Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
Rozdział białek metodą PAGE - zymogram peroksydaz
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
ANALIZA PORÓWNAWCZA IZOFORM PEROKSYDAZY W KOLE-<br />
OPTYLACH OWSA METODĄ ELEKTROFOREZY W śELU<br />
POLIAKRYLOAMIDOWYM. WYBARWIANIE ROZDZIELONYCH<br />
BIAŁEK COOMASSIE BRILLANT BLUE-G250<br />
WSTĘP<br />
Powstawanie nadtlenku wodoru i aktywnych form tlenu w tkankach roślinnych<br />
Głównym źródłem H2O2 w roślinach jest fotooddychanie, reakcja Mehlera i indukowana<br />
przez protony dekompozycja anionów nadtlenkowych O2 *- , β-utlenianie kwasów tłuszczowych w<br />
peroksysomach oraz reakcje związane z obroną przed patogenami.<br />
W fotooddychaniu do rybulozo-1,5-bisfosforanu zostaje przyłączony tlen w wyniku czego<br />
powstaje fosfoglikolan i 3-fosfoglicerynian. Specyficzna fosfataza odszczepia resztę fosforanową<br />
od fosfoglikolanu, a powstający glikolan po przedostaniu się do peroksysomów zostaje utleniony<br />
do glioksalanu przez oksydazę glikolanową zgodnie z równaniem:<br />
glikolan + O2 → glioksalan + H2O2<br />
W mitochondriach lub chloroplastach tylko jeden elektron redukuje O2 – powstaje anion nadtlen-<br />
kowy O2 *- . W chloroplastach anion nadtlenkowy powstaje głównie w tzw. reakcji Mehlera, która<br />
polega na redukcji O2 przez centrum Ŝelazowo-siarkowe Fx fotosystemu I. W wyniku uprotono-<br />
wania anionu nadtlenkowego tworzy się rodnik wodoronadtlenkowy HO2 * , który działa destruk-<br />
cyjnie na lipidy, kwasy nukleinowe i białka. Dwa rodniki wodoronadtlenkowe mogą reagować ze<br />
sobą, w wyniku czego powstaje H2O2:<br />
HO2 * + HO2 * → H2O2 + O2<br />
Anion nadtlenkowy moŜe być usuwany takŜe przez dysmutazę nadtlenkową, enzym, który katali-<br />
zuje przekształcenie dwóch anionów nadtlenkowych w H2O2 i O2:<br />
O2 *- + O2 *- + 2H + → H2O2 + O2<br />
W peroksysomach, w przeciwieństwie do mitochondriów, reakcja β-utleniania długołańcucho-<br />
wych kwasów tłuszczowych zachodzi z udziałem oksydazy Acylo-CoA zgodnie z równaniem:<br />
C16 Acylo-CoA + O2 → trans-∆ 2 enolo-CoA + H2O2<br />
Na ryc. 1 pokazano przybliŜone ilości H2O2 produkowane w chloroplastach, mitochondriach i pe-<br />
roksysomach w warunkach dobrego nasłonecznienia i optymalnej temperatury.<br />
1
Ryc. 1. Produkcja nadtlenku wodoru w komórce roślinnej (wg Foyer CH, Noctor G Physio-<br />
logia Plantarum 2003; 119: 355-364).<br />
RóŜne formy aktywnego tlenu, ale zwłaszcza anion nadtlenkowy O2 *- i H2O2, są potrzebne do li-<br />
gnifikacji, a ponadto funkcjonują one jako cząsteczki sygnałowe w reakcjach obronnych przeciw<br />
patogenom. Jednak większość nadtlenku wodoru i innych form aktywnego tlenu musi zostać usu-<br />
nięta enzymatycznie i nieenzymatycznie (antyoksydanty). W enzymatycznym usuwaniu H2O2<br />
uczestniczy katalaza, która rozkłada nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem reakcji:<br />
2H2O2 → 2H2O + O2<br />
Katalaza jest zlokalizowana w cytoplazmie, peroksysomach i glioksysomach. Peroksydaza usuwa<br />
nadtlenek wodoru w reakcji utleniania substratów:<br />
RH2 + H2O2 → R + 2H2O<br />
WaŜny układ usuwający H2O2 tworzą enzymy związane z metabolizmem kwasu askorbinowego i<br />
glutationu, a zwłaszcza para enzymów: <strong>peroksydaz</strong>a askorbinianowa/reduktaza dehydro-<br />
askorbinianowa. Utleniona przez <strong>peroksydaz</strong>ę forma kwasu askorbinowego jest redukowana w<br />
reakcji, w której dawcą wodorów jest zredukowany glutation (Ryc. 2). Peroksydaza askorbiniano-<br />
