160 standardizarea procedurii de conservare a tulpinilor de bacterii ...

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2(317) 2012
Microbiologia şi Biotehnologia
3. Ursu A.
Degradarea solurilor şi desertifi carea. Chişinău, Pontos. 2000, 307 p.
4. Vance, E.D., Brookes, P.C., Jenkinson, D.S. An extraction method for measuring soil
microbial biomass C // Soil Biol. & Bioch. 1987. V. 19. P. 703–707.
5. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. M., МГУ, 1970, c.
487.
6. Корчмару C. Оценка метода субстрат-индуцированного дыхания (для определения
почвенной микробной биомассы) на примере почв Молдовы. // Buletinul Academiei de Ştiinţe
a Moldovei. Ştiinţe vieţii. n. 1 (307), 2009, р.134-142.
7. Меренюк Г.,Урсу А., Корчмару C., Сашко Е. Микробиологическая характеристика
зональных почв Молдовы // Mediul Ambiant. 2009. nr.5 (47), p. 4-8.
STANDARDIZAREA PROCEDURII DE CONSERVARE
A TULPINILOR DE BACTERII PĂSTRATE ÎN COLECŢIA
NAŢIONALĂ DE MICROORGANISME NEPATOGENE.
I. STANDARDIZAREA PROCEDURII DE CONSERVARE A
TULPINILOR DIN GENUL PSEUDOMONAS PĂSTRATE IN
COLECTIA NATIONALĂ DE MICROORGANISME NEPATOGENE
Slanina Valerina, Lupaşcu Lucian, Tolocichina Svetlana, Burţeva Svetlana,
Postolachi Olga, Sîrbu Tamara, StepanovVitalie, Chiseliţa Oleg.
Institutul de Microbiologie şi Biotehnologie al Academiei de Ştiinţe a Moldovei
Referat
A fost demonstrat, că mediile de nutriţie King B şi bulion peptonat de carne, asigură
o densitate sufi cientă de celule nesesară unei liofi lizări reuşite a bacteriilor din genul
Pseudomonas. Au fost determinaţi parametrii optimi pentru liofi lizarea tulpinilor din
genul Pseudomonas. S-a stabilit, că utilizarea mediilor de protecţie, lapte degresat (LD)
+ zaharoză de 10,0% (Z 10%) şi succinatului de sodiu (Succ.Na) + zaharoză de 12,0%
(Z12%), a temperaturii de congelare (-20 o C), apoi revitalizarea cu apă distilată asigură
cea mai înaltă viabilitate a tulpinilor din genul Pseudomonas.
Cubinte cheie: liofi lizare - medii nutritive - medii de protecţie.
Depus la redacţie 27 martie 2012
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
Adresa pentru corespondenţă: SlaninaValerina Institutul de Microbiologie şi Biotehnologie
al Academiei de Ştiinţe a Moldovei, str.Academiei, 1, MD 2028 Chişinău, Republica
Moldova; e-mail: valerinaslanina@mail.ru, tel. (+373 22) 73 96 09
Introducere
Tulpinile de microorganisme, utilizate în biotehnologie prezintă valoare comercială,
de aceea problema menţinerii cît mai indelungate a proprietăţilor biosintetice şi celor
economic valoroase este permanent în atenţia savanţilor. Păstrarea microorganismelor
necesită utilizarea metodelor efi ciente de conservare şi monitorizarea permanentă al
efi cacităţii acestor metode. Diferite metode de conservare au avantajele şi dezavantajele
lor [4, 5, 9,14, 16, 18]. Verifi carea viabilităţii culturilor după păstrarea îndelungată
prin diferite procedee a arătat, că cele mai efi ciente metode de păstrare sunt crioconservarea
şi liofi lizarea, deoarece asigură un nivel destul de înalt de viabilitate şi activitate
de creştere [3, 6, 10, 17, 19-22].
160

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2 (317) 2012
Utilizarea preparatelor bacteriene în lupta cu insectele dăunătoare şi diverse micoze,
întâlnite la plantele agricole, prezintă şi astăzi un interes deosebit. Unele din cele
mai cunoscute preparate cu acţiune entomo- şi fi topatogenă sunt obţinute din bacteriile
ce aparţin genurilor Bacillus şi Pseudomonas. În cadrul Colecţiei Naţionale de Microorganisme
Nepatogene avem peste 20 tulpini din aceste grupuri taxonomice, o parte din
ele fi ind cunoscute pentru activitatea lor antimicrobiană. Conservarea de lungă durată
al acestor tulpini, fără modifi carea vădită a caracterelor morfo-culturale şi biochimice
reprezintă o sarcină de importanţă majoră pentru colecţie.
