蘇 仲 卿 張 珍 田 莊 榮 輝 (1981) 利 用 親 和 層 析 法 分 離 猪 胰 臟 蛋 白 質 水 解 酵 素 trypsin 和
chymotrypsin 之 中 間 規 模 試 驗 。 中 國 農 業 化 學 會 誌 。19: 218-226
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254
Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.89
生 物 化 學 實 驗 P1-7