Tehnica Southern-blot
Tehnica Southern-blot
Tehnica Southern-blot
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Metode de<br />
analiză a genelor<br />
Expresia genelor<br />
ADN ARNm Proteină Caracter<br />
5’ 5’-ATTGCAAGATTACCATGT<br />
ATTGCAAGATTACCATGT-3’ 3’ Catena codogenă (netranscrisă)<br />
3’ 3’-TAACGTTCTAATGGTACA<br />
TAACGTTCTAATGGTACA-5’ 5’ Catena anticodogenă (transcrisă)<br />
Transcripţie<br />
5’ 5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU<br />
AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ 3’ ARNm<br />
Translaţie<br />
Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid<br />
Maturizare<br />
Caracter fenotipic normal<br />
Secvenţiere<br />
PCR<br />
Analiza genelor<br />
ADN ARN<br />
Proteine<br />
<strong>Southern</strong>-<strong>blot</strong><br />
Hibridare in situ<br />
Northern-<strong>blot</strong><br />
RT–PCR<br />
Hibridare in situ<br />
Western-<strong>blot</strong><br />
Secvenţiere<br />
Analiza funcţiei<br />
Analiza<br />
histochimică<br />
Expresia genelor<br />
ADN mut ARNm mut Proteină an Caracter an<br />
5’ 5’-ATT ATTACAAGATTACCATGT<br />
CAAGATTACCATGT-3’ 3’ mutaţie G4→A 3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
Transcripţie<br />
5’ 5’-AUU AUUACAAGAUUACCAUGU<br />
CAAGAUUACCAUGU-3’ 3’ ARNm<br />
Translaţie<br />
ARNm mut<br />
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid polipeptidan Caracter fenotipic anormal<br />
Utilizarea tehnicilor de analiză a<br />
acizilor nucleici în medicină<br />
Analiza ADN:<br />
depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor<br />
genetice (prenatal, postnatal precoce);<br />
identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie<br />
genomică (analiza filiaţiei);<br />
depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul<br />
bolilor infecţioase şi gradului de infectare.<br />
Analiza ARNm:<br />
analiza expresiei genice ţesut-specifică;<br />
evaluarea gradului de expresie a genei normale /<br />
patologice.<br />
12/11/2009<br />
1
Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin<br />
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)<br />
2,5 kb<br />
10 kb<br />
6 kb<br />
5 kb<br />
10 kb<br />
6 kb<br />
5 kb<br />
-<br />
2,5 kb<br />
Tehnici de analiză a genelor<br />
PCR<br />
<strong>Southern</strong> - <strong>blot</strong><br />
Secvenţierea ADN<br />
+<br />
M<br />
12 kb<br />
10 kb<br />
8 kb<br />
6 kb<br />
4 kb<br />
2 kb<br />
Principii de bază<br />
Etapele principale<br />
Componente necesare (la general)<br />
Indicaţii şi limite<br />
RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z<br />
PCR<br />
reacţia ciclică de polimerizare<br />
Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare<br />
Replicare semiconservativă, repetată<br />
Specificitatea primerilor sintetici pentru gena gena–<br />
ţintă<br />
Hibridizarea ADN ADN-ţintă ţintă – primer ←<br />
complementar:<br />
Denaturare termică a ADN - de cercetat<br />
Modificarea ciclică a temperaturii:<br />
Denaturare<br />
Renaturare<br />
Sinteză<br />
12/11/2009<br />
2
Clonarea in vitro – PCR<br />
(reacţia ciclică de polimerizare a noilor<br />
copii de ADN)<br />
Componentele necesare pentru<br />
clonarea in vitro (PCR):<br />
- ADN de cercetat<br />
- Primeri specifici secvenţei de clonat –<br />
complimentari secvenţelor flancante<br />
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă<br />
- Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)<br />
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:<br />
- tº de denaturare ADN<br />
- tº de renaturare (ADN+primer)<br />
- tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de<br />
ADN)<br />
Extragerea ADN Pregătirea<br />
componentelor pentru<br />
PCR<br />
Electroforeza<br />
produşilor PCR<br />
Colorarea şi<br />
vizualizarea produşilor<br />
PCR<br />
Amplificarea<br />
ADN-ţintă<br />
Interpretarea<br />
rezultatelor<br />
Etapele tehnicii PCR<br />
A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante<br />
B. Repetarea automată a procedurilor de denaturarerenaturare-elongare<br />
de 30-35 ori<br />
•Denaturarea ADN la 96oC •Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor<br />
•Elongarea catenelor ADN la 72oC C. Analiza produşilor PCR<br />
- electroforeza<br />
- colorarea<br />
- interpretarea rezultatelor<br />
12/11/2009<br />
3
