Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri - Yakut Akyön Yılmaz

Termofilik (42-43 0 C) (C. fetus hariç) Mikroaerofilik (düşük oksijen) ve kapnofilik(artmış karbondioksit) (5%O 2 ,10%CO 2 ,85%N 2 ) İnsanlara bulaş: kontamine gıdalarla özellikle kümes hayvanlarının ürünleri pastörize edilmemiş süt veya işlenmemiş su ile olur

• • – – – – • –

• Azaltılmış O 2 (5% O 2 ) eklenmiş CO 2 (10% CO 2 )• 42 ℃ (seçicilik amacıyla)• Bir çok seçici besiyeri kullanılabilir• İki tip koloni:☺ sulu ve yayılan☺ yuvarlak ve dış bükey

• • • • •

• • • • • – –

•

•

• – • – – • – – – –

® ®

• – –

250 suş

C. jejuni (n=85) C. coli (n=12)AntibiyotikDuyarlı (%) Dirençli (%) Duyarlı (%) Dirençli (%)Meropenem 85 (% 100) - (% 0) 12 (% 100) - (% 0)Eritromisin 75 (% 88.2) 10 (% 11.8) 10 (% 83) 2 (% 17)Gentamisin 81 (% 95.3) 4 (% 4.7) 12 (% 100) - (% 0)Doksisiklin 75 (% 88.2) 10 (% 11.8) 12 (% 100) - (% 0)Siprofloksasin 41 (% 48.2) 44 (% 51.8) 6 (% 50) 6 (% 50)Sefalotin - (% 0) 85(% 100) - (% 0) 12 (% 100)Nalidiksik asit 44 (% 51.8) 41 (% 48.2) 2 (% 17) 10 (% 83)

2007-2009 YILLARINDA DIŞKI KÜLTÜRLERİNDEN İZOLE EDİLENCampylobacter TÜRLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİB. Levent, R. Kayalı, H. Bayrak, M. Alageyik, B. Esen48 Campylobacter suşuSiprofloksasin25 dirençli, 5 orta dirençliEritromisin3P-75

Trends in antimicrobial susceptibility of Campylobacterisolates in Poland (2000-2007).Rozynek E, Dzierzanowska-Fangrat K, Szczepańska B, Wardak S, Szych J, Konieczny P, Albrecht P,Dzierzanowska D251 Campylobacter suşu, çocuklardan 2000 - 2007siprofloksasin (%49.5 C. jejuni -% 51.3 C. coli),tetrasiklin(%17.5 -%18.0)ampisilin(%13.2 - %10.2)Makrolidlere duyarlıÇoklu antibiyotik direnci %5.1 2000-2003%34.6 2004-2007Pol J Microbiol. 2009;58(2):111-5.

• • •

• Metronidazol• Klaritromisin• Amoksisilin• Tetrasiklin• Kinolonlar• Furozolidonlar• Ketolidler• Rifamisinler

H. pylori’de antibiyotik duyarlılık testleriFenotipikKültürden-Agar dilüsyon-E-test-Disk difüzyonGenotipikBiyopsi ve Kültürden

Primer izolasyonBHI agar, Columbia agar, Brucella agar vb.+Vankomisin 10mg/LTrimetoprim 5mg/LSefzulodin 5mg/LAmfoterisin 5mg/L+% 7 – 10 at kanı veya koyun kanı35-37 0 C’de 5-7 gün, mikroaerofil koşullarda( %8-10 CO 2 , %5-6 O 2 , %80-85 NO 2 , %98 nem),inkübe edilir.

Antibiyotik duyarlılık testleri -70’de saklanmış olan H. pylori suşları antibiyotikiçermeyen zengin besiyerinde çoğaltılır. Primer izolasyon sonrasında maksimum 3 defapasaj yapılabilir. Mc Farland 0.5’e uygun süspansiyon yapılır,besiyerine L şeklindeki öze ile yayılır. 3 günlük kültürden antibiyotik duyarlılık testiuygulanır.

Kanlı agarda üç günlük kültür Kültürdeki H. pylori suşları sarmalformda olmalı, kokoid olmamalı.

CLSI standartlarına göreuygulanacak agar dilüsyon testiBesiyeri: Mueller – Hinton agar (MHA) + % 5koyun kanıİnokulum: SF içinde hazırlanmış 2 McFarland’a (1 X 10 7 -1 X 10 8 CFU/ml) uygun bulanıklıktasüspansiyondan, 1-3 μL damla,antibiyotik içeren agar dilüsyon plaklarınaİnkübasyon:35 0 C’de 3 gün, mikroaerofilikatmosfer

CLSI standartlarına göreuygulanacak agar dilüsyon testiKalite kontrol için kullanılacak;standart suş: H. pylori ATCC® 43504H. pylori NCTC® 11637MİK aralıkları: μg/mlAmoksisilin: 0.016 – 0.12Klaritromisin: 0.016 – 0.12Metronidazol: 64 – 256Tetrasiklin: 0.12 – 1.0

Avrupa H. pylori çalışma grubununagar dilüsyon testi için önerileriBesiyeri: Mueller – Hinton agar (MHA) + % 5koyun kanı veya at kanıİnokulum: SF içinde hazırlanmış 4 McFarland’a (1 X10 9 CFU/ml) uygun bulanıklıktasüspansiyondan, 1-3 μL damla,antibiyotik içeren agar dilüsyon plaklarınaİnkübasyon:37 0 C’de 3 gün, mikroarofilik ortam

Avrupa H. pylori çalışma grubununagar dilüsyon testi için önerileriKalite kontrol için kullanılacak;standart suş: H. pylori NCTC 11637H. pylori CCUG 38770H. pylori CCUG 38771H. pylori CCUG 38772

