Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
0,1 g AEC rozpuścić w 25 ml dwumetyloformamidu. 3,35 ml roztworu AEC uzupełnić do 50 ml<br />
0.1 M buforem octanowym pH 5,2. Roztwór przesączyć. TuŜ przed reakcją zmieszać 10 ml roztworu<br />
AEC i 10 µl 30% nadtlenku wodoru (H2O2).<br />
G) Bufor do homogenizacji tkanki – 50 mM bufor fosforanowy pH 7,0 zawierający 5 mM βmerkaptoetanol<br />
(17,5 μl/50 ml buforu)<br />
Polimeryzacja Ŝelu<br />
WYKONANIE<br />
A) Przygotowanie płytek do polimeryzacji Ŝelu: płytki odtłuścić, dokładnie wymyć i wysuszyć.<br />
ZłoŜyć razem 2 płytki (jedna krótsza), uszczelnić i spiąć ściskaczami do papieru. Ustawić pionowo.<br />
Przygotować dwa komplety płytek – jeden do wykrywania aktywności <strong>peroksydaz</strong>y,<br />
drugi do wybarwienia <strong>białek</strong>.<br />
B) Polimeryzacja Ŝelu rozdzielającego 8% – w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 2 ml<br />
roztworu IA, 2,5 ml roztworu IB, 1,25 ml roztworu IC, 1,25 ml roztworu ID i 3 ml wody.<br />
Wszystkie składniki dobrze wymieszać i wlać ostroŜnie między dwie płytki przy pomocy pipety,<br />
do wysokości 2,5 – 3 cm od górnej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię Ŝelu ostroŜnie<br />
nawarstwić około 100 μl wody (dostęp tlenu utrudnia polimeryzację) i całość pozostawić<br />
do spolimeryzowania (30 – 40 minut). Usunąć wodę znad spolimeryzowanego Ŝelu przy pomocy<br />
bibuły, uwaŜając by nie uszkodzić powierzchni Ŝelu.<br />
C) Polimeryzacja Ŝelu zagęszczającego 4% − w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 0,5<br />
ml roztworu IIA, 1,25 ml roztworu IIB, 0,625 ml roztworu IIC, 0,625 ml roztworu IID i 2 ml<br />
wody. Dokładnie wymieszać składniki i wlać mieszaninę między dwie płytki. OstroŜnie wło-<br />
Ŝyć grzebień tak aby nie pozostały pod nim pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił wycięcia<br />
miedzy zębami. Pozostawić Ŝel do polimeryzacji.<br />
Próby do elektroforezy<br />
A) Homogenizacja tkanki − odwaŜyć po 1 g koleoptyli owsa (etiolowanych oraz naświetlanych),<br />
zamrozić w ciekłym azocie i homogenizować w buforze do homogenizacji w stosunku 1:2 (1g<br />
tkanki:2 ml buforu). Homogenaty odwirować w mikrowirówce przez 5 min.<br />
B) Przygotowanie prób – do oznaczonych probówek Eppendorfa napipetować po 200 μl odpowiedniego<br />
supernatantu po wirowaniu, dodać po 25 μl roztworu błękitu bromofenolowego zawierającego<br />
glicerol.<br />
6