Resumo - capítulo 5 - Predição da estrutura secundária do RNA

Resumo - capítulo 5 - Predição da estruturasecundária do RNAPedro Ivo Gomes de FariaSumário1 Introdução 21.1 Fundamentos da predição da estrutura do RNA . . . . . . . . 21.2 Características da estrutura secundária do RNA . . . . . . . . 21.3 Limitações da predição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.4 Desenvolvimento de métodos de predição do RNA . . . . . . . 42 Métodos 52.1 Regiões autocomplementares em sequências de RNA predizema estrutura secundária . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.2 Método da energia livre mínima para a predição da estruturasecundária do RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 Predições estruturais subótimas pelo MFOLD e uso de gráficosde energia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Outros algoritmos para o dobramento subótimo de moléculasde RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.5 Predição das estruturas secundárias de RNA mais prováveis . 72.6 Usando a covariância de sequências para a predição de estruturas 82.7 Gramáticas livres de contexto estocásticas (SCFGs) para amodelagem da estrutura secundária do RNA . . . . . . . . . . 92.8 Buscas em genomas por genes que especifiquem RNAs . . . . 112.9 Aplicações da modelagem da estrutura do RNA . . . . . . . . 111

1 IntroduçãoSequências de ácidos nucleicos que especificam moléculas de RNA não podemser comparadas como as sequências proteicas ou as de DNA. Certas variaçõesno RNA mantêm padrões de pareamento de bases que dão origem à mesmaconformação de dupla fita (estrutura secundária) na molécula. Portanto, oalinhamento de duas sequências de RNA com o mesmo formato pode mostrarvariação nas posições de interação dos pares de bases. Além disso, genes quecodificam moléculas de RNA podem ter resíduos similares que reflitam a suaancestralidade comum.1.1 Fundamentos da predição da estrutura do RNAUm método para predição da estrutura secundária do RNA consiste em escolheros conjuntos de pares de bases complementares que resultam nas moléculasenergeticamente mais estáveis. A partir disso, estruturas com energiasquase tão estáveis quanto a mais estável podem ser produzidas, e as regiõescujas predições são as mais confiáveis podem ser identificadas.Outro tipo de método leva em conta padrões conservados de pareamentode bases durante a evolução de uma dada classe de moléculas de RNA.Posições da sequência que pareiam variam ao mesmo tempo (são covariantes)durante a evolução das moléculas de RNA, de forma a manter a integridadeestrutural. Por exemplo, se duas posições com G e C pareiam em uma dadamolécula, considera-se que moléculas com pares C/G, G/C, A/U ou U/A nasposições correspondentes são casamentos razoáveis.1.2 Características da estrutura secundária do RNAA estrutura secundária do RNA pode ser vista como um passo intermediáriona formação da estrutura tridimensional. Ela é formada por regiões de fitadupla formadas pelo dobramento da molécula sobre si própria (como ilustradona figura a seguir).2

Figura 1: Tipos de regiões de fita dupla e simples em estruturas secundáriasde RNA.Para que essas regiões ocorram, uma subsequência de bases em um sentidoprecisa ser complementar a outra subsequência de bases no sentidooposto. Os principais pares formados são (em ordem decrescente de estabilidademolecular) G/C (três ligações de hidrogênio), A/U (duas ligaçõesde hidrogênio) e G/U (duas ligações de hidrogênio).Além disso, também existem interações terciárias no RNA (interaçõesentre estruturas secundárias), que não são previsíveis por programas de3

