Генетика микроорганизмов2010 October.pdf

Генетический анализу бактерийNeurospora crassa, 1940 г.Д. Бидл Э. ТатумНобелевская премия по физиологии или медицине, 1958 г.«за фундаментальные исследования организациигенетического материала у бактерий».

Генетический анализ бактерий дал ключевыепредставления о природе и структуре генетическогоматериала, о генетическом коде, мутациях. На результатах генетического анализа бактерий взначительной степени базируются такиесовременные технологии, как генетическаяинженерия и биотехнология.

Факты Каждый человек содержит в своем организме ~1,5 кг бактерий. На 1 см 2 кожи около 250 000 бактерий. На теле 1 человека больше микроорганизмов, чемлюдей на Земле. Около 30% всей биомассы на Земле составляютбактерии. Предполагают, что на Земле более 1 миллиардавидов бактерий.

Словарь• Штамм – генетически однородная культураданного вида, выделенная из одной клетки иотличающаяся от остальных культурпроисхождением и часто рядом признаков,несущественных для систематики.• Штамм, выделенный из природы иявляющийся типичным представителемданного вида, называется диким типом.

Клонирование – один из основных методовгенетического анализа в культуре микроорганизмовКлон – группа клеток илимолекул идентичныхклетке или молекуле, откоторых они произошли. В генетике клон – этогенетически однородноепотомство, полученное приразмножении одной клеткиили вирусной частицы. У эукариотическихорганизмов клон –потомство одной клетки(споры), делящейсямитотически.СуспензиябактериальныхклетокСуспензиюраспределяют поповерхности агарав чашке ПетриПолучение отдельных клоновпозволяет изучать свойствагенетически однороднойсовокупности клеток(популяции).Каждая колонияобразовалась изодной клетки(является клоном)

Клонирование – один из основных методовгенетического анализа в культуре микроорганизмов Клон – группа клеток илимолекул идентичныхклетке или молекуле, откоторых они произошли. В генетике клон – этогенетически однородноепотомство, полученноепри размножении однойклетки или вируснойчастицы. У эукариотическихорганизмов клон –потомство одной клетки(споры), делящейсямитотически.

Признаки микробных культур, иликультуральные свойства можно подразделитьна несколько типов:а) морфологические(цвет колонии, морфология колонии)б) физиологические(отношение к температуре, рН)в) биохимические(потребность в факторах роста).

Словарь• Культуры, растущие на наиболее беднойпитательной среде из сред, обеспечивающихрост микроорганизма данного вида,называются прототрофными.• Культуры, требующие добавки к простойсреде, называются ауксотрофными.

Генетические элементы бактериальной клетки: Хромосома Плазмиды Профаги Транспозирующиеся элементы

Генетические элементы бактериальной клетки:ПлазмидаТранспозирующиесяэлементыХромосомаПрофаг

Плазмиды бактерий, в большинстве случаевявляются кольцевыми молекулами ДНК. Этимолекулы способны автономно реплицироваться вклетках бактерий и имеют собственный ориджинрепликации. Профаг – состояние фаговой ДНК при лизогении, прикоторой фаговая ДНК интегрирует в бактериальнуюхромосому или реплицируется как плазмида. Транспозирующиеся элементы, как правило, несуществуют автономно и интегрированы в другиемолекулы ДНК, такие как хромосома, плазмида,профаг.

Escherichia coliРазмер клеток:1,7 х 0.65 мкм1 кольцевая хромосомаРазмер – 4,6 · 10 6 п.н.4289 генов

Топология бактериальных хромосомEscherichia coliБактерияГеном1 кольцевая хромосома1 линейная хромосома;Agrobacterium tumefaciens C58Bacillus cereus F083676Rhodobacter sphaeroidesRhodococcus faciansStreptomyces ambofaciensBorrelia burgdorferi1 кольцеваяхромосома;1 кольцевая хромосома2 кольцевыххромосомы1 линейная хромосома1 линейная хромосома1 линейная хромосома

