Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar - s - Ege ...

Kromatografik sistemlerde
elektrokimyasal uygulamalar
DOÇ. DR. M. EMRAH KILINÇ
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı
emrah.kilinc@ege.edu.tr - kilince@gmail.com

SUNU PLANI
1) Tanımlar – Genel Bilgiler
2) Elektrokimyasal dedektör (ECD)
3) Elektrokimyasal hücre tasarımları
4) Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar
a) Kullanılan tayin yöntemleri
b) Yanıt akımının kaynağı
c) ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
d) Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
e) Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
5) Ticari ECD ürünleri
6) ECD Uygulama örnekleri

Kromatografi, analizlenecek bir örnek karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılması
esasına dayanan ve bu sayede kalitatif (nitel) ve kantitatif (nicel) analizlerin gerçekleştirildiği
yöntemlerin genel adıdır
Kromatografik yöntemlerde çalışma düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur:
• Sabit faz (stationary phase)
• Hareketli faz ya da mobil faz (mobile phase)
Mobil faz (mobile phase), örnek bileşenlerini, sabit faz (kolon) boyunca taşıyan, çeşitli
fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip çözelti veya çözücü karışımlarıdır. Kullanılacak mobil
fazın seçiminde, analizi yapılacak örnek madde bileşenlerinin özellikleri, kullanılacak sabit
faz ve dedektörün özellikleri vb. birçok parametreye dikkat edilmelidir
Sabit faz (stationary phase), mobil faz içerisinde gelen örneğe ait bileşenlerin etkileşime
girdikleri ve belirli ölçüde alıkonuldukları fazdır. Kromatografi tekniğine göre tasarlanmış ve
değişik materyallerden çok farklı ölçülerde imal edilerek “kolon” olarak adlandırılmış sabit
fazlar mevcuttur. Özellikle gaz ve sıvı kromatografileri için ticari boyutta oldukça fazla
marka ve boyutta kolon üretimi yapılmaktadır

Kromatografik yöntemlerin genel çalışma prensibine göre, mobil fazın içerisinde yer alan
bileşenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkileşmeleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar
Bu tutulma, örnekteki farklı bileşenler için farklı miktarlarda olur. Böylece bileşenler sabit
fazın sonlarına doğru, farklı hızlarda ilerledikleri için, birbirinden ayrılmış vaziyette sabit
fazı farklı zamanlarda terkederler
Bu şekilde sabit fazdan çıkan bileşenlerin derişimleri uygun bir biçimde ölçülür ve zamana
veya mobil fazın kullanılan hacmine karşı y-ekseninde işaretlenerek “kromatogram”
denilen grafikler elde edilir

KROMATOGRAFĠK YÖNTEMLERĠN TARĠHÇESĠ
Sıvı bir mobil fazın kullanıldığı kromatografik yöntemlerin (Sıvı kromatografisi) tarihçesi,
1855 – Boyaların tanınmasında yılında reaktif emdirilmiş filtre kağıdı kullanımını öneren
Alman Kimyacı Friedrich Ferdinand Runge
1860 – Christian Friedrich Schönbein ve öğrencisi Friedrich Goppelsroeder’in maddelerin
filtre kağıdında çözgenle farklı hızlarda sürüklendiğine dair çalışmaları (kapiler etki
kavramının sunumu!!)
1906 – Rus botanikçi Mikhail S. Tsvet’in bitkilerin renk pigmentleri ile ilgili yılında yaptığı
çalışmalara kadar uzanır
Tsvet, cam kolon içerisine doldurduğu toz CaCO 3 içerisinden, bitkilerden izole ettiği bitki
pigment ekstrelerini geçirdiğinde, klorofil ve ksantrofil gibi birçok bitki pigmentine ait renk
ayırımları gözlemlemiş ve bu gözleminden yola çıkarak yeni geliştirdiği yönteme renk
ayırımının (Yunanca’da chroma = renk ve graphein = yazma anlamına gelmektedir) ölçülmesi
anlamına gelen “kromatografi” ismini vermiştir

Tsvet M (1906 a) Physikalisch-chemische Studien über das Chlorophyll. Die Adsorptionen.
Ber Dtsch Botan Ges 24: 316-323
Tsvet M (1906 b) Adsorptionsanalyse und chromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls. Ber
Dtsch Botan Ges 24: 384-393

Önceleri düz yüzlemsel yapıda sabit fazlar kullanılmış ve bu teknikler daha sonra
kağıt kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi - ITK (thin layer chromatography
-TLC) olarak isimlendirilmiştir.
Modern sıvı kolon kromatografisi ise 1969 yılında HPLC’nin kullanıma girmeye
başlamasıyla gelişme göstermiştir
Bu yöntemlerin bilime büyük katkılar yapması sonucu bu alandaki buluşlarına
karşılık 1952 yılında A. J. MARTİN ve R. L. M. SYNGE’ye Nobel ödülü verilmiştir
1937 ve 1972 yılları arasında alınan 12 Nobel Ödülü kromatografinin önemli rol
oynadığı çalışmalara verilmiştir. Şüphesiz bu sayı günümüze kadar daha da artmıştır
Son yıllarda hem bir çok yeni kromatografik teknik geliştiği ve hem de bilimcilerin
karmaşık karışımları ayırmak için daha iyi tekniklere gereksinimleri arttığı için,
kromatografik uygulamalar büyük oranda artış göstermektedir

KROMATOGRAFĠ’NĠN TEMEL PRENSĠP VE TANIMLARI
ALIKONMA (Retention)
Mobil faz içerisinde gelen, analizi yapılacak maddeye ait bileşenlerin sabit faz ile
etkileşime girerek belirli oranda tutulması daha doğrusu yavaşlatılması ve böylece daha geç
olarak sabit fazı terk etmesi olayıdır. Bu özellikten yola çıkılarak, belirli sabit analitik
koşullar altında, her kimyasal madde için parmak izi niteliği taşıyan alıkonma zamanı
(retention time - t R) tanımı türetilmiştir. Bu kavram belirli sabit deneysel koşullarda analizi
yapılan maddenin sabit fazı terketmesi ve dedektöre ulaşması için geçen süreyi
göstermektedir (Şekil 1)
DEDEKTÖR YANITI
tR2
tR1
t0
Örnek
Enjeksiyonu
0 t'R1
ZAMAN (Dak.)
t'R2
ŞEKİL 1. Kromatograma ait genel değişgenler ve birimleri
W
W1/2
A B
Pik yüksekliğinin
%10’nu
t 0 = kolona ait ölü zaman (column dead time)
t R = alıkonma zamanı (retention time)
t' R = net alıkonma zamanı (net retention time)
t R = t 0 + t' R
R = Çözünürlük faktörü, birbirini takip eden 2 adet bileşene ait
piklerin birbirinden ayırımlarının başarısını (oranını) gösterir.
R= [2(t R 2 – t R 1)] / W 1 +W 2

DAĞILMA SABĠTĠ (Dissosiation coefficient)
Bölüşüm oranı veya bölüşüm katsayısı olarak da adlandırılır ve K C ile sembolize
edilir*
K C
C
S
CM
Burada C S örneğin sabit fazdaki, C M ise mobil fazdaki molar konsantrasyonunu
simgelemektedir
İdealde, K geniş bir örnek konsantrasyon aralığında sabittir, bu nedenle C S ve C M
doğru orantılıdır ve yukarıdaki eşitliğin geçerli olduğu kromatografiye doğrusal
kromatografi denilir
Doğrusal kromatografinin, simetrik Gauss tipi pikler vermesi ve alıkonma
zamanlarının enjekte edilen analit miktarından bağımsız olması gibi özellikleri
vardır
*IUPAC komisyonunun kromatografi için Analitik Adlandırmalar Komisyonunun önerisi (L. S. Ettre, Pure Appl. Chem.,
1993, 65, 819). Komite eski terimler olan bölüşüm sabiti veya bölüşüm oranı K yerine, Dağılma sabiti K C’nin kullanılmasını
önermektedir

