labiatae - Fen Bilimleri Enstitüsü - Balıkesir Üniversitesi
labiatae - Fen Bilimleri Enstitüsü - Balıkesir Üniversitesi
labiatae - Fen Bilimleri Enstitüsü - Balıkesir Üniversitesi
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
BAÜ FBE Dergisi<br />
Cilt:10, Sayı:1, 52-60<br />
Temmuz 2008<br />
Özet<br />
Farklı genomik dna izolasyon yöntemlerinin<br />
satureja (<strong>labiatae</strong>) türlerinde uygulanması<br />
Serap ÖZ AYDIN, Feray KÖÇKAR<br />
<strong>Balıkesir</strong> <strong>Üniversitesi</strong> Necatibey Eğitim Fakültesi <strong>Fen</strong> Bilgisi Öğrt.ABD, <strong>Balıkesir</strong><br />
<strong>Balıkesir</strong> <strong>Üniversitesi</strong> <strong>Fen</strong> Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ABD, <strong>Balıkesir</strong><br />
Bitkilerden genomik DNA izolasyonu için farklı protokoller bulunmaktadır. Ancak<br />
farklı bitkilerin kimyasal içerikleri de farklı olduğundan birbirine yakın türler için bile<br />
özel genomik DNA izolasyon yöntemi gerekli olabilmektedir. Bu çalışmada tıbbi ve<br />
aromatik bitkilerden, uçucu yağ ve fenolik bileşiklerce zengin Satureja (Labiatae) cinsi<br />
kullanılmıştır. Bu çalışmada üç farklı DNA izolasyon yöntemi uygulanmıştır. Bu<br />
yöntemler karşılaştırıldığında bazı değişiklikler yapılarak oluşturulan yöntemin en<br />
uygun yöntem olduğuna karar verilmiştir. Bu yöntemle elde edilen gDNA’ da,<br />
proteinler, RNA, polisakkaritler, uçucu yağlar, fenoller ve diğer kirleticiler minimal<br />
düzeydedir. Bu elde edilen DNA’ların saflığı ve miktarı jel elektroforezi ve UV (A260<br />
/A280 ve A260 / A230) spektroskopik ölçümlerle belirlenmiştir. Ayrıca Rasgele Arttırılmış<br />
Polimorfik DNA (RAPD) tekniğiyle DNA’nın PZR tekniklerine uygunluğu gösterilmiştir.<br />
Anahtar Kelimeler:DNA izolasyonu, Satureja, RAPD-PZR<br />
Abstract<br />
There are several methods available for isolation of genomic DNA for plants. However,<br />
since different plants have different chemical composition, even close species need<br />
specific genomic DNA isolation protocol. In this study, Satureja (Labiatae) genus that is<br />
very rich in essential oils and phenolic compounds and one of the aromatic plants has<br />
been used. Two different DNA isolation procedures have been tried. A modified<br />
procedure was developed after a comparison of two different procedures. Main<br />
contaminants for genomic DNA, RNA, polysaccharides, essential oils, phenolic<br />
compounds were at minimal level in the genomic DNA. The concentration and purity of<br />
the obtained DNA was determined by agarose gel electrophoresis and UV spectroscopy<br />
(A260/A280 and A260/230). In addition, the suitability of genomic DNA obtained from<br />
different procedure were also checked by RAPD-PCR reactions<br />
Key Words: DNA extraction, Satureja, RAPD-PCR<br />
52
1. Giriş<br />
Farklı genomik dna izolasyon yöntemlerinin satureja (<strong>labiatae</strong>) türlerinde uygulanması<br />
Sekonder metabolitlerce zengin olan bitkiler ilaç, kozmetik, yiyecek ve pestisid<br />
endüstrisinde değeri olan bitkilerdir. Bu aromatik ve tıbbi bitkilerin çoğu pek çok<br />
ülkede ve ülkemizde yetişmekte, ayrıca yıllardır halk ilacı ve çay olarak<br />
