Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...

Zborník príspevkov z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie 

Organizátori konferencie: 

„Analytické metódy a zdravie loveka“ 

Slovenská chemická spolonos 

Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave 

Vedecký výbor: 

prof. RNDr. Dušan Kaniansky, DrSc. (predseda vedeckého výboru konferencie, † 06.06.2010) 

prof. RNDr. Anton Gáplovský, DrSc. (estný predseda vedeckého výboru konferencie) 

doc. RNDr. Milan Hutta, CSc. (vedecký garant konferencie) 

doc. RNDr. Jozef Marák, CSc. (vedecký garant konferencie) 

prof. RNDr. Zdenk Glatz, PhD. 

prof. Ing. Pavel Jandera, DrSc. 

RNDr. Václav Kašika, CSc. 

prof. Ing. Jozef Lehotay, DrSc. 

prof. RNDr. Juraj Ševík, PhD. 

prof. Ing. Ladislav Soják, DrSc. 

prof. Ing. Karel Štulík, DrSc. 

Redakná rada zborníka a recenzenti: 

M. Hutta (predseda), J. Sádecká, J. Marák, A. Oriák, R. Bodor, R. Halko, M. Masár, 

A. Staová 

Za jazykovú a obsahovú stránku príspevkov zodpovedajú autori. Príspevky boli redakne 

upravené. Text neprešiel odbornou jazykovou úpravou. 

© Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave 

http://www.analytika.sk/KONFERENCIA2010/prispevky_inex.htm 

Vydala Slovenská vákuová spolonos, 2010 

ISBN 978-80-969435-7-9 

EAN 9788096943579

Milí priatelia, 

menom organizaného výboru a sponzorov konferencie je nám potešením pozva Vás 

na 18. medzinárodnú konferenciu „Analytické metódy a zdravie loveka“, ktorá sa bude 

kona v doch 11.-14.10.2010 v Bratislave v konferenných priestoroch Hotela Falkensteiner 

Bratislava (Pilárikova 5, 81103 Bratislava). 

Sme radi, že konferencia sa koná pod záštitou „estného predsedu vedeckého výboru 

konferencie“ pána prof. RNDr. Antona Gáplovského, DrSc., dekana Prírodovedeckej fakulty 

Univerzity Komenského v Bratislave. Táto konferencia si ctí 70. výroie založenia 

Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. 

Konferencia je prirodzeným pokraovaním série konferencií „Chromatografické 

metódy a zdravie loveka“, ktoré sa v rokoch 1975-1994 konali postupne v Smoleniciach, 

Starom Smokovci, Tatranskej Lomnici a Starej Lesnej a v rokoch 1997-2006 v Piešanoch. 

V roku 2008 (Nový Smokovec) bola konferencia tematický rozšírená a svojim názvom, 

„Analytické metódy a zdravie loveka“, reflektuje analytickú chémiu, bioanalytickú chémiu, 

biochemické metódy analýzy, analýzu potravín, biomedicínsku chémiu a environmentálnu 

analytickú chémiu. Predchádzajúcich 17 konferencií bolo usporiadaných vaka vekému 

úsiliu mnohých kolegov z katedry analytickej chémie a neskôr Ústavu analytickej chémie 

Fakulty chemickej a potravinárskej technológie Slovenskej technickej univerzity v Bratislave, 

za o im patrí naše poakovanie. 

Usporiadatelia konferencie, Katedra analytickej chémie Prírodovedeckej fakulty 

Univerzity Komenského v Bratislave v spolupráci s Odbornou skupinou pre chromatografiu 

a elektroforézu, Odbornou skupinou pre analytickú chémiu Slovenskej chemickej spolonosti 

a Odbornou skupinou pre chromatografiu a elektroforézu eské spolenosti chemické Vás 

srdene pozývajú na stretnutie odborníkov z výroby, výskumu, vysokých škôl, štátnych 

zdravotných ústavov, výskumných, kontrolných a klinických laboratórií zaoberajúcich sa 

chromatografickými, elektroforetickými, spektrálnymi a elektrochemickými metódami 

v analýze lieiv, biologických materiálov, vzoriek životného prostredia, potravinového 

reazca a v príbuzných oblastiach. Nepochybne, je našou významnou snahou poskytnú 

pohady na nové trendy v analytickej chémii, (bio)analytickej chémii, klinickej analýze a v 

oblasti miniaturizovaných (ipových) analytických systémov operujúcich nielen 

v separáciách, ale aj v implementácii nových techník a trendov v predúprave (bio)vzoriek, o 

sa zhoduje aj so zameraním Centra excelencie (bio)separaných metód založených na 

princípoch elektroseparácií, kvapalinovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie 

(VVCE 0070-07). 

Zárove je našou snahou vytvori tiež konferenný priestor pre metódy hmotnostnej 

spektrometrie a to aj v oblastiach spájajúcich separané metódy s hmotnostnou 

spektrometriou. 

Analytické metódy sú „mtve“ bez aplikácií analytických metód v praxi. Preto je 

našim hlavným motívom vytvori vemi významný konferenný priestor pre aplikácie 

spadajúce do oblastí, ktoré sú ahko rozpoznatené v kontexte s poznámkami uvedenými 

vyššie. 

Organizátori veria, že táto konferencia, zachovaním dobrých tradícii, vytvorí hodnotný 

a zaujímavý vedecký program. Milí kolegovia, milí študenti a priaznivci tejto analytickej 

problematiky, pozývame Vás na 18. medzinárodnú konferenciu „Analytické metódy a zdravie 

loveka“. 

V Bratislave 4.3.2010 prof. RNDr. Dušan Kaniansky, DrSc. 

(vedecký garant konferencie menom jej organizátorov)

Konferencia bola venovaná pamiatke prof. RNDr. Dušana Kanianskeho, DrSc. 

prof. RNDr. Dušan Kaniansky, DrSc., 

sa narodil 8.12.1946 v Ráztone, kde 

vyštudoval ZŠ a zahorel pre chémiu. SPŠCh 

v Bratislave, odbor Analytická chémia, 

ukonil v roku 1966. 

V rokoch 1966-1971 bol študentom 

Prírodovedeckej fakulty UK, odboru 

Chémia, špecializácie Analytická chémia. 

V rokoch 1971-1990 pracoval na Oddelení 

analytickej chémie Chemického ústavu UK 

a neskôr PriF UK, kde našiel podporu 

a zázemie pre svoju prácu a ako s úsmevom 

hovorieval pre svojho hlavného a možno aj 

jediného koníka 

– vývoj izotachoforetického analyzátora. 

Koncom roku 1989 sme si Dušana Kanianskeho zvolili za vedúceho katedry a od 

roku 1990 doteraz pracoval na Katedre analytickej chémie PriF UK (KACH). V rokoch 1990 

- 1997 a od roku 2003 do svojho skonu pracoval ako vedúci KACH, kde výraznou mierou 

prispel, prispieva a svojimi názormi a námetmi bude ešte dlho prispieva ku skvalitneniu 

vedy, a vzdelávania mnohých generácií analytických chemikov. 