KAPASĠTE FAKTÖRÜ (Capacity factor)
Alıkonma faktörü’de denir ve k’ ile sembolize edilir. Kolonda çözünen örneğin göç
hızını açıklamada sıkça kullanılan önemli bir terimdir. Kapasite faktörünün sayısal
değeri 1’den çok küçük olursa elüsyon çok hızlı olacağından alıkonma zamanının
tayini zorlaşır. Tersi durumda, Kapasite faktörünün 20-30’dan büyük olması
durumundaysa elüsyon zamanı aşırı uzun olur. İdealde, kromatografik analizler
kapasite faktörünün 2 ≤ k’ ≤ 10 olduğu durumlarda gerçekleştirilir
k'
1
t
R
t
1
0
t
0
k'
2
t
R
2
t
0
t
0

AYRILMA FAKTÖRÜ (Seperation factor)
Relatif alıkonma (relative retention) olarakta adlandırılır ve ile sembolize edilir.
Sistemin, birbirini takip eden 2 maddeyi ayırma gücünün bir göstergesi olup, kapasite
faktörlerinin oranıdır. Mobil ve sabit fazın özelliklerinden ve sıcaklıktan etkilenir
α
k'
2
k'
1

TEORĠK PLAKA SAYISI (Number of theoretical plates)
N ile sembolize edilir. Kolonun doldurma materyalinin özellikleri ve kütle transferinin
başarısı ile ilgili bir ölçüdür. N ne kadar büyük olursa, o kadar komplike örnekler, o kolon
ile başarıyla ayrıştırılabilir. N, Şekil 2’deki gibi üç farklı formülle hesaplanabilir
ŞEKİL 2. Teorik plaka sayısına ait üç farklı hesaplama formülü

PĠK SĠMETRĠSĠ (Peak symmetry)
Pikin simetrisi yüksekliğinin %10’lık kısmından ölçülür. İdeal simetrinin değeri 1 olup,
eğer
1 ise pik sola doğru yatık (tailing)
şekilde asimetrik olur
B
Simetri (fronting)
A
(tailing)

HACĠM AKIġ HIZI (Volume flow rate)
F ile sembolize edilir. Birimi cm 3 /saniye veya cm 3 /dakika = mL/dakika olup,
alıkonma hacminin alıkonma zamanına bölünmesiyle hesaplanır
F = V R / t R
DOĞRUSAL AKIġ HIZI (Linear flow rate)
v ile sembolize edilir. Birimi cm/dakika olup, kolon dolgusu uzunluğunun alıkonma
zamanına bölünmesiyle hesaplanır
ORTALAMA DOĞRUSAL AKIġ HIZI (Linear flow rate)
u ile sembolize edilir. Kolon uzunluğunun (L) kolon ölü zamanına (t o) bölünmesiyle
hesaplanıp birimi cm/saniye’dir. Doğrusal akış hızı, kolonun enine kesitinden
bağımsız olup, çözücü moleküllerinin kolon boyunca hareketleri sırasındaki ortalama
hızlarını gösterir.
u
v
L
t
0
L
t
0

DAĞILMA SABĠTĠ ve ALIKONMA ZAMANI arasındaki bağıntı
Bir örneğin alıkonma zamanı ile dağılma sabiti arasında ilişki kurabilmek için, örneğin
kolondaki göç hızını mobil fazının bir kesri olarak ifade edebiliriz
v = u X örneğin mobil fazda geçirdiği zaman kesri
Bu kesir, herhangi bir anda, örneğin mobil fazdaki ortalama mol sayısının kolondaki toplam
mol sayısına oranına eşittir
v = u
mobil fazda çözünen mol say.
X
çözünen toplam mol say.
Mobil fazda çözünen toplam mol sayısı, örneğin bu fazdaki molar konsantrasyonu (C M) ile
faz hacminin (V M) çarpımına eşittir. Benzer özellik sabit faz için de geçerlidir (C S ve V S)
X
v = u M M u
C
M
C
V
M
V
C
S
V
S
X
1
C
S
1
V /C
S
M
V
M

K C
C
S
CM
olduğu hatırlanırsa,
Örneğin doğrusal akış hızı, dağılma sabiti ve mobil faz ve sabit faz hacimlerinin bir
fonksiyonu olarak veren eşitlik elde edilir
v = u
X
1
K
C
1
V
S
/V
M

ÇÖZÜNÜRLÜK (Resolution)
R ile sembolize edilir. Birbirini takip eden iki adet bileşene ait piklerin birbirinden
ayırımlarının başarısını (oranını) gösterir. Takip eden piklere ait maksimalar arası
mesafenin iki pik’e ait genişliklerin (birimi dakika) toplamına bölünmesiyle
hesaplanır
R = [2(t R2-t R1)] / W 1+W 2
Takip eden pikler için iyi bir çözünürlükten bahsedebilmek için hesaplanan R
değerinin 1-1,5 civarında olması istenir (Şekil 3)
R 1 =0,8 R 2 =1,0 R 3 =1,25
ġEKĠL 3. Çözünürlük değerinin pik ayırımı üzerindeki etkisi

KROMATOGRAFĠK YÖNTEMLERĠN SINIFLANDIRILMASI
Kromatografik yöntemler, mobil ve sabit fazların fiziksel olarak nasıl temas ettiklerine
göre
1) kolon kromatografisi
2) düzlemsel kromatografi
şeklinde başlıca 2 ana grupta sınıflandırılabilir
Birincisinde sabit faz ince bir kolonda tutulur ve mobil faz basınç altında bu sabit faz
içerisinden geçmeye zorlanır
İkincisinde ise sabit faz düz bir plaka üzerine veya bir kağıdın gözenekleri arasına
tutturulur ve bu durumda mobil faz sabit faz arasından kapiler etkisiyle veya yer
çekimi etkisiyle hareket eder

Kromatografik yöntemler ayrıca kullanılan mobil faz tipine göre
1) sıvı kromatografisi
2) gaz kromatografisi
3) süperkritik akışkanlı kromatografi
şeklinde başlıca 3 ana grupta sınıflandırılabilir
Bunun haricinde kromatografik yöntemler,
alıkonma mekanizmasına ve çalışma metoduna göre
olmak üzere, iki farklı şekilde daha sınıflandırılabilir

ALIKONMA MEKANĠZMASINA GÖRE SINIFLANDIRMA
A) Adsorpsiyon Kromatografisi
Analizlenecek madde hem mobil faz hem de sabit fazı oluşturan moleküllerle etkileşim
içerisindedir. Polar maddeler polar, apolar maddeler ise apolar sabit faz tarafından daha
fazla tutulurlar
B) Partisyon (Dağılım) Kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografisinden farklı olarak bu yöntemde sabit fazda sıvıdır. Sıvı sabit
fazın getirdiği zorluklar uygulama alanını kısıtlamaktadır. Burada yapılan ayırım,
analizlenecek maddenin her 2 sıvıdaki çözünürlüğünün farklı olması esasına
dayanmaktadır
C) Boyut Ayırım (Size Exclusion) Kromatografisi
Analizlenecek maddelere ait moleküller boyutlarına göre ayrılmaktadır. Bu işlem için
çok değişik por çapları içeren dolgu maddesiyle doldurulmuş kolonlar kullanılmaktadır.
Böylece değişik çaplardaki porlar birer elek gibi davranarak maddeleri boyut (çaplarına)
göre alıkoymaktadır

