CAPITOLUL 11 Separarea prin cromatografie de lichide (LC)

11.1. Istoric
CAPITOLUL 11
Separarea prin cromatografie de lichide (LC)
Începutul cromatografiei de lichide este atribuit lui Ţwet (1903), care a reuşit
pentru prima dată separarea unor compuşi naturali coloraţi pe o coloană umplută cu
carbonat de calciu, utilizând o fază mobilă alcătuită din solvenţi organici. Dezvoltarea
cromatografiei de lichide ca tehnică analitică are loc ceva mai târziu şi este legată de
necesitatea crescândă de separare a compuşilor organici din matrici complexe.
In iunie 1941, Societatea Britanică de Biochimie, îşi ţinea cea de-a 214-a şedinţă
de comunicări, la Institutul Naţional de Cercetări Medicale. La această întâlnire Martin şi
Synge, doi tineri chimişti (Martin avea 31 de ani; Synge – 26), au prezentat o lucrare
despre separarea şi determinarea amino-acizilor N-acilaţi din probe de lână, printr-o nouă
metodă analitică. Aceştia au separat acetil-prolina de acetil-leucina, utilizând o coloană
umplută cu silicagel impregnat cu apă (un material foarte polar) şi cloroform ca fază
mobilă. Lua naştere astfel „cromatografia de partiţie”, recunoscută apoi ca separare prin
cromatografie de lichide în fază normală. [106,107] Exact 10 ani mai târziu, Martin şi un alt
tânăr cercetător (A.James – 29 ani) trimiteau spre publicare o lucrare descriind un proces
cromatografic în care faza mobilă este un gaz. [108,109] Se puneau bazele „cromatografiei
de partiţie gaz-lichid”. In anul 1948 Martin şi grupul său de cercetare încep cercetări la
Institutul Naţional din Londra cu privire la problema separării cromatografice a acizilor
graşi, cu catenă hidrocarbonată mare. Aplicarea separării cromatografice în fază normală
nu a dat rezultatele dorite, deoarece coeficienţii de partiţie ai acestor compuşi erau
aproape total în favoarea fazei mobile. Deci retenţia şi astfel separarea lor pe o coloană
polară nu avea loc. Ideea de a schimba rolurile celor două faze a venit imediat. Astfel au
realizat prima fază staţionară nepolară prin tratarea kiselgurului cu Si(CH3)2Cl2, care
devine total neaderent de către solvenţi polari şi hidrofili. In anul următor au realizat
pentru prima dată separarea acidului lauric (C12) de acidul stearic (C18). Mai târziu,
tehnica bazată pe acest principiu avea să fie cunoscută ca separare prin cromatografie
de lichide în fază inversă, deşi până în 1970 chiar şi IUPAC considera această tehnică
analitică doar de interes istoric. Prin realizarea fazelor staţionare chimic legate această
tehnică ia o mare dezvoltare, în prezent fiind cea mai importantă tehnică analitică de
separare. [110] Contribuţiile esenţiale ale lui Martin şi Synge la dezvoltarea cromatografiei
au fost răsplătite în anul 1952 prin acordarea Premiului Nobel în Chimie.
Prima fază staţionară sintetizată este atribuită autorilor Halasz şi Sebastian
(1969), care au refluxat silicagelul cu 1-octanol, obţinând eterul având la bază o structură
destul de instabilă în prezenţa apei, caraterizată de legăturile Si-O-C:
Si OH + HO-(CH2 ) 7CH3 Si O (CH ) CH + HOH
2 7 3
In 1970 Kirkland şi DeStefano au ataşat lanţuri hidrocarbonate la structura silicagelului
prin utilizarea reactivilor de derivatizare de tip silanic, obţinând structuri mult mai stabile
179

pe bază de legături Si-O-Si, ca în exemplul următor:
CH 3
Si OH + Cl Si (CH2 ) 7CH3 CH 3
180
CH 3
Si O Si (CH ) CH 2 7 3 + HCl
Horvath, Knox, Soczewinski, Snyder, Scott, Kirkland, Guiochon sunt doar câteva
nume mari de oameni de ştiinţă care au adus contribuţii fundamentale, teoretice sau
experimentale, la dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnică analitică de mare
performanţă.
