Prezentarea rezultatelor - spd-biotech

Investeşte în oameni !
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013
Axa prioritară 1 „Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”
Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale si post-doctorale in sprijinul cercetarii”
Titlul proiectului: ORGANIZAREA SCOLII POSTDOCTORALE DE INTERES NATIONAL “BIOTEHNOLOGII APLICATE” CU IMPACT IN
BIOECONOMIA ROMANEASCA
Numărul de identificare al contractului: POSDRU/89/1.5/S/52432
STUDIUL SISTEMELOR DE TRANSPORT SI CEDARE
CONTROLATA DE TIP LIPOZOMAL PENTRU PRODUSI
CU ACTIVITATE BIOLOGICA
TUTORE,
SL DR MARIANA FERDES
Postdoctorand
ALINA RUXANDRA ORTAN

SCOP
• proiectarea, caracterizarea si optimizarea unui sistem de transport si
cedare controlata pe baza de lipozomi incarcati cu ulei volatil de
Anethum graveolens, cu eficienţă mărită, cu cedare
prelungită/controlată, şi care să asigure o creştere a complianţei
pentru pacient.
OBIECTIVE
• Obţinerea şi caracterizarea uleiului volatil de Anethum graveolens
• Evaluarea activităţii antifungice a uleiului volatil de Anethum graveolens
• Realizarea unor formulări lipozomale optime, care să asigure o bună
stabilitate a uleiului volatil şi o posibilă potenţare a acţiunii antifungice a
acestuia
• Proiectarea, caracterizarea şi optimizarea unui sistem farmaceutic de tip
hidrogel, cu aplicare topică, pe bază de ulei volatil de Anethum graveolens
entrapat în lipozomi, care să asigure o cedare determinată a principiului
activ, o eficienţă marită în tratarea unor micoze locale, precum şi o bună
complianţă pentru pacient.

Anethum graveolens
Anethi fructus Anethi flores Anethi folium

Conţinutul în ulei volatil din produsele vegetale Anethi
flores, fructus şi folium –
ml % ulei volatil
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1 2 3
Anethi flores Anethi fructus Anethi folium

.
rt
Compuşii Anethi aetheroleum determinaţi prin analiză
gaz-cromatografică
Compus T R
(min)
KI Arie %
Frunze Flori Fructe
1 α - tuien 6.186 925 0.14 0.07 -
2 α - pinen 6.328 930 1.66 0.90 -
3 sabinen 7.521 974 0.12 0.05 -
4 β – mircen 8.372 994 0.12 0.06 -
5 α - felandren 8.782 1004 62.71 30.26 0.12
6 p - cimen 8.906 1024 1.11 0.65 -
7 limonen 9.006 1028 13.28 33.22 21.56
8 p-ment-3-en-2-ona 14.294 1181 0.07 - -
9 anetofuran 14.436 1185 16.42 22.00 -
0 cis-dihidrocarvona 15.013 1201 - 0.18 0.04
1 trans-dihidrocarvonă 15.054 1204 - 1.88 3.02
2 Carvonă 15.124 1249 - 10.29 75.21
3 α - copaen 22.752 1378 - 0.18 -
4 cadinol 27.391 1667 - 0.09 -
5 γ – murolen 22.743 1477 0.29 - -
6 p-ment-1,8-dien-6-ol 24.003 1527 0.07 - -
7 neofitadien 31.243 1838 0.42 - -
TOTAL 97.55 99.83 99.95

Valorile diametrului zonei de inhibiţie pentru cele trei
tipuri de Anethi aetheroleum testate
Compus Diametrul mediu al zonei de
inhibiţie (mm)
Testarea 1 Testarea 2 Testarea 3
C1 21 21 20
C2 19 19.5 19.5
C3 0 0 0
Miconazol 26.5 26 26
C1 – Anethi flores
C2 – Anethi fructus
C3 – Anethi folium