D) Afinite Kromatografisi
Alıkonma mekanizması maddeye özgün olmakta ve anahtar-kilit modeline uygun
biyolojik materyaller dolgu malzemesi olarak kullanılmaktadır. Maliyetinin çok yüksek
olması nedeniyle uygulama alanı oldukça kısıtlıdır
E) Ġyon DeğiĢim Kromatografisi
Yüklü bir maddenin ters yükle yüklenmiş katı bir sabit fazla tutulması prensibine
dayanır. Sabit faz genellikle asit veya baz fonksiyonel grupları içermektedir

ÇALIġMA METODUNA GÖRE
(Analizlenecek örneğin kolondan uzaklaştırılma mekanizmasına göre, çok sık kullanılmayan bir sınıflandırmadır)
1) Elüsyon Oluştumu Kromatografisi (Elution development chromatography)
2) Yerdeğiştirme Oluşumu Kromatografisi (Displacement Development Chromatography)
3) Frontal Analiz Kromatografisi (Frontal Analysis Chromatography)

ADLANDIRMA/TERMĠNOLOJĠ (NOMENCLATURE)
Standart bir sıvı kromatografi yöntemi olan HPLC ismini, ingilizce:
“High Performance Liquid Chromatography”
terimlerinin kısaltmasından almaktadır. Tüm ilkel kromatografik yöntemlerde (ITK,
kağıt kromatografisi vb) mobil faz, sabit faz içerisinden kapiler etki, yer çekimi gibi
etkenler sayesinde geçer.
HPLC’de ise mobil faz sabit faz (kolon) içerisine yüksek basınçla pompalanır.
Dolayısıyla HPLC için, güncel olmamakla beraber bazen,
“High Pressure Liquid Chromatography” ismi de uygun görülmektedir
Sıvı kromatografisi ile ilgili en güncel eğilimler ise;
UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography
UHPLC – Ultrahigh Performance Liquid Chromatography
NanoflowLC – Nanoflow Liquid Chromatography

HPLC DONANIMI
Standart HPLC donanımı temelde 4 bileşenden oluşmaktadır (Şekil 4). Bu bileşenler
sırasıyla
Pompa,
Enjektör,
Kolon (sabit faz) ve Dedektör’dür
Güncel uygulamalarda temel donanıma ayrıca, gaz uzaklaştırıcı (on-line degasser),
kolon fırını (column oven), otomatik örnekleyici (autosampler), fraksiyon toplayıcı
(fraction collector) vb çok çeşitli ara üniteler ihtiyaca göre ilave edilebilmektedir
ġEKĠL 4. Temel HPLC donanımı
1 2
3
4

HPLC’ye ait temel donanımı sırasıyla incelersek
POMPA
HPLC donanımında yer alan pompalama sistemleri, akış hızına göre,
pompanın yapımında kullanılan malzemeye göre ve pompanın mobil fazı
iletme mekanizmasına göre olmak üzere 3 farklı şekilde kategorize
edilebilmektedir:
I. Akış hızına göre
II. Pompanın yapıldığı malzemeye göre
III. Mobil faz iletme mekanizmasına göre

AKIġ HIZINA GÖRE
Mikro hacim pompa sistemleri (Microbore pumping systems)
İç çapı 2 mm’ye kadar olan kolonlar için kullanılır ve 1-250 L/dakika aralığında akış
hızı sağlarlar
Standart hacim pompa sistemleri (Standart bore pumping systems)
Analitik HPLC uygulamalarında en sık kullanılan pompa sistemi olup 100 L – 10
mL/dakika aralığında akış hızı sağlarlar. Yarı preperatif HPLC uygulamalarında iç çapı
12 mm’ye kadar olan kolonlar için tercih edilirler
Preperatif pompa sistemleri (Preperative pumping systems)
Analitik HPLC uygulamalarının dışındaki çalışma alanlarında (büyük hacimde
saflaştırma ve ayırma) kullanılır ve 10 mL/dakika’dan büyük akış hızı sağlarlar

POMPANIN YAPILDIĞI MALZEMEYE GÖRE
Metalik
En çok tercih edilen metalik malzeme, mekanik dayanıklılığı, aşınma direnci ve iyi
termal stabilitesi nedeniyle 316 paslanmaz çeliktir. Mobil fazın bileşenlerinden çok azı
(örn. HCl veya H 3PO 4) bu malzemeye zarar verebilir
Bir diğer metal alternatifi ise titanyum’dur. Mekanik dayanıklılık özellikleri 316
paslanmaz çeliğe benzemekle birlikte, aşınma direnci ve kimyasallara karşı inertliği
daha fazladır
Titanyum ve çelik materyaller 6000 psi basınca kadar dayanıklıdırlar. Metalik
materyallerin sakıncaları olarak ise yüksek maliyetleri, kuvvetli asidik ortamlara
dayanıksızlık, biyolojik örneklerle geçimsizlik sayılabilir

Ametalik
Metalik pompaların bahsedilen sakıncaları sebebiyle ametalik materyaller de pompa
imalinde kullanılmaktadır
Bu amaçla en çok polietiletilketon (PEEK), politetrafloroetilen (TEFLON) ve seramik
mateyaller tercih edilmektedir
TEFLON biyolojik örnekler ve asidik ortamlarla geçimli olmakla birlikte 2000 psi
basıncın üzerisi için dayanıklı değildir
PEEK ise 5000 psi basınca kadar dayanıklı olup 316 paslanmaz çeliğe zarar veren
asidik çözeltilere dayanıklıdır. Ancak HPLC uygulamalarında kullanılan bir çok
organik çözücülere dayanıksızdır
Seramik yapı materyali olarak safir 20 yılı aşkın süredir pompalarda özellikle piston
parçalarının imalatında kullanılmaktadır. Bu tür malzemeler iyi kimyasal stabiliteye
sahip olmakla beraber çok yüksek maliyetleri uygulamalarında kısıtlamalar
getirmektedir
ġEKĠL 5. Safir pistonlar

MOBĠL FAZ ĠLETME MEKANĠZMASINA GÖRE
ġırınga tipi pompalar (Syringe pumps)
Çok kullanılmamakla birlikte akış hızının 100 L/dakika’dan daha az olduğu
uygulamalarda (örn. Kapiller sıvı kromatografisi uygulamaları) tercih edilmektedirler. 10-
50 mL hacminde bir şırıngaya pistonun elektrik motoruyla ittirilmesiyle akış
sağlanmaktadır. Sağlanabilecek mobil faz akış süresi şırınganın hacmi ile sınırlı olup,
yeniden dolum sırasında akış kesilmek zorundadır
ġEKĠL 6. Şırınga tipi pompa

Pistonlu pompalar
Modern HPLC donanımının standart parçasıdır. Yapısı iki kısım hareketli parçadan oluşur.
Bunlar, çözeltinin pompalanırken geri kaçmasını engelliyen vana sistemleri (check valve) ve
pistonlardır

ENJEKTÖR
HPLC donanımını oluşturan enjektör analizlenecek örneğin sabit faz (kolon) öncesinde
mobil faza enjekte edilmesi için kullanılır. Sahip olduğu sarmal (loop) sayesinde insan
faktöründen kaynaklanan enjeksiyon hacmi hata oranı sıfıra çekilmiştir. Elle kumanda
edilen manuel ve bilgisayar kumandalı otomatik enjektörler (otomatik örnekleyici –
autosampler) olmak üzere 2 çeşidi bulunmaktadır