CH 3
11.2. Clasificarea separărilor prin cromatografia de lichide
Retenţia în cromatografia de lichide este un proces complex, care implică
interacţii ale speciilor din proba injectată atât cu faza mobilă, cât şi cu faza staţionară.
Cunoaşterea mecanismului după care se desfăşoară procesul de retenţie are ca prim
avantaj pentru analist posibilitatea predicţiei acestuia şi mai ales alegerea acelor condiţii
experimentale pentru atingerea unor selectivităţi maxime între analiţi. Cea mai importantă
clasificare a separărilor LC este bazată pe mecanismul care stă la baza separării, care la
rândul său depinde de natura celor faze (staţionară şi mobilă) participante în procesul de
separare cromatografică. Cele mai importante clase de separări LC sunt următoarele:
A) Cromatografia de lichide în fază normală (NP-LC – „ normal-phase liquid
chromatography”) în care faza staţionară este polară, iar faza mobilă este alcătuită dintrun
solvent nepolar cu un conţinut mic de modificator polar.
B) Cromatografia de lichide în fază inversă (RP-LC – „reversed-phase liquid
chromatography”) în care faza staţionară este nepolară şi hidrofobă, iar faza mobilă este
alcătuită dintr-un solvent polară.
C) Cromatografia de lichide prin mecanism de schimb ionic (IC – „ion
chromatography”), în care faza staţionară este un schimbător de ioni, iar faza mobilă este
apoasă cu un pH controlat.
D) Cromatografie de lichide prin mecanism de excludere (sau cromatografie pe
gel), în care faza staţionară este un gel cu porozitate controlată, iar componenţii probei
sunt separaţi în funcţie de forma şi dimensiunea moleculară.
E) Cromatografie de lichide bazată pe interacţia diferită a compuşilor asimetrici
cu anumite structuri din faza staţionară (numite selectori de chiralitate).
Cele mai importante separări cromatografice se efectuează în prezent pe o
coloană cromatografică, confecţionată dintr-un metal. In interiorul coloanei se găseşte
faza staţionară, fixată la capete între două frite. Diametrul şi lungimea sunt parametri
constructivi, funcţie de care coloanele se împart în mai multe clase, descrise în tabelul
următor.
Cromatografia de lichide planară este o tehnică cu aplicaţii din ce în ce mai puţin
utilizate în practică analitică. Cromatografia pe hârtie sau cromatografia în strat subţire în
diverse variante (ascendentă sau descendentă) pot decurge prin unul din mecanismele
de mai sus, iar vizualizarea compuşilor separaţi sub forma de spoturi se poate face
utilizând proprietatea de absorbţie sau de fluorescenţă a analiţilor separaţi, cu sau fără
reactiv de derivatizare (aşa-numita developare). Există şi posibilitatea ca spoturile
rezultate să fie izolate şi apoi printr-o procedură de extracţie cu un solvent adecvat,
analitul conţinut să fie determinat printr-o tehnică spectrometrică.

Tabel 11.1. Clasificarea coloanelor în LC în funcţie de dimensiuni. [111]
Descriere i.d. (mm) d.p. (μm) Debit optim fază mobilă
Coloane deschise < 0,025 - < 25 nL/min
Coloane nanobore 0,025 – 0,1 - 25-4000 nL/min
Coloane capilare 0,1 - 1 - 0,4 – 200 μL/min
Coloane microbore 1 - 2 3 - 5 0,05 – 1 mL/min
Coloane narrow-bore 2 - 4 3 - 5 0,3 – 3 mL/min
Coloane normal-bore 4 - 5 3 - 7 1 – 10 mL/min
Coloane semi-preparative 5 - 10 5 - 12 5 – 40 mL/min
Coloane preparative > 10 5 - 20 > 20 mL/min
11.3. Faze mobile în cromatografia de lichide
Faza mobilă (nepolară) în cromatografia de lichide în fază normală (NP-LC) este
alcătuită din două componente principale:
a) solventul nepolar, care poate fi unul dintre solvenţii: pentan, hexan, ciclohexan;
b) modificator polar (într-un procent foarte mic): tetrahidrofuran, 2-propanol, acetonitril,
eteri, esteri, cloroform, etc.