Compus Diametrul mediu al zonei de
inhibiţie (mm)
Testarea 1 Testarea 2 Testarea 3
C4 18.5 19.5 19
C5 0 0 0
C6 0 0 0
C7 0 0 0
C8 0 0 0
C4 – soluţie uleioasă de carvona în concentraţie egală cu a uleiului volatil din fructe;
C5 - soluţie uleioasă de limonen în concentraţie egală cu a uleiului volatil din fructe;
C6 - soluţie uleioasă de carvona – limonen în concentraţie egală cu a uleiului volatil
din fructe;
C7 - soluţie uleioasă de carvona în concentraţie egală cu a uleiului volatil din
inflorescenţe;
C8 - soluţie uleioasă de limonen în concentraţie egală cu a uleiului volatil din
inflorescenţe;

• Instabile fizicochimic
si biologic
• Insolubile in apa
• Nu au capacitatea
de transport la
tinta
ULEIURILE
VOLATILE
NOI
METODE
• Cresterea
stabilitatii
• Cresterea
biodisponibilitatii
in focar
• Diminuarea
efectelor adverse
• liposomi
• ciclodextrine
• nanoparticule
SISTEME
CARRIER

Structura unor lipozomi: vedere în secţiune
Lipozomii sunt particule microscopice lipidice bistratificate, ce închid în mijloc
compartimente de natură apoasă, în care se pot incorpora şi transporta atât
substanţe medicamentoase solubile în apă (în compartimentele apoase), cât şi
substanţe medicamentoase lipofile (în straturile duble lipidice).

Avantajele utilizarii lipozomilor ca sisteme de
transport si cedare controlata a uleiurilor volatile

Avantajele utilizarii lipozomilor in formulari cu
aplicatie topica

Mecanismul formării lipozomilor prin metoda
hidratării filmului lipidic

Influenţa naturii lipidelor asupra gradului de entrapare a
uleiului volatil de Anethi fructus
Întrucât caracteristicile lipozomilor, gradul de entrapare, stabilitatea,
viteza de eliberare a substanţei active sunt influenţate puternic de
natura lipidelor utilizate la prepararea lor, pentru experimentari am
preparat mai multe serii de lipozomi, în care s-a variat natura
fosfolipidelor, menţinându-se constante cantitatea de fosfolipide, ulei
volatil şi colesterol.
Raportul în greutate pentru toate seriile de lipozomi a fost: 100 : 25 : 10
(fosfolipid : ulei volatil : colesterol).
Am ales o serie de fosfolipide cu caracteristici diferite şi anume:
fosfatidilcolină (FC) - o fosfolipidă naturală care apare în majoritatea
formulărilor cu lipozomi, dipalmitoilfosfatidil colina (DPFC) şi
dimiristroilfosfatidil colina (DMFC) - fosfolipide de sinteză saturate,
dioleoilfosfatidil colina (DOFC) - o fosfolipidă de sinteză nesaturată,
dimiristroilfosfatidil glicerol (DMFG) - o fosfolipidă de sinteză saturată,
cu sarcină negativa.

Influenţa naturii lipidelor asupra gradului de entrapare a
uleiului volatil de Anethi fructus
Proba Fosfolipid
folosit
Gradul de
entrapare
(%)
LFR1 FC 98
LFR2 DPFC 97
LFR3 DMFC 58,9
LFR4 DOFC 77
LFR5 DMFG 55,2
fosfolipid : ulei volatil : colesterol
100:25:10

Gradul de entrapare şi procentul reconstituit de ulei volatil de
Anethi fructus după purificarea lipozomilor
Lotul
Determinarea
Cantitatea de
UFR din
supernatant
(mg / ml)
LFR6 1 25·10 -5
UFR
reconstituit din
sediment şi
supernatant
(%)
Eficienţa
de
entrapare
(%)
Eficienţa
medie de
entrapare
(%)
95.85 87.5 87.5
2 23·10 -5 96.23 89.58
3 25.5·10 -5 95.76 85.42
LFR7 1 18·10 -5 97.22 90.08 91.29
2 17.5·10 -5 96.35 91.42
3 17·10 -5 96.85 92.38
în supernatant există cantităţi foarte mici de ulei volatil
eficienţa de entrapare calculată pentru fiecare determinare a fiecărei serii de
lipozomi are valori apropiate