wa (APX) jest zlokalizowana w cytoplazmie, w błonach i stromie plastydów, reduktaza dehydro-<br />
askorbinianowa (DHAR) występuje w cytoplazmie i stromie plastydów, a reduktaza glutationowa<br />
(GR) w cytoplazmie, mitochondriach i w stromie plastydów.<br />
2
Ryc. 2. Antyoksydacyjny system ochrony, poszczególne enzymy i antyoksydanty<br />
nieenzymatyczne (Buchanan, Gruissem, Jones, Plant Biochemistry).<br />
Elektroforeza Ŝelowa<br />
Elektroforeza jest techniką rozdziału <strong>białek</strong> opartą na zróŜnicowaniu ich ruchliwości w po-<br />
lu elektrycznym. Cząsteczki <strong>białek</strong> migrują w polu elektrycznym z szybkością zaleŜną od ich wy-<br />
padkowego ładunku i masy cząsteczkowej. Od ładunku wypadkowego zaleŜy teŜ kierunek ruchu.<br />
<strong>Rozdział</strong> elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze na stałym podłoŜu (np. bibuła, fo-<br />
lia z octanu celulozy, Ŝel agarozowy lub poliakryloamidowy). Najczęściej jako nośniki uŜywane są<br />
Ŝele, poniewaŜ działają one jak sita molekularne, przez co znacznie zwiększają rozdzielczość (ryc.<br />
3). Cząsteczki o małych rozmiarach, w porównaniu z porami Ŝelu, łatwo w nim wędrują, natomiast<br />
cząsteczki znacznie większe niŜ pory Ŝelu pozostają prawie nieruchome. Cząsteczki o pośrednich<br />
rozmiarach poruszają się w Ŝelu z róŜną prędkością.<br />
3
Ryc. 3. Elektroforeza na Ŝelu poliakryloamidowym. A. Aparat do elektroforezy Ŝelowej. B. Pory Ŝelu po-<br />
liakryloamidowego działają jak sito i rozdzielają białka w zaleŜności od wielkości ich cząsteczek (J.M.<br />
Berg, J.L. Tymoczko, L.Stryer, Biochemia)<br />
Najczęściej stosowanym Ŝelem jest Ŝel poliakryloamidowy, który posiada szereg zalet de-<br />
cydujących o jego powszechnym uŜyciu jako nośnika. śel poliakryloamidowy jest chemicznie<br />
obojętny, bezbarwny i pozbawiony ładunków elektrostatycznych, odznacza się duŜą wytrzymało-<br />
ścią mechaniczną i termiczną oraz jest łatwy i szybki w przygotowaniu. Dodatkowo, dzięki moŜ-<br />
liwości zróŜnicowanego sieciowania, moŜna uzyskać określone rozmiary oczek sita molekularne-<br />
go (0,6 - 4 nm).Wielkość oczek sieci Ŝelu zaleŜy od proporcji między akryloamidem (H2C=CH–<br />
CO–NH2 ) a N,N’-metyleno-bis-akryloamidem H2C=CH–CO–NH–CH2–NH–CO– CH=CH2 (po-<br />
tocznie nazywanym bis-akryloamidem), które są substratami do polimeryzacji. Od ilości bis-<br />
akryloamidu w mieszaninie zaleŜy liczba wiązań poprzecznych, decydująca o rozmiarach sita mo-<br />
lekularnego. Do przeprowadzenia polimeryzacji konieczny jest dodatek nadsiarczanu amonu oraz<br />
katalizatora – N,N,N’,N’-czterometyloetyleno-dwuaminy (TEMED). W wyniku katalizowanego<br />
przez TEMED rozpadu nadsiarczanu amonu, powstają wolne rodniki tlenowe, pod wpływem któ-<br />
rych tworzą się rodniki poliakryloamidowe dające polimer.<br />
Dla uzyskania optymalnej rozdzielczości stosuje się Ŝel o odpowiedniej wielkości porów,<br />
która zaleŜy od stęŜenia procentowego Ŝelu. Elektroforezę w Ŝelu poliakryloamidowym moŜna<br />
wykonywać wieloma metodami, spośród których bardzo wygodną jest metoda wg Ogita i Markert<br />
[1]. Elektroforezę wykonuje się w układzie dwóch Ŝeli (rozdzielający i zagęszczający) róŜniących<br />
się stęŜeniem procentowym i pH. Zostanie ona zastosowana w opisywanym ćwiczeniu do analizy<br />
porównawczej izoform <strong>peroksydaz</strong>y z koleoptyli owsa.<br />
4
Sprzęt:<br />
MATERIAŁY I METODY<br />
Aparat do elektroforezy (wersja mini), płytki szklane o wymiarach10 x 10 cm, zasilacz stabilizowany<br />
