HÜCRE KÜLTÜRÜ YAZISI (1) (1)

GİRİŞ
Hücre, Robert Hooke’un 1665’li yıllarda tanımladığı küçük yapısal ve fonksiyonel ünitesini
yani canlıyı oluşturan temel yapı taşlarıdır. Gözle görülemeyecek kadar küçük olan bu yapı
canlı türüne göre farklılık göstermekle beraber değişik boyutlarda ve şekillerde olmak üzere
birçok çeşidi bulunmaktadır. Hücrelerin gösterdikleri yapı özelliklerine bağlı olarak prokaryot
ve ökaryot olmak üzere iki çeşidi bulunmaktadır. Prokaryotik hücreler sitoplazma organelleri,
nükleusu ve nükleus membranı bulunmayan, kalıtsal materyal olarak tek bir DNA molekülü
barındıran hücrelerdir. Prokaryotik hücre tipine örnek olarak bakteriler ve mavi-yeşil algler
verilebilir. Ökaryotik hücreler ise, hücre membranı ve membranla sarılmış organelleri
bulunan ve gelişmiş yapılar ihtiva eden hücre tipleridir. İnsanlar, hayvanlar ve bitkiler
ökaryotik hücre tiplerine örnek olarak verilebilir. (hücre nedir) Ökaryotik hücrelere
karakteristik olarak baktığımızda sitoiskelet oluşumunu sağlayan filament ve tübüllerden
oluşan bir sitemi bulunmaktadır.
Yaşamın temel, yapısal ve fonksiyonel birimini göstermekte olan hücreler, karakterizasyon
parametrelerine göre değerlendirildiğinde morfolojilerine göre yani sahip oldukları şekil ve
görünümleri baz alınarak 3 alt kategoriye (fibroblast,lenfoblast, epitel benzeri) ayrılmaktadır.
Lenfoblast benzeri (lenfoblastik) hücreler süspanse bir gelişim göstermekte ve küremsi şekil
ile karakterize edilirler. Epitelyal benzeri hücreler, diğer hücre morfolojilerine göre daha
düzenli boyutlarda olup çokgen şeklindedirler ve substrata tutunma geçekleştirerek büyüme
gösterirler. Fibroblastik hücreler (fibroblast benzeri) ise bipolar yada multipolar bir forma
sahip, adherent(yapışma) hücre özelliği göstermekte substrata tutunarak çoğalım
gerçekleştirmektedirler. Fibrobilastik hücrelerin, hücre dışı(ekstrasellüler) matriks üretimi,
özel mikroçevre oluşturarak hücreler arası iletişim(lenfoif dentritik hücrler) sağlaması,
endokrin aktivite, bariyer oluşturarak bağışıklıkla ilgili olmayan savunma(perinöriyal
hücreler) ve mekanik destek sağlamak gibi işlevleri bulunmaktadır. Mezenkimal hücrelerden
köken almakla beraber aktif ve inaktif olmak üzere iki ayrı formda bulunabilmektedir. Aktif
fibrolastlar genellikle kollajen demetlere yakın kısımlarda yer almakta ve yassılaşmış bir
yıldız şekline sahiptirler. İnaktif fibroblastlar ise aktif olanlara nazaran daha küçük ve oval
hücrelerdir.
Şekil1: Lenfoblast benzeri hücreler

Şekil 2: Substrata tutunmuş ve uzamış formda bulunan fibroblast benzeri hücreler.
Şekil 3: Epitelyal benzeri hücreler.
1.HÜCRE KÜLTÜRÜ
Hücre kültürü, tıp alanındaki gelişmeler ile tedavi metodlarını zenginleştirmek, deney
hayvanlarının kullanımını azaltmak ve kanser(!), gen haritalama, toksik maddelerin
incelenmesi gibi birçok alanda kullanılabilirliğinden dolayı büyük bir öneme sahiptir ve
hazırlanması titizlik isteyen çalışma methodudur. Hayvan yada bitkilerden izole edilen
hücrelerin yani canlı hücrelerin ait oldukları organizma dışında, in vitro ortamlarda
büyütülmesi işlemi hücre kültürünü ifade etmektedir. Günümüzde gerçekleştirilen hücre
kültürü çalışmalarına monoklonal antikor, tümör aşıları, hücre içi metabolik aktivitelerin
aydınlatılması, kalıtsal materyallerin replikasyonunun araştırılması ve çeşitli ilaçların hücre
siklusuna etkisinin incelenmesi de örnek olarak verilebilir.
Hücre kültürü in vitro ortamlarda gerçekleştirilmekte olup hücrelerin canlı organizmada
bulunduğu koşullar yani canlı ortamda yaşıyormuş gibi doğal yaşam şartları sağlanmaktadır.
Memeli hücreleri 37 0 C iken böcek hücrelerinin 28 0 C’de yaşaması her canlı tipinin yaşam
ortamının farlılık gösterdiğinin bir belirtecidir. Memeli hücreleri belirli besi ortamına(amino
asitler,glikoz,tuzlar,vitaminler), uygun pH (7.4), büyüme faktörleri (FBS- fetal bovine
serum),) sıcaklık(37 0 C), nem ve CO2 (%5) gibi çoğalması için gerekli olan ihtiyaçlarının
bulunduğu ortamlarda muhafaza edilmektedir.
Hücre kültürüyle gerçekleştirilen kompleks çalışmalara (kanser, metabolik aktiviteler, vb.) ,
protein ve nükleik asit izolasyonları, mikroskobik incelemeler gibi daha basite indirgenmiş
çalışma örnekleri verilebilmekte ve bunlar için biyolojik materyali sağlamaktadır.