Pentru o mai buna păstrare a viabilităţii, înainte de liofi lizare culturile de microorganisme
sunt suspendate într-un mediu stabilizator, ce le protejează de acţiunea şocului
osmotic şi termic.
În conformitate cu mecanismele de acţiune, mediile de protecţie sunt divizate în
două categorii:
- endocelulare, care penetrează membrana celulară;
-
extracelulare, care leagă apa extracelulară.
Microbiologia şi Biotehnologia
În cadrul cercetărilor cu microorganisme - destructori ai petrolului - Pseudomonas
sp. 142NF şi Rhodococcus sp. S67 - au fost utilizate 2 medii de protecţie: nr.1 (4 %
tiouree, 8% zaharoză, 4% poliglucină) şi nr. 2 (6% tiouree şi 10% zaharoză). A fost
demonstrat că pentru Pseudomonas cel mai bun mediu de păstrare este mediul nr.2, iar
pentru Rhodococcus – mediul nr.1, la aplicarea cărora viabilitatea a alcătuit 16,2% şi
52,3% respectiv, ceea ce este semnifi cativ mai mare decât la liofi lizarea pe alte medii
[15]. Viabilitatea bacteriilor marine, păstrate timp de 14 luni în stare liofi lizată, la fel
este mai mare şi alcătuieşte 60-65% pe mediile de protecţie ce conţineau zaharoză
(10%), gelatină, NaCl şi glutamat [7, 8].
Astfel, reeşind din cele expuse, liofi lizarea este cea mai efi cientă metodă de conservare
a tulpinilor de microorganisme atât din punct de vedere al păstrării viabilităţii,
caracterelor morfologice şi fi ziologice, activităţii biochimice şi stabilităţii genetice, cât
şi din considerentele aplicării sigure şi cu cheltuieli minime.
Material şi metode
Obiectul de studiu: 13 tulpini de bacterii din Colecţia Naţională de Microorganisme
Nepatogene aparţinând genului Pseudomonas (Ps.fl uorescens B-561, B-894, B-970,
B-01, Ps. clororafi s B-897, Ps. aureofaciens B 1249, CNMN-03, Ps. aurantiaca B 875,
B 548, Ps. sp.1, 63, 77, 78).
Cultivarea. Tulpinile investigate au fost cultivate static în condiţii aerobe în tuburi
de sticlă pe mediile agarizate geloză peptonată de carne sau King B[1,2].
Liofi lizarea. Culturile suspendate în medii protectoare au fost congelate rapid la t o =
-20…-30 0 C, uscarea masei congelate fi ind realizată la liofi lizatorul “Иней 3”la temperatura
condensorului -50…-60 0 C şi vid – 6,7 Pa.
Mediile de protecţie: lapte degresat (LD), gelatină de 1,0% + zaharoză 10,0%
(Gel1,0%+Z10,0%), lapte degresat 10,0% (LD10%), lapte degresat + zaharoză 10,0%
(LD+ Z10,0%), lapte degresat+glucoză 10,0% (LD+G10,0%), lapte degresat 10% +
glucoză 20,0% (LD10%+G20,0%), succinat de Na+zaharoză 12,0% (Succ.Na+Z12%),
lapte degresat+zaharoză 12,0% (LD+ Z12%).
Mediile de regenerare: apă distilată (AD), succinat de Na (Succ.Na), King B.
161

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2(317) 2012
Microbiologia şi Biotehnologia
Determinarea viabilităţii culturilor de bacterii. Viabilitatea culturilor a fost determinată
prin numărarea coloniilor până şi după conservare. Pentru aceasta înainte de
liofi lizare au fost efectuate diluţiile succesive de suspensie până la densitatea de 10 6 ...
10 10 celule/ml cu însămînţarea ulterioară a 0,1 ml suspensie pe mediul agarizat geloză
peptonată de carne sau King B. Pentru aprecierea viabilităţii după liofi lizare conţinutul
unei fi ole a fost resuspendată în 1,0 ml mediu de regenerare: apă distilată (AD), succinat
de sodiu (Succ.Na) ori mediul King B. Au fost efectuate diluţiile respective şi inoculări
în 3-4 plăci Petri a câte 0,1 ml de soluţie respectivă pe mediile solidifi cate geloză
peptonată de carne sau King B. Coloniile crescute pe plăci au fost numărate după 3 zile
de incubare la temperatura de 30 0 - 35 o C [11 - 13].
