1. Ocena jakościowa Ag-Ab
1. Ocena jakościowa Ag-Ab
1. Ocena jakościowa Ag-Ab
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Ocena</strong> <strong>jakościowa</strong> reakcji<br />
antygen - przeciwciało<br />
Mariusz Kaczmarek
immunogeny – wykazują immunogenność i antygenowość<br />
hapteny – tylko antygenowość<br />
Antygeny<br />
Immunogenność - zdolność do wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi<br />
odpornościowej swoistej<br />
Antygenowość - zdolność do reagowania z przeciwciałami oraz receptorami<br />
na limfocytach T i B<br />
– substancja rozpuszczona w roztworze<br />
– substancja związana z komórką<br />
– substancja związana ze sztucznym nośnikiem
Przeciwciała<br />
IgG – ( ~80%) odpowiedź wtórna, ochrona przed drobnoustrojami<br />
i ich toksynami, pamięć immunologiczna, marker<br />
przewlekłego procesu chorobowego;<br />
IgD – (~1%) wpływ na funkcje limfocytów;<br />
IgE – (~0,002%) ochrona przed pasożytami jelitowymi, alergie;<br />
IgA – (~13%) dimery lub forma rozpuszczalna, błony śluzowe;<br />
IgM – (~6%) odpowiedź pierwotna, pentametry, obrona przed<br />
drobnoustrojami; marker ostrego procesu chorobowego;
Oddziaływania pomiędzy antygenem a przeciwciałem<br />
Powinowactwo - siła wiązania pojedynczego epitopu przez przeciwciało<br />
Awidność - siła wiązania kilku epitopów<br />
Paratop – miejsce wiązania epitopu na Ig
• bibuły filtracyjne<br />
Nośniki dyfuzyjne<br />
• błony syntetyczne - octan celulozy, nitroceluloza,<br />
skrobia, związki krzemu, np. pewikon<br />
• żele - agarowe lub agarozowe
Reakcje antygen-przeciwciało<br />
• Reakcja precypitacji – w przebiegu reakcji antygen wytrąca się i<br />
staje się widoczny<br />
• Reakcja aglutynacji – w wyniku reakcji komórki lub cząstki<br />
nośnika aglutynują, łączą się ze sobą<br />
• Wiązanie układu dopełniacza<br />
• Neutralizacja toksyn bakteryjnych<br />
• Bez widocznych skutków fizycznych czy biologicznych (detekcja<br />
znacznika, np. izotop, enzym)
Precypitacja antygenu - proces łączenia się antygenu ze swoistym<br />
przeciwciałem w warunkach in vitro.<br />
Etapy reakcji precypitacji:<br />
Reakcja precypitacji<br />
<strong>1.</strong> Kompleksy antygen-przeciwciało<br />
2. <strong>Ag</strong>regacja<br />
3. Powstawanie precypitatu<br />
Precypitat (strąt) - sieć przestrzenna utworzona z wielu połączonych<br />
cząsteczek antygenu i przeciwciał.<br />
Precypityny - przeciwciała (immunoglobuliny) ulegające reakcji precypitacji
Krzywa precypitacji Heidelberga<br />
Precypitacja kompleksu <strong>Ag</strong>-<strong>Ab</strong> następuje w strefie równowagi stężeń<br />
obszar ekwiwalentny
• stężenie reagentów reakcji<br />
• stężenie elektrolitu indukującego precypitację<br />
• pH środowiska reakcji<br />
• czasu reakcji<br />
• temperatury<br />
Warunki reakcji precypitacji<br />
• obecności innych białek
Podział metod precypitacyjnych<br />
Odczyny precypitacyjne w środowisku płynnym:<br />
- precypitacja pierścieniowa<br />
- precypitacja szkiełkowa<br />
- odczyn flokulujący (test kłaczkujący)<br />
Odczyny precypitacyjne w środowisku stałym (immunodyfuzja):<br />
- pojedyncza immunodyfuzja probówkowa<br />
- podwójna immunodyfuzja probówkowa<br />
- podwójna immunodyfuzja płytkowa
Podwójna dyfuzja w agarze (PDA)<br />
testy identyczności<br />
Reakcja identyczności<br />
Reakcja częściowej identyczności<br />
Reakcja nieidentyczności
Immunoelektroforeza<br />
Immunoelektroforeza - technika różnicowania białek na podstawie ich<br />
właściwości elektroforetycznych i immunologicznych.<br />
-<br />
I etap II etap<br />
<strong>Ag</strong> +<br />
żel agarozowy<br />
dołki z surowicami<br />
a.<br />
kierunek<br />
elektroforezy<br />
rowek z przeciwciałami anty-IgG, IgA, IgM łuki precypitacyjne<br />
b.<br />
przeciwciało<br />
H. Samara
Przykłady gammapatii<br />
H. Samara
-<br />
Immunoelektroforeza krzyżowa wg Laurella<br />
<strong>Ag</strong>1 + <strong>Ag</strong>2<br />
I etap<br />
<strong>Ag</strong>1 <strong>Ag</strong>2<br />
+<br />
+<br />
-<br />
II etap<br />
<strong>Ag</strong>1 <strong>Ag</strong>2
Immunoelektroforeza przeciwprądowa<br />
(elektrosynereza)<br />
- <strong>Ag</strong><br />
<strong>Ab</strong> +
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
E<br />
rozdział elektroforetyczny<br />
mieszaniny białek<br />
-<br />
+<br />
Immunofiksacja<br />
inkubacja żelu z membraną<br />
nasączoną swoistymi przeciwciałami<br />
wybarwienie kompleksów<br />
<strong>Ag</strong>-<strong>Ab</strong> w żelu
www.molecularstation.com<br />
mieszanina <strong>Ag</strong><br />
znakowanych<br />
