TEMAT PRACY DYPLOMOWEJ

Opracowanie metody rozdzielania i wizualizacji białek w żelach
agarozowych stosowanych w planarnej elektroforezie żelowej
Ewa Zwolińska
Kierujący pracą: dr inż. Iwona Głuch
Wstęp
W biologii, a szczególnie biochemii, procesy rozdzielania białek, polipeptydów
i kwasów nukleinowych oraz innych substancji biologicznie czynnych są pierwszym
etapem badań prowadzonych nad tymi związkami. Jedną z najpopularniejszych technik
stosowanych w tym celu jest elektroforeza żelowa. [1,2]
Celem pracy było ustalenie optymalnych warunków przeprowadzenia reakcji
barwienia białek w zakresie widzialnym, w celu opracowania metody wizualizacji żeli
agarozowych.
Wyniki i dyskusja
Przeprowadzone badania wykazały, że rozdzielanie elektroforetyczne białek w żelu
agarozowym przy zastosowaniu buforu bez dodatku SDS nie pozwala na uzyskanie
wyraźnych prążków, ze względu na zbyt mały stopień zdenaturowania białek. Bufor z
dodatkiem SDS pozwala na uzyskanie zadowalających wyników.
Ustalono, że optymalne stężenie agarozy w żelu wynosi 1,5%. Pory w takim żelu są na
tyle małe, że następuje efektywne rozdzielanie białek, ale są również na tyle duże, że barwnik
może bez przeszkód wniknąć i związać się z białkiem.
Badania wykazały, że optymalny stosunek stężenia roztworu barwnika do stężenia
roztworu białka podczas barwienia za pomocą czerni amidowej wynosi 0,1 mg/ml : 10 mg/ml.
Efektywność barwienia białek zależy od stężenia roztworu barwnika.
Badania wykazały również iż najlepszy stosunek stężenia roztworu barwnika do
stężenia roztworu białka podczas wizualizacji za pomocą błękitu brylantowego Coomassie
wynosi 0,1 mg/ml : 3,3 mg/ml.
Zarówno przy stosowaniu czerni amidowej jak i błękitu brylantowego Coomassie
istotnym parametrem od którego zależy efektywność wizualizacji jest czas inkubacji żelu w
roztworze barwnika. Dla czerni amidowej optymalnym czasem jest 20 minut, a dla błękitu
brylantowego 30 minut.
Wnioski
Do rozdzielania białek w żelach agarozowych w wariancie poziomym może być
wykorzystywany bufor używany do rozdzielania białek w żelach poliakrylamidowych.
Efektywność wizualizacji zależy od stosunku stężenia roztworu barwnika do stężenia
roztworu białka. Barwienie błękitem brylantowym Coomassie jest bardziej czułe niż
barwienie czernią amidową, jednak jest to barwnik droższy niż czerń amidowa. Dlatego też

do badań, w których jest wymagana duża czułość lepszym barwnikiem jest błękit brylantowy
Coomassie, a w badaniach w których duża czułość nie jest wymagana, lepsza jest czerń
amidowa.
Opracowana metoda w ustalonych optymalnych warunkach pozwala na uzyskanie
dwóch wyraźnych prążków pochodzących od rozdzielonych białek, wchodzących w skład
białka jaja kurzego, na jasnym tle żelu, zarówno przy użyciu czerni amidowej jak i błękitu
brylantowego Coomassie.
Literatura
[1] J. Walory, M. Pilarek, M. Kalinowska, H. Jaworowska-Deptuch; Biochemia.
Ćwiczenia laboratoryjne.; Oficyna Wydawnicza PW; Warszawa 2003
[2] Praca zbiorowa pod redakcją I. Głuch i M. Balcerzak; Chemia analityczna. Ćwiczenia
laboratoryjne.; Oficyna Wydawnicza PW; Warszawa 2007