Aceştia pot fi clasificaţi în solvenţi slabi (cu putere elutropică mică) şi solvenţi tari
(putere elutropică mare, după cum se poate observa din tabelul 11.2).
Faza mobilă (polară) în RP-LC este în general alcătuită din două componente
principale: componenta apoasă şi componenta organică. Parametrii fazei mobile care
influenţează retenţia în RP-LC sunt următorii:
• Natura modificatorului organic (acetonitril, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol,
tetrahidrofuran, dioxan, etc); puterea elutropică a modificatorului organic este o măsură a
capacităţii sale de a micşora factorul de capacitate (timpul de retenţie) al analiţilor: cu cât
puterea elutropică este mai mare, cu atât timpul de retenţie va fi mai mic.
• Conţinutul modificatorului organic (% în volume): de regulă, cu cât concentraţia
modificatorului organic este mai mare, cu atât timpul de retenţie al analiţilor este mai mic
(prin creşterea solubilităţii analiţilor în faza mobilă);
• pH-ul şi componentei apoase din faza mobilă influenţează retenţia analiţilor cu
proprietăţi acido-bazice;
• Natura acidului (acizi formic, acetic, trifluoracetic, tricloracetic) sau a tamponului utilizat
în componenta apoasă (se pot utiliza soluţii tampon pe bază de fosfat, borat, acetat, etc,
cu amoniac, trietilamina, dar cu pH-ul cuprins între 2 şi 8);
• Tăria ionică a componentei apoase (care depinde de concentraţia unor săruri adăugate,
sau de concentraţia soluţiei tampon);
• Natura şi concentraţia agenţilor de formare de perechi ionice (R4N + - -
; R-SO3 ; R-O-SO3 ,
etc).
Solvenţii folosiţi în LC trebuie să fie filtraţi (pentru a nu conţine particule în
suspensie), degazaţi şi de puritate cromatografică. Folosirea unor solvenţi cu particule
solide în suspensie conduce la colmatarea coloanei cromatografice şi a sistemului
cromatografic. Prezenţa unor gaze (N2 sau O2) dizolvate în faza mobilă poate influenţa
181

detecţia, deoarece după ieşirea din coloana cromatografică fluxul mobil are o presiune
mai mică decât în coloană şi astfel se pot forma bule gazoase care pot perturba în
procesul de detecţie.
11.4. Faze staţionare în cromatografia de lichide
Fază normală
Cea mai importantă fază staţionară în cromatografia de lichide în fază normală
este silicagelul (SiO2). Acesta este considerat un adsorbant foarte polar, datorită
grupărilor silanol reziduale din matricea sa. De asemenea, Al2O3, ZrO2, sau TiO2 sunt
menţionate des ca faze staţionare polare în NP-LC. Fazele staţionare polare legate sunt
derivate din silicagel; acestea conţin grupări funcţionale polare X, precum hidroxil, nitro,
cian, sau amino, legate printr-un lanţ hidrocarbonat scurt R:
Dintre acestea, aminopropil-silicagelul sau dihidroxipropil-silicagelul sunt cele mai
utilizate faze staţionare legate în separările LC prin acest mecanism.
Utilizând tehnica derivatizării amino-silicagelului cu acidul dodecamolibdofosforic
s-au realizat noi faze staţionare polare, utilizate în separarea compuşilor aromatici.