Vaka svojej vrodenej húževnatosti, mimoriadnej inteligencii, nadaniu pre to o robil 

svojim nadpriemerným výkonom vedeckej práce zvyšoval a ešte bude zvyšova kredit 

katedry a cez mnohé aktivity v spolupráci s mimouniverzitnými a medzinárodnými 

pracoviskami zlepšuje aj kredit PriF UK a UK ako celku. Prof. Kaniansky je významným 

zakladateom slovenskej vedeckej školy v oblasti elektromigraných separaných metód a 

svojou vedecko-pedagogickou a organizanou prácou ako pracovník UK ovplyvnil širokú 

odbornú domácu aj zahraninú obec. Poet prítomných aj tu, pri tejto smutnej udalosti, o tom 

tiež svedí. 

Prof. Kaniansky je autorom viac ako stodesa vedeckých publikácií, a z mnoho 

desiatok prednášok a stoviek iných odborných príležitostí ho osobne poznajú stovky kolegov 

doma a v zahranií, ktorí rôznou formou a z celého sveta už vyjadrili svoj smútok a sústras 

nad jeho náhlou stratou. Svojou vedeckou prácou ovplyvnil tisíce odborníkov po celom svete.

Celkove boli jeho práce citované viac ako 2000 krát, o ho zaradilo poda ISI na svetovú 

úrove v chémii. Najvyššie ocenenie Vedec roka SR 2001 získal ešte ako doc. RNDr. Dušan 

Kaniansky, CSc., z Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. 

Prof. Kaniansky, náš Dušan, založil výraznú vedeckú školu - v oblasti 

elektroseparaných metód vychoval množstvo doktorandov, diplomantov, študentov. Mnohí 

sa hrdo hlásime k jeho škole a odkazu pre nás. Dušan bol organizátorom mnohých 

vzdelávacích kurzov pre pracovníkov praxe v rámci programov celoživotného vzdelávania, 

okruh udí ktorí ho rešpektovali, uznávali a mali ho radi je skutone veký. 

Aktívne sa podieal s mnohými spolupracovníkmi na vývoji a aj na realizácii 

pokroilej inštrumentácie pre elektroseparané techniky, priom spoluvytváral mnohé nové 

trendy, napríklad v oblasti vývoja, dizajnu a realizácie elektroseparácií na ipe. Na základe 

jeho dlhodobej sústredenej a tvorivej práce bolo za obdobie rokov 1982 – 2010 

vyprodukovaných v spolupráci s domácimi a zahraninými firmami viac ako 800 pokroilých 

analyzátorov, ktoré slúžia pre potreby klinických, environmentálnych, vodohospodárskych a 

iných pracovísk, kde sú zamestnaní vo vysokej miere aj absolventi UK. 

Na UK bol aktívne a nadšene zapojený do zlepšovateských aktivít a dnes je autorom 

a spoluautorom viac ako dvadsa patentov, z toho niekoko s celosvetovou ochranou a tiež 

spoluautorom slovenských technických noriem. 

Izotachoforetický analyzátor, ktorého bol duchovným otcom a spolutvorcom bol viackrát 

ocenený doma aj v zahranií. 

Ocenenie Prof. RNDr. Dušana Kanianskeho, DrSc. Zlatou medailou Univerzity 

Komenského pri príležitosti jeho 60 narodenín bolo uznaním jeho plodnej práce v prospech 

Univerzity Komenského, ktorej rozsah, kvalita a dosah mnohonásobne prekrauje bežné 

kritériá a tiež ocenením jeho viac ako 40 roného mimoriadne aktívneho, plodného a 

pozitívneho pôsobenia na Prírodovedeckej fakulte UK. 

Prof. Dušan Kaniansky, bol mnohostrannou osobnosou. Svojim priateským 

priamym konaním a náronosou; premysleným, zodpovedným a sústredeným prístupom k 

vedeckej práci, vzdelávaniu a radostným postojom k mimopracovným záubám, ktorými bola 

zase vedecká práca, je príkladom pre nás všetkých, a tiež zdrojom osobného ponauenia. 

es jeho pamiatke.

Obsah zborníka príspevkov z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie 

„Analytické metódy a zdravie loveka“ 

ANALÝZA BENZÉNU, TOLUÉNU, ETYLBENZÉNU A XYLÉNOV VO VODNÝCH VZORKÁCH POUŽITÍM 

TECHNIKY INCAT-GC 

HELENA JURDÁKOVÁ, PETER PODOLEC, ALEXANDRA SZABÓOVÁ, JANA KRUPOVÁ, JAROSLAV BLAŠKO, 

IVAN OSTROVSKÝ, LADISLAV SOJÁK, JOZEF VIŠOVSKÝ, VICTOR G. BEREZKIN .........................................str. 1 

MOŽNOSTI VYUŽITIA ATÓMOVEJ EMISNEJ SPEKTROMETRIE AKO METÓDY ANORGANICKEJ 

PRVKOVEJ ANALÝZY V ENVIRONMENTALISTIKE 

KAROL FLÓRIÁN, MIROSLAVA HAMBORSKÁ a VLADISLAVA MIKOVÁ .........................................................str. 6 

APLIKÁCIA EXTRAKCIE S VYUŽITÍM TEPLOTY ZÁKALU MICELÁRNYCH ROZTOKOV 

NA STANOVENIE STOPOVÝCH KONCENTRÁCIÍ CHRÓMU VO VODNÝCH VZORKÁCH METÓDOU 

ELEKTROTERMICKEJ ATÓMOVEJ ABSORPNEJ SPEKTROMETRIE 

LENKA MACHÁKOVÁ a MÁRIA ŽEMBERYOVÁ ...................................................................................................str. 14 

MOŽNOSTI VYUŽITIA KOMBINÁCIE TECHNÍK TLC A IEC SPOLU S BEŽNE DOSTUPNÝM SKENEROM 

NA ANALÝZU HUMÍNOVÝCH LÁTOK Z PÔDY POMOCOU METÓDY HPLC 

JANKA RÁCZOVÁ, MILAN HUTTA a JURAJ PESSL ..................................................................................................str. 21 

IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE VE SKOKOVÉM GRADIENTU pH 

ELIŠKA ŠIŠPEROVÁ, ELIŠKA GLOVINOVÁ, JAN POSPÍCHAL ...............................................................................str. 29 

BIOAKUMULÁCIA TOXICKÝCH PRVKOV MIKROSKOPICKOU HUBOU ASPERGILLUS NIGER A JEJ 

VYUŽITIE NA ELIMINÁCIU ENVIRONMENTÁLNEJ ZÁAŽE 

JANA BARTEKOVÁ, LENKA MACHÁKOVÁ, MÁRIA ŽEMBERYOVÁ, ALEXANDRA ŠIMONOVIOVÁ, 

KATARÍNA GÁPLOVSKÁ ..............................................................................................................................................str. 35 

DEVELOPMENT OF THE SOLID SAMPLING ETAAS METHOD FOR THE DETERMINATION OF TIN 

IN SOILS AND THE COMPARISON WITH DISSOLUTION BASED LIQUID SAMPLING ETAAS 

PÉTER TÖRÖK and MÁRIA ŽEMBERYOVÁ ................................................................................................................str. 41 