Avantajele PCR<br />
Metodă rapidă<br />
•Metodă Metodă ieftină<br />
•Utilizarea Utilizarea cantităţilor mici de material analizat<br />
•Nu Nu necesită izotopi radioactivi<br />
•Interpretarea Interpretarea uşoară a rezultatelor<br />
Dezavantajele PCR<br />
•Necesitatea Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice<br />
amplificate<br />
•Necesitatea Necesitatea primerilor sintetici, specifici<br />
secvenţei analizate<br />
Identificarea inserţiilor / deleţiilor<br />
Identificarea agenţilor infecţioşi<br />
Utilizarea PCR<br />
•Identificarea Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice<br />
•Identificarea Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile<br />
nucleotidice)<br />
•Identificarea Identificarea expresiei genice ( (RT RT-PCR PCR)<br />
•Dactiloscopia Dactiloscopia genomică (filiaţie)<br />
•Identificarea Identificarea agenţilor infecţioşi<br />
•Identificarea Identificarea gradului de infecţie ( (quantitative quantitative PCR PCR)<br />
Identificarea mutaţiilor punctiforme<br />
12/11/2009<br />
4
Stabilirea paternităţii (filiaţiei) <strong>Tehnica</strong><br />
<strong>Southern</strong>-<strong>blot</strong><br />
Hibridarea acizilor nucleici<br />
•Unirea Unirea complementară a fragmentelor<br />
(moleculelor) de acizi nucleici:<br />
•ADN ADN de cercetat cu<br />
•sonda sonda oligonucleotidică<br />
•În În reacţie participă molecule monocatenare<br />
•Moleculele Moleculele ADN ADN-ţintă ţintă sunt fixate<br />
•Moleculele<br />
Moleculele-sonde sonde sunt marcate radioactiv sau<br />
fluorescent<br />
•Identificarea Identificarea complexelor hibride se realizează<br />
prin intermediul autoradiografiei<br />
Utilizarea tehnicii<br />
<strong>Southern</strong> <strong>Southern</strong>-<strong>blot</strong> <strong>blot</strong><br />
• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari<br />
• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce<br />
afectează SR<br />
• Dactiloscopia genomică RFLPs<br />
Bazată pe RFLPs<br />
Hibridizare cu sonde marcate<br />
Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un<br />
suport solid (pe membrane de nitroceluloză)<br />
<strong>Tehnica</strong> <strong>Southern</strong> <strong>Southern</strong>-<strong>blot</strong> <strong>blot</strong><br />
Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN<br />
Denaturarea şi<br />
transferul ADN<br />
pe membrane<br />
Hibridare cu sonda<br />
Autoradiografia<br />
Vizualizarea şi<br />
interpretarea<br />
rezultatelor<br />
RFLPs şi analiza genotipului<br />
Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2<br />
Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C<br />
12/11/2009<br />
C (mm)<br />
B (Nm)<br />
A (NN)<br />
5
<strong>Tehnica</strong> Northern Northern-<strong>blot</strong> <strong>blot</strong><br />
Extragerea ARN Electroforeza ARN<br />
Transferul ARN<br />
pe membrane<br />
Identificarea nivelului<br />
de expresie şi a variantei<br />
de splicing<br />
Hibridare cu sonda<br />
Autoradiografia<br />
Vizualizarea şi<br />
interpretarea<br />
rezultatelor<br />
<strong>Tehnica</strong><br />
Northern Northern-<strong>blot</strong> <strong>blot</strong><br />
•Extragerea Extragerea ARN din ţesutul ţintă<br />
•Electroforeza Electroforeza ARN în condiţii de<br />
denaturare<br />
•Transfer Transfer pe membrană de<br />
nailon<br />
•Hibridarea Hibridarea cu sonda marcată<br />
•Autoradiografia<br />
Autoradiografia<br />
Utilizarea tehnicii<br />
Northern Northern-<strong>blot</strong> <strong>blot</strong><br />
•Identificarea Identificarea expresiei genice în anumite<br />
ţesuturi, anumite condiţii<br />
•Identificarea Identificarea variantei de splicing a proARNm<br />
•Identificarea Identificarea nivelului de expresie<br />
•Identificarea Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)<br />
12/11/2009<br />
6
Secvenţierea ADN<br />
Stabilirea secvenţei de nucleotide<br />
Metoda chimică (tehnica Maxam Maxam-Gilbert, Gilbert, 197 1973)<br />
Metoda dideoxi (tehnica SSanger,<br />
nger, 197 1975)<br />
Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)<br />
5’-ATTACA ATTACAAGATTACCATGT<br />