Datele experimentale au fost supuse prelucrării statistice în baza programului computerizat
Offi s Excel 2007.
Rezultate şi discuţii
Cel mai înalt grad de viabilitate al tulpinilor de Pseudomonas după sublimare a
fost stabilit pentru mediile protectoare în componenţa cărora intră zaharoza: laptele
degresat+zaharoza de 10,0% şi succinatul de Na+zaharoza de 12,0% (Tab.1, Tab. 2).
Procentul de supravieţuire a bacteriilor studiate la utilizarea acestor medii protectoare
a fost destul de mic – până la 0,67 - 1,92% (1,8×10 9 - 2,5×10 9 ), totuşi în comparaţie cu
restul mediilor protectoare aceste rezultate rămân a fi cele mai bune.
Procentul viabilităţii celulelor bacteriene de Pseudomonas după 1 an de păstrare în
stare liofi lizată pentru cele 6 medii de protecţie a scăzut considerabil şi constituie doar
0,2-38,6% faţă de numărul celulelor viabile înregistrat imediat după liofi lizare (Tab. 3).
După 1 an de păstrare în stare liofi lizată rezultate bune privind stabilizarea numerică
a celulelor bacteriene de Pseudomonas au fost remarcate pentru mediul care conţine,
ca şi în cazurile precedente, zaharoză: Gel.1,0%+Z10,0%. Acest fapt a fost remarcat şi
în investigaţiile efectuate de Cupleţcaia M. B. şi Arcadieva Z.A. (1997) [11], care au
stabilit un înalt grad de viabilitate a microorganismelor studiate la utilizarea mediului
protector - gelatină 1,0%+zaharoză 10,0%.
Astfel, viabilitatea culturilor de Pseudomonas imediat după liofi lizare a fost destul
de mică faţă de rezultatele expuse în sursele bibliografi ce [11, 13, 15]. Comparativ cu
speciile de Pseudomonas aurantiaca, P. fl uorescens şi P. aeruginosa, care au avut o
viabilitate cuprinsă între 47,5-87,9% [13], culturile de Pseudomonas testate în CNMN
au manifestat o rezistenţă scăzută faţă de liofi lizare, procentul de supravieţuire fi ind
de circa 0,03...1,92%. Totuşi, numărul de celule viabile la tulpinile de Pseudomonas
atât imediat după liofi lizare (7,0×10 7 ...2,5×10 9 ), cât şi după 1 an de păstrare (1,0×10 6
...5,4×10 7 ) este mai mult decât sufi cient pentru revitalizarea culturii din starea de anabioză
şi restabilirea numerică a populaţiilor tulpinilor date.
Procedeele de rehidratare şi condiţiile de regenerare a microorganismelor după
liofi lizare exercită o infl uenţă majoră asupra viabilităţii microorganismelor. Astfel,
conform datelor bibliografi ce [13, 17], pentru revitalizarea culturilor de Pseudomonas,
au fost testate mediile: apa distilată, succinatul de sodiu şi mediul King B. Conform
rezultatelor obţinute (Tab. 4) viabilitatea maximă a tuturor tulpinilor de Pseudomonas
a fost înregistrată la utilizarea în calitate de mediu de regenerare a apei distilate. La
regenerarea tulpinilor, luate în studiu, cu succinat de sodiu şi mediu King viabilitatea
este de 2-4 ori mai mică.
162

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2 (317) 2012 Microbiologia şi Biotehnologia
163

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2(317) 2012 Microbiologia şi Biotehnologia
164

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2 (317) 2012
Tabelul 4. Viabilitatea tulpinilor de bacterii ce aparţin genului Pseudomonas pe diverse
medii de regenerare.
Tulpina
Mediile de regenerare, cel/ml
(X±x)×10 7
AD Succ.Na King B
Ps.aurantiaca B548 43,0 ±8,1 12,7±3,0 10,0±2,6
Ps.aurofaciens B-1249 20,7±1,5 3,7±1,5 2,3±0,9
Ps.fl uorescens B-970 49,0±9,1 21,3±2,4 15,7±1,2
Pseudomonas sp.77 96,0±10,4 88,0±7,2 46,3±2,6
Pseudomonas sp.78 34,3±3,3 8,7±1,4 6,3±1,4
Deci, mediul optim pentru regenerarea tulpinilor liofi liozate de Pseudomonas este
apa distilată.