İlk olarak hücre kültürü, kurbağa sinir hücrerinin, daha sonra ise tavuk kalp hücrelerinin
incelenmesiyle kullanılmaya başlanmıştır. İnceleme çalışmalarının yaygınlık kazanmasına
bağlı olarak çok sayıda canlı ve hücre çeşiti için hücre kültürleri geliştirilmiştir ve virüs bilimi
olarak bilinen viroloji alanındaki uygulamalar için 1940’lı tarihlerde kullanılmaya
başlanmıştır. 1954 yılında Nobel Tıp ödülünün alındığı çocuk felci üzerine geliştirilmiş olan
aşılar da hücre kültürü çalışmalarına verilebilecek en önemli örnekler arasında yer almaktadır.
Bu ödüllü çalışmadan daha önce 1951’li yılların başlarında ilk kez servikal karsinomalı (
rahim kanalı kanseri-HeLa hücreleri) hastadan alınan insan kanser hücrelerinin kültürü
hazırlanmıştır. Kanser hücreleri, sonsuz, anormal ve kontrol dışı bölünme ile çoğalan agresif
hücrelerdir. HeLa hücre seriside günümüzde kanser çalışmalarında sıklıkla kullanımı devam
etmekte olan ölümsüz hücre hattı olarak isimlendirilmektedir.
Şekil 4: HeLa (rahim kanalı kanser hücreleri)
2.KÜLTÜR VE ÇOĞALMA POTANSİYELİNE BAĞLI HÜCRE TİPLERİ
2.1. Kültür Tiplerine Göre Hücreler
2.1.1. Primer Hücre Kültürü: Doku ve organ parçalarının hücre kültürü hazırlamak
amacıyla kullanılmasına eksplant denilmektedir. Ekspalntın doku veya organlardan tripsin ile
ayrıştırılmasının ardından in vitro şartlarda kültür kaplarına gereçekleştirilen ilk ekimlerine
primer kültür denir. İn vitro koşularda çoğalma gerçekleştirirken in vivo ortamda sahip
oldukları genotipik ve fenotipik özelliklerini büyük oranda koruyabilmektedirler.
Şekil 5:Primer hücre kültüe basamakları

2.1.2. Sekonder Hücre Kültürü: Maksimum 50 defa pasajı gerçekleştirilebilen ve normal
diploid kromozom sayısına sahip hücrelerden elde edilerek hazırlanan kültürlere
denilmektedir.
2.1.3. Sürekli Hücre Kültürü: Kromozom sayıları sabit olamamakla beraber genel olarak
kanser hücrelerinin kültüre edilmesiyle hazırlanmakta olup aynı zamanda laboratuvar
ortamında değişim gösterebilmektedirler. Bu kültüre bilim dünyasında ölümsüz hücreler
olarak kabul edilen ve günümüzde kanser çalışmalarında halen kullanılmakta olan insan
serviks karsinoma (HeLa) hücreleri örnek verilebilir.
2.2.Büyüme Tiplerine Göre Hücreler
2.2.1. Adherent Hücreler: En bilinen örnekleri arasında bağ dokusu ve fibroblast hücreleri
verilen, kültür kabına tutunma bağımlılığı ile kültüre edildikleri flask yada diğer kültür
kaplarına yapışarak monolayer (tek tabaka) halinde gelişim gösteren hücrelerin tamamını
kapsamaktadır. Split edilmek istendiğinde enzim(tripsin) yada mekanik kuvvet (kazıma)
yardımıyla kültür kabından (flask, petri, well plate, vb.) kaldırılarak, besiyeri ile santrifüj
sonrasında süspanse form kazandırılmış olup diğer flasklara aktarılmaktadır.
Şekil 6: Monolayer büyüme gösteren hüceler
2.2.2. Süspanse Hücreler : Adherent hücrelerden farklı bir gelişim gösteren bu hücreler,
tutunma bağımlılığı olamayan, kültür kaplarına yapışma eğiliminde bulunmadan çoğalım
göstermektedirler. Başka flasklara aktarılmak istediğinde, herhangi bir enzime veya mekanik
uygulamaya ihtiyaç duymadan aktarım sağlanabilmektedir. Bulunduğu ortamla bağlantı
kurmadan çoğalabilen kan hücreleri örnek olarak verilebilmektedir.
Şekil 7: Yüzeye tutunmadan, besi ortamında askıda büyüyen hücreler