kullanılmaktadır (1,2). Labiatae familyasına dahil olan Satureja cinsine ait türler de<br />
zengin karvakrol ve timol içerdiği ile bilinmektedir (3,4). Satureja cinsinin ürettiği bu<br />
önemli kimyasal bileşiklerden dolayı uçucu yağ içerikleri, diğer kimyasal içerikleri,<br />
etnomedikal etkileri üzerine yapılan çalışmalar yanında farmakolojik aktivitelerini ve<br />
antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek için yapılan pek çok çalışmalar bulunmaktadır<br />
(5,6).<br />
Satureja cinsinin, bu önemli özelliklerine rağmen halen sistematik problemleri<br />
bulunmaktadır. Özellikle bazı türler deniz seviyesinden 2500 m yüksekliğe ve çok geniş<br />
yayılış alanına sahip olduğundan yüksek bir varyasyon göstermektedir. Ayrıca bazı<br />
hibritler bulunmaktadır. Bu nedenlerle bazı türlerin sınırlarının belirlenmesi oldukça güç<br />
olabilmektedir. Bu sistematik problemler bitkilerin morfolojik karakterlerinin<br />
kullanılmasıyla çözümlenememektedir. Bu sebeple farklı karakterlerle türlerin teşhisinin<br />
yapılmasının gerekliliği ortaya çıkmıştır. Moleküler sistematik yöntemlerin kullanılması<br />
gerekliliği belirmiştir.<br />
Türlerin belirlenmesi için yapılacak DNA temelli bu çalışmalar RAPD (7,8), RFLP (9),<br />
genom haritası, DNA parmakizi çalışmaları gibi moleküler genetik çalışmalarıdır. Bu<br />
teknikler için yüksek saflıkta DNA’ ya ihtiyaç vardır (10). Pek çok bitki türünde<br />
başarıyla uygulanan değişik DNA izolasyon yöntemları mevcuttur (12,13,14,15). Ancak<br />
bitkiler arasında da biyokimyasal açıdan oldukça farklı kompozisyonlar bulunmaktadır.<br />
DNA izolasyonu, yapılarında yüksek oranda fenoller, ketonlar, aldehitler,<br />
polisakkaritler gibi sekonder metabolitleri içeren bitkilerde problemli olabilir. Aynı tür<br />
içerisinde ana bileşik değişebilmektedir. Satureja hortensis ’in kültüre alınmış<br />
formlarında karvakrol, doğal formlarında ise timol ana bileşik olarak belirlenmiştir.<br />
Türkiye’nin doğusunda yetişen bitki örnekleri yağlarında timol’ü ana bileşen olarak<br />
tespit edilmesine karşın batısında yetişenlerde ana bileşiğin karvakrol olduğu<br />
saptanmıştır (16). Değişik türler arasındaki kemotipik heterojenlik, bir izolasyon<br />
protokolünden optimal DNA izolasyonuna izin vermeyebilir ve belki de yakın ilişkili<br />
türler arasında bile farklı izolasyon yöntemları gerekebilir (17).<br />
Bu çalışmada kullanılan Satureja cinsi içerdiği bileşikler sebebiyle tıbbi ve ekonomik<br />
açıdan önemli bir bitki grubudur. Aynı zamanda bu bitki, sistematik açısından oldukça<br />
problemli olduğundan moleküler yöntemler uygulanılması amaçlanmaktadır. Modifiye<br />
ettiğimiz DNA izolasyon yöntemi ile elde edilen gDNA örneklerine RAPD tekniği<br />
uygulanmıştır.<br />
2. Materyal-yöntem<br />
2.1. DNA izolasyonu için bitki örneklerinin toplanması<br />
DNA İzolasyonu için 2000-2002 tarihleri arasında Satureja cinsine ait 7 farklı<br />
lokaliteden farklı vejatasyon dönemlerinde toplanmış türler kullanılmıştır. Bunlar, S.<br />
wiedemanniana (Tokat-Turhal), S. cuneifolia (Denizli-Babadağ), S. pilosa (<strong>Balıkesir</strong>-<br />
Kazdağ), S. icarica (Çanakkale-Gökçeada), Satureja sp.1 (Bursa-Mezitler), Satureja<br />