predição secundária (mas podem ser encontradas por análise de covariância).1.3 Limitações da prediçãoNa predição da estrutura secundária do RNA, algumas hipóteses simplificadorassão comumente feitas. A primeira delas é a de que a estrutura maisprovável é similar à estrutura mais estável energeticamente. A segunda é ade que a energia associada a um par de bases numa estrutura de dupla fitasó é influenciada pelo par anterior (e ao por quaisquer outros pares da estrutura).Finalmente, supõe-se que a estrutura seja formada pelo dobramentoda cadeia sobre si própria de forma a não produzir nós.1.4 Desenvolvimento de métodos de predição do RNAEntre os vários métodos para predição da estrutura secundária do RNA estáo de Martinez (1984), que considera todas as regiões de dupla fita possíveis.Cada uma delas recebe um peso proporcional à sua constante de equilíbrio,calculada pela função de Boltzmann K eq = exp(−∆G o /RT ) (∆G o é a variaçãode energia livre padrão entre as regiões, R é a constante dos gasesperfeitos e T é a temperatura). A molécula de RNA é dobrada por ummétodo de Monte Carlo no qual uma região é escolhida aleatoriamente deum conjunto com pesos (similar ao método usado pelo amostrador de Gibbs).Nussinov e Jacobson (1980) foram os primeiros a projetar um algoritmopreciso e eficiente para a predição da estrutura secundária. O algoritmogera duas matrizes de pontuação M (armazena o número máximo de paresde bases que podem ser formados em qualquer intervalo [i; j] da sequência)e K (armazena os pareamentos). A partir dessas matrizes, uma estruturacom o número máximo possível de pares de bases pode ser deduzida por umprocedimento que faz o caminho reverso na matriz (similar ao que produz osalinhamentos de sequências via programação dinâmica).O programa MFOLD é comumente usado para prever as estruturas deuma molécula de RNA mais estáveis energeticamente, fornecendo um conjuntode estruturas possíveis num intervalo de energia e dando uma indicaçãode confiabilidade. Porém, como o programa possui complexidade de tempoproporcional a N 3 (onde N é o tamanho da sequência), ele apenas é usadopara moléculas de RNA pequenas (até 1000 nucleotídeos).4

2 Métodos2.1 Regiões autocomplementares em sequências de RNApredizem a estrutura secundáriaRegiões autocomplementares no RNA (que podem se hibridizar para formarregiões de fita dupla) podem ser encontradas por uma matriz de pontos. Emum dos métodos para isso, a sequência original é disposta no eixo horizontale o seu complemento (desconsiderando os pares G/U) no eixo vertical (ambasno sentido 5 ′ → 3 ′ ). Pontuando a matriz nas posições em que o nucleotídeoda linha é igual ao da coluna, as regiões autocomplementares irão aparecercomo diagonais que se dirigem da parte superior esquerda para a inferiordireita. Como existem muitos casamentos aleatórios entre as quatro basesdo RNA, é necessário usar uma janela larga com elevada estringência parafiltrá-los (como o que é feito com sequências de DNA).2.2 Método da energia livre mínima para a prediçãoda estrutura secundária do RNAPara predizer a estrutura secundária do RNA, cada base é comparada a todasas outras por uma análise similar à da matriz de pontos. A mesma sequênciaé listada nos dois eixos da matriz, e as bases complementares são marcadaspara identificar possíveis regiões de dupla fita. A energia de cada estruturaprevista é estimada pela regra do vizinho mais próximo, somando dois tiposde energias:1. as energias negativas acumuladas para cada par de bases na região defita dupla;2. as energias positivas desestabilizadoras das outras regiões (como laçosou saliências).Para calcular a energia acumulada de pares de bases consecutivos, umatabela semelhante à ilustrada a seguir é utilizada.5

Figura 2: A) Energia acumulada para uma região de dupla fita quando o parlistado na linha é seguido pelo par listado na coluna. B) Energias desestabilizadorasassociadas a laços ou saliências.2.3 Predições estruturais subótimas pelo MFOLD euso de gráficos de energiaOriginalmente, o programa FOLD apenas previa uma estrutura secundáriade RNA (a que tinha energia livre mínima). Uma versão posterior (MFOLD)é capaz de prever várias estruturas com energias próximas do mínimo possível.Para encontrá-las, o método de programação dinâmica foi modificadopara avaliar partes de uma nova matriz de pontuação, na qual a sequência érepresentada em duas cópias (uma no eixo horizontal e outra na vertical).As regiões de i = 1 a n e j = 1 a n são usadas para calcular a energiaV (i, j) da melhor estrutura que inclui o par de bases i,j (por isso é chamadade região incluída). Uma segunda região (a região excluída) é usada paracalcular a energia da melhor estrutura que inclui i,j mas não é derivada daestrutura em i + 1, j − 1. Após certas correções, a diferença entre os valoresincluídos e excluídos é a estrutura mais energética que inclui o par i,j.6