GC-FID STANOVENIE CELKOVÉHO OBSAHU ESTEROV KYSELINY FTALOVEJ PO ICH KONVERZII 

NA DIMETYL FTALÁT V POTRAVINÁCH 

RÓBERT KUBINEC, JANKA KUBINCOVÁ, PETER PODOLEC, ALEXANDRA SZABÓOVÁ, IVAN OSTROVSKÝ, 

RENÁTA GÓROVÁ, JOZEF VIŠOVSKÝ ....................................................................................................................str. 48 

UVONENIE PRCHAVÝCH ORGANICKÝCH ZLÚENÍN (VOCs) Z PÚCNYCH RAKOVINOVÝCH BUNIEK 

WOJCIECH FILIPIAK, ANNA FILIPIAK, ANDREAS SPONRING, CLEMENS AGER, ANTON AMANN, JAKOB 

TROPPMAIR, ALEXANDRA SZABÓOVÁ, RÓBERT KUBINEC ................................................................................str. 51 

TEPLOTNE PROGRAMOVANÉ PLYNOVO CHROMATOGRAFICKÉ LINEÁRNE RETENNÉ INDEXY 

VŠETKÝCH C4-C23 METYLESTEROV MONOMETYLOVANÝCH NASÝTENÝCH MASTNÝCH KYSELÍN 

NA METYLSILIKÓNOVEJ OV-1 STACIONÁRNEJ FÁZE 

RÓBERT KUBINEC, JAROSLAV BLAŠKO, RENÁTA GÓROVÁ, GABRIELA ADDOVÁ, IVAN OSTROVSKÝ, 

ANTON AMANN, LADISLAV SOJÁK ...........................................................................................................................str. 59 

UTILIZATION OF La(NO3)3 TO MINIMIZE THE PHOSPHATE INTERFERENCES BY Pb DETERMINATION 

IN FOOD-STUFFS AT 217.0 NANOMETERS USING SOLID SAMPLING-ETAAS 

PÉTER TÖRÖK and MÁRIA ŽEMBERYOVÁ ................................................................................................................str. 70 

GC-MS ANALÝZA ZLOŽENIA MASTNÝCH KYSELÍN LETNÉHO A ZIMNÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA 

A OBSAH CLA VO VYROBENOM 

JAROSLAV BLAŠKO, IVAN OSTROVSKÝ, RENÁTA GÓROVÁ, JANKA KUBINCOVÁ, JOZEF VIŠOVSKÝ, 

IGOR FÁBRY, LADISLAV SOJÁK .................................................................................................................................str. 76 

IN-ELECTRODE COULOMETRIC TITRATION TO DETERMINATE SOME COMPONENTS IN WATER 

ALENA MANOVÁ, ERNEST BEINROHR, FRANTIŠEK ACHO, ROMAN HUDEC ................................................str. 84 

POSSIBLE DIAGNOSIS OF OVARIAN CANCER BY SYNCHRONOUS FLUORESCENCE SPECTRA OF URINE 

MILAN ZVARÍK, LIBUŠA ŠIKUROVÁ and UBA HUNÁKOVÁ ...............................................................................str. 88 

COMPUTER-AIDED OPTIMIZATION OF MICROEXTRACTION TECHNIQUE 

MIROSLAVA BURSOVÁ, RADOMÍR ABALA ..........................................................................................................str. 92

KRYŠTÁLOVÁ ŠTRUKTÚRA A BIOLOGICKÁ AKTIVITA CHIRÁLNYCH DERIVÁTOV INDOLIZÍNU 

VIKTOR VRÁBEL, UBOMÍR ŠVORC a ŠTEFAN MARCHALÍN.............................................................................str. 100 

ŠTÚDIUM MOŽNOSTI VYUŽITIA AFINITNEJ CHROMATOGRAFIE S IMOBILIZOVANÝMI IÓNMI KOVU 

NA FRAKCIONÁCIU HUMÍNOVÝCH LÁTOK 

RADOSLAV HALKO, KATARÍNA KROVÁ, LUCIA KOZÁKOVÁ a MILAN HUTTA ........................................str. 106 

ŠTÚDIUM OFF-LINE ÚPRAVY VZORKY PÓDY METÓDOU DISPERZIE MATRICE NA TUHEJ FÁZE (MSPD) 

PRED RP-HPLC ANALÝZOU VYBRANEJ SKUPINY PESTICÍDOV 

MÁRIA CHALÁNYOVÁ, IVANA PROCHÁCKOVÁ ..................................................................................................str. 110 

SIMULTANOUS DETERMINATION OF GALACTITOL AND GALACTOSE IN AQUEOUS SAMPLES BY GAS 

CHROMATOGRAPHY – MASS SPECTROMETRY 

IVAN OSTROVSKÝ, RÓBERT KUBINEC, JAROSLAV BLAŠKO, JOZEF VIŠOVSKÝ, RENÁTA GÓROVÁ, 

GABRIELA ADDOVÁ, PETER PODOLEC, ALEXANDRA SZABÓOVÁ .................................................................str. 116 

ANALYSIS OF LYSOZYME IN HUMAN SALIVA USING BY OFF-LINE COMBINATION OF PREPARATIVE 

ISOTACHOPHORESIS AND MASS SPECTROMETRY 

MONIKA KONDEKOVÁ, ANDREA STAOVÁ, JOZEF MARÁK ............................................................................str. 124 

RAPID LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF IBUPROFEN AND ITS 

METABOLITES IN HUMAN URINE 

ANDREA STAOVÁ, JOZEF MARÁK, MONIKA RADIOVÁ, DUŠAN KANIANSKY ........................................str. 133 

DVOUROZMRNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE - PERSPEKTIVNÍ TECHNIKA PRO ANALÝZU 

SLOŽITÝCH VZORKÚ PÍRODNÍCH LÁTEK 

PAVEL JANDERA ..........................................................................................................................................................str. 145 

STANOVENIE OXIDANÝCH PRODUKTOV OXIDU DUSNATÉHO V TELOVÝCH TEKUTINÁCH 

NA ELEKTROFORETICKOM IPE 

PETER TROŠKA, MARIÁN MASÁR, MICHAL HORIIAK, RICHARD CHUDOBA, 

DUŠAN KANIANSKY ...................................................................................................................................................str. 153 

VYUŽITIE KAPILÁRNEJ ZÓNOVEJ ELEKTROFORÉZY PRI MONITORINGU ROZKLADNÝCH 

PRODUKTOV NIEKTORÝCH LIEIV 

PAVOL KRUK, HENRIETA STANKOVIOVÁ, MARIÁN MASÁR, DUŠAN KANIANSKY, 

ANTON GÁPLOVSKÝ ...................................................................................................................................................str. 160 

VYUŽITIE ELEKTROFORETICKÉHO IPU PRE STANOVENIE RÔZNYCH BIOMARKEROV 

V NEUROLOGICKEJ DIAGNOSTIKE 

LADISLAV DAN, MARIÁN MASÁR, DUŠAN KANIANSKY ................................................................................str. 164 

RÝCHLY MONITORING ANIÓNOV A KATIÓNOV V PITNÝCH VODÁCH ZÓNOVOU ELEKTROFORÉZOU 

NA IPE S VODIVOSTNOU DETEKCIOU 

MILAN LUC, MARIÁN MASÁR, DUŠAN KANIANSKY ...........................................................................................str. 172 