(do 150 V).<br />
Odczynniki:<br />
A) Odczynniki do Ŝelu rozdzielającego<br />
• Roztwór IA (Akrylamid) – rozpuścić 39 g akrylamidu i 1 g bis-akrylamidu w wodzie, dodać<br />
20 ml glicerolu, całość uzupełnić wodą do 100 ml.<br />
UWAGA: akrylamid jest neurotoksyną wchłanianą przez skórę, dlatego naleŜy unikać kontaktu z<br />
roztworami tego związku i uŜywać rękawiczek lateksowych<br />
• Roztwór IB (0.75 M Tris-HCl) – rozpuścić 9,15 g Trisu w wodzie, dodać 3 ml HCl, całość<br />
uzupełnić wodą do 100 ml.<br />
• Roztwór IC (0.2 % (w/v) nadsiarczan amonu) – rozpuścić 0,2 g nadsiarczanu amonu w<br />
100 ml wody.<br />
• Roztwór ID (0.4 % (v/v) TEMED) – 0,4 ml TEMEDu uzupełnić do 100 ml wodą.<br />
B) Odczynniki do Ŝelu zagęszczającego<br />
• Roztwór IIA (Akrylamid) – rozpuścić 38 g akrylamidu i 2 g bis-akrylamidu w wodzie,<br />
dodać 20 ml glicerolu i uzupełnić wodą do 100 ml.<br />
• Roztwór IIB (0.75 M Tris –HCl) – rozpuścić 1,5 g Trisu w wodzie, dodać 1 ml HCl i<br />
uzupełnić wodą do 100 ml.<br />
• Roztwór IIC (0.4 % (w/v) nadsiarczan amonu) – rozpuścić 0.4 g nadsiarczanu amonu w<br />
100 ml wody.<br />
• Roztwór IID (2.0 % (v/v) TEMED) – 2 ml TEMEDu uzupełnić wodą do 100 ml.<br />
C) Bufor do elektroforezy (pH 8.3) – rozpuścić 1,5 g Trisu i 7,2 g glicyny w 1 L wody.<br />
D) Roztwór do wybarwiania <strong>białek</strong> – 0,004% błękit brylantowy – rozpuścić 20 mg Coomassie<br />
Brillant Blue G-250 w 500 ml 3,5 % kwasu nadchlorowego z 20 % metanolem.<br />
E) Roztwór odbarwiający – 10% (v/v) kwas octowy<br />
F) Roztwór AEC (3-amino-9-etylokarbazol) do wykrywania aktywności <strong>peroksydaz</strong>y – syntetycznym<br />
substratem utlenianym przez <strong>peroksydaz</strong>y w obecności H2O2 moŜe być 3-amino-9etylokarbazol<br />
o wzorze:<br />
5
0,1 g AEC rozpuścić w 25 ml dwumetyloformamidu. 3,35 ml roztworu AEC uzupełnić do 50 ml<br />
0.1 M buforem octanowym pH 5,2. Roztwór przesączyć. TuŜ przed reakcją zmieszać 10 ml roztworu<br />
AEC i 10 µl 30% nadtlenku wodoru (H2O2).<br />
G) Bufor do homogenizacji tkanki – 50 mM bufor fosforanowy pH 7,0 zawierający 5 mM βmerkaptoetanol<br />
(17,5 μl/50 ml buforu)<br />
Polimeryzacja Ŝelu<br />
WYKONANIE<br />
A) Przygotowanie płytek do polimeryzacji Ŝelu: płytki odtłuścić, dokładnie wymyć i wysuszyć.<br />
ZłoŜyć razem 2 płytki (jedna krótsza), uszczelnić i spiąć ściskaczami do papieru. Ustawić pionowo.<br />
Przygotować dwa komplety płytek – jeden do wykrywania aktywności <strong>peroksydaz</strong>y,<br />
drugi do wybarwienia <strong>białek</strong>.<br />
B) Polimeryzacja Ŝelu rozdzielającego 8% – w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 2 ml<br />
roztworu IA, 2,5 ml roztworu IB, 1,25 ml roztworu IC, 1,25 ml roztworu ID i 3 ml wody.<br />
Wszystkie składniki dobrze wymieszać i wlać ostroŜnie między dwie płytki przy pomocy pipety,<br />
do wysokości 2,5 – 3 cm od górnej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię Ŝelu ostroŜnie<br />
nawarstwić około 100 μl wody (dostęp tlenu utrudnia polimeryzację) i całość pozostawić<br />
do spolimeryzowania (30 – 40 minut). Usunąć wodę znad spolimeryzowanego Ŝelu przy pomocy<br />
bibuły, uwaŜając by nie uszkodzić powierzchni Ŝelu.<br />
C) Polimeryzacja Ŝelu zagęszczającego 4% − w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 0,5<br />
ml roztworu IIA, 1,25 ml roztworu IIB, 0,625 ml roztworu IIC, 0,625 ml roztworu IID i 2 ml<br />
wody. Dokładnie wymieszać składniki i wlać mieszaninę między dwie płytki. OstroŜnie wło-<br />