MANUEL ENJEKTÖR (MANUEL INJECTOR)
Örneğin enjekte edilebilmesi için enjektör önce doldurma (load) pozisyonuna getirilerek
örnek, isteğe göre seçilebilen sabit hacimli, loop içerisine doldurulur. Loop’a doldurulan
örnek hacmi loop sabit hacmini geçerse, fazla olan kısım dışarıya otomatik olarak atılır.
Daha sonra enjektörün kolu enjeksiyon (inject) pozisyonuna getirilerek örnek mobil faz
içerisine enjekte edilmiş olur. Kullanılan loop hacimleri çok değişken olup genellikle 5
L – 5 mL aralığında değişir. Loop hacmi küçüldükçe tekrarlanabilirlik adına yapılan
hata oranı da büyümektedir. Manuel enjektörlerin çalışma prensibi Şekil 6’da şematize
edilmiştir. Buna göre, yükleme pozisyonunda pompa sadece kolon’a mobil faz basmakta
olup, loop hacmi enjektörle doldurulmaktadır. Eğer enjekte edilen hacim sabit loop
hacminden fazla ise, aşırı kısım 6 nolu çıkıştan çöpe atılmaktadır. Enjeksiyon
pozisyonunda ise pompa artık öncelikle loop içerisine ve oradan da kolon’a mobil faz
basmaktadır. Yani artık ilave edilen örnek çözeltisinin ayırımı başlamıştır

YÜKLEME POZİSYONU ENJEKSİYON POZİSYONU
Loop
(50 L)
1 2
6
5
4
3
Pompa
Kolon
Enjeksiyon
ġEKĠL 7. Manuel enjektörün çalışma prensibi
Loop
(50 L)
6
1 2
5
ġEKĠL 8. Manuel enjektörün yapısı
4
3
Pompa
Kolon
MANUEL ENJEKTÖR
(MANUEL INJECTOR)
Rheodyne 7725i ENJEKSİYON VALFI

OTOMATĠK ENJEKTÖR (OTOMATĠK ÖRNEKLEYĠCĠ - AUTOSAMPLER)
İki tip otomatik enjektör mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel tipidir. XY tipinde
enjektör hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek örneği şişesinden çekmekte ve
loop vasıtasıyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun için seçilen örneklere ait bilgilerin,
gerekli yazılım kullanılarak, önceden bilgi işlemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel
tipinde ise örnekler dönen, dairesel şekilli bir taşıyıcı vasıtasıyla sabit bir enjektörün
altına taşınmaktadır
ġEKĠL 9. XY tipi otomatik enjektörün yapısı

MOBĠL FAZ KABĠNĠ
(SOLVENT CABINET)
VAKUM DEGAZ ÜNĠTESĠ
(VACUUM DEGASSER)
POMPA
(PUMP)
OTO ENJEKTÖR
(AUTOSAMPLER)
KOLON FIRINI
(COLUMN COMPARTMENT)
DEDEKTÖR
(DETECTOR)
ġEKĠL 10. AGILENT 1100 SERĠSĠ ĠCĠN ÖNERĠLEN YERLEġĠM DÜZENĠ
KONTROL MODÜLÜ
(CONTROL MODULE)
MANUEL ENJEKTÖR
(MANUEL INJECTOR)

ÇÖZGEN
REZERVUARI
ONLINE DE-GAZ
ÜNĠTESĠ
ĠZOKRATĠK POMPA
KOLON
FIRINI
UVD
FLD
ECD
ÇÖP

KOLON
Karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit
fazdır. Kolon imalatında yapı materyali olarak 316 paslanmaz çelik, TEFLON, cam veya
PEEK en sık tercih edilenlerdir
Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı materyalden çok, iç yüzeyine yapılan
kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir
Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok çeşitli olup, kullanılacak mobil fazın ve
uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve
fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir
Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak
basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir

Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm aralığında değişmektedir. Kolon iç çapı arttıkça
akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü dolayısıyla
duyarlılık azalmaktadır
Kolonların boyları (uzunluğu) çok çeşitli olup genellikle 30-300 mm aralığında
değişmektedir
Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayırımı daha iyi olmakta fakat analiz süresi
uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır
Kolon boyutlarının tanımlanmasına uluslararası standartlar getirilmiştir. Buna göre önce
mm cinsinden uzunluk ve çap yazılmakta, bunu firma adı, sabit faz türü, A O türünden
poroz yüzey çapı ve mm cinsinden partikül büyüklüğü izlemektedir

Örneğin
250/4,6 Nucleosil C18 100 – 5
yazıldığında,
kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6 mm iç çapa sahip olduğu anlaşılmaktadır.
Kolonun firması (markası) Nuclesoil olup, sabit faz türü normal fazda kullanılan
bir tür olan C18 dir. Poroz yüzey çapı 100 A O olup, dolgu materyaline ait
partikül büyüklüğü 5 m’dir.

KOLON KĠMYASI
Genellikle üç Tip dolgu materyali (DM) ticari olarak mevcuttur.
1) Silisyum Tabanlı DM
2) Polimerik DM
• Divinilbenzen Tabanlı DM
• Metakrilat Tabanlı DM
• Vinilalkol Tabanlı DM
3) İnorganik DM (Al, Zn ve Ti oksit bileşikleri)
Silisyum Tabanlı DM
Mobil Faz pH değeri 9 olmalı, optimum pH aralığı genellikle 1-8’dir.
DM’nin yüzeyi silanol foksiyonel gruplarını ve siloksan köprülerini içerir. DM’nin
yüzeyinde çok çeşitli silanol yapıları bulunabilir
O
HO
Si
O
Tek
hidroksilli
Si
O
OH
OH
Si
O
Çok
hidroksilli
ġEKĠL 11. Silanol ve siloksan yapıları
H
O
O
Si
O
Köprülü
O
Si
H
O
Si
OH
Tekli
OH
O

Silanol grupları asidik ve hidrofilik karaktere sahiptir. Hidrofilik (polar) olmaları
sebebiyle mobil faza ve analizlenecek maddeye ait polar fonksiyonel gruplarla
etkileşerek alıkoyarlar. Dolayısıyla Normal Faz Kromatografideki adsorpsiyon
merkezleridir
Ancak Siloksan köprüleri göreceli olarak daha hidrofobik (apolar) karakterde olup polar
fonksiyonel gruplara karşı nötrdürler
Silisyum Tabanlı DM ısıya oldukça dayanıklı oldukları için ısıtılabilirler. 800 O C’de
silanol fonksiyonel gruplarının %90’ı bozunur. Risksiz 200-300 O C’ye kadar ısıtma
yapılabilir

C 18
C 8
O Si
O Si
R 2
R 1
R 2
R 1
Cyano O Si
N
Cyclohexyl
R 1
R 2
O Si
ŞEKİL 12. Sıkca Kullanılan Silisyum Tabanlı DM’leri
R 1
R 2
C
Nitro
Amino
O Si
O Si
R 1
R 2
R 1
R 2
NH 2
NO 2

HPLC SĠSTEM TÜRLERĠ
Analiz süresince kullanılan mobil fazın içeriğinde gerçekleşen değişim ve mobil
fazı oluşturan çözgenlerin karıştırılma prensibine göre HPLC sistem türleri
genel olarak 3 farklı kategoride gruplandırılmaktadır. Bu kategorilerin temel hali
olan izoktarik sistemde analiz süresince mobil fazın içeriği değişmezken diğer
sistemlerde değişim gerçekleşmektedir

ĠZOKRATĠK SĠSTEM
Mobil faz içeriğinin veya oranının analiz süresince değişmediği sisteme
izokratik sistem denilir. Tek pompa ve tek çözgenin kullanıldığı sistemdir.
Çözgen tek bileşen içerebileceği gibi çoklu bileşenlerden oluşan homojen bir
karışım da olabilir. Az sayıda maddenin ayırımı ve rutin analizlerinin söz
konusu olduğu durumlarda, özellikle ekonomik bir çözüm olduğu için tercih
edilir. En büyük sakıncası çözünürlüğün fazla sayıda örnek için yetersiz
oluşudur. Dolayısıyla çok sayıda pikin ayırımı söz konusu olduğu, araştırma-
geliştirme amaçlı çalışmalarda genellikle yetersiz kalan bir seçenektir.