Топология бактериальных геномовБактерияEscherichia coliГеном1 кольцевая хромосомаRhodobacter sphaeroidesЦианобактерииBacillus cereus F083676Agrobacterium tumefaciensC58Borrelia burgdorferiRhodococcus faciansStreptomyces ambofaciens2 различных кольцевых хромосомы8-12 идентичных кольцевыххромосом3-8 кольцевых плазмид1 кольцевая хромосома1 мегаплазмида1 линейная хромосома;1 кольцевая хромосома;2 плазмиды1 линейная хромосомадо 20 линейных и кольцевых плазмид1 линейная хромосома1 линейная плазмида1 линейная хромосома

Характеристика некоторых плазмидПлазмида Характеристика ИсточникColE1TolTipSymSCP1RK2Бактериоцин, который убиваетклетки E.coliДеградация толуола и бензойнойкислотыИндукция опухолей у растенийОбразование клубеньков накорнях бобовых растенийСинтез антибиотикаметиленомицинаУстойчивость к ампициллину,канамицину и тетрациклинуE.coliPseudomonas putidaAgrobacteriumtumefaciensRhizobium melilotiStreptomycescoelicolorKlebsiella aerogenes

Основные свойства плазмиды RK2:- Широкий круг хозяев.- Низкая копийность.- Конъюгативная.

Cтруктурно-функциональная организацияполового фактора FF-фактор (fertility) содержит около 60 геновtra-район содержит 35 генов, контролирующихконъюгативный перенос ДНК

Основные свойства плазмиды ColE1:- узкий круг хозяев (сем. Enterobacteriaceae)- мультикопийная (∼ 20 копий на клетку)- неконъюгативная, но способная к мобилизации

Основные свойства плазмиды RK2:- детерминирует устойчивость клеток к ампицилину,тетрациклину и канамицину- широкий круг хозяев- низкая копийность- конъюгативная

Основные свойства плазмиды RSF1010:- детерминирует устойчивость клеток к сульфаниламидам истрептомицину- широкий круг хозяев- мультикопийная (∼ 30 копий на клетку)- неконъюгативная, но способная к мобилизации

Любой организм, который слишком строго контролируетнеизменность генетической информации, передаваемой изпоколения в поколение, имеет мало шансов на выживание.Поэтому бактерии выработали механизмы обмена генетическимматериалом с помощью горизонтального переноса генов.Практически все известные бактерии обладают по крайней мере,одним из трех способов переноса генетической информации,приводящей к рекомбинации генетического материала –конъюгацией, трансформацией и трансдукцией.Все процессы передачи генетической информации убактерий являются однонаправленными – одна клеткавыступает в качестве донора, другая – в качествереципиента.

Вертикальный перенос генов —организм получает генетический материалот своего предка. Горизонтальный перенос генов —процесс, в котором организм передаётгенетический материал другому организму,не являющемуся ему потомком.

Конъюгация у бактерий Перенос генетического материала от однойбактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту)при их непосредственном контакте был открытДж.Ледербергом и Э.Татумом в 1946г. Процесс назван конъюгацией.Дж. ЛедербергЭ. ТатумНобелевская премия по физиологии или медицине, 1958 г.«за фундаментальные исследования организациигенетического материала у бактерий».

Половой процесс у бактерий Половой процесс у бактерий в форме прямогопереноса генетического материала от однойбактериальной клетки (донора) к другой(реципиенту) при их непосредственном контактебыл открыт Дж.Ледербергом и Э.Татумом в1946г. Процесс назван конъюгацией.Дж.Ледерберг

Эксперимент Дж.Ледерберга и Э.Татума по скрещиваниюдвух ауксотрофных штаммовСмешаннаякультураMet - Bio - Thr - Leu - Thi -Клетки отмывали от среды и высевали на чашкиc минимальной средой.Прототрофы возникали с частой ~ 10 7 клеток.Met + Bio + Thr + Leu + Thi +

Эксперимент Б.Дэвиса, демонстрирующий необходимостьфизического контакта между клетками для генетическойрекомбинацииДавлениеШтамм АШтамм ВФильр

КонъюгацияКонъюгация – процесс переноса плазмиды, а иногда ихромосомной ДНК из клетки-донора в клетку-реципиент приих непосредственном контакте или через мостик-подобноесоединение.