sp.2 (<strong>Balıkesir</strong>-Zeytinli), Satureja sp.3 (Çanakkale-Küçükkuyu).<br />
53
Serap ÖZ AYDIN, Feray KÖÇKAR<br />
Bu bitkilerin araziden toplanan taze yaprakları genomik DNA izolasyonuna kadar –80<br />
°C derin dondurucuda saklanmışlardır.<br />
2.2. Genomik DNA izolasyonu<br />
2XCTAB yöntemi: Satureja bitkilerinden genomik DNA izolasyonu için Saghai-<br />
Maroof ve ark.yönteminden modifiye edilmiş 2XCTAB yöntemi kullanılmıştır (13).<br />
1 g taze yaprak dokusu sıvı azotla toz haline getirilir. Ependorfa 750 µl 2XCTAB<br />
(Sigma) solüsyonu eklenir. Ependorf parafilmle sarılır, 30 dk. 65 °C de su banyosunda<br />
bekletilir ve parafilmi açılır. Ependorfa 750 µl kloroform : izoamilalkol (24:1) (Sigma)<br />
eklenir. Tüp iyice çalkalanır üst fazı ( 650 µl ) 1.5 ml lik tüpe transfer edilir. Eğer faz<br />
temiz değilse 550 µl alınır ve üzerine 300 µl 2XCTAB ve 750 µl kloroform eklenir ve<br />
15000 rpm de 5 dk.santrifüj edilir. Diğer ependorfa 650 µl alıp üzerine absolü<br />
izopropanol (Sigma) eklenir (oda sıcaklığında) 25000 rpm ve 25 °C de 5 dk. santrifüj<br />
edilir. İzopropil alkolü dikkatle dökülür. Kurutma kağıdına kapatılır. 1 ml % 70 etanol<br />
(Sigma) eklenir ve 15000 rpm de 25 °C de 5 dk.santrifüj edilir. Daha sonra etanolü<br />
uzaklaştırılır ve 30 dk. beklenerek kuruması sağlanır. Pellet 500 µl TE pH 8 içinde<br />
çözülür.<br />
2.3. Dellaporta ve ark. yöntemi<br />
Daha sonra Dellaporta ve ark. (14) yöntemi izolasyon işlemi için kullanılmıştır.<br />
1 g taze yaprak dokusu sıvı azot ile ezilir. 15 ml ayrıştırma tamponu (100 mM Tris<br />
(Sigma), 50 mM EDTA (pH: 8, Sigma), 500 mM NaCl (Fluka), 10 mM<br />
mercaptaethanol (Merk) ve distile su ) üzerine ezilmiş bitki dokusu eklenir. Bu tüp içine<br />
1 ml %20 SDS (Sigma) eklenip 1 dk hızlıca çalkalanıp 10 dk 65 °C’ de inkübe edilir.<br />
Daha sonra üzerine 5 ml, 5 M Potasyum asetat (Merk), eklenip tüp yavaşça çalkalanır<br />
ve buzda 20 dk. bekletilir. Tüpler 15000 rpm’ de oda sıcaklığında 20 dk. Santrifüj edilir.<br />
Süpernatant dikkatlice bir eppendorf tüpe aktarılır bunun üzerine soğuk 10 ml<br />
izopropanol eklenir ve daha sonra -20 °C’de 30 dk. bekletilir. -20 °C’den alınan tüp<br />
14000 rpm’ de oda sıcaklığında 5 dk santrifüjlenir. Süpernatant yavaşça dökülür ve<br />
pellet kurutulur. Bunun üzerine 400 TE-I (50 mM Tris, 10 mM EDTA ) eklenir ve 30<br />
dk. çözünmesi için beklenir. Çözündükten sonra 75 µl 3M NaOAc (Merk), ve 500 µl<br />
izopropanol eklenerek 30 sn satrifüjlenir. Süpernatant boşaltılp 1ml % 80 Etanol eklenip<br />
yine 30 saniye santrifüjlendikten sonra ependorf ters çevrilip 1 saat kurumasını beklenir.<br />
Son aşama olarak DNA 500 µl TE-II (10mM Tris, 1mM EDTA) içinde çözülür.<br />
2.4. Modifiye DNA izolasyon yöntemi<br />
Bu yöntemde Dellaporta ve ark.(14) İle Pich. ve ark.(15) yöntemlerine benzer olan bir<br />
yöntem modifiye edilmiş ve Do ve arkadaşlarının(18) kullandığı yöntemdeki gibi 2.5<br />
M NaCl konsantrasyonu ile polisakkaritler uzaklaştırılmıştır. Bu yöntem aşağıdaki<br />
gibidir:<br />
1 gram taze yaprak dokusu havanda sıvı azot yardımıyla toz haline gelinceye kadar<br />
ezilir. 1 ml ekstraksiyon tamponu (100mM Tris-HCl (pH=8.0), 50 mM EDTA<br />
