DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA 1. Rodzaje diagnostyki ...
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA 1. Rodzaje diagnostyki ...
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA 1. Rodzaje diagnostyki ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>DIAGNOSTYKA</strong> <strong>MOLEKULARNA</strong><br />
<strong>1.</strong> <strong>Rodzaje</strong> <strong>diagnostyki</strong> molekularnej:<br />
- diagnostyka bezpo rednia – ma zastosowanie w przypadku, gdy prawidłowy<br />
gen jest poznany, a jego sekwencja mo e by wykorzystana jako sonda<br />
molekularna lub starter w celu wykrycia mutacji w DNA;<br />
- diagnostyka po rednia – stosujemy, kiedy gen zwi zany z wyst powaniem<br />
okre lonej choroby genetycznej jest nieznany; wykorzystuj c analiz sprz e<br />
lub analiz asocjacji mo emy wyselekcjonowa geny, w ród których znajduje<br />
si nasz poszukiwany gen-kandydat.<br />
2. Metody stosowane w diagnostyce molekularnej:<br />
- hybrydyzacja z sondami molekularnymi<br />
- metoda PCR – ła cuchowej reakcji polimerazy<br />
• Hybrydyzacja (renaturacja) – tworzenie podwójnej helisy mi dzy komplementarnymi<br />
niciami DNA lub RNA, pochodz cymi z ró nych ródeł.<br />
Techniki hybrydyzacyjne:<br />
- hybrydyzacja punktowa – pozwala na jednoczesne wykrywanie i identyfikacje<br />
wielu próbek na tym samym filtrze,<br />
- hybrydyzacja typu Southern – stosowana najcz ciej, dotyczy hybrydyzacji<br />
DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spo ród mieszaniny<br />
fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi,<br />
- hybrydyzacja Nothern – dotyczy hybrydyzacji RNA-DNA i dostarcza<br />
informacji o ekspresji genów,<br />
• Amplifikacja DNA metod PCR (ła cuchowej reakcji polimerazy) – reakcja ta<br />
odzwierciedla naturalny proces replikacji i umo liwia w warunkach in vitro szybkie<br />
powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA. Badana sekwencja DNA jest<br />
powielana przy u yciu pary oligonukleotydowych starterów, z których ka dy jest<br />
komplementarny do jednego ko ca sekwencji docelowej DNA. Startery te s<br />
wydłu ane w kierunku przeciwnym, za pomoc termostabilnej polimerazy DNA, w<br />
cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:<br />
- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,<br />
- wi zanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,<br />
- synteza nici komplementarnej 68-72°C<br />
Produkty PCR – wizualizacja nast puje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cz steczki<br />
DNA umieszczone w elu migruj w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnie naładowanej<br />
elektrody, a ich szybko zale y od wielko ci cz steczki – im mniejsze tym szybciej b d si<br />
przesuwały w elu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkaluj cy DNA) s<br />
widoczne po na wietleniu wiatłem UV.<br />
Strategia <strong>diagnostyki</strong> molekularnej:<br />
Du e zmiany genowe :delecje, duplikacje , insercje<br />
Delecje mog by wykryte metod Southerna lub PCR-Multiplex. W duplikacjach<br />
najcz ciej stosuje si metody ilo ciowe: Q-PCR.<br />
Przykład: dystrofia mi niowa Duchenne’a
Znane mutacje w miejscu restrykcyjnym<br />
Analiza RFLP (analiza polimorfizmu długo ci fragmentów restrykcyjnych), która mo e<br />
wykaza odmienny układ fragmentów DNA po ci ciu okre lonym enzymem restrykcyjnym.<br />
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia<br />
Znane mutacje punktowe poza miejscem restrykcyjnym<br />
Strategia wykrywania opiera si na metodzie ASO lub ASA, czyli wykorzystaniu znajomo ci<br />
mutacji do skonstruowania odpowiednich sond lub starterów, które wykryj zarówno allel<br />
prawidłowy, jak i zmutowany.<br />
Przykład: mukowiscydoza (CF)<br />
Nieznane mutacje<br />
Techniki przesiewowe - identyfikacja zmian w sekwencjach oparta na porównaniu<br />
wielokrotno ci i/lub konformacji badanych dwu- i jednoniciowych fragmentów kwasów<br />
nukleinowych. Wspólnym elementem jest powielenie badanego fragmentu DNA technik<br />
PCR i rozdział elektroforetyczny w elu poliakrylamidowym np. PCR-HD (heterodupleksy),<br />
PCR-SSCP (polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych), PCR-DGGE.<br />
Przykład: zespół Marfana<br />
Sekwencjonowanie<br />
Najcz ciej u ywan metod jest metoda Sangera, oparta o syntez DNA przez polimeraz<br />
DNA in vitro. Do reakcji dodaje si niewielk ilo dideoksynukleotydów, które s<br />
wbudowywane w DNA, ale nie mog by substratem do dalszego wydłu ania nici. W ten<br />
sposób otrzymuje si fragmenty DNA zako czone specyficznym nukleotydem. Produkty<br />
reakcji rozdziela si elektroforetycznie, co powoduj ich segregacj pod wzgl dem wielko ci<br />
produktów.<br />
Analiza sprz e<br />
Metoda stosowana w sytuacji kiedy nie znamy genu zwi zanego z wyst powaniem okre lonej<br />
choroby genetycznej. Celem tej metody jest znalezienie sekwencji DNA (markera<br />
genetycznego), która jest dziedziczona ł cznie z poszukiwanym przez nas genem. Analiza<br />
sprz e wymaga pobrania materiału od wielu członków rodziny w celu ustalenia segregacji<br />
markerów genetycznych z locus poszukiwanego genu. Aby wynik był jednoznaczny, osoba<br />
obci ona ryzykiem przeniesienia genu warunkuj cego chorob musi by heterozygot pod<br />
wzgl dem markera. Stosowana dla chorób jednogenowych o mendlowskim typie<br />
dziedziczenia.<br />
Analiza asocjacji<br />
Polega na badaniu porównawczym rozkładu alleli ró nych polimorfizmów pomi dzy grup<br />
chorych niespokrewnionych a grup kontroln . Analiza asocjacji wykrywa ró nice w<br />
rozkładzie alleli – stwierdzenie bezpo redniej asocjacji identyfikuje zarówno gen, jak i<br />
polimorfizm odpowiedzialny za zwi kszone ryzyko wyst pienia choroby. Stosowana w<br />
chorobach uwarunkowanych wielogenowo/wieloczynnikowo.<br />
Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka: www.ibb.waw.pl/∼ptg c<br />
GeneTests www.geneclinics.org
Strategia <strong>diagnostyki</strong> genetycznej<br />
gen znany gen nieznany<br />
poszukiwanie mutacji analiza sprz e<br />
Poszukiwanie mutacji<br />
mutacje znane mutacje nieznane<br />
mutacje rearan acje metody<br />
punktowe genowe przesiewowe<br />
PCR-RFLP PCR-multiplex PCR-HD<br />
PCR-ASA Q-PCR PCR-SSCP<br />
ASO Southern blot PCR-DGGE<br />
Wynik<br />
prawidłowy nieprawidłowy<br />
inne mutacje/ wykluczenie potwierdzenie<br />
mutacje w choroby rozpoznania<br />
innych genach
Change language