Astfel, conform rezultatelor obţinute, putem constata că păstrarea viabilităţii tulpinilor
de bacterii Pseudomonas în urma procesului de liofi lizare depinde atât de mediile
protectoare şi de regenerare utilizate, cât şi de particularităţile tulpinilor luate în
studiu.
Viabilitatea tulpinilor de bacterii, ce urmează a fi conservate, se afl ă într-o
dependenţă directă de parametrii utilizaţi pentru procedura de liofi lizare, un rol esenţial
revenindu-i, în acest sens, temperaturii de congelare. Pentru verifi carea acţiunii temperaturii
de congelare asupra viabilităţii culturilor de bacterii studiate acestea au fost suspendate
în mediile protectoare selectate LD+S10,0 % şi Succ. Na+Z12,0 % şi congelate
la două regimuri de temperaturi: (-20 0 C) şi (-30 0 C) (Tab. 5). Rezultatele obţinute,
la modul general, indică asupra faptului că culturile studiate manifestă un procent mai
mare al viabilităţii în cazul aplicării temperaturii de (-20 0 C), faţă de cea de (-30 o C). În
consecinţă, pentru realizarea procedurii de liofi lizare a culturilor de bacterii din genul
Pseudomonas, luate în studiu, se recomandă aplicarea temperaturii de congelare de
(-20 0 C).
Tabelul 5. Studiul infl uenţei temperaturii de congelare asupra viabilităţii culturilor de
Pseudomonas liofi lizate.
Tulpina Mediile de protecţie
Ps. aurantiaca B548
Ps. aurofaciens B-1249
Ps. fl uorescens B-970
Pseudomonas sp.77
Pseudomonas sp.78
Microbiologia şi Biotehnologia
Temperatura de congelare
-20 0 C -30 0 C
(X ± x) × 10 7 cel/ml (X ± x) × 10 7 cel/ml
LD+Z10% 8,3±0,9 1,3±0,7
Succ. Na+Z12% 75,7±6,2 14,0±3,1
LD+Z10% 3,3±0,9 1,0±0,6
Succ. Na+Z12% 15,7±1,5 16,7±1,5
LD+Z10% 14,3±1,2 12,3±0,9
Succ. Na+Z12% 24,7±4,1 23,7±3,3
LD+Z10% 3,0±0,6 1,0±0,6
Succ. Na+Z12% 17,3±1,2 16,7±0,9
LD+Z10% 15,0±1,0 17,7±1,5
Succ. Na+Z12% 16,7±0,9 17,3±0,9
165

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2(317) 2012
Microbiologia şi Biotehnologia
Concluzii
1. Mediile de nutriţie King B şi bulion peptonat de carne oferă condiţiile necesare
unei multiplicări accelerate a microbilor, asigurând prin aceasta o densitate sufi cientă
de celule necesare pentru procedura de liofi lizăre.
2. Mediile de protecţie, lapte degresat+zaharoză de 10,0% (LD 10%) şi succinat
de sodiu (Succ.Na )+zaharoză de 12,0% asigură cea mai înaltă viabilitate la liofi lizare
a tulpinilor din genul Pseudomonas.
3. Cel mai efi cient mediu de revitalizare pentru bacteriile cercetate s-a dovedit a
fi apa distilată, care asigură o viabilitate superioară comparativ cu alte medii utilizate
în studiu;
4. Viabilitatea tulpinilor de bacterii din genul Pseudomonas la liofi lizare se afl ă
într-o dependenţă directă de temperatura de congelare. Rezultatele obţinute, indică asupra
faptului că culturile studiate manifestă un procent mai mare al viabilităţii la temperatura
de -20oC, faţă de temperatura de -30oC Referinţe
1. Auub Nicolas D., Pettinari M.Julia,
et all. A polyhydroxybutyrate producing Pseudomonas
sp. isolated from Antarctic environment with high stress resistance. // Curr. Microbiolgy,
2004, 49, Nr. 3, p.170 - 174.
2. King E. O. Ward M. K., Raney D. E. Two simple media for the demonstration of piocianin
and fl uorescein. // J. Lab. Clin. Med., 1954, V.44, p.301-307.
3. Scheyhing C.H., Hormann S., Ehrmann M.A., Vogel R.F.
Barotolerance is inductible
by preincubation under hydrostatic pressure, cold-, osmotic and acid- stress condition in
Lactobacillus sonfranciscensis DSM 20451T . // Lett. Appl. Microbiology, 2004, 39, Nr.3, p.
284-289.