(pH=8.0), 500mM NaCl, 0.007% 2-mercaptoetanol) ve 130 µl %10’luk SDS<br />
mikrosantrifüj tüpüne eklenir ve karıştır. 15 dk. 65 O C ‘de inkübasyona bırakılır. 300 µl<br />
5M potasyum asetat eklenip 30 dk. buzda bekletilir. 15000 rpm 10 dk. Santrifüj edilir.<br />
Süpernatant iki tüpe aktarılır yaklaşık 300 µl kadar. Her bir tüpe 300 µl fenol (pH 8,<br />
54
Farklı genomik dna izolasyon yöntemlerinin satureja (<strong>labiatae</strong>) türlerinde uygulanması<br />
Sigma) ve 200 µl dH2O eklenir. 15000 rpm de 10 dk. Santrifüj edilir. Supernatantı<br />
alınıp (≅ 800µl) üzerine eşit hacimde kloroform-izoamilalkol eklenir. 10 dk. 15000 rpm<br />
de 4 o C de santrifüj edilir. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarılır gerekirse koroformizomilalkol<br />
tekrarlanabilir. 2 hacim absolu etanol eklenip 30 dk. buzda bekletilir. 5 dk.<br />
15000 rpm de sanrifüj edilip süpernatantı dökülür. Pelet 70% lik alkolle yıkanıp TE’ de<br />
çözülür. gDNA ‘dan 5µg alınır bu miktar 500 µl’ ye TE ile tamamlanır. 2,5 M NaCl<br />
eklenir üzerine 2 hacim etanol konduktan sonra 20-30 dk. beklenir. 10 dk. Satrifüjden<br />
sonra etanol dökülüp yerine % 70 ’lik 500 (l etanol eklenir 3 dk spin ettikten sonra TE<br />
içinde çözülür.<br />
3. DNA örneklerinin saflık, miktar tayini ve pzr tekniklerine uygunluğunun<br />
belirlenmesi<br />
Tüm yöntemlerle izole edilen DNA örnekleri jel elektroforezinde yürütülerek kontrol<br />
edilmiştir. Bunun için % 0.7 agaroz (Sigma), jel elektroforezi kullanılmıştır. Genomik<br />
DNA ’nın saflığını daha kesin sayısal ifadelerle belirlemek için spektrofotometre<br />
(Unıcam-Hexios α ) ile absorbans (A260 /A280 ve A260 / A230) değerleri ölçülmüş, saflığı<br />
ve miktarı hesaplanmıştır (19).<br />
4. RAPD-PZR uygulaması:<br />
İzole edilen DNA’nın PZR reaksiyonlarına uygunluğunu göstermek için de elde edilen<br />
genomik DNA RAPD reaksiyonlarında test edilmiştir.<br />
Her bir reaksiyon (25 µl) , 2,5 mM MgCl2 (Fermentas), 0.2 mM dNTP (dATP, dCTP,<br />
dGTP, dTTP), (Fermentas), 1 µM Primer (Sigma ), 1 U Taq Polymerase (Fermentas),<br />
2,5 µl 10XPCR tampon (Fermentas), 10 ng genomik DNA içermektedir. Amplifikasyon<br />
işlemi PZR cihazı (Techne-Progene) ile şu basamaklarda gerçekleşmiştir :1. döngü 94<br />
°C’de 2dk., bunu izleyen 42 döngü, denaturasyon aşaması 94 °C’de 30 s ,primer<br />
bağlanma aşaması 35°C’ de 30 s, uzama aşaması ise 72°C’ de 60 s ve son basamak 1<br />
döngü 72°C’ de 4 dk.’dır (20).<br />
RAPD-PZR sonucu oluşan ürünler 80 V, 1.2% agaroz jelde yürütülmüştür. Daha sonra<br />
UV transilluminator kullanılarak jeller değerlendirilmiştir. Jellerin fotoğrafları polaroid<br />
667 tip film kullanılarak polaroid kamera ile çekilmiştir.<br />
5. Sonuç ve tartışma<br />
Labiatae familyasına ait tıbbi ve aromatik bitkilerin ürettiği sekonder metabolitler ve<br />
uçucu yağlar pek çok alanda bu bitkilerin değerini arttırmaktadır. Ancak bu bitkiler ile<br />
DNA temelli bir çalışma yapılması düşünüldüğünde, DNA izolasyonunda, sekonder<br />
metabolitler, uçucu yağlar, fenolik bileşikler gibi bitki etken maddeleri çeşitli sorunlar<br />
ortaya çıkabilmektedir. DNA’da bu maddelerin varolması DNA temelli çalışmalarda<br />
engelleyici etkiler göstermektedirler. Bu sorunlar, izolasyon yöntemlerinde bazı<br />