Tablo 1: Adherent- süspanse hücre karşılaştırması
Süspanse Hücreler
Tutunma bağımlısı olmayan tüm hücre
hatlarına uygun,
Kültürün seyreltilmesi büyümeyi teşvik
edecek şekilde etkilemektedir.
Hücrelerin konsantrasyon seviyeleri büyüme
sınırını belirlemektedir.
Adherent Hücreler
Başta primer(birincil) kültür tipi dahil
olmakla beraber çoğu hücre tipi için uygun,
İnverted mikroskopta görsel gözlemlenmesi
kolay,
Yüzey alanı büyüme oranlarını
sınırlamaktadır.
3.HÜCRE KÜLTÜRÜ LABORATUVARI
Hücre kültürü laboratuvarında yapılan eylemi ciddiye almak ve güvenlik uyarılarına dikkat
kesilmek olmazsa olmazdır. Bu ortamda meydana gelebilecek dikkatsizlikler ve kural ihlalleri
ciddi sağlık problemlerine yol açabileceğinden, kişi sadece kendi güvenliği için değil
laboratuvarda çalışan başka insanları da tehlikeye atmaktan sakınmalıdır. (Hücre kültürü
çeviri)
3.a.Aseptik teknikler
Aseptik teknikler kültür ortamının stabil olmasını sağlamak, mikroorganizmaların ve çeşitli
bulaşkanların kontaminasyonunu önlemek amacıyla gerçekleştirilen teknik uygulamalardır.
Bir hücre kültüründe yapılan çalışmaların en sağlıklı şekilde gerçekleştirilebilmesi için
kontaminasyon riskinin en aza indirgenmesi şarttır. Kültür ortamının kontaminasyona
uğraması steril olmayan solüsyonlar ve pipet uçları, düzenli olarak sterilize edilmeyen
kaynaklanmaktadır. Aseptik tekniğin unsurları steril bir çalışma alanı, kişisel hijyen, steril
reaktifler, medyum ve steril kullanımdır. (Hücre kültürü çeviri).
3.b.Steril Çalışma Alanı
Havadaki toz parçacıklarından ve partiküllerden (öksürme, hapşırma ve sporlar vs.)
korunmanın en iyi ve elverişli yolu biyogüvenlik kabinlerinin kullanılmasıdır. Steril bir
çalışma ortamı için;
• Biyogüvenlik kabinleri kapı ve pencerelerden, laboratuvardaki personel geçiş trafiğinden en
az şekilde etkilenebilecek bir yere kurulmalıdır.
• Çalışma ortamı olabildiğince düzenli olmalı ve depolama alanı olarak kullanılmamalıdır.
• Ortam çalışmadan önce ve sonra düzenli olarak %70 etanol ile dezenfekte edilmelidir.
Özellikle herhangi bir solüsyonun dökülmesi halinde alan temizlenmelidir.
• Hücre kültürü kabini içerisinde ateş ile çalışmak önerilmemektedir.
• Biyogüvenlik kabininin yapılan çalışmada sürekli kapanıp açılması uygun değildir. Uzun
süre çalışılmayacaksa kapatılmalıdır (Cell culture basics).
3.c.Personel Hijyeni
Yapılacak çalışmaya başlanmadan önce ve sonra mutlaka ellerinizi yıkamanız gerekmektedir.
Ayrıca tehlikeli kimyasallardan korunmak için laboratuvar önlüğü giyilmeli ve steril
laboratuvar eldiveni takılmalıdır (Cell culture basics).

3.d.Steril Ajanlar ve Medyumlar
Ticari olarak satın alınan reaktifler ve medyumların sterilizasyonu sağlanmış bir şekilde gelir.
Fakat bu malzemelerin çalışma esnasında kirlenebilmeleri kuvvetle muhtemeldir.
Sterilizasyonundan emin olmadığınız malzemeleri laboratuvarda otoklav veya steril filtre
cihazı kullanılarak sterilize etmek mümkündür (Cell culture basics).
3.d.1.Steril Çalışma Adımları
• Ellerinizi ve çalışma alanını sürekli %70 etanol ile silin.
• Kapları, şişeleri, flaskları vb. malzemeleri çalışma alanına koymadan önce mutlaka %70
etanol ile silin. Ayrıca dökülmelere karşı dikkat edin
• Sıvılarla çalışırken steril cam veya plastik tek kullanımlık pipet uçları kullanın. Herhangi bir
bulaşma riskine karşın her pipet ucunu bir kez kullanmaya özen gösterin ve pipetlerinizi
çalışma alanında dışarı çıkarmamaya özen gösterin.
• Şişerlerle çalışırken kapaklarını açık bırakmamaya ve açtığınız kapakları üst tarafı aşağıya
bakacak şekilde koymaya dikkat edin.
• Çalışma esnasında konuşmamaya, şarkı söylememeye ve ıslık çalmamaya özen gösterin.
• Kontaminasyonun en aza indirgenmesi için çalışmanızı olabildiğince hızlı gerçekleştirin
(Cell culture basics).
3.e.Kontaminasyon Riski
Laboratuvarda çalışırken her an konteminasyon riskine karşı dikkatli olunmalı. Bu, yapılan
çalışmaların sağlıklı sonuç alınması ve verimliliğinin maksimum düzeyde olması için şarttır.
Konteminasyon hemen her laboratuvarda temel sorunlardan biridir. Herhangi bir
konteminasyon oluşması halinde sadece laboratuvar malzemelerinin ziyanı değil aynı
zamanda büyük zaman kayıplarına da sebep olacağından yapılan çalışmanın her adımına
dikkat edilmeli ve steril çalışılmalıdır. Konteminasyonun engellenmesi için hücre kültürünün
her basamağında kullanılacak olan materyaller %70’lik etanol ile temizlenmelidir. (Hücre
kültürü çeviri)
3.1.HÜCRE KÜLTÜRÜ EKİPMANLARI
3.1.a.Biyogüvenlik Kabini (Laminar flow-Hood)
Biyogüvenlik kabinleri laboratuvarda çalışan personeli, yapılan çalışmayı ve ortamı, havadaki
toz partiküllerinden, sporlardan ve çeşitli enfeksiyöz mikroorganizmaların bulaşmasından
korumak için kullanılan bir cihazdır. Biyogüvenlik kabininin temel çalışma prensibi;
içerisinde oluşturduğu kontrollü hava akımı ile iç ortamı-dış ortamdan ayırmakta ve
kontaminasyona neden olacak moleküllerin girişini engellemeye dayanmaktadır. Kabinin iç
ortamının dış ortamdan ayrılması steril çalışma ortamının sağlanması için gereklidir.
Biyogüvenlik kabinleri steril çalışma alanı düzeylerine göre üç sınıfa ayrılır(Hücre kültürü
çeviri, Cell culture basics).