Конъюгация у бактерий Способность бактерий быть донорами генетическогоматериала при конъюгации определяетсяприсутствием в них конъюгативных плазмид. Прототип конъюгативных плазмид – F-плазмида(fertility, половой фактор) описан у E.coli У.Хейсом в1952 г. F-фактор – первая описанная плазмида у бактерий.У.Хейс

Структурно-функциональная организация плазмиды FF-фактор (fertility, плодовитость) содержит около 60 генов.tra-район содержит 36 генов, контролирующих конъюгативныйперенос ДНК (в том числе гены, контролирующие синтез пилей)

Конъюгация у E.coliF + F -Конъюгирующая параДонорная клетка – F + , «мужская»Реципиентная клетка – F - , «женская»

Конъюгация у E.coli

Конъюгативный перенос полового фактораДонорные, мужскиеклетки, содержащиеF-плазмиду, имеютот 1 до 3 пилей.Пили имеют осевойканал. Ониобеспечиваютконтакт междуклеткамиконъюгирующейпары.oriT

Конъюгативный перенос полового фактораПослеустановленияконтакта пилисокращаются иклетки входят втесный контакт.oriT

Конъюгативный перенос полового фактораoriTВ сайт oriTплазмиды Fвводитсяоднонитевойразрыв(никирование ДНК)и эта нить, начинаяс 5'-концапередается вреципиентнуюклетку.5’

Конъюгативный перенос полового фактораПри этом вдонорной клеткесинтезируетсякомплементарнаянить ДНК.В реципиентнойклетке такжесинтезируетсякомплементарнаянить и ДНКзамыкается вкольцо.oriT5’

Конъюгативный перенос полового фактораoriT5’Реципиентнаяклетка,получившая F-плазмиду,приобретает и всесвойства мужскойклетки, т.е. онасама теперьявляется донором.

Конъюгативный перенос полового фактораПили имеютосевой канал.Ониобеспечиваютконтакт междуклеткамиконъюгирующей пары.F

Конъюгативный перенос полового фактораЗатем в сайт oriTполовогофакторавводитсяоднонитевойразрыв(никированиеДНК) и эта нить,начиная с 5'-концапередается вреципиентнуюF

Конъюгативный перенос полового фактораПри этом вдонорнойклеткесинтезируетсякомплементарная нить ДНК.Вреципиентнойклетке такжесинтезируетсякомплементарная нить иДНКFF

Конъюгативный перенос полового фактораРеципиентнаяклетка, получившаяполовой фактор,приобретает и всесвойства мужскойклетки, т.е. она саматеперь являетсядонором.FFFF

F-плазмида передается с высокой частотой ~ 10 -1 . F-плазмида может интегрировать в хромосому. При ее переносев реципиентную клетку также будет происходить переносхромосомной ДНК. В популяции F + - клеток F-плазмида интегрирует в хромосому снизкой частотой. Поэтому F + - штаммы могут переносить снизкой частотой хромосомные маркеры в F - -клетки. Если изолировать клетки с интегрированной F-плазмидой иполучить из них чистую культуру, то такие штаммы (Hfrштаммы;Hfr-high frequency of recombination) передаютхромосомные маркеры с высокой частотой ~ 10 -2 .

Схема интеграции F-фактора в хромосомуoriTproFlacХромосомаprooriTFlacХромосомаHfr-штамма

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииВ Hfr-клеткахплазмида Fинтегрирована вхромосому.oriTHfr-клетки имеютпили.Послеустановленияконтакта пилисокращаются иклетки входят втесный контакт.

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииВ сайт oriT плазмиды Fвводится однонитевойразрыв (никированиеДНК) и эта нить,начиная с 5'-концапередается вреципиентную клетку.oriT

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииПри этом в донорнойклетке синтезируетсякомплементарная нитьДНК.oriTВ реципиентной клеткетакже синтезируетсякомплементарная нить, но,в отличие от переносаF-фактора, ДНК незамыкается в кольцо.

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииoriTДонорная клеткапереносит толькочасть своего геномав реципиентнуюклетку, в результатечего возникает неполная, а частичнаязигота –мерозигота.

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииoriTРекомбинантывозникают врезультатедвойногокроссинговера

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииoriTРеципиентныеклетки никогда неприобретаютF-фактора илиспособности бытьHfr-донорами.