değişikliklerin yapılmasıyla ortadan kaldırılabilmektedir.<br />
Satureja cinsindeki akrabalık ilişkilerini belirlemek için yapılacak olan RAPD<br />
çalışmalarında kullanılmak üzere saf DNA gereklidir. Bu amaçla ilk olarak Dellaporta<br />
ve ark.’a (14) göre izolasyon yapılmıştır. Spektro ölçümlerinden A260 /A280 oranı<br />
55
Serap ÖZ AYDIN, Feray KÖÇKAR<br />
ortalama 1.3 değerini geçmemiştir. Bu yöntemle elde edilen gDNA örnekleri % 0.7 ’lik<br />
agaroz jelde yürütülmüştür. Bu jelin fotoğrafı Şekil 1’de verilmiştir.<br />
İlk uygulanan yöntemle izole edilen DNA’nın saflık değeri düşüktür. Bu nedenle farklı<br />
bir yöntem ile (2xCTAB) daha DNA izole edilmiştir (13). Bu örnekler içinde A260 /A280<br />
oranı hesaplanmıştır. Değer ortalama olarak 1.5 civarındadır. Bu yöntemle elde edilen<br />
DNA miktarı Spektro ölçümleriyle belirlenebilmesine karşılık oldukça az olduğundan<br />
agaroz jelde görüntülenmesi mümkün olmamıştır. (Şekil 3 c)<br />
Özellikle Dellaporta ve Ark. yöntemine göre izole edilen gDNA fazla miktarda RNA<br />
kirliliği içermektedir. Şekil-1’ deki jelde de görülen kirliliği ortadan kaldırmak amacıyla<br />
örnekler Ribonükleaz A işlemine tabi tutulmuşlardır. Bu işlemden sonra UV<br />
spektrometrede incelendiğinde düşük yoğunlukta DNA’nın varlığı tespit edilirken jelde<br />
incelendiğinde görüntülememiştir. Bu şekilde RNA kirliliğinden temizlenmiş olan<br />
gDNA örnekleriyle yapılan RAPD reaksiyonlarında bir amplifikasyon oluşmamıştır.<br />
Ayrıca uygulanan fenol kloroform ekstraksiyonu, sonucu değiştirmemiştir. Aynı şekilde<br />
diğer yönteme de aynı işlemler uygulanmış yine RAPD reaksiyonunda sonuç<br />
alınamamıştır.<br />
Bu durumda Satureja cinsine ait bitkilere uygun yeni bir gDNA yönteminin<br />
uygulanmasının gerekliliği ortaya çıkmıştır. Modifiye bu metod iki temel basamaktan<br />
oluşmaktadır. İlk basamakta Dellaporta ve ark. ile Pich ve ark yöntemi modifiye<br />
edilerek mini izolasyon yöntemi oluşturulmuştur. Ancak bu şekliyle tüm DNA örnekleri<br />
RAPD reaksiyonu sonucu tekrarlanabilir net bantlar vermemiştir. İkinci basamakta<br />
PZR’ ı inhibe ettiği tesbit edilen polisakkaritler temizlenmiştir. Bu işlem Do ve<br />
arkadaşlarının [18] uyguladığı gibi yüksek konsantrasyonda NaCl kullanımıyla<br />
çözülmüştür. Modifiye yöntemle elde edilen genomik DNA örneklerinin agaroz jel<br />
görüntüleri ve UV spektrofotometre absorbans değerleri gerekli standartlara uygun<br />
bulunmuştur. Modifiye yöntemle elde edilen örneklerin absorbans değerleri<br />
ölçüldüğünde A260 /A280 oranının (ortalama 1.82) saf DNA değerinde olduğu<br />
hesaplanmıştır. Bu yönteme ait 7 farklı DNA örneğinin agaroz jelde verdikleri görüntü<br />
Şekil 2’de verilmiştir.<br />
56
Farklı genomik dna izolasyon yöntemlerinin satureja (<strong>labiatae</strong>) türlerinde uygulanması<br />
M A D M K Z Ç G M A D M K Z Ç G M<br />
Şekil-1 Dellaporta et.all.yöntemine göre gDNA<br />
izolasyonu sonucunda elde edilen gDNA’nın<br />
konsantrasyonunu gösterir agaroz jel fotoğrafı<br />
Şekil-2 Modifiye yönteme göre gDNA izolasyonu<br />
sonucunda elde edilen gDNA’nın konsantrasyonunu<br />
gösterir agaroz jel fotoğrafı<br />