1
1
2
3
4
5
6 7 8
9 10
11
12
13
14
15
Şekil 8: Steril bir biyogüvenlik kabini içerisinde bulunan ekipmanlar
1-2: Çalışma esnasında ependorf ve falcon tüplerin yerleştirildiği steril Rek (Rack).
3-4: Steril ependorf tüpü kutuları
5: PBS
6: Tripan blue
7: DMSO
8: Steril pipet uçları
9: Pipetler (10-1000 µl)
10: Steril aspiratör uçları
11: Petri kapları
12: Falcon tüpler
13: Pipetör
14: Aspiratör hortumunun yerleştirildiği yalıtkan zemin
15: Kalem
1.Sınıf Biyogüvenlik kabini: 1. Sınıf hücre kültürü biyogüvenlik kabinleri iyi mikrobiyolojik
şartlar oluşturulduğunda laboratuvarda çalışan personele, çevreye ve yapılan çalışmaya iyi bir
koruma sağlar. (Hücre kültürü çeviri, Cell culture basics).

2.Sınıf Biyogüvenlik kabini: 2. Sınıf hücre kültürü biyogüvenlik kabinleri hücre kültürü
çalışmaları için gerekli aseptik ortamı sağlamakla beraber BSL- 1,2 ve 3 materyalleri içeren
bir iş için tasarlanmıştır (Cell culture basics).
3.Sınıf Biyogüvenlik kabini: 3. sınıf Biyogüvenlik kabinleri gaz geçirmesine engel teşkil
etmektedir ve çalışanlar için yüksek güvenlik düzeyine sahiptir(Cell culture basics).
3.1.b.İnverted (Ters) Mikroskoplar
Mikroskop 1590-1610 ylları arasında günümüz kaynaklarına göre keşfeden kişinin tam
bilinmediği, gözle görülemeyecek kadar küçük yapıların gözlemlenmesi amacıyla kullanılan
bir cihazdır. Mikroskopların çalışma alanına göre ışık mikroskobu, elektron mikroskobu ve
ters mikroskop gibi çeşitleri mevcuttur. Ters mikroskoplar kültürdeki hücrelerin gözle
görülmesi, stabil durumları hakkında hakkında fikir edinmek ve buna göre yapılacak
çalışmaya karar vermek için kullanılmaktadır. Ters mikroskoplar ışık mikroskoplarından
farklı olarak zemin alt kısmındaki objektif mercekleri, üst kısmındaki ışık kaynağı ve
yoğunlaştırıcı bulunduran mikroskop türüdür. Bazı hücreler kültür edildikten sonra kabın
tabanına tutunduklarından dolayı objektif kısmı zeminin alt kısmından okülere görüntü
sağlamaktadır. Mikroskopla çalışan personelin sağlıklı görüntü alabilmesi amacıyla
mikroskopta 4X, 10X ve, 20X gibi farklı büyütme ölçekleri yer almakta, görüntünün
netleşmesi açısından bir makrovida ve bir mikrovida, ışık şiddetinin ayarlanması için de bir
kontrol düğmesi bulunmaktadır. (Hücre kültürü çeviri).
1
3
4
2
5
7
6
Şekil 9: Ters Mikroskop
1: Oküler
2: Mikroskop gövdesi
3: Kamera
4: Işık kaynağı
5: Hareketli tabla
6: Makro-Mikro vida