CHARAKTERIZÁCIA RP-HPLC FRAKCIONOVANÝCH HUMÍNOVÝCH KYSELÍN VYUŽITÍM 

KOMBINÁCIE RP-HPLC METÓDY S ELÚCIOU SO SKOKOVÝM A LINEÁRNYM GRADIENTOM 

ROHÁRIK PAVOL, GÓRA RÓBERT, HUTTA MILAN ..............................................................................................str. 177 

VPLYV ZWITERIONICKÝCH DETERGENTOV NA SEPARÁCIU HUMÍNOVÝCH KYSELÍN ZÓNOVOU 

ELEKTROFORÉZOU S IZOTACHOFORETICKOU ÚPRAVOU V SPÁJANÝCH KOLÓNACH 

ANDREA PASTIEROVÁ, RÓBERT BODOR, DUŠAN KANIANSKY .......................................................................str. 184 

OVPLYVNENIE SEPARANEJ KAPACITY ZNÍŽENÍM SATURANÉHO FAKTORA A PREKRYV PÍKOV 

V HYDRODYNAMICKY OTVORENOM A ZATVORENOM SEPARANOM SYSTÉME PRI STANOVENÍ 

MNOHOZLOŽKOVEJ MODELOVEJ VZORKY 

MIROSLAVA HALAŠIOVÁ, RÓBERT BODOR, DUŠAN KANIANSKY ..................................................................str. 190 

CHARAKTERIZÁCIA PÔDNYCH HUMÍNOVÝCH KYSELÍN OFF-LINE KOMBINÁCIOU METÓD RP-HPLC A 

SEC 

RÓBERT GÓRA, MILAN HUTTA, PAVOL ROHÁRIK, NATÁLIA MASARYKOVÁ .............................................str. 198 

VÝVOJ NOVEJ METÓDY ANEXOVEJ CHROMATOGRAFIE NA CHARAKTERIZOVANIE PÔDNYCH A 

RAŠELINOVÝCH HUMÍNOVÝCH LÁTOK 

MILAN HUTTA, JURAJ PESSL, JANKA RÁCZOVÁ .................................................................................................str. 206

ANALÝZA BENZÉNU, TOLUÉNU, ETYLBENZÉNU A XYLÉNOV VO VODNÝCH VZORKÁCH POUŽITÍM 

TECHNIKY INCAT-GC 

HELENA JURDÁKOVÁ a , PETER PODOLEC*, ALEXANDRA SZABÓOVÁ, JANA KRUPOVÁ, JAROSLAV 

BLAŠKO a , IVAN OSTROVSKÝ a , LADISLAV SOJÁK a , JOZEF VIŠOVSKÝ a , VICTOR G. BEREZKIN b 

a 

Chemický ústav, Prírodovecká fakulta Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovensko 

b 

A.V. Topchiev Institute of Perochemical Synthesis, Russian Academy of Science, Leninsky Prosp. 29, 119991 Moscow, 

Russia 

email: podolec@fns.uniba.sk 

Úvod 

Dôležitou úlohou ochrany životného prostredia je zisti prítomnos a zdroje rôznych kontaminantov a uri ich 

koncentrácie. Prchavé a iastone prchavé organické zlúeniny tvoria vekú as kontaminantov životného prostredia, ktoré 

sú objektmi plynovochromatografickej (GC) analýzy. V mnohých prípadoch sú zlúeniny vo vzorkách zo životného 

prostredia prítomné v nízkych koncentráciách a bežne používané GC detektory nie sú schopné ich detegova. Z tohto dôvodu 

je príprava vzoriek zásadným krokom analýzy. V súasnosti sa v environmentálnej analýze venuje osobitná pozornos 

metódam prípravy vzoriek, ktoré zabezpeujú zníženie množstva použitých kvapalných rozpúšadiel alebo dokonca ich 

úplnú elimináciu poas analytického postupu. Poet predúpravných krokov prípravy vzoriek by mal by minimálny [1,2]. 

Existuje vea techník bez použitia rozpúšadiel, medzi ktoré patrí aj rozvíjajúca sa technika INCAT (inside needle 

capillary adsorption trap) [3-17]. Táto technika je vhodná na analýzu prchavých organických zlúenín prítomných 

v stopových koncentráciách v rôznych vzorkách. Prchavé organické zlúeniny, akými sú aj benzén, toluén, etylbenzén 

a xylény (BTEX) sú polutanty životného prostredia a kvôli ich mobilite a škodlivým úinkom je potrebné tieto zložky 

v životnom prostredí analyzova. 

Medzi hlavné výhody zariadenia INCAT patria jednoduchá metodika, jednoduchos a rýchlos analýzy [6]. 

Nevýhodami sú skutonosti, že objem odobratých vzoriek je obmedzený, teplota desorpcie je limitovaná teplotou injekného 

portu plynového chromatografu a eluné zóny analytov sú mierne rozmyté [6]. alšie problémy spoívajú v kompetitívnych 

efektoch a kolísaní v úinnosti vzorkovania pre rôzne analyzované látky v dôsledku nízkej kapacity sorbentu [8]. 

Cieom práce bolo vyvinú robustné zariadenie INCAT s adsorbentom v celom objeme ihly vhodné na 

zakoncentrovanie stopových množstiev prchavých organických zlúenín, benzénu, toluénu, etylbenzénu, meta- a orto-xylénu 

z vodných vzoriek. Normalizovaný prípustný limit kvality pre pitnú vodu je 1 μg.l -1 pre benzén, 50 μg.l -1 pre toluén a 100 

μg.l -1 pre xylén [18]. Táto práca opisuje nové usporiadanie zariadenia INCAT s boným otvorom a sorbentom Carbopack X 

v celom objeme ihly. Používal sa uzatvorený systém stripovania analytov z vodných vzoriek. Na desorpciu zachytených 

analytov sa použil injekný port plynového chromatografu s modifikovaným kovovým linerom. Skúmali sa experimentálne 

parametre ako prierazový objem (BTV) stripovacieho plynu, linearita, opakovatenos, limit detekcie (LOD) a kvantifikácie 

(LOQ). 

Experimentálne podmienky 

Materiály 

Nápl zariadenia INCAT tvoril sorbent Carbopack X 0,25-0,42 mm s aktívnym povrchom 250 m 2 g -1 od Supelco 

(Bellefonte, USA). Štandardy benzén, toluén, etylbenzén, xylén m- a o-xylén boli zo Slovenského metrologického ústavu 

(Bratislava, Slovensko) a metanol (gradient grade) od firmy Merck (Darmstadt, Nemecko). Ihly z nerezovej ocele (kanyly) 

90 mm dlhé s vonkajším/vnútorným priemerom 1,3 mm/1,1 mm a 1,1 mm/0,9 mm sa získali od Nissho (Osaka, Japonsko). 