2.4 Outros algoritmos para o dobramento subótimo demoléculas de RNAUm algoritmo originalmente descrito por Waterman e Byers (1985) é capazde encontrar alinhamentos de sequência dentro de um limite a partir do ótimo(a partir de modificações no procedimento que faz o caminho reverso na matrizde programação dinâmica). O método consegue calcular eficientementevárias estruturas alternativas que estejam em um dado limite a partir da estruturade energia mínima (o que é uma limitação do programa MFOLD). Ométodo foi usado para demonstrar que várias sequências naturais de RNAtpodem formar várias estruturas alternativas que estão próximas da estruturade energia livre mínima, e que a modificação das bases possui um papelimportante nessa estabilidade energética.2.5 Predição das estruturas secundárias de RNA maisprováveisUm modo diferente de prever estruturas é considerar a probabilidade de quecada região pareada seja formada baseando-se em princípios termodinâmicose na mecânica estatística. A possibilidade de formar uma região com energialivre ∆G é expressa pela distribuição de Boltzmann, que diz que ela éproporcional a exp(−∆G/kT ) (onde k é a constante de Boltzmann e T é atemperatura absoluta).Para um conjunto de estados estruturais possíveis, a soma das possibilidadesfornece uma função de partição que pode ser usada para normaliza-las,resultando na probabilidade de ocorrência de cada uma. Portanto, a probabilidadede eu uma estrutura A (com energia ∆G a ) ocorra é exp(−∆G a /kT )/Q,onde Q = ∑ s exp(−∆G s /kT ) (com s percorrendo todo o conjunto de estruturaspossíveis).A chave para essa análise é o cálculo da função de partição Q. Comoexistem muitas estruturas possíveis, o cálculo é simplificado utilizando umafunção auxiliar Q b (i, j) (que é a soma das probabilidades de todas as estruturasque incluem o par de bases i,j). A função de partição Q(i, j) incluitanto Q b (i, j) quanto as probabilidades das estruturas em que i não estápareado com j.Para ilustrar a diferença entre os métodos da energia livre mínima e dafunção de partição, consideremos que as bases nas posições i + 1, j − 1 ei,j formem pares (os dois pares são adjacentes). No método da energia livremínima, a energia do par i + 1, j − 1 seguido pelo par i,j será adicionada aV (i + 1, j − 1) para calcular V (i, j) (onde V é uma matriz de pontuação quearmazena a melhor estrutura que possui o par i,j). Por outro lado, Q b (i, j)7

será calculado pelo produto de Q b (i + 1, j − 1) por exp(−∆G/kT ) (onde ∆Gé a energia acumulada do par i + 1, j − 1 seguido pelo par i,j). A partir daí,Q b (i, j) e Q(i, j) são calculados iterativamente em uma matriz de pontuaçãoaté que o valor Q(1, n) = Q seja atingido.2.6 Usando a covariância de sequências para a prediçãode estruturasO segundo método mais usado para fazer predições da estrutura secundáriado RNA (e também análise de estruturas terciárias) é a análise de covariância.O método examina sequências das mesmas moléculas de RNA de espéciesdiferentes para buscar posições que variem juntas (pois isso é uma evidênciade que elas possam interagir), de modo a fazer com que formem um parde bases em todas as moléculas. Mudanças de sequências que ocorrem nasregiões de dupla fita do RNA devem manter o pareamento, mas as regiõesde fita simples não possuem essa restrição. A justificativa para o método é ade que esse tipo de substituição conjunta (ou covariância) ocorre durante aevolução de tais genes.Os passos gerais da análise de covariância em sequências de RNA são osseguintes:1. alinhe os pares de sequência de modo ótimo para identificar padrõescomplementares que representam uma estrutura secundária em potencial;2. faça algo análogo ao passo anterior, mas a partir de um alinhamentomúltiplo;3. faça uma análise estatística (teste de chi-quadrado) do número de observaçõesde um par de bases em particular nas colunas i e j do alinhamentomúltiplo, comparado ao número esperado baseado na frequênciadas duas bases;4. calcule a pontuação da informação mútua para cada par de colunasdo alinhamento. Sendo f i (B k ) a frequência da base B k na coluna i ef i,j (B m , B n ) a frequência conjunta das bases B m e B n , o conteúdo deinformação mútua entre as colunas m e n é dado porH(m.n) = ∑B 1 ,B 2f m,n (B 1 , B 2 ) × log 2 {f m,n (B 1 , B 2 )/[f m (B 1 )f n (B 2 )]}8