7: Hassas ayarlayıcı
3.1.c.Santrifüj
Santrifüj bir karışım içerisinde farklı boyutlardaki partiküllerin ve farklı yoğunluklara sahip
sıvıların yer çekimi kuvvetine bağlı olarak yüksek hızda döndürmek suretiyle birbirlerinden
ayrılmasını sağlayan cihazdır. Hücre kültüründe santrifüj kullanmanın amacı, yapılacak işlem
için kültür kabından alınan hücrelerin diğer ortam bileşenlerinden (besiyeri, tripsin, DMSO
gibi) ayrılmasını sağlamaktır. Santrifüjün yüksek hızda çalıştırılması hücrelere zarar
vereceğinden işlem sırasında hassas davranılmalıdır. (Hücre kültürü çeviri).
3.1.d.İnkübatör
Hücrelerin kültüre edilmesi için in vivo koşullara yakın ortamın sağlanması şarttır.
İnkübatörler hücrelerin büyüyebilmesi için ihtiyaç duydukları uygun ortam sağlamaktadır.
İnkübatörlerde ayarlanabilir sıcaklık, CO2 ve nem gibi belirli koşullar altında (% 5 CO2 ve
37 o C sıcaklık) hücrelerin yaşam ortamı sağlanması açısından önem arzetmektedir. Hücrelerin
canlılığını devam ettrebilmesi ve çoğalabilmesi açısından bir miktar nemin ortamda
bulunması gerekmektedir. Nem ortamdaki solüsyonların buharlaşmasını engellemektedir.
Hemen her inkübatörde nemin sağlanması için bir miktar saf suyun bulunduğu bir kap
bulunmaktadır. Hücreler in vivo ortamda bulundukları dokuya göre değişkenlik göstermekle
beraber belirli pH düzeylerinde varlıklarını sürdürmektedirler. Ayrıca in vivo ortamda
hücrelerin yapısal ve fonksiyonel çalışmalarını yerine getirebilmesi, enzimlerin çalışması ve
pH düzeyinin sabit kalması açısından hücre içi ve hücreler arası tampon sistemleri
bulunmaktadır. İnkübatörlerin bu şartları sağlamasının yolu ise CO2 ’den geçmektedir. CO2
inkübatördeki hücrelerin pH seviyelelerinin değişmeye karşı direnç göstermesini
sağlamaktadır. CO2 gazının inkübatöre aktarılması için CO2 gazı tüpü bir bağlantıyla cihaza
giriş sağlamaktadır. (Hücre kültürü çeviri-fizyolojik tampon sistemleri)
Vücut içerisinde iç dengeyi sağlamak için hücre içi ve hücreler arası birden fazla tampon
sistemi bulunmakta ve birçok organ bu sistemlerde görev almaktadır. Vücutta ortamın pH,
sıcaklık vb. değişimleri hücrelerin fonksiyonlarını bozacağından çeşitli hastalıklara sebep
olmakla beraber organizmanın yaşam kalitesini düşürmekte hatta ölümcül sonuçlara yol
açabilmektedir. Vücut içerisindeki dengenin sağlanması için karbonik asit-bikarbonat
tamponu, protein tamponu ve fosfat tamponu olmak üzere üç ana tampon sistemi mevcuttur.
Şekil 10: İnsan vücudunda bulunan bikarbonat tampon sisteminde CO 2’nin önemi.

-İnkübatör Tipleri
İnkübatörler tiplerine göre kuru ve nemli inkübatörler olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Kuru
inkübatörler daha ucuzdur ve hücrelerin inkübe edildiği ortam buharlaşmayı önlemek
amacıyla kapalıdır. Kuru inkübatörlerde nemin sağlanması için bir su kabı bulunmaktadır
fakat ortam koşullarının hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak sağlamamak gibi
dezavantajları bulunmaktadır. Nemli inkübatörler kuru inkübatörlere nazaran daha pahalıdır
ancak kültür şartlarının hassasiyeti yüksek düzeylidir. Nemli inkübatörler ortam koşullarının
istenildiği gibi olmasını sağlarken personelin konrolü için ortamın durumu hakkında bilgi
vermekte ve hassas çalışma programına sahip gibi avantajları vardır.
1
3
2
4
5
6
7
Şekil 11: CO 2 İnkübatörü
1: CO2 oranı göstergesi
2: Nem oranı göstergesi
3: Sıcaklık göstergesi
4: Ortam koşulları ayarlayıcı düğmeler
5: Ortamın CO2 ihtiyacını ayarlayan CO2 tüpüne bağlı panel
6: İnkübatör rafları
7: Nemin sağlandığı karışımın bulunduğu su kabı
3.1.e.Su Banyosu
Hücre kültürü laboratuvarında kullanılan solüsyonlar genellikle 4 0 C’de saklanmaktadır.
Hücrelerin inkübatör aşamasından (37 0 C) alınıp 4 0 C’deki bir solüsyon ile muameler
edildiğinde hücreler şoka uğramakta ve strese girmektedirler. Böyle bir sorunun engellenmesi
açısından 37 o C’lik su banyoları mevcuttur. 4 o C’den alınan solüsyonlar su banyosunda yani
37 o C’de bir süre bekletilir, solüsyonlar bir miktar ısınması sağlandıktan sonra hücrelere
muamele edilir. (Hücre kültürü çeviri)