DÜġÜK BASINÇLI GRADĠENT SĠSTEM
Mobil faz içeriğinin veya oranının analiz süresince değiştiği sisteme gradient sistem
denilir. Tek pompa ve en fazla dört farklı mobil fazın kullanıldığı sistemdir. Kullanılan
mobil fazlar gene tek bileşen içerebileceği gibi çoklu bileşenler de içerebilir. Karışma
pompadan önce gerçekleşir ve basınç diğer gradient sisteme göre daha düşüktür
YÜKSEK BASINÇLI GRADĠENT SĠSTEM
Birden fazla sayıda (en fazla dört) pompa, ve en fazla dört farklı mobil fazın kullanıldığı
sistemdir. Karışma pompalardan sonra gerçekleştiği için basıncı en yüksek sistemdir.
Ayrıca optimum çözünürlüğün en kolay sağlandığı sistemdir. Ancak birden fazla sayıda
pompa kullanıldığı için sistemin donanım maliyeti diğer seçeneklere göre oldukça
fazladır

HPLC METODUNUN GELĠġTĠRĠLMESĠ
HPLC analizlerinde öncelikle bir metodun tanımlanması ve geliştirilmesi
gerekliliği vardır, aksi takdirde cihazın aynı analiz için her kullanımında tüm
ince ayarların tekrar yapılması ve gerekli bilgilerin yüklenmesi ve genel bir
format verilmesi gerekecektir
Böyle bir durumda insan faktörünün, daha henüz analize başlamadan hata
yapma olasılığı her zaman mevcuttur
Buna göre metod geliştirme aşamasında, öncelikle aşağıdaki deneysel koşullar
saptanır. Elde edilen veriler analizi istenilen hassasiyette olanaklı hale
getiriyorsa bir sonraki aşama olarak metodun yazılması yani tanımlanması
gerçekleştirilir
Bir metodun geliştirilmesi aşamasında aşağıdaki deneysel koşullar ve deneysel
verileri uygulamalı olarak saptanmalıdır

1. Örneğe ait fiziksel ve kimyasal özelliklerin belirlenmesi
2. Örnek hazırlanmasına ait detayların belirlenmesi
3. Dedektör seçiminin yapılması
4. Kromatografik ayırma koşullarının saptanması
5. Kromatografik ayırma koşullarının optimize edilmesi
6. Muhtemel problemler için özel çözüm işlemlerin saptanması
7. Rutin laboratuvar analizleri için metodun validasyonu

HPLC’DE YÖNTEM GEÇERLĠLĠĞĠ (VALĠDASYONU)
Kromatografik yöntemler için validasyon deneylerine ait,
belirlenmiş bir parametre önceliği veya sıralaması mevcut değildir,
dolayısıyla optimum sıralama daha çok kullanılan metoda göre
oluşturulmaktadır
Ancak literatürde benzer konuda atıf almakta olan makalelere göre,
bir sıvı kromatografik metod için, aşağıdaki tablodaki sıralamanın
uygun olabileceği ve sıkça kullanılmakta olduğu bildirilmiştir

VALĠDASYON
PARAMETRELERĠ
1. Özgünlük
(standartlar ile)
2. Doğrusallık
3. Kesinlik
4. Doğruluk
5. Günler (ölçümler)
arası kesinlik
6. Belirleme sınırı
(LOD)
7. Tayin sınırı
(LOQ)
8.Özgünlük (gerçek
örnekler ile)
9. Esneklik
(Ruggedness)
10. Sağlamlık
(Robustness)
ÖLÇÜM ĠġLEMLERĠ
Tüm standart piklerinin yeterli düzeyde ayırımı. Çözünürlük faktörü
(resolution factor) > 2,5
Çalışılan konsantrasyon aralığından 5 farklı standart 3’er kez enjekte edilir.
Pik alanlarının ortalamaları alınır ve konsantrasyona karşı grafigi çizilir.
Doğrusal regresyon hesaplanır.
Bir standart 3 farklı konsantrasyonda 5’er kez enjekte edilir. Pik alanlarının
relatif standart sapmaları hesaplanır.
Kör örnek çözeltisine 3 farklı konstrasyonda analit ekilir (spiking). Gerçek
değerler kullanılarak valide edilecek HPLC metodu ile elde edilen sonuçların
sapması hesaplanır.
3 standart farklı konsantrasyonlarda 15 gün boyunca enjekte edilir. Bu işlem 3
farklı operatör tarafından aynı partiden 3 farklı analitik kolon kullanılarak
gerçekleştirilir. Miktarların kesinliği ölçülür.
Belirleme sınırına yakın konsantrasyonda bir standart 3 defa enjekte edilir.
Sinyal yüksekliği ve gürültü değerlerinin ortalaması alınır.
LOD = [(K ORT + 3s)- b]a-1
K ORT = kör örneğin ortalaması, s = kör örneğin standart sapması
b= kalibrasyon eğrisinin intersept’i, a= kalibrasyon eğrisinin eğimi
Tayin sınırındaki miktar için kesinlik değeri tanımlanır. Tayin sınırı ve 20 katı
miktar aralığında 6 farklı konsantrasyonda standart çözeltisi hazırlanır. Tüm
örnekler 6 defa enjekte edilir ve miktarların standart sapmaları hesaplanır.
Miktarlara karşı standart sapmaların grafiği çizilir.
Grafikten karşılık gelen tayin sınırındaki standart sapma hesaplanır.
Analit içeren örnekler kullanılır. Pik saflığı DAD ve/veya kütle (MS)
dedektör ile kontrol edilir. Örnek farklı kromatografik koşullar ve kolonlar ile
çalışılır.
Kesinlik ve doğruluk parametreleri farklı laboratuvarlarda kontrol edilir.
Sistematik biçimde kromatografik koşullar değiştirilir. Örneğin: kolon
sıcaklığı, akış hızı, gradient kompozisyonu, mobil fazın pH’sı, dedektör
ayarları (dalgaboyu, tayin potansiyeli vs). Değiştirilen koşulların pik ayırımı
ve alanları üzerine etkisi incelenir.