Retenţia puternică a compuşilor aromatici pe astfel de faze staţionare polare se explică
prin interacţia puternică a orbitalilor π din nucleele aromatice cu orbitalii d ai Mo. [112]
Fază inversă
Si O Si
CH 3
CH 3
CH 2 CH 2 CH 2
Aminopropil-silicagel
Si OH
O
Si
O
Si
O
Si
CH 3
Si O Si
O
O
CH 3
NH 2
In cromatografia de lichide în fază inversă (RP-LC) fazele staţionare sunt
hidrofobe. Acestea se pot obţine prin modificarea chimică a silicagelului (sau chiar
182
R X
+
(CH2 ) 3-NH3 +
(CH2 ) 3-NH3 +
O (CH2 ) 3-NH3 Si O
CH 3
Si CH 2 CH CH 2
CH 3
OH OH
Dihidroxipropil-silicagel
3-
PMo12O40

aluminei) sau pot fi de natură polimerică. De aceea, aceste faze staţionare se mai
numesc şi faze chimic legate („bonded phases”). Principiul de sinteză a fazelor chimic
legate se bazează pe reacţia grupărilor silanol reziduale din matricea silicagelului tratat
termic cu un agent de silanizare. In figura următoare, prin reacţia de derivatizare, în una
din cele două modalităţi menţionate, s-a introdus radicalul hidrocarbonat octadecil legat
de matricea silicagelului. [113,114]
In funcţie de natura radicalului R grefat prin intermediul reactivului de derivatizare
de tip silanic se disting următoarele faze staţionare (redate în ordinea descrescătoare a
hidrofobicităţii lor):
• -C18H37 (octadecil-silicagel, sau C18);
• -C8H17 (octil-, sau C8);
• C6, C4, C2
• -C6H5 (fenil-);
• -C6H4-NO2 (nitrofenil);
• -(CH2)3-CN(cianopropil).
CH 3
Si OH + X Si (CH 2 ) 17 CH 3
Si OH
O
Si OH
O
Si OH
Silicagel
pKa = 5-7
Densitate:
8 ± 1 μmol/m 2
CH 3
X O
+ X Si (CH 2 ) 17 CH 3
X
183
CH 3
Si O Si (CH2 ) 17CH3 Si
Si
O
Si
O
O
O
Si
O
Si
O Si
CH 3
Si
(CH 2 ) 17 CH 3
(CH 2 ) 17 CH 3
(CH 2 ) 17 CH 3
(CH 2 ) 17 CH 3
Densitate:
4,5 μmol/m 2
Fig. 11.1. Modalităţi de obţinere a fazelor staţionare chimic modificate din silicagel,
utilizând reactivi de derivatizare mono-funcţionali sau tri-funcţionali, şi unele caracteristici
ale suprafeţei silicagelului înainte şi după derivatizare.
Cu toate acestea, în materialul rezultat după reacţia de silanizare o parte
însemnată a grupărilor silanol rămân intacte. Prezenţa acestora în compoziţia fazei
staţionare poate influenţa mecanismul de separare, datorită interacţiunilor dipol-dipol sau

prin legături de hidrogen cu grupări similare din moleculele de analit. Derivatizarea
completă a acestora conduce la faze staţionare complet inertizate (cunoscute în literatura
de specialitate ca faze staţionare de tip „end-capped”) şi se poate efectua prin utilizare
unui reactiv de derivatizare trifuncţional, plus aplicarea în final a unei silanizări cu
trimetilclorsilan, care datorită volumului său mai mic poate accesa restul de grupări
silanol, ecranate steric de grupările chimic legate deja introduse anterior.
Fazele staţionare chimic modificate de tip monolitic, conţinând radicali
hidrocarbonaţi R, se obţin prin procese sol-gel. Aceste materiale au un aspect ceramic,
caracterizate de o porozitate înaltă, iar radicalii R sunt orientaţi în afara matricei solide.