Ŝyć grzebień tak aby nie pozostały pod nim pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił wycięcia<br />
miedzy zębami. Pozostawić Ŝel do polimeryzacji.<br />
Próby do elektroforezy<br />
A) Homogenizacja tkanki − odwaŜyć po 1 g koleoptyli owsa (etiolowanych oraz naświetlanych),<br />
zamrozić w ciekłym azocie i homogenizować w buforze do homogenizacji w stosunku 1:2 (1g<br />
tkanki:2 ml buforu). Homogenaty odwirować w mikrowirówce przez 5 min.<br />
B) Przygotowanie prób – do oznaczonych probówek Eppendorfa napipetować po 200 μl odpowiedniego<br />
supernatantu po wirowaniu, dodać po 25 μl roztworu błękitu bromofenolowego zawierającego<br />
glicerol.<br />
6
Elektroforeza<br />
A) Umieszczenie płytek z Ŝelem w aparacie do elektroforezy – po spolimeryzowaniu Ŝelu zagęszczającego<br />
ostroŜnie wyjąć grzebień uwaŜając aby powstałe studzienki nie uległy uszkodzeniu.<br />
Płytki z Ŝelem umocować w aparacie tak aby krótsza płytka była skierowana do wewnątrz aparatu.<br />
Oba naczynia elektrodowe wypełnić buforem do elektroforezy. Sprawdzić szczelność<br />
aparatu.<br />
B) Nanoszenie prób – oznaczone próby nanosić do kolejnych studzienek, podwarstwiąjąc je przy<br />
uŜyciu pipety automatycznej z kapilarną końcówką<br />
śel do wykrywania aktywności <strong>peroksydaz</strong>y<br />
Studzienka 1 – 5 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 2 – 10 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 3 – 5 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
Studzienka 4 – 10 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
śel do wybarwienia <strong>białek</strong><br />
Studzienka 1 – 15μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 2 – 30 μl supernatantu z koleoptyli etiolowanych<br />
Studzienka 3 – 15 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
Studzienka 4 – 30 μl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę<br />
C) Warunki elektroforezy – po naniesieniu prób podłączyć aparat do elektroforezy do zasilacza,<br />
włączyć zasilacz i ustawić takie napięcie aby natęŜenie prądu na jedną płytkę wynosiło około<br />
10 mA. Po wniknięciu prób w Ŝel zwiększyć napięcie utrzymując natęŜenie nie przekraczające<br />
20 mA. Elektroforezę naleŜy zakończyć kiedy błękit bromofenolowy znajdzie się około 0,5 cm<br />
od dolnej krawędzi Ŝelu. WYŁĄCZYĆ ZASILACZ.<br />
Wybarwianie <strong>białek</strong> w Ŝelu<br />
Płytki delikatnie podwaŜyć łopatką i rozdzielić. śel umieścić w kuwecie z roztworem barwiącym.<br />
Po 10 min barwnik zlać do butelki, nadmiar z Ŝelu wypłukać wodą, a następnie zalać 10% kwasem<br />
octowym w celu odbarwienia tła. Zmienić kilka razy roztwór odbarwiający, na koniec przepłukać<br />
wodą.<br />
Lokalizowanie izoform <strong>peroksydaz</strong>y w Ŝelu<br />
Drugi Ŝel umieścić w kuwecie i zalać 50 ml roztworu AEC z nadtlenkiem wodoru. Obserwować<br />
pojawianie się prąŜków zredukowanego substratu. W odpowiednim czasie przerwać reakcję zlewając<br />
roztwór AEC i przemywając Ŝel wodą destylowaną.<br />
7
OPRACOWANIE WYNIKÓW<br />
Porównać liczbę i intensywność prąŜków odpowiadających izoformom <strong>peroksydaz</strong>y w ekstrakcie<br />
z koleoptyli etiolowanych i poddanych naświetleniu (analiza <strong>zymogram</strong>u). Podobnie zanalizować<br />
Ŝel barwiony na białka (proteinogram).<br />
Literatura<br />
[1] Ogita ZI, Markert CL (1979) A miniaturized system for electrophoresis on polyacrylamide<br />
gels. Analytical Biochemistry 99: 233-241.<br />
8