Общая схема кроссинговераДонорная клетка переносит только часть своего генома вреципиентную клетку, в результате чего возникает неполная, а частичная зигота – мерозигота.

Общая схема кроссинговераКлетка-реципиент имеет кольцевую хромосому и получает отдонора линейный фрагмент двуцепочечной ДНК. Большаячасть донорного фрагмента замещает гомологичный участок вхромосоме. Кроссинговер происходит дважды.

BbBbОдиночный кроссинговер привел бы к образованиюлинейной молекулы и гибели клетки

Схема переноса хромосомных генов при конъюгацииHfr F -HfrF -

Результат эксперимента с прерыванием конъюгацииЭ.Вольмана и Ф.Жакоба (1961 г.)Кинетика переноса геновв скрещивании Hfr х F -Схема переноса маркеровв зависимости от времени

Эксперименты с прерыванием конъюгацииЭ.Вольмана и Ф.Жакоба (1961 г.)СкрещиваниеHfr x F - (в соотношении 1:10)Hfr Str s Azi r Gal + Lac + Ton rF - Str r Azi s Gal - Lac - Ton sЭ.ВольманФ.ЖакобStr s /Str r – чувствительность/устойчивость к стрептомицинуAzi s /Azi r – чувствительность/устойчивость к азиду натрияTon s /Ton r – чувствительность/устойчивость к фагу Т1Gal + /Gal - – способность/неспособность утилизировать галактозуLac + /Lac - – способность/неспособность утилизировать лактозуСелективная среда для отбора рекомбинантов всегдасодержала стрептомицин, чтобы убить клетки донора

Результат эксперимента с прерыванием конъюгацииЭ.Вольмана и Ф.Жакоба (1961 г.)Hfr Str s Azi r Gal + Lac + Ton rF -Str r Azi s Gal - Lac - Ton sКинетика переноса генов в скрещивании Hfr х F -

Результат эксперимента с прерыванием конъюгацииЭ.Вольмана и Ф.Жакоба (1961 г.)Hfr Str s Azi r Gal + Lac +Ton rF - Str r Azi s Gal - Lac -Ton sКинетика переносагеновв скрещивании Hfr хСхема переносамаркеровв зависимости отвремени

Кинетика переноса генов в скрещивании Hfr х F -Карта участка хромосомы E.coli

Кольцевая карта хромосомы E.coliПоследовательностьпереноса генов совершенноодинакова для всех Hfrштаммов,однако штаммыотличаются положениемточки О в этойпоследовательности инаправлением переносагенов.

Кольцевая карта хромосомы E.coliСледовательно,различные Hfr-штаммыобразовались врезультате интеграцииполового фактора вразличные сайтыхромосомы и вразличной ориентации.

Кольцевая карта хромосомы E.coliПерестановки геновможно объяснить тем,что хромосома E.coliявляется кольцевой.

Использование конъюгации для генетическогокартирования Перенос хромосомной ДНК от Hfr-донора креципиенту F- происходит ориентированно начиная сточки О (сайт интеграции F-фактора). Скорость переноса хромосомы на единицу ее длиныпостоянна, поэтому время вхождения каждого гена вреципиентную клетку служит мерой их генетическогорасстояния, т.е. представляет генетическую карту. Вся хромосома E.coli передается за 100 мин. Генетическая карта E.coli является кольцевой.

Схема морфологического строения фага Т4ГоловкаДНКХвостовой стержень сфутляромНити отросткаБазальная пластинка

Фаг Т4Размер0,065 х 0.10 мкм1 линейная двунитевая ДНКРазмер 170 т.п.н.Около 100 генов

Литический цикл развития фаговАдсорбцияЛизис хозяйской клеткии выход фаговогопотомстваПроникновениеДНК фага в клеткуВнутриклеточноеразвитиеСинтез фаговыхбелков и ДНКСозреваниеСборка зрелыхфаговых частиц

Умеренные фаги способны не толькоавтономно размножаться, но иинтегрировать в геном бактериальнойклетки, переходя в состояние профага