Prepararea unor astfel de materiale de tip ceramic porneşte de la reactivul de bază
tetrametoxisilan, care prin hidroliză acidă (în prezenţă de HCl) formează compuşi
intermediari cu legături Si-OH, datorată reacţiei: [115]
Si(OCH3)4 + n HOH → Si(OCH3)4-n(OH)n + n CH3OH
In continuare au loc reacţii de condensare ce conduc la formarea de legături siloxanice,
iar structura devine tridimensională:
Si OH + HO
Si
Si O Si + HOH
Si OCH HO
Si
3 + Si O Si + CH3OH Dacă alături de tetrametoxisilan se adaugă într-un raport molar ales trimetoxialchilsilan;
structura tridimensională rezultată va conţine radicali hidrocarbonaţi R legaţi de atomul de
siliciu. Ecuaţia reacţiei poate fi scrisă în mod simplificat astfel:
OCH 3
R
O R
HOH
x CH3O Si OCH3 + y CH3O Si OCH ( Si O)
( Si O
3
)
x y
O O
OCH 3
OCH 3
La încălzire, molecule de apă şi metanol sunt eliminate din porii materialului format.
Acesta poate lua forma unei bare care apoi se introduce în coloana cromatografică.
Fazele staţionare modificate din silicagel au o mare aplicabilitate în cromatografia
de lichide, dar prezintă şi unele inconveniente. Două dintre inconvenientele cele mai
serioase ale acestor faze staţionare sunt:
- domeniul de pH al componentei apoase utilizate este relativ restrâns (2-8); la pH-uri sub
2 are loc hidroliza grupărilor –O-Si(CH3)2-R, iar la pH-uri mai mari de 8 are loc dizolvarea
silicagelului;
- acestea nu pot fi utilizate în separări cromatografice pentru concentraţii ale componentei
apoase în faza mobilă apropiate de 100%. In acest caz lanţurile hidrocarbonate legate de
structura silicagelului colapsează, ele neputând a reveni la conformaţia iniţială după
utilizarea de faze mobile total sau aproape total apoase (mai mari de 98%).
Colapsarea lanţurilor hidrocarbonate este similară formării micelelor, lanţurile
hidrocarbonate având tendinţa de a micşora suprafaţa de contact cu mediul apos. In Fig.
11.2 sunt redate tendinţele unei suprafeţe de silicagel chimic modificat cu lanţuri
184
+ (4x + 3y) CH 3 OH

hidrocarbonate, în prezenţa unei faze mobile conţinând un procent semnificativ de
modificator organic, comparativ cu o fază mobilă cu un conţinut apropiat de 100% apă.
CH 3
O Si
CH 3
CH 3
O Si
CH 3
CH 3
O Si
CH 3
Fig. 11.2. Conformaţii ale lanţurilor C18 în prezenţa unui mediu apă + modificator (solvent) organic
(partea stângă) şi în prezenţa unui mediu total apos (partea dreaptă).
Acest ultim inconvenient s-a putut rezolva prin realizarea de faze staţionare
chimic modificate, conţinând grupări polare intercalate între lanţul hidrocarbonat şi atomul
de siliciu. O astfel de structură este mai flexibilă la faze mobile total sau aproape total
apoase. Sinteza lor presupune două etape, una de introducere a grupării polare, urmată
de introducerea radicalului hidrofob R. Două dintre posibilităţile aplicate în obţinerea
fazelor staţionare chimic legate cu grupări polare intercalate sunt prezentate în
continuare. Calea de sinteză a fazelor staţionare legate, cu grupare polară intercalată de
tip amidică este următoarea: [116]
OH
OH
OH
OH
(silicagel)
Mediu polar (solvent organic / apă) Mediu foarte polar (100% apă)
Lanţuri hidrocarbonate de tip C18
+ CH 3 CH 2 O Si
O
OH
O
OH
CH 3
CH 3
CH 3
Si
CH 3
CH 3
Si
CH 3
NH 2
Grupa amidica
NH CO R
NH CO R
Fig. 11.3. Procedeu de derivatizare a silicagelului pentru obţinerea fazelor staţionare chimic legate
cu grupare polară amidică intercalată.