3.1.f.Depolama Alanı ve Buzdolapları
Hücre kültürü laboratuvarında kullanılan besiyerlerleri ve diğer solüsyonlar, ilaçlar, kimyasal
maddelerin oda sıcaklığında bozulmasını önlemek amacıyla bir belirli koşullar altında bir
saklama alanına ihtiyaç vardır. Buzdolapları bu ihtiyacı karşılayabilecek düzeyde bir cihazdır.
4 o C veya -20 o C saklanması gereken medyum ve çeşitli ilaçlar için buz dolapları idealdir.
Bunun dışında daha düşük sıcaklıklarda saklanması gereke materyaller vardır. Bahsedilen
materyaller için ise -80 o C’lik özel kabinler veya -196 o C’lik sıvı azot tankları
bulunmaktadır.(buzdolapları ve kültür kapları).
3.1.g.Hücre Kültür Kapları
Hücrelerin beslenmesi, birbirleriyle iletişim halinde olması ve çoğalabilmesi için farklı
büyüklüklerde hücre kültür kapları bulunmaktadır. Hücrelerin ekimi flask ve petri kapları,
inkübatöre alınması için flasklar kullanılmaktadır. Bahsedilen kültür kapları hücre
çoğalmasının en sağlıklı şekilde olmasını sağlamak açısından dip kısımları düzdür ve
hücrelerin yapışmasını sağlamak için kabın yüzeyi hücre dışı matriksi taklit eden özel sentetik
bileşenlerden üretilmiştir. Bunları dışında yapılacak işleme göre değişkenlik gösteren 6, 12,
24, 48 ve 96 kuyucuğa sahip kaplar da mevcuttur. (Hücre kültürü çeviri ve buzdolapları ve
kültür kapları).
4.HÜCRE KÜLTÜRÜNDE KULLANILAN SOLÜSYONLAR
İn vitro ortamda hücrelerin metabolik aktivitelerini sürdürerek yetiştirilebilmeleri için gerekli
normal fizyolojik mikroçevreyi yine laboratuvar ortamında hazırlanmakta olan kültür
besiyerleri(besleyici solüsyonlar) sağlamaktadır. Vitamin, aminoasit, iyon, lipid, protein ve
karbonhidrat içeriği ile hücrelerin gelişimine katkıda bulunmaktadır. Hücre tipine, hücrenin
elde edildiği organizmanın türüne ve ortama adapte olma özelliklerine göre besiyeri ihtiyacı
farklılık gösterebilmektedir. Hücrelerin besiyeri türüne bağlı olarak farklı davranışlar
gösterebilmesi göz önünde bulundurularak çalışılan hücre hattına uygun besiyeri
belirlenmelidir.
4.1.DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Media): Kültürde büyütülen hücrelerin
beslenmeleri için ihtiyaç duyulan glukoz, uygun pH, fenol, demir kırmızısı, canlılıklarının
devamı için gerekli ozmolarite, fonksiyonları için vitamin ve aminoasitleri içeriğinde
barındırmaktadır. Fakat içeriği tek başına hücrelerin gelişimi için yeterli düzeye sahip
değildir. İnsan, hamster, fare vb. birçok hücre tipi için kullanımı mevcuttur.
4.2.FBS (Fetal Bovine Serum): İçeriği tam olarak analiz edilmemiştir fakat hücrelerin kültür
kaplarına yapışmalarını ve buna bağlı olarakda çoğalma gerçekleştirebilmelerini sağlayan
zengin protein çözeltisidir. Hormonlar, hücrelerin büyümesi ve çoğalmasını gerçekleştiren
faktörler ve özellikle adherent hücreler için gerekli olan yüzeye tutunabilmeyi sağlayan
hücrelerarası matriks proteinlerini içeriğinde bulundurur. Hücrelerarası bağlantıda Ca ve Mg
iyonları önem teşkil etmektedir. FBS çözeltisi , sığır hayvanlarının fetüsünden izole edilen
kanın doğal olarak pıhtılaşması sonucunda geriye kalan bölümden hazırlanmaktadır.

4.3.Tripsin: Tripsin, proteaz enzim ailesinde yer alan bir endopeptidazdır. İşlevsel
merkezinde histidin(46.AA) ve serin (183.AA) amino asitleri yer almaktadır. Sindirim sistemi
enzimi olarakda blinen tripsin polipeptid bağlarını arjinin ve lizin amino asitlerinden kesime
uğratmaktadır. Bu enzim 24500 molekül ağırlığında pankreastan inaktif tripsinojen şeklinde
salgılanmakta ve ince barsakta tripsin yada enteropeptidaz etkisiyle aktif tripsin formu
kazandırılmaktadır. Enzimlerin sıcaklıkta yapı ve fonksiyonlarını kaybetmesi söz konusu
olduğu için saklama koşullarına dikkat edilmelidir. Tripsinin aktivitesini kaybetmemesi için
en uygun sıcaklık -20 o C’dir. Fakat tripsin uygulamasının ardından sıcaklık (37 o C) artışı
daha etkili çalışmasını sağlamaktadır. FBS’in içeriğinde tripsin inhibitörleri bulunmaktadır.
İnhibitör, enzimlerin etkinliğini durduran maddelerin geneline verilen isimdir. Bu nedenle
hücre kültürü çalışmalarında tripsisinizasyon basamağından önce ortam PBS (Ca +2 ve Mg +2
içermeyen) ile yıkanmalı ve yüzeydeki serumun uzaklaştırlması gerekmektedir.
Şekil 12: Süspanse edilmiş hücreler
Adherent hücre Tripsinizasyon ESM protein bağlantıları kopmuş
Hücreler
4.4.dPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline): İçeriğinde inorganik tuzlar (Ca +2 ve
Mg +2 ) ve su bulunmaktadır. Bu şekilde hücre metabolizmasını desteklemekte ve hücreler için
en uygun ortamı sağlamak için pH’ı tamponlamaktadır. dPBS’in hücre kültürü çalışmalarında
kullanılamasının temel amacı hücre içindeki ve dışındaki osmotik basıncı dengede tutan bir
tuz solüsyonu olmasıdır.
4.5.Freezen Medium: Hücrelerin saklanmasında, sıklıkla kullanılmakta olan sıvı nitrojende
(-186 o C) veya -80 o C‘de tavsiye edilen donma ortamında DMSO yada gliserol gibi
intraselüller kriyoprotektan bir ajan kullanılmalıdır. Hücre kültürü dondurma ortamı olan
Recovery yada Synthesizer-a-Freeze® gibi özel olarak tasarlanmış tam bir kriyoprotektan
aracılarıda kullanabilmektedir.
Recovery, hücrelerin yaşamlarını devam ettirebilmeleri ve çözdürme işlemine tabi
tutulduktan sonra hücrelerin geri kazanımı için ihtiyaç duyulan fetal sığır serumu içermektedir
ve memeli hücre kültürleri için hazır kullanımlı kriyoprezervasyon bir ortam sağlamaktadır.
Synthesizer-a-Freeze® medium, %10 DMSO içeriğine sahipken protein barındırmamakta ve
kimyasal olarak tanımlanmış olup primer hücre kültürleri için en uygun kriyoprezervasyon
ortamı oluşturmaktadır.