(M: Marker DNA, A:Tokat, D:Denizli, M:Mezitler, K:Kazdağ, Z:Zeytinli,<br />
Ç:Küçükkuyu, G:Gökçeada lokalitelerine ait gDNA bantları.)<br />
Şekil 3’te 3 farklı izolasyon yöntemiyle elde edilen gDNA örneklerinin karşılaştırılması<br />
verilmiştir. (d: [14] , c: [13] , m:modifiye yöntem). Jel fotoğrafından da görüleceği gibi ilk<br />
yötemle elde edilen DNA örneği çok fazla kirlilik içermektedir. İkinci uygulanan<br />
yöntemle elde edilen DNA miktarı çok az olmaktadır. Bizim bu bitkiler için<br />
uyguladığımız yöntemle elde edilen DNA ise jelde net bir bant oluşturmaktadır. Bu da<br />
bize DNA’nın oldukça temiz ve miktarının yeterli olduğunu göstermektedir.<br />
Farklı izolasyon yöntemlerinin sonucunda elde edilen farklı genomik DNA örneklerinin<br />
RAPD reaksiyonuna uygunluğu, çok sayıda primer kullanılarak değerlendirilmiştir.<br />
Farklı yöntemlerle elde edilen DNA örnekleriyle RAPD reaksiyonu uygulaması<br />
yapılmıştır. Bu örneklerden sadece modifiye yöntem ile elde edilen DNA örnekleri<br />
PZR’ da çoğaltılabilmiştir. Çok sayıda primer kullanılarak gDNA’ nın kalitesinin<br />
değerlendirildiği bu RAPD-PZR sonuçlarının görüntülerine ait bir örnek agaroz jel<br />
fotoğrafı Şekil 4’te verilmiştir. Tüm primerlerle, tekrarlanabilirliği olan bantların<br />
oluşması bu türler için gerekli DNA izolasyon yönteminin belirlendiğini göstermiştir.<br />
57
Serap ÖZ AYDIN, Feray KÖÇKAR<br />
M d c m<br />
Şekil-3 Üç Farklı gDNA izolasyon sonucunun karşılaştırması (d: [14] , c: [13] , m:modified<br />
method, M: 1 kb DNA Standardı)<br />
bp<br />
1000<br />
1500<br />
500<br />
bp<br />
10000<br />
8000<br />
6000<br />
5000<br />
4000<br />
3500<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M<br />
Şekil-4 OPB-08 Primerinin RAPD-PZR sonucu oluşan bantlarını gösterir agaroz jel<br />
fotoğrafı<br />
(M:1 kb DNA Standardı, 1:S.wiedemanniana , 2:S.cuneifolia, 3:S.parnassica<br />
subsp.sipylea, 4:S.icarica, 5:S.pilosa, 6:Satureja sp.1, 7:Satureja sp. 2, 8:Satureja sp.3)<br />
Bu çalışma ile Satureja cinsine ait türlerin DNA izolasyonunda, diğer yöntemlere göre<br />
daha az miktarda kimyasal gerektiren ve kolay uygulanabilen bir genomik DNA<br />
58
Farklı genomik dna izolasyon yöntemlerinin satureja (<strong>labiatae</strong>) türlerinde uygulanması<br />
izolasyon yöntemi belirlenmiştir. Bu yöntem, ayrıca uçucu yağ ve diğer sekonder<br />
metabolitler açısından zengin diğer Labiatae türlerinin DNA izolasyonu için de<br />
kullanılabilir.<br />
Kaynaklar<br />
1. P.H.Davis, Flora of Turkey and the East Aegean Islands, (1982), Vol.7,p 314,<br />
Üniversity Press, Edinburgh.<br />
2. Başer K.H.C., “Essantial oils from arn,natik plants which are used as herbal teaın<br />
Turkey”, Flavours, Fragrances and Essantial Oils.Proceeding of the 13<br />
thInternational Congress of Flavours, Fragrances and Essantial Oils, İstanbul,<br />
Turkey(1995)<br />
3. Tümen, G., Kırımer, N., Başer, K.H.C., The essential oils of Satureja L.occurring in<br />
Turkey, Proceeding of the 27 th.international symposium on essantial oil, (Franz,<br />
C.H.,Mathe, A. And Buuchbauer,G.,EDS.) Allured Publishing Corporation,<br />
ViennaAustria, pp.250-254(1997).<br />
4. Başer, K.H.C., Tümen, G., Satıl, F., Kırımer, N. “Comparative Morphological and<br />