Sıvı kromatografik yöntemlerde validasyon konusunda bilimsel literatürde genel
olarak kabul görmüş 3 farklı yönerge mevcuttur. Bunlar;
ICH – International Conference of Harmonization
FDA (CDER) – Food & Drug Administration, Center for Drug Evaluation &
Research
USP – United States Pharmacopea
International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals
for Human Use (ICH), Guideline Q2(R1)-Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, ICH
Secretariat, c/o IFPMA, Geneva, 2005, 1–13.
FDA labelling information,
http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/2006/ucm108583.htm, 2006.
Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods, FDA-CDER, Nov. 1994.
General Chapter , Validation of compendial methods, United States Pharmacopeia XXIII, National
Formulary, XVIII, Rockville, MD, The United States Pharmacopeial Convention, Inc, 1995, 1982-1984

KOLON SEÇĠMĠ
Ticari olarak 3 temel kolon grubu mevcut olup, yapılacak seçimde bu kolonlar ile
optimum olarak hangi grup kimyasal maddelerin ayırımının yapılabildiğine dikkat
edilmelidir
TERS FAZ KOLONLAR
(C18/RP18/ODS,PHENYL,C8,C4,C2,TMS vb.)
Bu tip kolonlar, apolar, ortapolar, polar bileşikler, zayıf asit ve bazlar, proteinler,
peptidler, kuvvetli organik asit ve bazlar için daha uygundurlar. Uygunluk sırası ise
C18 > Phenyl = C8 > C4 > TMS şeklindedir. Ancak aminler, izomerler ve suda
çözünmeyen organik maddeler için uygun değildirler

NORMAL FAZ KOLONLARI
(-CN,-NH 2, -NO 2, DIOL)
Normal faz kolonlar, genelde suda çözünmeyen organik bileşikler, izomerler için
daha uygundur. Bunlardan -NH 2, amin grubu içerenler ve karbonhidratlar için
daha uygundur. -NO 2 ise aromatik veya çifte bağı çok olan bileşikler için
uygundur. Uygunluk sırası genellikle
-CN < -NH 2 < -NO 2 < -OH < Silika şeklindedir
ĠYON DEĞĠġ TOKUġ KOLONLARI
(-SO 3H,-COOH,-NR 3,-NR 2)
Bu tip kolonlardan -SO 3H, kuvvetli katyonlar için, -NR 3, kuvvetli anyonlar için, -
COOH, zayıf katyonlar için ve son olarak -NR 2 ise zayıf anyonlar için daha
uygundur

KOLON BAKIMI
HPLC sisteminin ayırımını ve genel anlamda performansını direkt olarak etkileyen bir
faktör olduğu için kolonların bakımı konusu oldukça önem arz etmektedir. Ticari olarak
mevcut üç temel kolon grubunun bakımları da farklı deneysel koşullarda
gerçekleştirlmektedir. Buna göre
TERS FAZ KOLONLAR
(C18/RP18/ODS,PHENYL,C8,C4,C2,TMS vb.)
Yıkama çözgeni: H 2O, MeOH, Kloroform, 2-Propanol, THF
Saklama çözgeni: MeOH
NORMAL FAZ KOLONLARI
(-CN,-NH 2, -NO 2, DIOL)
Yıkama çözgeni: Kloroform, Diklorometan, 2-Propanol
Saklama çözgeni: Hekzan, 2-Propanol
ĠYON DEĞĠġ TOKUġ KOLONLARI
(-SO 3H,-COOH,-NR 3,-NR 2)
Yıkama çözgeni: 10-100 kat konsantre mobil faz, diklorometan, 2-Propanol, H 2O
Saklama çözgeni: MeOH

DEDEKTÖR
HPLC donanımında 4 temel bileşenden birisi olan dedektör, örnek bileşenlerini tayin ederken
ölçtüğü fiziksel özelliğe göre gruplandırılabilir. Bu şekilde yapılan gruplandırmaya göre sekiz
çeşit dedektör mevcuttur. Dedektör donanımına ait genel özellikler IUPAC tarafından
tanımlanan birimler kullanılarak verilmektedir

UV/GÖRÜNÜR BÖLGE (UV/Vis) DEDEKTÖRÜ
Lambert-Beer kanunu’na göre zamana karşı absorbans ölçülür. Genellikle tek veya en
fazla iki farklı dalga boyunda eş zamanlı ölçüm yapılabilmektedir. Ekonomik olması ve
geniş uygulama alanına sahip olması nedeniyle en sık kullanılan dedektördür. Diğer
dedektörlerin sahip oldukları uygulanabilirilik kısıtlamaları nedeniyle, uygulanabilen
madde grubu sayısı bakımından en iyi performansa sahiptir, ayrıca bakım ve
kullanımının kolay olması da tercih nedenlerindendir
UV absorsbsiyon dedektörleri 180 ile 350 nm dalgaboyu arasındaki ışığı absorbe eden
maddeler için kullanılırlar
Ortaklanmamış elektron çiftine sahip olanlar ve çift bağ yapmış olan maddeler gibi
çoğu madde bu dalga boyları arasındaki ışığı absorblarlar
UV dedektör sensorü 1µL ile 10µL arasında kapasiteye sahip,ayırıcı kolondan geçen
gözler içerir
UV ışığı bu gözden geçip bir foto-elektrik göze düşecek şekilde ayarlanır
Fotoselden çıkan yanıt modifiye bir amplifikatöre ordanda bir kayıt aleti ile data
sistemine kaydedilir

ÇOKLU FOTODĠYOD (PHOTODIODE ARRAY – PDA) DEDEKTÖRÜ
UV/VIS dedektörle aynı çalışma prensibine sahiptir, yani zamana karşı absorbans ölçülür,
dolayısıyla UV/VIS dedektörün geliştirilerek modifiye edilmiş versiyonudur.
Ancak tasarımında temelde çok önemli bir ayrıcalık olarak, tüm dalga boylarında eş zamanlı
ve anlık spektrum alabilme özelliğine sahiptir. Bu özelliği nedeniyle kromatogramda yer alan
tüm piklerin arzu edilen dalga boyu aralığındaki spektrumlarını da gösteren üç boyutlu (x, y ve
z) kromatogramlara sahiptir ve bu sayede karmaşık örneklerde pik teşhislerinin daha sağlıklı
şekilde yapılabilmesine olanak sağlar

(300-2500 nm)
(190-400 nm)

Foto Diyodun ÇalıĢma Prensibi
Fotodiyot ışığı, çalışma moduna bağlı
olarak, akım veya gerilime dönüştürebilen
bir foto dedektördür.
Yeterli kitenik enerjiye sahip bir ışık fotonu
fotodiyot yüzeyine çarptığında bir elektronu
uyararak serbest bir elektron ve boş bir
orbital oluşumuna neden olmaktadır.
Birleşme yüzeyine ışık gelince, bu ışığın
verdiği enerji ile kovalan bağlarını kıran P
bölgesi elektronları, gerilim kaynağının
pozitif kutbunun çekme etkisi nedeniyle N
bölgesine ve oradan da N bölgesi serbest
elektronları ile birlikte kaynağa doğru
akmaya başlar.
Diğer taraftan, kaynağın negatif kutbundan
kopan elektronlar, diyodun P bölgesine
doğru akar. Böylelikle gelen ışığın şiddetiyle
orantılı olarak oluşan akım elektronik
çeviricilerde çevrilerek absorbans şiddeti
olarak kromatogramda gösterilir.

40
0
400
(mA
U)
300
(nm)
1900
40
t R
(min)
85

FLORESANS (FLUORESCENCE) DEDEKTÖRÜ
Belirli dalga boyunda uyarılan maddelerin temel hale dönerken yaydığı fluoresans
emisyonunun ölçümü zamana karşı yapılmaktadır. Kısıtlı sayıda madde grubuna
uygulanabilir. Tayin sınırı açısından en hassas dedektörlerdendir
ĠLETKENLĠK (CONDUCTIVITY) DEDEKTÖRÜ
Kondüktometre ile benzer prensipte çalışan bu dedektörde iletkenlik (μS)
monitörize edilerek tayinler gerçekleştirilmekte olup, sistem sıcaklık değişimlerine
karşı oldukçaduyarlıdır
REFRAKTĠF ĠNDEKS (REFRACTIVE INDEX) DEDEKTÖRÜ
Analizlenecek madde üzerine yollanan ve kırılan ışığın kırılma açısı üzerinden
tayin yapılmaktadır

SUNU PLANI
1) Tanımlar – Genel Bilgiler
2) Elektrokimyasal dedektör (ECD)
3) Elektrokimyasal hücre tasarımları
4) Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar
a) Kullanılan tayin yöntemleri
b) Yanıt akımının kaynağı
c) ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
d) Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
e) Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
5) Ticari ECD ürünleri
6) ECD Uygulama örnekleri