Литический и лизогенный циклы развития умеренных фаговАдсорбцияЛизис хозяйской клеткии выход фаговогопотомстваПроникновениеДНК фага в клеткуВнутриклеточноеразвитиеСинтез фаговыхбелков и ДНКСборка фаговыхчастицИнтеграция фаговойДНК с хромосомойбактериипрофагСинтез фаговыхбелков и ДНКРазмножениелизогенной клеткиСпонтанный илииндуцированный выходпрофага из хромосомы

Трансдукция Трансдукцией называется перенос ДНК из клетки-донорав клетку-реципиет, осуществляемый бактериофагом.Открыта Дж.Ледербергом и Н.Циндером в 1951 г. при поискеполового процесса у Salmonella thyphimurium.Дж.ЛедербергН.Циндер

Общая (неспецифическая) трансдукцияНекоторые умеренные фаги (P22, P1) способны переносить любойучасток хромосомы бактерии (фаг P22 – у Salmonella thyphimurium,фаг P1 у Escherichia coli)Инфекционный фагТрансдуцирующий фаг(не содержит фаговойДНК, дефектный фаг)При формировании фаговых частиц у 0,3% популяции фага вместоупаковки ДНК фага происходит ошибочное включение фрагментахромосомной ДНК в головку фага.

Механизм общей трансдукцииВ головку фага, помещается фрагмент ДНКоколо 1,5% генома бактерии (1,5 мин картыE.coli, 40 генов)Рекомбинанты возникают в результатедвойного кроссинговера

Специфическая трансдукция Отличается от неспецифическойтрансдукции тем, что бактериофаг можетпереносить только определенные гены. Это явление характерно для умеренногобактериофага лямбда. Этот фаг можеттрансдуцировать только гены gal и bio. Трансдукция осуществляется с низкойчастотой – 10 -5 – 10 -6 .

Механизм общей трансдукцииНормальный умеренныйфагДефектный фагРекомбинантывозникают врезультате двойногокроссинговера

После проникновения в клетку линейная ДНК фага λзамыкается в кольцоЛипкие концыОднонитевыеразрывыВ клетке ДНК фагазамыкается в кольцоЛигазаЛипкие концы – однонитевые комплементарныеучастки по 12 нуклеотидов

Схема интеграции фага λ в хромосому E.coliи образование трансдуцирующего фагаИнтеграция и вырезание фага λ осуществляется с помощьюмеханизма сайт-специфической рекомбинации по участкам гомологииattP и attB и контролируется фаговыми генами int и xis.Размер хромосомы у фага λ около 49 т.п.н.

Схема интеграции фага λ в хромосому E.coliи образование трансдуцирующего фага

Трансдуцирующий фаг дефектен, поскольку гены,контролирующие рост и созревания фага во времялитического цикла, замещены бактериальной ДНК. Фаг способен инфицировать бактерии, но неспособен там размножаться. Кроме того, он не может интегрировать вхромосому, поскольку имеет гибридный att-сайт.Его интеграция возможна только в присутствиифага-помощника (нормального фага).

Специализированная трансдукция Трансдуцирующий фаг не может интегрировать вхромосому, поскольку имеет гибридный att-сайт.1) Участки хромосомной ДНК, введенные фагом, могутрекомбинировать с хромосомой реципиентной клетки изамещать гомологичные участки в хромосоме.При этом лизогенных трансдуктантов не образуется.

Специализированная трансдукция+2) При множественном заражении, когда клетки инфицируютсятрансдуцирующим фагом и нормальным фагом (который в данном случаевыполняет роль фага-помощника) происходит двойная лизогенизацияобоими фагами.

Специализированная трансдукция+Например, если трансдуцирующий фаг переносит участокДНК с аллелем дикого типа gal (gal + ), а реципиент нес мутантныйаллель gal (gal - ), то образуются частичные гетерозиготы(гетерогеноты), у которых донорный участок gal, внесенныйфагом, добавлен к геному реципиента.

Специализированная трансдукция+Трансдуктанты Gal + частично гетерозиготны (gal - /gal + ).Такое состояние называется гетерогенотой.Трансдуктанты Gal + нестабильны и выщепляют клетки Gal -с частотой около 2 х 10 -3 на клеточное деление.