Agar dilüsyon testi FDA onaylı bir antibiyotik duyarlılıktesti Çok miktardaki H. pylori suşununantibiyotik duyarlılığını çalışmak içinideal ve standart bir yöntem Uygulaması zor Kontaminasyon Mikroaerofil

E-testBesiyeri: Mueller – Hinton agar (MHA) + % 5kanColumbia kanlı agarİzosensitest kanlı agarİnokulum: Buyyon içinde hazırlanmış 3 McFarland’a uygunbulanıklıkta süspansiyondan,tüm agar yüzeyine yayılırUygulama: 90 mm plaklara bir tek stripİnkübasyon:35 0 C’de 3 gün, mikroarofilik ortam

E-test FDA onayı olamayan bir antibiyotikduyarlılık testi BSCA (The British Society for Antimicrobial Chemotherapy) EHSG (European Helicobacter Pylori Study Group) Tek tek olgularda H. pylori suşununantibiyotik duyarlılığını çalışmak için idealbir yöntem Uygulaması kolay Pahalı

H. pylori’de klaritromisindirencini saptamak içinmoleküler testler23S rRNA gen amplifikasyonu gerekenler- Sequencing, pyrosequencing- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)- OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)- DEIA (DNA Enzyme Immunoassay)- INNO-LiPA (Line Probe Assay)- 3’ mismatch PCR- PHFA (Preferential Homoduplex Assay)- Real-time PCR FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-MCA(Melting Curve Analysis)- DG-DGGE (Double Gradient-Denaturating Gradient GelElectrophoresis)Amplifikasyon gerekmeyen- FISH assay (Fluorescence in situ Hybridization assay)

Real-time PCR FRET MCA

Metronidazol direnci• Avrupa %14.9-40• ABD %22-37• Brezilya %53• Meksika %76• Asya %9-77• Türkiye %47.7

Klaritromisin direnci• Avrupa %1.7-27.5• ABD %4-15• Brezilya %9.8• Meksika %25• Asya %1-13.8• Portekiz %39.4 (çocuk)• Türkiye %27.6-30.9

Amoksisilin direnciAvrupa %0.2- 0.6Kore %8.8-18.8Kim et al. J Clin Gastroenterol 2006; 40: 683-687Kim et al. Int J Ant Agents 2006; 28: 6-13

Tetrasiklin direnciAvrupa %0-10

Florokinolon direnci• Avrupa %3.9-20

June 1999- June 200124.2%January-June 2001 37.5%

Helicobacter resistance: amoxicillin,clarithromycin,tetracycline,metronidazole and rifampicin by agar dilution methodÖ. Karamerlioğlu, S. Çolakoğlu, E. Yula, F. Köksal, E. NazlıcanApril 2002-April 2005 386 strain• No resistance to amoxicillin, tetracycline, rifampicin.• Metronidazole (2002) 34%, (2003) 37.2%, (2004) 33.8%.• Clarithromycin (2002) 14.9%, (2003) 17.4%, (2004) 18.1%.

27.6%Clarithromycin resistance in H. pylori by agar dilution and E-testAcademic Gastroenterology Journal 2005Peren H. Bağlan, Gülendam Bozdayı, Muhip Özkan, Ali Özden77 patientAD 55.8 %E-test 54.5%

Agar dilution 28 strains (Konya,Turkey- Fatma Kalem)Clarithromycinnumber(%)Metronidazolenumber(%)Amoxicillinnumber%)Sensitive 20(71.5) 17(60.8) 28(100)Resistant 8(28.5) 11(39.2) 0(0)Helicobacter pylori antibiotic resistance in Iran.120 strainAccording to modified disc diffusion test,1.6% to amoxicillin,16.7% to clarithromycin,57.5% to metronidazole, andno resistance to tetracycline. sWorld J Gastroenterol. 2005 Oct 14;11(38):6009-13.Mohammadi M, Doroud D, Mohajerani N, Massarrat S. Biotechnology Research Center,Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran.

Monitoring of Helicobacter pylori resistance to clarithromycinby real-time PCR assay in gastric biopsy specimens over a 4-year period in TurkeyM. Yalınay Çırak, D. Engin, S. Ünal, T. Karakan, s. Türet, Ş.Dumlu (2007)2003 % 16.32004 % 26.62005 % 29.62006 % 422007 % 50 (ilk 5 ay)

RETROSPECTİVE EVALUATİON OF HELİCOBACTER PYLORİCLARİTHROMYCİN RESİSTANCE İN CHİLDREN BY REAL-TİME PCR

The prevalence of primary and secondary Helicobacter pylori resistance toclarithromycin and probable contributing cofactors: data from southeastern Anatolia.Tüzün Y, Bayan K, Yilmaz S, Dursun M, Ozekinci T. (Diyarbakır)Hepatogastroenterology. 2008 Jan-Feb;55(81):289-93Primary resistance to clarithromycin 16.4 %Clarithromycin resistance rates :Düzce, Turkey 30 %Ayşe Demet Kaya, Elif Öztürk, Yusuf Akcan, Mustafa Behçet , Esra Karakoç,Mihriban Yücel, Müge Mısırlıoğlu, Serdar TuncerCurrent Therapeutic Research. 68:3, 2007, 151-160.

FLORESAN IN SITU HİBRİDİZASYON (FISH) VE REAL-TIME PCRYÖNTEMLERİ İLE Helicobacter pylori ENFEKSİYONU TANISI VE PRİMERKLARİTROMİSİN DİRENCİNİN DEĞERLENDİRİLMESİE. Demiray Gürbüz, Ö. Yılmaz, M. Soytürk, S Sarıoğlu, Y. Doğan, C.Gönen, İ. Şimşek30 H. pyloriFISH %22.2Real-Time PCR39.3P-71

Teşekkür ederim…