5-HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALARI
5.1.Çözdürme: Sonraki çalışmalarda kullanım amacı ile saklanmış, dondurulmuş olan hücre
hatlarının kullanılabilmesi için ilk olarak çözdürülmesi gerekmektedir. Çözdürme işlemi
oldukça fazla hassasiyet gerektirmekte ve en az hücrelerin dondurulma aşaması kadar önem
arz etmektedir.
5.2.Ekimi:
5.3.Hücrelerin Yeni Ortam Adaptasyonu ve Çoğalma Fazları
Hücrelerin belirli bir ortamdan alınıp başka bir ortama ekimi yapılırken son derece dikkatli
olunmalıdır. Çünkü hücreler bulunduğu ortamlara uyum sağlamak için uğraş sarfetmektedirler
ve ani değişimler hücreler üzerinde şok etkisi yaratmaktadırlar. Hücre kültürü laboratuvarında
bahsedilen bu ortam şartlarının hücreler üzerindeki etkisi hakkında fikir edinilmesi için belirli
fazlar mevcuttur. Bunlar sırası ile şöyledir;
5.3.1.Lag (Adaptasyon) Fazı
- Hücreler girdikleri yeni besi ortamına ve şartlara uyum sağlamaya çalışırlar.
- Hücre tipine göre uzunluğu değişebilir.
- Bazı durumlarda çok kısa veya hiç olmayabilir. (Lag-Log fazı)
5.3.2.Logaritmik (Log) Üreme Fazı
- Hücrelerin uyum evresinin bittiği ve büyüme, bölünme maksimum düzeyde olduğu
fazdır
- Hücreler fiziksel ve kimyasal olarak en dengeli durumdadır
- Dengeli bir büyüme görülmektedir.
- Hücrelerin yapılacak işlem için en sağlıklı olduğu evredir. (Lag-Log fazı)
5.3.3.Durgun Faz
- Hücrelerin büyümeleri durur, toplam canlı hücre sayısı sabit kalır.
- Hücrelerde üreme durur veya üreme oranı ile ölüm oranı dengededir. (Lag-Log fazı)
5.3.4.Ölüm Fazı
- Hücrelerin besin ve oksijen ihtiyacını karşılayamaması, ortamda toksik maddelerin
birikmesi ve popülasyon yoğunluğunun dengesiz konumda artmış olmasından
kaynaklanır.
- Ölüm fazından alınan hücreler sağlıksız cevap verme eğilimindedirler. (Lag-Log fazı)
-