Z tohto materiálu sa pripravili tiež frity (5 mm × 1,1 mm o.d./0,9 mm i.d.), naplnili sa sklenými guôkami (0,125-0,2 mm) 

a následne boli sintrované pri 680 °C po dobu 45 minút v laboratórnej piecke. Sklené guôky sa získali od BDH (Poole, 

Anglicko), laboratórna piecka CLASSIC 1313 od CLASSIC CZ s.r.o. (evnice, eská republika). MTB vzorkovací ventil od 

Hamilton (Reno, Nevada, USA). Kapilára z nerezovej ocele (200 mm × 1,6 mm o.d./0,5 mm i.d.) na stripovanie vodných 

vzoriek bol od Supelco (Bellefonte, USA) a dve vitónové hadiky (1000 mm × 3.2 mm o.d /1,6 mm i.d.) spájajúce zariadenie 

INCAT a kapiláru z nerezovej ocele s pumpou boli od Masterflex (Vernon Hills, IL, USA). 

Vzorkovanie 

Vodné vzorky (s objemom 50 ml) na skúmanie prierazového objemu stripovacieho plynu pre INCAT zariadenie sa 

pripravili pridaním 5 μl štandardného roztoku metanolu obsahujúceho 100 mgl -1 jednotlivých zlúenín BTEX. Pri sledovaní 

linearity sa do vzoriek pitnej vody (50 ml) pridalo 5 μl štandardného roztoku metanolu obsahujúceho 1-1000 mgl -1 každého 

BTEX. Reálna vzorka vody pochádzala z rieky Malý Dunaj v západnej oblasti Slovenska, 2 km od ropnej rafinérie. 

 

Zborník príspevkov 

z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie 

"Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9 

- 1 - 

hotel Falkensteiner, Bratislava 

11. - 14. 10. 2010

Vzorky vody sa stripovali pomocou membránovej vákuovej pumpy KNF LAB (KNF Neuberger, Freiburg, 

Nemecko) pri laboratórnej teplote 21 °C. Na zachovanie presného stanovenia objemu stripovacieho plynu v rozsahu 

50-20 000 ml sa použil prietokomer FlowTracker 1000 (Agilent Technologies, Avondale, USA). 

GC analýza 

GC merania sa uskutonili na plynovom chromatografe Agilent Technologies 6890N (Avondale, USA), 

s plameovo ionizaným detektorom (FID) a split/splitless injektorom. Nosný plyn bolo hélium s tlakom 60 kPa v injektore. 

Teplota detektora sa udržiavala na 280 °C. Dávkovania na desorpciu aromatických štandardov zo zariadení INCAT sa 

uskutonili v splitless móde po dobu 3 minút pri teplote injekného portu 280 °C. Následne sa zariadenie INCAT z injektora 

odstránilo a systém sa prepol do split módu. Použil sa nasledujúci teplotný program: 50 až 250 °C s 10 °C.min -1 . Na GC 

separáciu sa použila kapilárna kolóna DB-1 (30 m x 0,32 mm i.d, df = 5 μm; J&W Scientific, Folsom, CA, USA). 

Validácia metódy 

Validácia metódy sa uskutonila poda postupu EURACHEM [19,20]. Limity detekcie (yD) a kvantifikácie (yQ) sa 

vyjadrili ako signály založené na priemere slepých pokusov ( x b ) a smerodajná odchýlka odozvy slepých pokusov (sb): 

yD = x b + 2tsb yQ = x b + 10sb 

kde t je konštanta t-testu Studentovej distribúcie závislá od úrovne spoahlivosti (vybral sa 95% interval spoahlivosti) 

a stupov vonosti. Hodnoty b a sb sa vypoítali uskutonením 10 slepých pokusov. Hodnoty koncentrácií LOD a LOQ sa 

získali projekciou zodpovedajúcich signálov yD a yQ prostredníctvom kalibranej závislosti y= f(x) na koncentranú os. 

Linearita sa overila v rozsahu troch poriadkov a potvrdila sa uskutonením Mandelovho testu. Za úelom overenia 

opakovatenosti sa vypoítali smerodajné odchýlky z piatich meraní so štyrmi rôznymi koncentráciami. 

Výsledky a diskusia 

Návrh zariadenia INCAT modifikovaného kovového linera 

Vyvinulo sa nové usporiadanie zariadenia INCAT s adsorbentom v celom objeme ihly na zakoncentrovanie stopových 

množstiev prchavých organických látok (BTEX) z vodných vzoriek. Ako je znázornené na Obr. 1, zariadenie sa skladá z ihly 

z nerezovej ocele N s boným otvorom H, z frít z nerezovej ocele F naplnených sklenými guôkami, zatváracieho ventilu V, 

tesnenia z PTFE a silikónových hadiiek T a adsorbentu Carbopack X (40 mm džky ihly, 12,5 mg) A. 

Obr.1 Schéma INCAT zariadenia. N, ihla z nerezovej ocele; F, frity zo sklených guôok; A, adsorbent Carbopack X; H, 

boný otvor; T, tesnenie z PTFE a silikónovej hadiky; V, zatvárací ventil. 

Analyty sa zo vzoriek vôd stripujú pomocou pumpy a zachytávajú na adsorbente v zariadení INCAT. Používal sa 

uzatvorený systém stripovania (Obr. 2). Po zachytení analytov sa na zariadení INCAT uzatvorí ventil a analyty sa desorbujú 

vo vyhrievanom injeknom porte plynového chromatografu, odkia sú následne unášané nosným plynom do kapilárnej 

kolóny na separáciu. Nosný plyn prúdi cez zariadenie INCAT cez boný otvor v injektore plynového chromatografu. 

Na dosiahnutie minimálneho mtveho objemu sa používal injekný port s modifikovaným kovovým linerom (Obr. 3). 

Liner (78 mm džka, 6 mm o.d., 1,5 mm i.d.) bol vyrobený z nerezovej ocele kvôli dobrej tepelnej vodivosti a inertnosti tohto 

materiálu. Skladá sa z dvoch kovových astí, ktoré sú spojené závitom a vitónovou hadikou (10 mm džka × 4 mm o.d./0,9 

mm i.d.), ktorá slúži ako tesnenie medzi dvoma asami. Táto modifikácia linera zabezpeuje prúdenie nosného plynu 

priamo cez boný otvor zariadenia INCAT, a tak nie je potrebný alší zdroj inertného plynu na zavedenie analytov do 

chromatografického systému. Po desorpcii analytov a odstránení INCAT zariadenia z injektora je umožnený voný prechod 

nosného plynu cez liner. 

Novo navrhnuté zariadenie INCAT je tiež charakteristické uzavretým sorpno-desorpným systémom, ale na rozdiel od 

prechádzajúceho uverejneného zariadenia [12,16] nepotrebuje na podporu zavedenia analytov do prístroja pomoc vodných 

pár. 

 




- 2 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 2. Schéma uzatvoreného systému stripovania. H, stojan; C, kapilára z nerezovej ocele; N, INCAT zariadenie; V, vialka; 

S, vzorka; T, vitónové hadiky. 

Prierazový objem (BTV) 

Obr.3. Schéma injekného portu s kovovým linerom a INCAT zariadením. Aby sa získal maximálny výažok každej BTEX pri stripovaní bez straty najprchavejšej zložky (benzén), skúmal sa 

prierazový 

objem (BTV). Obr. 4 znázoruje závislos výažku stripovania každej BTEX od objemu stripovacieho plynu pri 

21 °C. 100% vystripovanie sa dosiahne pri objeme stripovacieho plynu 2000 ml pre dané zariadenie INCAT a všetky analyty. 