185
O
OH
O
OH
CH 3
Si
CH 3
CH 3
Si
CH 3
CH 3
O Si
CH 3
CH 3
O Si
CH 3
CH 3
O Si
CH 3
+ R C
NH 2
NH 2
O
Cl

Calea de sinteză a fazelor staţionare legate, cu grupare polară intercalată de tip
carbamic, este redată mai jos: [116]
OH
OH
OH +
OH
Fig. 11.4. Procedeu de derivatizare a silicagelului pentru obţinerea fazelor staţionare
chimic legate cu grupare polară carbamică intercalată.
Introducerea grupării polare influenţează procesul de retenţie cromatografică.
Gruparea polară poate interacţiona cu grupări polare din moleculele de analit. In cazul
grupărilor polare intercalate de tip amidic sau carbamic, pot interveni interacţii π-π între
analit şi gruparea polară din faza staţionară. Astfel, în exemplul redat în Fig. 11.5, ordinea
de eluţie se poate modifica în cazul perechii de analiţi trans-stilben şi dibenzil la eluţia
printr-o coloană umplută cu fază staţionară C18 cu grupare polară intercalată, comparativ
cu una C18 clasică. Spre deosebire de dibenzil, molecula de trans-stilben posedă în plus
o dublă legătură carbon-carbon, care determină o interacţie mai puternică cu legăturile π
din grupările polare ale fazei staţionare. In schimb, în cazul separării pe o coloană clasică
C18, ordinea de eluţie este dată de ordinea hidrofobicităţii; trans-stilbenul este mai puţin
hidrofob decât dibenzilul, datorită dublei legături (vezi Tabelul 2.4), astfel că va elua
primul din coloana cromatografică.
Răspuns detector
Răspuns detector
CH 3
Cl Si
CH 3
O
O N H
R
Grupare
carbamica
Fig. 11.5. Compararea separării unui amestec de trans-stilben şi dibenzil, pe o coloană
cu fază staţionară C18 (sus) şi fază staţionară C18 cu grupare polară intercalată (jos).
Condiţiile de separare identice pentru cele două coloane: faza mobilă compusă din
70% CH3OH şi 30% H2O; debit – 1 mL/min; 40°C; detecţie UV 254 nm. [117]
186
- HCl
O
OH
O
OH
min
Si
min
CH 3
CH 3
CH 3
Si
CH 3
O
O N H
O N H R
O
R

11.5. Mecanismul de separare LC în fază normală
Cromatografia de lichide în fază normală se aplică de obicei la separarea
compuşilor organici foarte polari, cum sunt aminoacizii.
Cromatografia lichid-solid (LSC) este de obicei denumită ca o tehnică de
separare în fază normală, caracterizată de utilizarea unui adsorbant anorganic sau a unei
faze staţionare chimic legate cu grupări funcţionale polare, iar ca fază mobilă neapoasă –
unul sau mai mulţi solvenţi organici apolari (în special hexanul) în amestec cu un solvent
polar, până la realizarea unei valori optime a „tăriei” solventului din punct de vedere al
polarităţii. In cadrul acestei separări, pe suprafaţa fazei staţionare se formează un strat
de molecule adsorbite ale fazei mobile, cu o compoziţie ce depinde de alegerea fazei
mobile, care de multe ori nu reflectă compoziţia acesteia sau modificarea ei în timpul unui
proces de separare în gradient de solvent. Retenţia unui solut este determinată de
balanţa interacţiunilor moleculei de solut cu moleculele fazei mobile şi a moleculelor
adsorbite pe suprafaţa fazei staţionare. Pentru acest proces s-au propus până în prezent
două modele de retenţie: [30] a) modelul competiţional dezvoltat de Snyder şi Soczewinski;
b) modelul interacţiilor de solvent, propus de Scott şi Kucera.
