PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR

PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULARObjectiu: unificar conceptes.PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a lamanipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcidsnucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressiófuncional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode deSanger, seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animalssuperiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.BIBLIOGRAFIAIntroduction to Genetic Analysis. 7th ed.Griffiths, Anthony J.F.; Miller, Jeffrey H.; Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; Gelbart, WilliamM. New York: WH Freeman and Co; c1999.Molecular Cell Biology. 4th ed.Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell,James E. New York: WH Freeman and Co; c1999.Genomes. 2nd ed.Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers, Ltd 2002.Human Molecular Genetics 2. 2nd ed.Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999.Ingeniería Genética y transferencia Génica.Marta Izquierdo Rojo; Editorial PirámideMadrid, 2001

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació,clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics,hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode deSanger, seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules deDNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzimsde restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics,hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger,seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a lamanipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmidsi YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcidsnucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressiófuncional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode deSanger, seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animalssuperiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

CRE-RECOMBINASEACre recombinaseataacttcgtata gcatacat tatacgaagttatloxPBloxPloxPExcision of a loxP flanked regionloxP

Cloning vectorSize of insertStandard high copy number plasmidBacteriophage λ insertionBacteriophage λ replacementCosmidPAC (P1 artificial chromosome)BAC (bacterial artificial chromosome)YAC (yeast artificial chromosome)0 - 10 kb0 - 10 kb9 - 23 kb30 - 44 kb130 - 150 kbup to 300 kb0.2 - 2.0 Mb

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a lamanipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiquesi de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcidsnucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid,expressió funcional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode deSanger, seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animalssuperiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

TejidoOvocitosXenopusEnsayomRNAH 2 OmRNASelecciónpor tamañoABCDH 2 O A B C DSintesiscDNA123456H 2 O 1 2 3 4 5 6Aislamiento de clones únicos

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics,hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR,Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciacióautomàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics,hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger,seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució allevat. Transgènia a animals superiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules deinsecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

RECOMBINACIÓN IN VIVO

HOMOLOGOUSRECOMBINATIONhomologyXselectionmarkerhomologyXtargetingconstructgene of interestdouble homologousrecombinationselectionmarkerinactivated gene

eggZYGOTEfertilizedeggspermBLASTOCYST32-64-cellstageinner cell mass (ICM)Embryonic Stem cells:culturegenetic manipulationreintroduce in host-embryo

CRE-LOXP:TISSUE-SPECIFICGENE INACTIVATION(only one floxed allele indicated, should behomozygous or other allele otherwiseinactivated)

PROGRAMA:1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics,hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger,seqüenciació automàtica.6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió aE.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lulesde mamífer. Teràpia gènica.

ATGNeeds to be in frameTAAT7 promoterAffinitytagcDNAInsert in an expression plasmidNH 4Purify fusionprotein viaaffinity tag• Common affinty tags are be 6X-His & GST –both protein will bind reversibly with highaffinty and specificty to a particularchromatography resin

TransfectionLiposomeElectroporation

Vectors amb promotors induïblesTet-inducible, two component system.CMV PromoterTet r-VP16 activation domain+TetRas