Táto hodnota objemu stripovacieho plynu je tiež hodnota BTV pre benzén a výažok stripovania klesá pri vyšších objemoch 

stripovacieho plynu. Pri objeme stripovacieho plynu 15 000 ml sa benzén takmer úplne vyfúka zo zariadenia INCAT 

a toluénu zane ubúda, keže sa dosiahne BTV pre toluén. Pre ostatné zlúeniny sa BTV nedosiahne ani pri objeme 

stripovacieho plynu 20 000 ml. 

 




- 3 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr.4. Závislos výažku stripovania (R) jednotlivých BTEX od objemu stripovacieho plynu pri 21 °C. 

Linearita, opakovatenos, limit detekcie a kvantifikácie 

Na stanovenie linearity kalibranej závislosti sa analyzovali vzorky BTEX pri desiatych rôznych koncentráciách (0,1; 

0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 a 100 μgl -1 ). V tabuke 1 sú uvedené hodnoty smerníc a úsekov jednotlivých závislostí, 

korelané koeficienty, F calc a Fcrit z Mandelovho testu pre všetky zložky analyzované pomocou zariadenia INCAT. Z tabuky 

1 je zrejmé, že kalibrané závislosti sú lineárne v celom rozsahu koncentrácií, o potvrdzujú hodnoty Fcalc a F crit 

z Mandelovho testu. 

Opakovatenos vyjadrená pomocou relatívnej smerodajnej odchýlky (RSD), uvedená v tabuke 2, sa sledovala pri 

štyroch koncentráciách (0,1; 0,5; 5 a 50 μgl -1 ). Pre každú koncentráciu sa uskutonilo pä meraní. Pre koncentrácie 5 a 50 

μgl -1 sú hodnoty RSD v rozsahu 0,5-2,6%. Vyššie hodnoty RSD sú pri nižších koncentráciách blízke limitu detekcie. 

Sledoval sa tiež pamäový efekt a bol zaznamenaný pri vyšších koncentráciách 50 a 100 μgl -1 . Pri druhej desorpcii 

z INCAT zariadenia bolo množstvo nedesorbovaných analytov nižšie než 0,1% vo všetkých prípadoch. Odstránenie tohto 

efektu vyžaduje dlhší as na desorpciu, o nemá žiadny vplyv na analýzu. 

Limity detekcie a kvantifikácie sú uvedené v tabuke 3 spolu s priemernými hodnotami pre slepé pokusy a smerodajnou 

odchýlkou slepých pokusov z 10 meraní. LOD hodnoty pre vodné vzorky BTEX namerané pomocou INCAT zariadenia sú 

0,05-0,07 μgl -1 , o je porovnatené s bežne používanými technikami purge-and-trap (P & T) a mikroextrakcie na tuhej fáze 

(SPME) [12,16]. 

Tabuka 1. Hodnoty smerníc (a) a úsekov (b) jednotlivých kalibraných závislostí pre BTEX v rozsahu koncentrácií 0,1-100 

μgl -1 , korelané koeficietny (r 2 ), vypoítané (Fcalc) a kritické (Fcrit) hodnoty Mandelovho testu. 

Analyty a b r 2 F cal F crit 

Benzén 616,12 -18,03 0,9996 9,14 12,25 

Toluén 612,21 2,61 0,9997 3,16 12,25 

Etylbenzén 562,57 3,92 0,9999 5,45 12,25 

m-Xylén 615,59 -2,47 0,9999 4,42 12,25 

o-Xylén 503,66 7,97 0,9998 4,11 12,25 

Tabuka 2. Hodnoty relatívnej smerodajnej odchýlky (RSD) pre odozvy BTEX pri 4 koncentráciách. 

Analyty RSD (%) 

0,1 μgl -1 

0,5 μgl -1 5 μgl -1 50 μgl -1 

Benzén 11,6 7,9 0,6 1,3 

Toluén 8,8 5,1 0,7 1,6 

Etylbenzén 3,0 2,2 0,5 2,0 

m-Xylén 7,8 1,7 0,6 1,6 

o-Xylén 5,7 1,0 2,6 1,5 

Tabuka 3. Priemerné hodnoty slepých pokusov ( x b ), smerodajné odchýlky slepých pokusov (sb), limity detekcie (LOD) 

a kvantifikácie (LOQ) pre jednotlivé BTEX použitím INCAT zariadenia vyrátané z 10 meraní. 

Analyty 

x b (pAs) sb (pAs) LOD (μgl 1 ) LOQ (μgl 1 ) 

Benzén 11,53 1,71 0,06 0,08 

Toluén 27,39 3,74 0,07 0,10 

Etylbenzén 16,34 3,66 0,05 0,09 

m-Xylén 31,28 2,45 0,07 0,09 

o-Xylén 33,55 2,24 0,07 0,10 

 




- 4 - 


11. - 14. 10. 2010

Reálne vzorky 

Na obr. 5 je znázornený chromatogram vzorky vody z rieky Malý Dunaj. Stanovené koncentrácie jednotlivých 

látok boli 0,4; 3,8; 1,1; 3,0; 1,5 μgl -1 pre benzén, toluén, etylbenzén, m-xylén, p-xylén a o-xylén. 

Obr.5. Chromatogram vzorky vody z rieky Malý Dunaj. 1, benzén; 2, toluén; 3, etylbenzén; 4, m-xylén a p-xylén, 5, o-xylén. 

Záver 

Nové usporiadanie zariadenia INCAT so sorbentom Carbopack X a upravený kovový liner sa použili na analýzu 

stopových množstiev BTEX vo vzorkách vôd. Vyvinuté zariadenie je vhodné na analýzu BTEX vo vzorkách pitnej 

a odpadovej vody v širokom lineárnom rozsahu s vemi dobrou opakovatenosou. Limity detekcie aj kvantifikácie pre 

BTEX zlúeniny analyzovaných zariadením INCAT sú porovnatené s bežne používanými metódami P & T a SPME. Medzi 

hlavné výhody INCAT zariadenia v porovnaní s uvedenými technikami patria predovšetkým nižšia cena analýz a mechanická 

odolnos. alšími výhodami sú tiež jednoduchá metodika, jednoduchos a rýchlos analýz. 

Príspevok vznikol v rámci projektu ITMS 26240220007 s názvom „Výskum a vývoj nových technológií chemickej analýzy pre 

metabonomiku/metabolomiku“. 

Literatúra 

[1] J. Namiesnik,W.Wardencki, J. High Resolut. Chromatogr. 23 (2000) 297. 

[2] K. Demeestere, J. Dewulf, B. De Witte, H. Van Langenhove, J. Chromatogr. A 1153 (2007) 130. 

[3] W.K. Fowler, C.H. Duffey, H.C. Miller, Anal. Chem. 51 (1979) 2333. 

[4] L. Jech, Ph.D. Thesis, Charles University, Prague, 1992. 

[5] S. Müller, J. Efer,W. Engewald, Chromatographia 38 (1994) 694. 

[6] T. Qin, X. Xu, T. Polák, V. Pacáková, K. Štulík, L. Jech, Talanta 44 (1997) 1683. 

[7] M.E. McComb, R.D. Oleschuk, E. Giller, H.D. Gesser, Talanta 44 (1997) 2137. 