GATTACCATGT-3’ 3’ catena codogen codogenă<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’ catena anticodogenă (matriţă)<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTAC-3’ 3’<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTACA-3’ 3’<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTACA CAA-3’ 3’<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAG-3’ 3’<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGA-3’ 3’<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGA GAT-3’ 3’<br />
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGAT GATT-3’ 3’<br />
A<br />
T<br />
G<br />
C<br />
5’-ATTA ATTACA-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAA-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGA-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATT GATTA-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACC GATTACCA-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGA GAT-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGAT GATT-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCA<br />
GATTACCAT-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCATG<br />
GATTACCATGT-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAG-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCAT<br />
GATTACCATG-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTAC-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTA GATTAC-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTAC GATTACC-3’ 3’<br />
5’-ATTA ATTA -- primer marcat P32 pentru ADN-polimerază<br />
A, T, C, T – dNTP (2 (2’-dNTP) dNTP)<br />
pentru sinteza noilor catene<br />
A, T, C, T – ddNTP (2 (2’,3 ,3’-ddNTP dNTP)<br />
pentru stoparea sintezei<br />
A T C G<br />
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCATGT<br />
GATTACCATGT-3’ 3’<br />
-<br />
+<br />
ADN mut ARNm mut Proteină an Caracter an<br />
5’-ATT ATTACA CAAGATTACCATGT<br />
GATTACCATGT-3’ 3’ mutaţie G G4→A 3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA<br />
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’<br />
Transcripţie<br />
5’-AUU AUUACA CAAGAUUACCAUGU<br />
GAUUACCAUGU-3’ 3’ ARNm ARNmmut Translaţie<br />
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid polipeptidan Caracter fenotipic anormal<br />
•Sinteza Sinteza enzimatică a<br />
ADN<br />
•Utilizarea Utilizarea în paralel a<br />
nucleotidelor ce<br />
conţin deoxiriboză şi<br />
dideoxiriboză<br />
•Stoparea Stoparea sintezei în<br />
cazul incorporării<br />
ddNTP<br />
•Extragerea Extragerea ADN<br />
•Denaturarea Denaturarea ADN<br />
•Sinteza Sinteza catenelor<br />
complementare utilizând<br />
primeri marcaţi cu 32 P în<br />
prezenţa dNTP şi ddNTP<br />
•Electroforeza Electroforeza în condiţii<br />
de denaturare<br />
•Vizualizarea Vizualizarea fragmentelor<br />
marcate prin<br />
autoradiografie<br />
<strong>Tehnica</strong> dideoxi<br />
<strong>Tehnica</strong> dideoxi<br />
12/11/2009<br />
7
-<br />
+<br />
•Pregătirea Pregătirea<br />
preparatelor de<br />
cromozomi<br />
•Denaturarea Denaturarea ADN<br />
•Hibridarea Hibridarea cu sonda<br />
marcată<br />
•Vizualizarea Vizualizarea la<br />
microscopul optic<br />
(+) 5' TAAATGGCTA<br />
TAAATGGCTA.......3'(-)<br />
Hibridarea in situ<br />
Hibridarea in situ<br />
pentru depistarea<br />
secvenţelor ARN<br />
Hibridarea in situ cu<br />
utilizarea probei sens (stânga)<br />
şi antisens (dreapta)<br />
Analiza<br />
histochimică –<br />
identificarea<br />
proteinelor în ţesut<br />
Hibridarea in situ cu<br />
utilizarea preparatelor<br />
de cromozomi metafazici<br />
Metoda automată<br />
Hibridarea in situ pentru<br />
depistarea secvenţelor ADN<br />
Hibridarea in situ cu<br />
utilizarea preparatelor<br />
cu nuclei interfazici<br />
12/11/2009<br />
8
Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor<br />
nucleici:<br />
1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de<br />
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de<br />
reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.<br />
2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice<br />
- prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii<br />
copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor<br />
patologii severe.<br />
3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea<br />
vectorilor de gene etc.).<br />
4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în<br />
diagnosticul bolilor infecţioase.<br />
5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza<br />
filiaţiei, în criminalistică.<br />
12/11/2009<br />
9