Gradul de entrapare după separarea lipozomilor de
substanţa neentrapată prin centrifugare urmată de
spălarea acestora
Proba
LFR
7
LFR
7
Nr. de spălări
Cantitatea de
UFR din
supernatant
(mg / ml)
Eficienţa de
entrapare
( % )
0 (A) 17.5·10 -5 91.29
1 (B) 16.5·10 -5 92.33
2 (C) 17.5·10 -5 91.29
3 (D) 18.5·10 -5 90.56
fără spălare (A), spălare cu 0,2 ml tampon fosfat (B) 2 spălări cu cîte 0,2 ml tampon fosfat (C) 3
spălări cu cîte 0,2 ml tampon fosfat (D).
diferenţele care au rezultat între probele cu 0-3 spălări sunt în limita erorilor experimentale
ale metodei de dozare.

Compoziţiile seriilor de lipozomi (mg/ml)
Componeţ
LF
R9
i
LFR
10
LFR
11
Formulări
LFR
12
LFR
13
LFR
14
LFR
15
LFR
FC 19.5 19.5 19.5 19.5 39 39 19 39
C 2.6 2.6 2.6 5.2 2.6 5.2 5.2 2.6
UFR 6 3 9 9 9 9 6 6
16

Eficienta de entrapare al uleiului volatil extras din Anethi
fructus în diferite formulări lipozomale
• unde:
• T – cantitatea de ulei volatil în
supernatant şi sediment
• S – cantitatea de ulei volatil din
supernatant
prin spectrofotometrie
prin tehnica gaz cromatografiei.
am determinat procentul în carvonă continut de lipozomi după
distrugerea lor cu metanol.
Ştiind că uleiul volatil de Anethi fructus are un conţnut de 75.21%
carvonă am calculat cantitatea totală de ulei volatil entrapată şi
eficienţa de entrapare pentru toate formulările lipozomale
propuse.

Gradul de entrapare al uleiului volatil extras din Anethi
fructus în diferite formulări lipozomale

Procentul de ulei volatil regăsit în cazul formulării LR9 în timpul
păstrării
Interval de timp de la
preparare
Procent de ulei volatil reţinut
MLV SUV
1 zi 100 ± 0 100 ± 0
2 zile 100 ± 0.25 100 ± 0.30
3 zile 99 ± 0.95 98 ± 0.98
7 zile 97 ±1.20 98 ± 1.00
1 luna 96 ± 1.10 95 ± 1.65
2 luni 91 ± 2.35 90 ± 2.38
Valorile sunt exprimate ca media a 6 serii identice de lipozomi, ± deviaţia
standard.

CONDITIONAREA SUSPENSIILOR LIPOZOMALE

Compozitia gelurilor experimentale
Tip de gel
preparat
G11A
G11B
G13A
G13B
Compoziţie
10 g suspensie lipozomală LFR11
90 g gel farmat din:
- 0.5 g carbopol 940
- 12 g glicerină
- 0.4g TEA
- 87.1 g apă
10 g suspensie lipozomală LFR11
90 g gel farmat din:
- 1 g carbopol 940
- 12 g glicerină
- 0.4g TEA
- 86.6 g apă
10 g suspensie lipozomală LFR13
90 g gel farmat din:
- 0.5 g carbopol 940
- 12 g glicerină
- 0.4g TEA
- 87.1 g apă
10 g suspensie lipozomală LFR11
90 g gel farmat din:
- 1 g carbopol 940
- 12 g glicerină
- 0.4g TEA
- 86.6 g apă