4. Schinner F., Ohlinger R., Methods on Soil Biology. // Springer. 1995. 426 p.
5. Zarnea G. Tratat de microbiologie generală. // Ed. Academiei Române, 1994, 757 p.
6. Важинская И.С., Новик Г.И., Кантерова А.В.
Выживаемость мицелиальных грибов
после криоконсервации в зависимости от состава защитных сред. // Мат. IV. Межд.
Конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии»
Минск, 2008, с. 113-115
7. Выпияч А.Н., Маркелова С.И. Жизнеспособность и биолюминисценция лиофильно
высушенных клеток. // Вести МГУ, сер. 16, 1995, № 3, с. 33-37.
8. Ефременко Е.Н. Татаринова Н.Ю.
Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов
иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость
и биосинтез целевых метаболитов. // Микробиология, 2007, т. 76, №3, с. 383-389.
9. Золотилина Г.Д, Шакирзянова М.Р.
Жизнеспособность коллекционного фонда
бактерий при длительном хранении. // Докл. Акад.Наук Респ. Узбекистан, 2004, № 2, с.
84-90.
10. Кантерова А.В., Важинская И.С., Новик Г.И. Жизнеспособность и активность
роста грибов родов Aspergillus и Penicillium после длительного хранения в лиофилизированном
состоянии. // Conf. şt. Naţ, consacrată celei dea 50 aniv. de la fondarea sectţiei de microbiologie.
„Probleme actuale ale microbiologie şi biotehnologie”, Chişinau, 2009, p. 44-46.
11. Куплетская М.Б., Аркадьева З.А. Методы длительного хранения коллекции микроорганизмов
кафедры микробиологии Московского Государственного Университета.
// Микробиология, 1997, T. 66, №2, с. 283-288.
12. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов.
// Пущино, 1990, 186с.
166

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 2 (317) 2012
13. Методы общей бактериологии. // Под ред. Ф. Герхардта и др., М.: Мир, 1983, с.
512-536.
14. Мурас В.А., Житкевич Н.В., Майко И.Н., Самойленко В.Н.
Исследование некоторый
оруикональных изменений в клетках фитопатогенных бактерий при длительном
хранении простыми методами. // Микробиол., 1994, 56, №4, с. 85.
15.
Microbiologia şi Biotehnologia
Петриков К.В., Якшина Т.В., Власова Е.П., Пунтус И.Ф., Нечаева И.А.,
СамойленкаВ.А, Филонов А.Е. Изучение выживаемости микроорганизмов – деструкторов
нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus при различных способах хранения. // «Современное
состояние и перспективы развития Микробиологии и Биотехнологии.», Мат.
Межд. Конф., Минск, 2008, с. 223-225.
16. Плотников О.П., Маркова Л.И., Виноградова ТН.А., Харченко В.Г., Казаринова
Т.Д. Состав для хранения бактерий. // Пат. 2045573 Россия, МКИ6 С12N 1/04
№92007101/13; Заявл.19.11.92; Опубл. 10.10.95, Бюл. №28.
17. Сидякина Т.М.
Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. Консервация
генетических ресурсов: Методы. Проблемы. Перспективы. // АH СССР. Пущинская
науч. центр. Ин-т биол. физ., 1991, с. 81-159.
18. Шубина В.Э., Николаева С.И. Изучение возможности длительного хранения
культуры Pseudomonas fl uorescens в водной суспензии. // Ин-т биол. Защиты раст. АН
Респ. Молдова, Деп. В МолдНИИТЭИ, 23.06.98., № 1604-М98, Кишинев, 1998, 3 с.
19. Цуцаева А.А., Ананьина А.Е., Павленко Н.В. Жизнеспособность споровой культуры
Streptomyces fradiaie ВНИИТ – 25 Л после воздействия некоторых факторов процесса
лиофилизации. // Проблемы криобиологии, 2004, №1, Харьков, с. 26 – 30.
20. Чугаева Ю.В., Выдрякова Г.А., Кузнецова А.М.
Устойчивость светящихся бактерии
при использовании различных методов хранения. Корекция гомеостаза. // Материалы
7 Всерос. Симп., Красноярск, 1996, с. 74-75.
21. Шендеров Е.А., Гахова Э.Н. и др.
Способ длительного хранения естественных
симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных. // Пат. 2123044,
Россия, МПК С12N 1/04; C 12N 1/100, 1998, Бюл. № 34.
22. Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В.А. Сохранность трансформированных
клеток рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae в условиях криоконсервации
в зависимости от фазы роста. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2004.
http. www. webcenter. ru/-iprzhr/biomed. html.
167