In forma cea mai simplificată, modelul competiţional presupune că suprafaţa
întreagă a adsorbantului este acoperită de un monostrat de molecule ale fazei mobile.
Retenţia are loc prin dislocuirea unui număr de molecule de fază mobilă, adsorbite la
nivelul centrilor activi ai fazei staţionare, echivalente ca volum cu molecula de solut. In
următoarea etapă are loc dislocuirea moleculei de solut adsorbită de către molecule ale
fazei mobile. O reprezentare schematică a acestui model simplu de explicare a retenţiei
în NP-LC este redată în figura următoare.
187
Analit
Fig. 11.6. Reprezentarea schematică a modelului competiţional de retenţie
în cromatografia de lichide în fază normală.
Modificator
polar
Conform modelului competiţional dat în Fig. 11.6, retenţia se bazează pe
următoarele două procese fizice care au loc la suprafaţa fazei staţionare:
Si-OH + nS → Si-OH⋅(S)n
Si-OH⋅(S)n + A → Si-OH⋅(S)n-x⋅A + xS
, în care Si-OH reprezintă centrul de adsorbţie de pe suprafaţa adsorbantului (considerat
ca fiind gruparea silanol reziduală din structura silicagelului), la care se adsorb n
molecule de solvent polar S din faza mobilă, iar molecula de analit A va dislocui x dintre
moleculele de solvent adsorbite.

Pentru ca analitul să elueze din coloana cromatografică este necesar ca acest
proces să fie reversibil. De aceea tăria interacţiei sale cu centrul activ nu trebuie să fie
foarte puternică. După cum se poate observa, modelul competiţional neglijează orice
interacţie între molecula de analit şi moleculele fazei mobile. Predicţia retenţiei este
redată de relaţia simplificată:
k
log 1 = α(
ε1
− ε2
)
(11.1)
k2
ε reprezintă parametrul de tărie al fazei mobile (putere elutropică), care semnifică energia
liberă de adsorbţie a moleculelor de solut per unitate de suprafaţă de fază staţionară, iar
parametrul α este specific moleculei de solut (în dependenţă de volumul molar). In tabelul
de mai jos sunt redate valorile parametrului ε pentru cei mai importanţi solvenţi utilizaţi în
mecanismul de fază inversă în HPLC.
Tabel 11.2. Valorile parametrului ε pentru solvenţi utilizaţi în NP-LC. [118]
Solvent
188
ε pentru
Silicagel Alumina
n-hexan 0,01 0,01
1-clorbutan 0,20 0,26
cloroform 0,26 0,40
izopropileter 0,34 0,28
acetat de etil 0,38 0,58
tetrahidrofuran 0,44 0,57
acetonitril 0,50 0,65
Modelul bazat pe interacţia moleculelor de solut, respectiv a modificatorului polar
din faza mobilă, presupune formarea a două straturi adsorbite, ca urmare a interacţiilor
dipol-dipol. Atunci când concentraţia modificatorului polar este mică, formarea celui de-al
doilea strat de molecule de modificator polar adsorbite, în interacţie cu primul strat şi cu
centrul activ, nu are loc, iar interacţia moleculei de solut cu centrul activ devine mai
puternică, conducând la timpi de retenţie mari. Dimpotrivă, atunci când concentraţia
modificatorului polar creşte, are loc formarea celui de-al doilea strat de molecule
adsorbite, iar molecula de solut va interacţiona mult mai slab cu centrul activ, datorită
ecranării celor două straturi adsorbite. Ca urmare, timpul de retenţie al solutului va fi de
data aceasta mai scurt, fiind dat de relaţia simplificată:
1
= α + β ⋅ Cmodificator
polar
(11.2)
tr
Această relaţie este însă valabilă pentru un domeniu relativ îngust al concentraţiei
modificatorului polar din faza mobilă.