Şekil 13: Hücrelerin yeni ortama göre durumları.
5.4.Hücre Kültürünün Rutin Bakımı
Kültüre daha yeni alınmış hücreler kültür kabına bağlanmaya başlamaktadırlar. Daha sonraki
evrede kültür kabına yerleşen hücreler uygun besiyerinin de olması ile tek tabaka olana değin
bölünmeye başlarlar. Yeteri düzeyde besin ve oksijene ulaşamayan hücrelerin bölünmesine
devam etmesi onların sağlıksız olmasına neden olur. Hücrelerin % cinsinden yüzeyi
kaplamasına konfluens adı verilmektedir. Hücreler metabolik aktivitelerini ve çoğalmalarını
gerçekleştirebilmek için besiyeri içeriğini kullanmaktadırlar. Bu yüzden hücrelere taze ortam
sağlanabilmesi için ortalama olarak 2-3 günde bir değiştirilmelidir. Bu, hücreler üzerinde
yapılacak olan çalışmanın verimli olması için gereklidir. Kültür kabında bölünen hücrelerin
monolayer (tek tabaka) düzeye ulaştıklarında bölünmeleri yavaşlar ve durur. Kanserli hücreler
ise bu durumun aksi şekilde davranırlar. Kültür kabının yüzeyini kapladıklarında çok tabakalı
olacak şekilde bölünmelerine devam ederler. (hücre kültürü çeviri).
Kültürde bulunan hücrelerin rutin durumlarını saptamak için çeşitli uygulamalar vardır. Fenol
red çözeltisinin kullanımı bu tekniklerden biri olmakla beraber, kullanışlı olması ile sıkça
tercih edilen yöntemlerden biridir. Fenol red çözeltisi bir pH indikatörüdür ve stabil durumda
(pH; 7.5) pembe renktedir. Ortamın pH’sı 7.5’ten daha düşük (asidik) bir değere indiği zaman
sarı, pH 7.5’in üstünde (bazik) bir değere çıktığı zaman ise kırmızı renge bürünür. Bilindiği
üzere hücreler degrede olduklarında hücre içerisindeki iyon vb. moleküllerin salgılanması
gerçekleşir. Atık moleküllerin ortama salınması ile ortamın pH’sı ya asidik düzeye iner ya da
bazik düzeye çıkmaktadır. Ortamda fenol red çözeltisinin bulunmasının nedeni hücre kültürü
pH düzeyinin gözle görülecek düzeye bir belirteç olmasından gelmektedir.(fenol kırmızısı)
5.5.Hücre Sayımı : Hücre kültürü çalışmalarında en önemli basamaklardan birini
oluşturmaktadır. Hücre sayımı, çalışmalarda gereksinim duyulduğu kadar hücrenin işleme
alınabilmesinde aynı zamanda da sayım yaparken kullanılan tripan blue boyası ile canlı ve
ölü hücrelerinde analizinin yapılmasında olanak sağlamaktadır. Laboratuvarlarda 0.1 mm 3
hacimde sayım yapılmasını sağlayan Thoma lamın tercih edilmektedir. Thoma lamın,
üzerinde çukur bir kısım bulundurmakta ve bu çukurun oluşturmuş olduğu iki bölmeye lamel
yerleştirildikten sonra hücreler aktarılmaktadır. Lamın sayım yapılacak alanı üzerinde kare

çizgilerle belirtilmiş bölmeler yer almaktadır. Thoma lamın İnverted mikroskobuna
yerleştirilrek genellikle 10X’de hücrelerin sayımı gerçekleştirilmektedir.Sayım işlemi
yapılırken en büyük karenin kenar çizgilerinde bulunan hücreler dışında bütün hücreler
sayıma dahil edilmektedir.
Şekil 14: Thoma lamın ve mikroskopta gözlemlenen sayım alanı
5.6.Hücre Pasajlama:
5.7.Dondurma: Hücreler dondurma işlemine tabi tutulduklarında, hızlı bir şekilde
dondurulması hücre içeriğinde (intrasellüler) buz kristalleri olşumuna bağlı olarak hücre
membranının hasarına sebebiyet vermektedir. Hızlı dondurmanın aksine yavaş
gerçekleştirilen dondurma ekstraselüler ortamda (hücre dışı) buz kristallerinin oluşumuna ve
osmotik dehidratasyona sebep olmakta böylece hücre hasarına yol açmaktadır. İntrasellüler ve
ekstrasellüler ortamda meydana gelen buz kristallerinin oluşumu, hücre bariyerlerinin
bozulması ile beraberinde getirdiği hücre ve organellerinin lizisine neden olmaktadır.
Karşılaşılabilecek böyle sorunları ortadan kaldırmak yada en aza indirgemek için DMSO yada
gliserol gibi kriyoprotektan ajanlar olarak isimlendirilen maddeler ile hücreler muamele
edilmelidir. Kriyoprotektan ajanların kullanımının temel nedeni, H2O moelküllerini bağlaması
böylece kristalizasyonu yavaşlatarak solütlerle aynı zaman aralığında kristalleşmesini
sağlamasındandır. Kriyoprotektan ajanlar intrasellüler (gliserol ve dimetilsülfoksit(DMSO))
ve ekstrasellüler (hidroksietil starch (HES)) olmak üzere iki şekilde bulunmaktadır.
DMSO hücre zarını geçebilmekte ve suda büyük dercede çözünebilmesi ile hücre içinde ve
dışında osmolaliteyi yükselterek hücre membranında bulunan tuz gradientini dengeye
getirmektedir. DMSO’nun genellikle %10 konsantrasyonda kullanılmaktadır.
Kriyoprotekatan ajanlar ile muamele edilmiş hücreler, fonksiyonlarının tamamen durduğu
kabul edilen -196C’de sıvı azot içerisinde uzun süre muhafaza edilebilmektedir. Hücrelerin
saklama sıcaklığnın -79C’nin altına düştüğü durumlarda hücre kaybına neden olmaktadır.

5.8.Saklama Koşulları: Hücre kültürü stoklanmasında kriyoprotektan ajanlar kullanılmasıyla
beraber sıklıkla tercih edilen sıvı azat tankında(-196 o C) yada -80 o C’de muhafaza
edilmektedirler. Kriyorotektan ajanlar hücre zarının ve organellerinin zarar görmesini
minimize ederken özellikle sıvı azot tankının tercih edilmesinin nedeni hücre içi metabolik
aktivitelerin tam anlamıyla yavaşlaması ve yaklaşık bir sene boyunca sağlıklı bir şekilde
saklanabilmesi için uygun olmasıdır.