[8] S. Shojania, R.D. Oleschuk, M.E. McComb, H.D. Gesser, A. Chow, Talanta 50 (1999) 193. 

[9] J. Lipinski, Fresenius J. Anal. Chem. 369 (2001) 57. 

[10] V.G. Berezkin, E.D. Makarov, B.V. Stoljarov, Neftekhim 42 (2002) 242. 

[11] V.G. Berezkin, E.D. Makarov, B.V. Stoljarov, J. Chromatogr. A 985 (2003) 63. 

[12] R. Kubinec, V.G. Berezkin, R. Górová , G. Addová , H. Mranová , L. Soják, J. Chromatogr. B 800 (2004) 295. 

[13] A.Wang, F. Fang, J. Pawliszyn, J. Chromatogr. A 1072 (2005) 127. 

[14] Y. Saito, I. Ueta, K. Kotera, M. Ogawa, H. Wada, K. Jinno, J. Chromatogr. A 1106 (2006) 190. 

[15] A. El-Beqqali, A. Kussak, M. Abdel-Rehim, J. Chromatogr. A 1114 (2006) 234. 

[16] P. Pikryl, R. Kubinec, H. Jurdáková, J. Ševík, I. Ostrovský, L. Soják, V. Berezkin, Chromatographia 64 (2006) 65. 

[17] Y. Saito, I. Ueta, M. Ogawa, M. Hayashida, K. Jinno, J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (2007) 1. 

[18] Water quality—determination of benzene and some derivates, 1993, ISO/DIS 11423. 

[19] The fitness for purpose of analytical methods: a laboratory guide to method validation and related topics, in: 

EURACHEM Guide, first English ed., LGC, Teddington, 1998. 

[20] M.C. Bruzzoniti, S. Cavalli, A. Mangia, C. Mucchino, C. Sarzanini, E. Tarasco, J. Chromatogr. A 997 (2003) 51. 

 




- 5 - 


11. - 14. 10. 2010

MOŽNOSTI VYUŽITIA ATÓMOVEJ EMISNEJ SPEKTROMETRIE AKO METÓDY ANORGANICKEJ 

PRVKOVEJ ANALÝZY V ENVIRONMENTALISTIKE 

KAROL FLÓRIÁN*, MIROSLAVA HAMBORSKÁ a VLADISLAVA MIKOVÁ 

Katedra chémie Hutníckej fakulty TU v Košiciach,Letná 9, Košice,042 00 

Karol.Florian@tuke.sk 

Úvod 

V oblasti environmentálnych analýz sa stále viac kladie dôraz na fakt, že reálny obraz o miere zneistenia životného 

prostredia nie je možné získa len na základe údajov celkového obsahu rizikových prvkov v environmentálnych vzorkách, ale 

hlavne na základe údajov o ich výskyte v rôznych fyzikálno-chemických formách. Tento prístup je pri hodnotení zdravotných 

dopadov oprávnený najmä preto, lebo as z celkového obsahu prvku je pevne viazaná v stabilných formách, ktoré 

neinteragujú so životným prostredím, ale ovea nebezpenejšie sú tie formy ktoré sú schopné za uritých podmienok sa 

rozpúša a dostáva až do biologického reazca (bioprístupné formy) [1]. Tieto prvkové formy v životnom prostredí 

prejavujú rozdielnu mieru toxicity a pohyblivosti. Z uvedeného dôvodu sa v ostatných rokoch venuje mimoriadna pozornos 

metódam frakcionanej a špecianej analýzy [2,3] aj v oblasti anorganických environmentálnych analýz. Aplikované metódy 

sú však asovo aj finanne nároné a mnohokrát aj problematické kvôli malým množstvám environmentálne relevantných 

vzoriek (gravitané prašné spady, biofilmy [4], slúžiace na monitorovanie vodných ekosystémov). 

V mnohých prípadoch, prednostne pri sledovaní výskytu tzv. ažkých kovov postauje pre prvotnú informáciu 

o environmentálnej záaži aj výsledok anorganickej prvkovej analýzy (vi príslušné Vládne nariadenia, resp. vyhlášky MŽP 

SR [5-7]), ktorý umožní v prvom rade ich precíznu charakterizáciu, resp. klasifikáciu. Pri tejto innosti je neodmyslitená 

aplikácia vhodných, rýchlych ale súasne dostatone spoahlivých analytických metód, vyznaujúcich sa aj výhodnou 

dôkazuschopnosou. Takto definovaná analyticko-chemická úloha je typickým zadaním pre oblas metód atómovej 

spektroskopie a to so špeciálnym zameraním na neštandardné metódy priamej (bezrozkladovej) analýzy [8], ktoré majú v 

porovnaní s postupmi založenými na analýze roztokov rad výhod – nízke limity stanovitelnosti, malé množstvá vzoriek, 

jednoduchos a rýchlos. Vylúenie agresívnych chemikálií, používaných pri rozklade vzoriek pre klasické spektrometrické 

techniky (prednostne ICP-OES) je taktiež pozitívom, hlavne z ekologického pohadu. V oblasti environmentálnych aplikácií 

majú významnú úlohu metódy s modernou inštrumentalizáciou so súasným využitím generáciami spektrochemikov 

zozbieraných skúseností. Svoje uplatnenie našla - s ohadom na malé množstvá vzoriek opä aj kombinácia oblúkového 

výboja (vo výrazne modernizovanej verzii [9]) s moderným spektrometrom, iže iastoný návrat ku klasike, úspešnej v 

druhej polovici minulého storoia. Kombinácia elektrotermického vyparovania (ETV - známeho v oblasti AAS) s indukne 

viazanou plazmou (ICP) a Echelle-CID-spektrometrom [10] otvorila pre oblas prvkovej environmentálnej analýzy taktiež 

rad nových možností. 

Uritým problémom pri priamych (bezrozkladových) analýzach sa javí analytická kalibrácia, hlavne pre nedostatok 

vhodných certifikovaných referenných materiálov (CRM), prípadne pre nevhodné koncentrané rozpätia existujúcich CRM. 

Problém sa dá iastone obís použitím tzv. mono-štandardového postupu [11,12], kedy sa zmena látkového množstva 

dosahuje variabilnými navážkami jediného (prípadne niekoko málo) CRM. 

Príspevok je zameraný na niekoko konkrétnych príkladov možností využitia priamej (bezrozkladovej) atómovej 

spektrometrie v rozliných oblastiach environmentálne orientovaných prvkových anorganických analýz. 

Experimentálna as 

Inštrumentalizácia bola rôzna pri jednotlivých uvádzaných príkladoch. Pri analýze vzoriek gravitaných prašných 

spadov sa aplikoval aj moderný, elektronicky riadený oblúkový výboj DCA-301 v kombinácii s mnohokanálovým 

spektrometrom LECO-750, kde prenos žiarenia na detektor (fotonásobie) bol realizovaný pomocou dvoch snímacích 

šošoviek a svetlovodov (schéma na obr.1). 

a b c 

Obr.1.: (a); pohad do elektródového priestoru DCA – 301 poas analýzy (b), schéma usporiadania elektródového priestoru 

a dvojitej optiky (c) (prevzaté z [14]) 




- 6 - 


11. - 14. 10. 2010

Modernizovaný oblúkový výboj (obr.1) sa použil aj v kombinácii s Echelle-CID-spektrometrom IRIS Intrepid II XSP 

pri analýze sedimentov, pri sledovaní kovových prvkov v biofilmoch sa použil komerný CID-Echelle-spektrometer 

s integrovaným iastone programovateným oblúkovým výbojom ATOMCOMP-2000 (obr.2) a nakoniec pri tzv. 

mnohomatrixovej kalibrácii sa aplikovala technika ETV-ICP-OES, takisto so spektrometrom IRIS Intrepid II XSP. 