ELEKTROKĠMYASAL (ELECTROCHEMICAL) DEDEKTÖR
Sadece elektroetkin maddelere uygulanabilen ve indirgenme veya
yükseltgenme sırasında açığa çıkan yanıt akımının, elektrokimyasal
hücrede zamana karşı ölçümü yapıldığı (kronoamperometri) bir dedektör
sistemidir.
Elektrokimyasal hücre
ikili veya üçlü elektrot sistemlerinin kapak üzerinden yerleştirilerek,
elektrokimyasal ölçüm (akım, potansiyel veya iletkenlik ölçümleri) ve
elektrokimyasal işlemlerin (elektrodepozisyon, sıyırma, korozyon gibi)
gerçekleştirildiği, ortam olarak iletken tampon çözeltileri içeren, 10-20 mL
arasında hacime sahip cam veya inert malzemeden (polimerler, teflon gibi)
yapılmış çalışma kaplarıdır. Elektrokimyasal hücreler basit olarak
laboratuvar koşullarında hazırlanabilir, veya ticari olarak satılan hazır
hücrelerde kullanılabilir

SUNU PLANI
1) Tanımlar – Genel Bilgiler
2) Elektrokimyasal dedektör (ECD)
3) Elektrokimyasal hücre tasarımları
4) Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar
a) Kullanılan tayin yöntemleri
b) Yanıt akımının kaynağı
c) ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
d) Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
e) Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
5) Ticari ECD ürünleri
6) ECD Uygulama örnekleri

Elektrokimyasal Hücre Tasarımları
Bilimsel literatürde fazla sayıda alternatif hücre tasarımları yer almakla birlikte kabul
görmüş 3 adet genel tasarım mevcuttur. Bunlar, ince tabaka (thin-layer), duvar jeti
(wall-jet) ve iç geçiĢ (flow through) tipi elektrokimyasal hücre tasarımlarıdır:
A B C
İnce Tabaka (Thin-layer) (A), Duvar jeti (Wall-jet) (B) ve İş geçiş (Flow-through) (C)
tip elektrokimyasal hücre tasarımları

Genel ilke olarak hücre imalatında sınırlayıcı akımın (limiting current) düşük olduğu
tasarımlara önem verilmektedir. Bu amaçla çalışma elektrodu yüzeyinde oluşan difüzyon
katmanının kalınlığının (d) olabildiğince ince olaması göz önüne alınmalıdır. Difüzyon
katmanının kalınlığı ne denli azaltılabilirse sınırlayıcı akımın da (I s) o denli küçük
olması sağlanabilmektedir. Bu sayede daha yüksek sinyal akımı elde edilebilmektedir.
Her 3 tip hücre tasarımı için Is değerleri aşağıdaki eşitlikler kullanılarak hücre
boyutlarının fonksiyonu olarak hesaplanabilmektedir:
İnce tabaka hücre için I s = 0.8nFc D 2/3 l 1/3 bv -1/6 u 1/2
Duvar jeti hücre için I s = 1.2nFcD 2/3 ar 3/4 v -5/12 u 3/4
İç geçiş hücre için I s = 8.0nFcD 2/3 l 2/3 r 2/3 v 1/3
n redoks tepkimesine giren elektron sayısını
F Faraday sabitesini (96487 C/mol)
c türün konsantrasyonu (mol/L)
D difüzyon sabitesi ( 10 -5 cm 2 s -1 )
l uzunluk (cm)
r çap (cm)
b en (cm)
a jet çapı (cm)
v vizkosite ( 10 -3 cm 2 s -1 )
u doğrusal hız (cm/saniye)

Her üç tip hücre tasarımında da sınırlayıcı akım (Is) n, F, c ve D 2/3 değişkenleri ile
doğrusal olarak bağıntılıdır. Is ayrıca doğrusal hız (u) ile de orantılı olup, u’nun yüksek
olduğu durumlarda difüzyon katmanının kalınlığının (d) azalmakta ve elektrot yüzeyinde
redoks tepkimesinin gerçekleşmesi için gerekli olan tepkime zamanı kısalmaktadır.
Genel olarak u 1cm/s değerinin üzerinde tutulmalıdır. Tipik u değerlerinde bu bağlamda
en avantajlı tasarım duvar jeti tipi hücrelere ait olmaktadır. Is iç geçiş tipi hücrelerde
elektrot uzunluğu ile de orantılı olmakla birlikte bu durum genel olarak 101’den daha
düşük bir çarpan olarak hesaplamalara dahil olabilmektedir. Bunun en temel nedeni ise
elektrot yüzeyi ile gerçekleşen ilk temas aşamasında seyreltik çözeltilerde analitin
neredeyse tamamının ilgili redoks tepkimesini tamamlamasıdır. Is vizkosite değerine de
bağıml olmakla birlikte bu açıdan da en uygun tasarım duvar jeti olmaktadır. Hücre
tasarımında dikkate alınması gereken önemli değişkenlerden bir tanesi de sinyal/gürültü
oranıdır (SNR).
İnce tabaka hücre için SNR (rl) 1/3
Duvar jeti hücre için SNR (l) -1/2

Elektrokimyasal Akış Hücresi (Agilent Technologies 1050 serisi HPLC’ler
için 1049A Elektrokimyasal Dedektör)
Elektrokimyasal Akış Hücresi (BAS LC-4C amperometrik dedektör için
“Cross-flow thin-layer” hücre
Elektrokimyasal Akış Hücresi (BAS UniJet Detector)

SUNU PLANI
1) Tanımlar – Genel Bilgiler
2) Elektrokimyasal dedektör (ECD)
3) Elektrokimyasal hücre tasarımları
4) Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar
a) Kullanılan tayin yöntemleri
b) Yanıt akımının kaynağı
c) ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
d) Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
e) Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
5) Ticari ECD ürünleri
6) ECD Uygulama örnekleri

Kullanılan tayin yöntemleri
Yöntem
Kontrol Edilen
DeğiĢken
Ölçülen
DeğiĢken
Hücre
Tasarımı
Elektronik
donanım
Amperometri Potansiyel sabit Akım Üçlü elektrot sistemi Basit Potentiostat
Kulometri
Voltametri
Puls Amperometri
Potansiyel sabit
Potansiyel zamanın bir
fonksiyonu olarak
değiĢtirilir
Potansiyel sabit.
Ölçümler arası
elektrodu temizlemek
için potansiyel pulslar
halinde uygulanır
Akım, yük
ÇalıĢma
elektrodunun yüzey
alanı amperometriye
göre daha büyüktür
Akım Üçlü elektrot sistemi
Akım puls
uygulanmadığı
zaman örneklenir
Üçlü elektrot sistemi
Basit Potentiostat
Voltametrik
yöntemleri
uygulayabilen
mikroiĢlemcili
potentiostat
Ek Bilgi
Analitin genelde maks. %10’nu
yüzeyde değiĢime uğrar. Ticari
seçeneği fazla, stabil bir
tekniktir.
Analitin genelde %100’ü
yüzeyde değiĢime uğrar. Ticari
seçeneği kısıtlı, stabil bir
tekniktir.
Analitin çok değiĢken oranda
yüzeyde değiĢime uğrar. Ticari
seçeneği fazla, stabil bir
tekniktir.
Amperometrik tayine ait
tekrarlanabilirlik pulsla
yapılan temizlikle
iyileĢtirilebilir.