Schema dispozitivului experimental folosit la studiul
cineticii de cedare a uleiului volatil din lipozomi
Stabilirea condiţiilor operaţionale şi
etapele parcurse în derularea
experimentelor cinetice la dispozitivul
experimental
• Membrana artificială este menţinută 24 de
ore în mediul receptor
• Se introduce prin vasul tampon lichidul
receptor într-un volum egal cu volumul
compartimentului acceptor
• Se reglează debitul de curgere (2ml/min);
• Se pun în funcţiune pompa peristaltică,
agitatorul şi ultratermostatul
• Se termostatează sistemul prevăzut numai
cu membrană şi mediul receptor 30 de
minute înainte de derularea propriu-zisă a
experimentului cinetic.
• In compartimentul donor se introduce
sistemul ce urmează a fi testat
• Se extrag probe de 5 ml din vasul tampon,
înlocuind imediat cu lichid receptor proaspăt
în acelaşi volum
• Evaluarea cantităţilor de substanţă cedate
la diferite intervale de timp se face
spectrofotometric

Modele matematice verificate pentru caracterizarea cineticii de cedare a
uleiului volatil de Anethi fructus din formulările lipozomale preparate
Modelul cinetic de ordinul zero, descris de
ecuaţia
unde:
M i = k 0·t
M i
masa de substanţă cedată ce creşte liniar în
timpul t
k 0
constanta de viteză de cedare, de ordinul zero
Modelul cinetic de ordinul întâi, descris de
ecuaţia
unde
ln(M t - M i) = lnM t - k 1t
M t – M i masa de substanţă activă necedată
după timpul t de la primul contact cu
lichidul
M t masa iniţială a substanţei
k 1 constanta de viteză de cedare/dizolvare de
ordinul întâi

Modelul Higuchi (difuzia Fick), aplicabil la
cedarea prin difuzie a substanţelor active
din matrici polimerice:
unde:
M i - cantitatea de substanţă trecută în soluţie
prin difuzie în timpul t
k - constanta de viteză de cedare
Modelul Hixon – Crowell este aplicabil sistemelor care
se dizolvă sau erodează în timp, conform ecuaţiei :
unde:
M i - masa de substanţă cedată în timpul t
M t - masa iniţială a substanţei
k -constanta de viteză de cedare
Modelul Korsmeyer - Peppas se utilizează
pentru descrierea cineticii de cedare când
substanţa activă a fost încorporată într-o
matrice polimerică
m
ln nlntlnk m Valorile exponentului n trabuie să fie în
intervalul (0,5 - 1). Ecuaţia este verificată
până la valoarea m/m ∞ ≈ 0,6.

Verificarea modelului cinetic Higuchi pentru gelurile
cu lipozomi LFR11
Coeficientul de difuzie este dat de relaţia:
Timpul de latenţă este dat de
ecuaţia:
unde:
h - grosimea membranei (0.007cm)

Valorile parametrilor cinetici în procesul de cedare a uleiului
volatil din formulările G11A, G11B, G13A, G13B
Tip de gel G11A G11B G13A G13B
Ecuaţie de regresie 10 -11 x-10 -11 7·10 -12 x -7·10 -12 2·10 -11 x -10 -11 10 -11 x-10 -11
Constanta de viteză
de cedare·10 -11 g/h
Coeficient de
corelatie R 2
Coeficient de difuzie
D (cm 2 /s)
1 0.7 2 1
0.9986 0.9978 0.9935 0.9967
2.21·10 -9 1.55·10 -9 4.18·10 -9 2.10·10 -9
Procent cedat la 24 h 18.48 13.39 20.12 15.84
Timp de latenţa (h) 1.03 1.46 0.81 1.08

Valorile parametrilor cinetici obţinute pentru formulările
experimentale pe o perioadă de păstrare de 1 lună