izotopem<br />
reakcja ze<br />
swoistym<br />
przeciwciałem<br />
Immunoprecypitacja<br />
koprecypitacja i<br />
odwirowanie<br />
kompleksów <strong>Ab</strong>-<strong>Ag</strong><br />
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
E<br />
rozdział elektroforetyczny<br />
kompleksów<br />
-<br />
+<br />
detekcja antygenu<br />
(autoradiografia)
• ruch cząsteczki obdarzonej ładunkiem w polu<br />
elektrycznym<br />
• szybkość wędrówki białka w polu elektrycznym<br />
zależy od natężenia pola elektrycznego,<br />
wypadkowego ładunku cząsteczki białka i<br />
współczynnika tarcia<br />
• nośnik – żel poliakryloamidowy<br />
Elektroforeza SDS-PAGE<br />
• rozdział białek ze względu na ich m.cz. następuje<br />
po dodaniu dodecylosiarczanu sodu (SDS),<br />
detergentu anionowego<br />
• po rozdziale białka barwione są błękitem<br />
kumasyny, azotanem srebra, bądź znakowane<br />
radioaktywnie<br />
• umożliwia rozdział białek różniących się masą o<br />
ok. 2%<br />
barwienie błękitem kumasyny<br />
barwienie azotanem srebra
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
E<br />
rozdział elektroforetyczny<br />
mieszaniny białek<br />
Immunoblotting (western blot)<br />
• wiązanie antygen-przeciwciało<br />
• homogenat tkanki lub ekstrakt białkowy poddawane są elektroforezie ze<br />
względu na długość łańcucha (białka zdenaturowane) lub wielkość<br />
(białka natywne) w żelu poliakryloamidowym lub ogniskowaniu<br />
izoelektrycznym<br />
• transfer na błonę nitrocelulozową<br />
• blokowanie błony innym białkiem (BSA, odtłuszczone mleko)<br />
-<br />
+<br />
przeniesienie białek na<br />
membranę nitrocelulozową<br />
-<br />
+<br />
inkubacja membrany ze<br />
swoistymi przeciwciałami<br />
detekcja kompleksów<br />
<strong>Ag</strong>-<strong>Ab</strong> na membranie
• Przeciwciała przeciwko poszukiwanym antygenom<br />
białkowym:<br />
– przeciwciało pierwszorzędowe niewyznakowane<br />
– przeciwciało drugorzędowe związane z enzymem, zdolnym do<br />
zamiany bezbarwnego substratu w barwny produkt (reakcja<br />
kolorymetryczna)<br />
• Inne typy detekcji:<br />
- chemiluminescencja,<br />
- radiografia,<br />
- fluorochrom<br />
Immunoblotting – detekcja
Ogniskowanie izoelektryczne<br />
• pozwala rozdzielić białka ze względu na ich punkt<br />
izoelektryczny (pI)<br />
• mieszaninę białek poddaje się elektroforezie w gradiencie<br />
pH w żelu bez SDS<br />
• gradient pH tworzy się poprzez dodanie amfolitów tzw.<br />
spacerów<br />
• białka zatrzymują się w pH żelu odpowiadającemu ich pI<br />
• rozdział białek różniących się jednym ładunkiem<br />
wypadkowym
Elektroforeza dwukierunkowa<br />
• połączenie ogniskowania izoelektrycznego i SDS-PAGE<br />
• próbę poddaje się ogniskowaniu izoelektrycznemu<br />
• pasek żelu wzdłuż którego nastąpił rozdział wpolimeryzowuje się poziomo w<br />
górną część żelu poliakryloamidowego z SDS<br />
• następuje ponowny rozdział, tym razem ze względu na ich masę cząsteczkową
Chromatografia<br />
• Metoda używana do rozdziału mieszaniny związków różniących<br />
się właściwościami fizykochemicznymi (wielkość, ładunek,<br />
kształt, rozpuszczalność) i biologicznymi<br />
• Rozdział substancji pomiędzy 2 fazy: stałą (szklana, metalowa,<br />
plastikowa kolumna wypełniona złożem – agarozą, dekstranem,<br />
polimery akryloamidu) i ruchomą (buforem o odpowiednim<br />
składzie jonowym i pH przepływającą przez fazę stacjonarną<br />
zawierającą badana mieszaninę białek)
<strong>Ag</strong>lutynacja (odczyn zlepny) – reakcja, w wyniku której aglutynogen<br />
jest wiązany przez aglutyniny, co prowadzi do powstania wytrącających<br />
się kompleksów<br />
Reakcja aglutynacji<br />
<strong>Ag</strong>lutynacja bezpośrednia (czynna)<br />
Test aglutynacji bezpośredniej<br />
<strong>Ag</strong>lutynacja pośrednia (bierna)<br />
Test aglutynacji pośredniej
• wielkość cząsteczek reagujących<br />
• gęstość ładunku powierzchniowego<br />
• siła jonowa<br />
• pH roztworu, w którym zawieszone są komórki<br />
• temperatura reakcji<br />
• czas reakcji<br />
Warunki reakcji aglutynacji
Hemaglutynacja<br />
• bezpośrednia (czynna) – <strong>Ag</strong> powierzchniowy limfocytów<br />
• pośrednia (bierna) – <strong>Ag</strong> jest opłaszczony na krwinkach wzorcowych
Miano przeciwciał<br />
najwyższe rozcieńczenie lub najniższe stężenie<br />
surowicy przy którym możliwa jest dodatnia<br />
reakcja antygen-przeciwciało
Test hamowania hemaglutynacji<br />
Odczyn antyglobulinowy Coombsa<br />
Bezpośredni test antyglobulinowy<br />
Pośredni test antyglobulinowy
Change language