Chemical Studies on Satureja Species From West Anatolia” Second Balkan<br />
Botanical Congress (SBBC), p. 129-132, Ed. By Neriman Özhatay, İstanbul –<br />
Turkey. 14-18 May (2000)<br />
5. Lamaison, J.L., Petitjean-Freytet, C., Duband, F., Carnat, A.P.,”Rosmarinic Acid<br />
Content and Antioxidant Activity in French”, Fitoterapia, 62, 2:166-171(1991)<br />
farmasotik aktivite)<br />
6. Müller-Riebau F., Beger B. And Yegen o., “Chemical composition and fungitoxic<br />
properties to phytopathogenic fungi of essantial oils selected aromatic plants<br />
growing wild in Turkey”, J. Agric. Food Chem. 43, 2262-2266(1995)(antimkrobial)<br />
7. Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski & S.V. Tingey, 1990.<br />
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful genetic markers<br />
Nucl. Acids. Res. 18:6531-6535<br />
8. Welsh J.,Mc Clelland M (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary<br />
primers.Nucl. Acid Res 19:303-306.<br />
9. Southern EM, “Detectionof specific sequences among DNA fragments separated by<br />
gel electrophoresis”. J.Mol.Biol., 144:395-404(1975).<br />
10. Aljanabi, S.M., Forget, L., Dookun, A., “An Improved and Rapid Protocol for the<br />
Isolation of Polysaccharide and Polyphenol Free Sugarcane DNA” Plant Mol.<br />
Bio.Repor. 17:1-8(1999).<br />
11. Porebski S., Bailey L.G. and Baum B.R.,” Modification of a CTAB DNA extraction<br />
protokol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components”<br />
Plant Mol. Biol. Reptr. 15:8-15(1997).<br />
12. Doyle J.J.and Doyle J.L. “A rapid DNA isolation procedure from small quantities of<br />
fresh leaf tissue” Phytochem Bull19:11-15(1987)<br />
13. İncirli, A., Bilgiç, H., Akkaya, M. S., "Assessment of Polymorphic AFLP Markers<br />
in Triticum durum and Aegilop sp. ", Turk J. Biol. 25, 291-299 (2001).<br />
14. Dellaporta, S. L.,Wood, J., Hicks, J.B., “A Plant DNA Mini Preparation Version II”,<br />
Plant Molecular Biology Reporter, Voll 1, (1983) ,.pp:19.<br />
15. Pich, U. And Schubert, I., Minipep Method For İsolation Of DNA From Plants With<br />
A High Contentof Polyfenols ",Nüc. Acid. Res.,21, 3328 (1993).<br />
16. Başer K.H.C., Özek T.,Kırımer N. And Tümen G.,“A Comparative Study of The<br />
Essantial Oils of Wild and Cultivated Satureja hortensis”, J.Essent.Oil Res.(İn press)<br />
59
Serap ÖZ AYDIN, Feray KÖÇKAR<br />
17. Weishing K., Nybom H., Wolf K and Meyer W., “DNA Isolation And Purification.<br />
İn:DNA Fingerprinting İn Plants And Fungi, pp 44-59 CRC Press, Boca Raton,<br />
Florida (1995).<br />
18. Do N. and Adams R.P. “A Simple Technique For Removing Plant Polysaccharide<br />
Contaminants From DNA” BioTechniques 10: 163–166(1991).<br />
19. Sambrook, J. ,Russell, D.W., Maniatis, T, Molecular Cloning A Laboratary Manual.<br />
2ndedition Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).<br />
20. Öz Aydın S. Bazı Satureja Türlerinin Morfolojik, Moleküler ve Sistematik Yönden<br />
Değerlendirilmesi, Doktora Tezi, <strong>Balıkesir</strong> <strong>Üniversitesi</strong>, <strong>Fen</strong> <strong>Bilimleri</strong> <strong>Enstitüsü</strong>,<br />
Biyoloji Eğitimi Anabilim Dalı, <strong>Balıkesir</strong>, (2004).<br />
60