CONCLUZII GENERALE
Studiile întrprinse în vederea dozării catităţii de ulei volatil au arătat
că frunzele de mărar pot fi considerate o sursă modestă de ulei volatil
dar inflorescenţele si fructele au un conţinut ridicat în acest metabolit
secundar
Analiza gaz cromatografică a evidenţiat diferenţe majore calitative şi
cantitative între cele trei uleiuri volatile studiate;
Rezultatele testării potenţialului antifungic al uleiurilor volatile,
precum şi al unor soluţii uleioase ale principalelor componente
sugerează că acesta este imprimat de carvonă;
Validarea metodei spectrofotometrice de dozare a uleiului volatil din
Anethi fructus, prin compararea cu rezultatele obtinute prin metoda gaz
cromatografică, constituie un pas important în monitorizarea uleiului
volatil de Anethum graveolens datorită faptului că acestă metodă este
uşor de folosit, rapidă şi necesită cantităţi mici de probe;

CONCLUZII GENERALE
Experimentele efectuate în vederea entrapării uleiului volatil în lipozomi
au evidentiat o bună eficienţă de entrapare a uleiului volatil, o stabilitate
mărită, o cedare relativ constantă şi deci un efect de lungă durată;
Studiile de cedare in vitro au arătat că pentru hidrogelurile proiectate se
respectă un model cinetic de ordin 0 după un interval de timp de trei ore
de la începerea unui experiment cinetic Acest lucru întăreşte concluzia că
lipozomii pot acţiona ca sisteme rezervor pentru eliberarea controlată a
uleiului volatil încapsulat
Experimentele de stabilitate au arătat că nu s-au înregistrat modificări
majore ale profilelor de cedare ale uleilui volatil din gelurile experimentale
pe o perioadă de o lună, ceea ce sugerează faptul că gelurile conţinând ulei
volatil entrapat în lipozomi pot conferi efecte terapeutice optime, datorită
cedării locale controlate, ceea ce duce la o creştere a eficienţei şi
complianţei, pe lângă stabilitatea crescută a formulărilor topice
experimentate.

CONCLUZII GENERALE
În urma cercetărilor experimentale desfăşurate in cadrul tezei de
postdoctorat am reuşit formularea unui hidrogel optim cu Anethi
aetheroleum care să permită o activitate termodinamică maximă a
principiului activ şi să asigure un flux cât se poate de mare al acestuia.
Uleiul volatil de Anethum graveolens s-a dovedit a prezenta o activitate
antifungică bună faţă de Candida albicans. Datorită marii instabilităţi a
uleiului volatil, am ales încorporarea în lipozomi, care asigură o stabilitate
mare, determină o cedare controlată şi potenţează activitatea antifungică a
acestuia. Condiţionarea sub formă de hidrogel este convenabilă atât din
punct de vedere economic, cât şi ca eficacitate şi complianţă.

INDICATORI DE REZULTAT
• Alina Ortan, Cristina Dinu Parvu, Maiana Ferdes - Evaluation of
the Anethi Aetheroleum Antifungal Effect, The International
Conference of the University of Agronomic Sciences and
Veterinary Medicine of Bucharest:"Agriculture for Life, Life for
Agriculture”, October 4 - 6, 2012, Bucharest, Romania – poster
premiat
• Alina Ortan, Mariana Ferdes, Cristina Dinu Pirvu - Comparative
microbiological activity of volatile oils from Anethum graveolens
species, Studia Universitatis “Vasile Goldiş”, Seria Ştiinţele Vieţii
Vol. 22, issue 4, 2012, pp. 531-535, revista indexata BDI
• Alina Ortan, Mariana Ferdes, Steliana Rodino, Cristina Dinu Pirvu
- Topical delivery system of liposomally encapsulated volatile oil
of Anethum graveolens, Revista Farmacia, ISI - acceptat spre
publicare

Vă mulţumesc!