Yanıt akımının kaynağı
Dedektöre ait yanıt akımı aslında elektrokimyasal tepkimenin hızının ölçülmesine
dayanmaktadır. Tepkime hızı ise yüzey alana birim zamanda çarpan tanecik
sayısı ile orantılıdır. Akım sinyalini etkileyen faktörler şunlardır;
1) Aktif Elektrot yüzey alanı
2) Analit konsantrasyonu
3) Sıcaklık
4) Mobil fazın vizkositesi
5) Mobil fazın pompalanma hızı
6) Çalışma potansiyeli
Kromatogramda pik yüksekliği olarak ölçülen akım değeri, o çalışma
potansiyelinde redoks tepkimesine giren kimyasal türlerin konsantrasyonu ile
doğru orantılıdır. HPLC-ECD tayinlerinde ölçülen toplam akım Fradayik
akımların (I F) bileşkesidir:
I toplam = I F (analit) + I F (artalan) + I F(kapasitif)
İdeal şartlar altında dedektörün sadece I F (analit) akımını okuması istenir.
Bununla beraber I F (artalan) safsızlıkların, mobil fazın ve elektrot materyalinin belirli
ölçüde redoks tepkimesine girmesiyle oluşur.

İstenmeyen I F (artalan) akımından kurtulmak için artalan (background) yanıtı analit
yanıtından çıkartılır. Mümkün olan en düşük çalışma potansiyelinin seçilmesi de I F
(artalan) ın düşürülmesine yardımcı olmaktadır.
I F(kapasitif) ise donanım tasarımına ait bir problem olup,
dQ
dV
IF(kapasitif) = C denkleminden de görülebileceği gibi çalışma potansiyelinin
dt dt
değişime uğramasıyla artış göstermektedir. Amperometrinin sabit çalışma
potansiyelinde gerçekleitirlmesi sayesinde I F(kapasitif) ihmal edilebilir düzeyde
olmaktadır.

ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
Yükseltgenmeye dayalı kinetik olarak hızlı kabul edilen bir redoks tepkimesinde, elektrot
potansiyeli sınırlayıcı akım değerine ulaşılan ve genellikle redoks pik potansiyelinden 120
mV daha pozitif olan bir potansiyel değerine ayarlanmalıdır. 120 mV’dan daha fazla pozitif
değerlerin tercih edilmesi I F (analit) değerinde herhangi bir artış getirmezken gürültü
miktarının artışı anlamına gelen I F (artalan) değerini artırmaktadır. Bu durum ise duyarlılığı
(S/N) olumsuz etkilemektedir.
Bununla beraber kinetik olarak oldukça yavaş seyreden ve tersinir olmayan redoks
tepkimelerinde mecburiyetten bu kurala uyulmaz ve I F (artalan) değerinin kabul edilebilir
sınırlar içerisinde kalması koşuluyla çalışma potansiyeli maksimum düzeyde arttırılır.
Çalışma elektrodunun seçiminde, redoks tepkimesinin tersinir olması, elektrot
malzemesinin inert kalabiliyor olması gibi temel 2 etkene ayrıca dikkat edilecek olursa
duyarlılık (S/N) parametresinden daha az ödün verileceği unutulmamalıdır.

Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
HPLC-ECD tayinlerinde kullanılacak tüm mobil fazlar için iletken olması = iyon içeriyor
olması gerekliliği vardır. ECD ve amperometri su bazlı polar kromatografik ayırımların
(terz faz, iyon çifti, iyon değiş tokuş kromatografisi) hemen hemen hepsiyle geçimlilik
gösteriyor olması bir avantajdır.
Ters faz kromatografide kullanılan mobil faz genellikle ultra saf su ve organik faz
karışımıdır (su-metanol, etanol, izoproppanol). Metanol tercihi çalışma potansiyelinin
yüksek pozitif değerlerine kısıtlama getirmektedir ( 1000 mV vs Ag/AgCl).
Tetrahidrofuran (THF) kolaylıkla bünyesinde oluşan elektroetkin safsızlıklar (peroksitler)
nedeniyle, elektrolit olarak amin tabanlı kimyasallar ise I F (artalan) değerini arttırmaları
nedeniyle tercih edilmemelidir.
Mobil faz pH değeri tampon çözeltiler (0.01 – 0.1M, fosfat, sitrat, asetat tamp.) kullanılarak
mutlaka sabitlenmelidir. İndirgenme yapılıyorsa tampon bileşenlerinden ve özellikle
asitlerden gelebilecek eser düzeydeki metal iyonlar I F (artalan) değerini arttırmaktadır. Mobil
faz bileşenleri HPLC saflığında çözgenler olmalıdır.

Çalışma elektrodunun materyeli belirli negatif ve pozitif sınırlara sahiptir. Bu değerlerin
üzerinde hem mobil faz bileşenleri ve hem de az da olsa elektrot materyeli redoks
tepkimesine girdiğinden I F (artalan) değeri kayda değer düzeyde yükselmektedir.

Mobil faz içerisinde yer alan çözünmüş oksijenin indirgenmesi sonucu I F (artalan) değerinin
yükselmesi kaçınılmazdır. Dolayısıyla indirgenme yapılıyorsa de-gaz işlemi oldukça
önemlidir.
Alkali mobil fazlarda O 2 + 2H 2O + 4e - 4OH -
Asidik mobil fazlarda O 2 + 4H + + 4e - 2H 2O
Mobil fazın tamamiyle susuz yani organik çözgenlerden oluşması da mümkündür. Bu
amaçla gerekli elektroliti taşımaları koşuluyla asetonitril, dimetilformamid (DMF),
dimetilsülfoksit (DMSO), diklorometan (CH 2Cl 2) kullanılabilir. Elektrolit olarak ise
tetrabutilamonyum hekzaflorofosfat, tetrabutil amonyum perklorat, tetrafloroborat en sık
tercih edilen moleküllerdir.
Bahsi geçen organik çözgenler redoks tepkimelerine girmeye, polar çözgenlere göre, daha
az eğimli olduklarından elektrotların uygulanabilir oldukları potansiyel aralıklarını
genişletmektedirler. Bu sayede aromatik hidrokarbonlar ve alkoller gibi daha zor tayin
edilebilen türler redoks tepkimesine sokulabilmektedir.

Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
Son yıllarda yeni eğilim olarak herhangi 3 tip
elektrokimyasal hücre birbirine seri olarak
bağlanmasıyla sağlanan çoklu (array) elektrot
kullanımı sayesinde 3 boyutlu kromatogramlar elde
edilebilmektedir.

SUNU PLANI
1) Tanımlar – Genel Bilgiler
2) Elektrokimyasal dedektör (ECD)
3) Elektrokimyasal hücre tasarımları
4) Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar
a) Kullanılan tayin yöntemleri
b) Yanıt akımının kaynağı
c) ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
d) Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
e) Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
5) Ticari ECD ürünleri
6) ECD Uygulama örnekleri

SUNU PLANI
1) Tanımlar – Genel Bilgiler
2) Elektrokimyasal dedektör (ECD)
3) Elektrokimyasal hücre tasarımları
4) Kromatografik sistemlerde elektrokimyasal uygulamalar
a) Kullanılan tayin yöntemleri
b) Yanıt akımının kaynağı
c) ÇalıĢma potansiyelinin optimizasyonu
d) Mobil faz ve elektrot kısıtlamaları
e) Seçicilik: çoklu (array) elektrotlar
5) Ticari ECD ürünleri
6) ECD Uygulama örnekleri

Elektroetkin fonksiyonel gruplar – Yükseltgenme 1

Elektroetkin fonksiyonel gruplar – Yükseltgenme 2

Elektroetkin fonksiyonel gruplar – Ġndirgenme 1

Elektroetkin fonksiyonel gruplar – Ġndirgenme 2