5. calcule o número de mudanças em cada par de colunas do alinhamentodividido pelo número total de mudanças (pontuação ec), examine ocontexto filogenético dessas mudanças (para determinar o número devezes que elas ocorreram durante a evolução) e escolha as pontuaçõesmais altas que são representativas dessas mudanças;6. meça a covariância de cada par de posições do alinhamento (contandoos números de todas as 16 combinações possíveis de pares de bases edividindo pelo número esperado de cada combinação), escolha o parpredominante e some as frequências de todos os sítios que covariemindependentemente para obter a pontuação de covariância.Uma dificuldade encontrada na modelagem de moléculas de RNA é aidentificação de pares de bases em potencial num conjunto de moléculas deRNA relacionadas, baseando-se na covariância entre dois sítios. O modelousado para analisar a estrutura secundária do RNA é o de árvore ordenada.Para construí-lo, começa-se com um modelo mais geral, que é treinado comum conjunto de sequências. Posteriormente, pode-se usar o modelo treinadopara revelar as regiões que se pareiam com maior probabilidade ou parafazer uma busca em banco de dados por sequências que produzam uma altapontuação quando alinhadas ao modelo.2.7 Gramáticas livres de contexto estocásticas (SCFGs)para a modelagem da estrutura secundária do RNAUma teoria geral para modelar sequências de símbolos (como as bases noDNA) foi desenvolvida por linguistas. Uma gramática livre de contexto éapropriada para encontrar grupos de símbolos em partes diferentes da sequência(e, portanto, não estão no mesmo contexto). Regiões complementares emsequências (como as que formam as estruturas secundárias do RNA) são exemplosde tais sequências livres de contexto. As gramáticas livres de contextoestocásticas introduzem incerteza na definição de tais regiões (permitindo autilização de símbolos alternativos, como ocorre na evolução e moléculas deRNA), e por isso definem tanto os tipos de interação entre as bases como asvariações nessas posições.A gramática livre de contexto estabelece uma série de regras (chamadasde produções) para gerar a sequência a partir do alfabeto (nesse caso, umamolécula de RNA com seções que podem parear ou não). Além dos símbolosda sequências (os terminais) , outro conjunto de símbolos (os não-terminais,designados por S 0 , S 1 , S 2 , . . .) determinam os estágios intermediários das produções.Em uma SCFG, cada produção de um símbolo não-terminal possui9

uma probabilidade associada de resultar no produto. Por exemplo, a produçãoS 1 → CS 2 G também poderia ser representada por outras 15 combinaçõesde pares de bases (cada uma com sua probabilidade correspondente).Portanto, cada produção é representada por uma distribuição de probabilidadessobre os resultados possíveis.Figura 3: Exemplo de análise da sequência CAUCAGGGAAGAUCUCUUG.A) Definição da gramática. B) Uma possível derivação para a sequência. C)Árvore de análise sintática da derivação. D) Estrutura secundária correspondenteà derivação.10

2.8 Buscas em genomas por genes que especifiquemRNAsUm dos objetivos da pesquisa de RNAs é desenvolver métodos para identificarsequências genômicas que codifiquem moléculas de RNA pequenas (comoRNAts e snoRNAs). Moléculas grandes e altamente conservadas podem seridentificadas com base na similaridade com sequências já conhecidas, mas essemétodo não funciona para sequências pequenas ou com maior variação. Umgrande problema dos métodos disponíveis para isso está na busca em genomasextensos, pois mesmo os que possuem uma taxa pequena de falsos positivostornam-se inviáveis (pois existem muitos falsos positivos para verificar).2.9 Aplicações da modelagem da estrutura do RNAEm suma, os métodos para a predição da estrutura de moléculas de RNAincluem:1. análise de todas as combinações possíveis de regiões de fita dupla pormétodos de minimização de energia;2. identificação da covariância de bases que mantêm as estruturas secundáriae terciária de uma molécula de RNA durante a evolução.11