Трансформация Трансформацией называется процесс переносагенетической информации, в результатекоторого экзогенная ДНК проникает вреципиентную клетку и вызывает еенаследственные изменения.

Трансформация1. Открыта Ф.Гриффитом 1928 г. у Salmonella thyphimurium.2. О.Эйвери, К.Мак-Леод и М.Мак-Карти в 1944 г. установили, что«трансформирующим началом» является ДНК.Ф.Гриффит О.Эйвери К.Мак-Леод М.Мак-Карти

Способность клетки быть трансформированной в результатепоглощения экзогенной ДНК называется компетентностью.По развитию состояния компетентности бактерии можноразделить на две группы:1. Бактерии с природной компетентностьюа) у которых компетентность возникает лишь вопределенной фазе роста (стрептококки, бациллы)б) клетки которых компетентны в любой фазе роста(гонококки, менингококки).2. Бактерии с отсутствием естественной компетентности(E.coli).

Стадии трансформации1. Развитие компетентности.2. Связывание ДНК с клеточной поверхностью.3. Процессинг ДНК и ее поглощение.4. Интеграция в хромосому с помощьюгомологичной (recA-зависимой)рекомбинации.

ДНКадсорбируетсяна мембране спомощью ДНКсвязывающегобелка

ОднонитеваяДНКпереноситсячерез мембранус помощьютранслокационного аппарата, вто время какдругая нитьдеградирует

Однонитевая ДНКспаривается сгомологичнойпоследовательностью ДНКреципиентнойхромосомы

РекомбинацияоднонитевойДНК сбактериальнойхромосомой

ДНКадсорбируется намембране спомощью ДНКсвязывающегобелка

Однонитевая ДНКпереносится черезмембрану спомощьютранслокационногоаппарата, в товремя как другаянить деградирует

ОднонитеваяДНКспаривается сгомологичнойпоследовательностьюДНКреципиентнойхромосомыРекомбинацияоднонитевой ДНК сбактериальнойхромосомой

Рекомбинацияоднонитевой ДНК сбактериальнойхромосомой

Рекомбинация при трансформацииRecA,АТФОднонитевая ДНКРекомбинация осуществляется путем замещения одной из двух цепейреципиентного дуплекса на гомологичный фрагмент ДНК донора.В результате образуется временный гетеродуплекс ДНК, который вдальнейшем подвергается коррекции, направленной на удалениенекомплементарного основания.

Трансформация E.coli плазмидной ДНКРеципиентнаяклеткаОбработка клеток CaCl 2при 4 о СПлазмидная ДНКДобавление ДНК, инкубацияТепловой шок 42 о СОтбор трансформантов на среде с ампициллином

КонъюгацияКонъюгация – процесс переноса плазмиды, а иногда ихромосомной ДНК из клетки-донора в клетку-реципиент приих непосредственном контакте или через мостик-подобноесоединение.•Бактериальную конъюгацию часто некорректнорассматривают как бактериальный эквивалент половогоразмножения или скрещивания поскольку она включаетобмен генетическим материалом.•Однако бактериальная конъюгация – это просто переносгенов от одной бактерии к другой, в отличие от слияниягамет при половом размножении у высших организмов.•Установлено, что бактерии могут конъюгировать нетолько с бактериями других видов, но также с дрожжами,клетками растений и млекопитающих*.* Конъюгативный перенос Ti-плазмиды из Agrobacteriumtumifaciens в растения, плазмид F и RP4 из E. coli в дрожжи,Sacromyces cerevisiae, плазмиды RP4 из E. coli в клетки яичникакитайского хомячка.

Иногда под половым процессом подразумевают нестолько оплодотворение, сколько любой обменгенетическим материалом, не обязательносопряженный с размножением. В этом случае кразновидностям полового процесса относятконъюгацию у бактерий, называемую такжепарасексуальным процессом. Поскольку при трансформации и трансдукции такжепроисходит обмен генетическим материалом, тонекоторые исследователи также относят ихразновидностям полового процесса у бактерий.

Рекомендуемая литератураАлиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С.Общая генетика. М.:Высшая школа, 1985.Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика.М.:Мир, 1981.Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основамиселекции. М.:Высшая школа, 1989.