Podrobnosti experimentálnych podmienok uvádzajú tabuky I. a II. 

Tabuka I.: Experimentálne podmienky pri práci so zdrojom DCA-301 v spojení so spektrometrom LECO-750, resp. 

IRIS Intreprid II XSP 

Spektrometer 

LECO-750 / Intreprid II XSP 

Pracovná oblas 165 nm – 1000 nm 

Druh zobrazenia priame pomocou svetlovodu 

Druh budenia riadený jednosmerný oblúk 

Budiaci zdroj DCA-301 

Primárne napätie 220V 

Intenzita prúdu poda programu 4 až 18 A 

Expoziná doba individuálna, poda typu materiálu 

Typ elektród vysokoodporové uhlíkové elektródy, 

Elektrokarbon,s.r.o. Topoany 

Vzdialenos elektród 4,00 mm 

Nosná elektróda SW – 380 , kladná polarita 

Protielektróda SW – 202 

Vyhodnocovací softvér SPECTRUMAT / TEVA. 

Analytický signál 

integrovaná intenzita s individuálnou vobou 

integraných hraníc 

a b c 

Obr.2.: Optický emisný spektrometer AtomComp 2000 (a), príklad programu asovej závislosti riadeného oblúka (b), 

schéma merania signálu na CID ipe (c) 

Tabuka II.: Experimentálne podmienky pri práci so spektrometrom Atomcomp-2000 

Spektrometer ATOMCOMP 2000 


Druh zobrazenia priame s jednou šošovkou 

Druh budenia riadený jednosmerný oblúk 

Budiaci zdroj integrovaný jednosmerný oblúk 

Primárne napätie 220V 

Intenzita 4 – 18 A 

Expoziná doba 5 + 15 + 25 s (posledný krok menitený) 

Typ elektród grafitové elektródy, Carbonne-Lorraine 

Vzdialenos elektród 4,00 mm 

Nosná elektróda typ 9119, kladná polarita 

Protielektróda typ 9109 

Vyhodnocovací softvér ThermoSPEC/CID 


integrovaná intenzita s pevne nastavenými hranicami 

integrácie (voba pixelov) 




- 7 - 


11. - 14. 10. 2010

Prvková analýza gravitaných prašných spadov 

V rámci viac ako 10-roného sledovania gravitaných prašných spadov v hospodársko-sídelnej aglomerácii (HSA) 

Košice sa normovaným spôsobom [15] odoberali vzorky (obr.3), ktoré sa po odparení a vysušení pri 105°C miešali 

s grafitovým práškom a spektrochemickým prídavkom Li2CO 3 a následne sa navažovali do grafitových nosných elektród (15 

mg vzorky). Analytická kalibrácia sa realizovala pomocou štandardov pripravených synteticky zo spektrálne istých 

chemikálií . Výsledky (celkové množstvo spadu, resp. obsahy sledovaných prvkov: Cr, Cu, Mn, Pb, Sn, Ti, V, Zn a Fe) 

umožnili sledovanie dlhodobých trendov v záaži ažkými kovmi, ako aj súvislostí medzi obsahmi jednotlivých prvkov 

a celkovým gravitaným spadom. 

Obr.3: Vzorkovanie gravitaných prašných spadov 

Priama spektrometrická analýza sedimentov – rôzne kalibrané postupy 

Pri priamej spektrometrickej analýze sedimentov (rienych aj jazerných) sa využilo budenie v modernizovanom 

oblúkovom výboji v spojení so spektrometrom IRIS INTREPID a kalibrácia sa uskutonila dvoma spôsobmi: 

- klasickou metódou viacerých kalibraných vzoriek (CRM) s 10 opakovanými meraniami pri každej vzorke 

- tzv. monoštandardovou kalibráciou s využitím viacerých konštantných navážok (12 - 10 - 8 -6 – 2 – 1 mg) jedinej 

kalibranej vzorky (CRM) s 10 opakovaniami pri každom navážku 

- tzv. monoštandardovou kalibráciou s 50 variabilnými navážkami (0,48 – 11,50 mg) jediného štandardu (CRM) 

Vzorky sedimentov sa použili bez akéhokovek prídavku, navažovali sa priamo do grafitových elektród v príslušných 

množstvách. 

Priama spektrometrická analýza biofilmov 

Biofilmy - mikroorganizmy (baktérie, riasy, huby) sa akumulujú sa na pevných povrchoch, sú všadeprítomné na Zemi, 

kolonizujú všetky typy povrchov, kde je možný rast v prostredí pôd, podzemných a povrchových vôd. Vo vodných ekosystémoch 

sú dôležitou súasou potravinového reazca, podieajú sa na samoistiacich procesoch v pôdach, vodách a sedimentoch, 

hrajú podstatnú úlohu pri biologickom istení odpadových vôd ako aj pri bioremeditácii ažkých kovov, ktoré sa v biofilmoch 

akumulujú. 

V tomto prípade sa použila popísaná inštrumentácia Atomcomp-2000, kalibrácia sa realizovala pomocou synteticky pripravených 

vzoriek, ktorých zloženie (matrix + sledované prvky) sa zvolilo na základe literárnych údajov [4]. Matrix mal zloženie 

80 % SiO 2 + 10 % Fe2O3 + 10 % Al2O3, sledovali sa Mn (2,5 - 0,0125 % ), Cu (1,0 - 0,005 %), Zn(0,25 - 0,00125 %) 

a Cd, Co, Cr, Ni, Pb (0,1 - 0,0005 % ). Ako reálne vzorky sa odobrali dve vzorky v blízkosti areálu US Steel v Košiciach 

(obr.4 poda [16]) , na kontrolu slúžilo viacero CRM sedimentov, resp. kalov (BCR 144, BCR 146, BCR 277, GWB 07312). 

Obr.4: vzorka biofilmu [16] 

Multimatrixová kalibrácia 

Inštrumentalizácia ETV-ICP-OES je dostatone robustná voi vplyvom matrixu, pokia sa vhodne optimalizujú 

experimentálne podmienky. Pri sledovaní možnosti použitia jedinej kalibrácie pre odlišné environmentálne vzorky [17] sa 

použilo spojenie elektrotermickej atomizácie s ICP-spektrometrom IRIS Interpid s horizontálnou plazmou (obr.5), 

s experimentálnymi podmienkami, uvedenými v tabuke III. 




- 8 - 


11. - 14. 10. 2010

ICP-Torch 

Transport-Tube 

Bypass 

(Zusatzgas) 

ETV-Furnace 

~ 

Power-Supply 4kW 

Carrier-gas + 

Reaction-gas 

Obr.5: Horizontálne usporiadanie inštrumentalizácie ETV-ICP-OES (poda [17]) 

Tabuka III: Experimentálne podmienky pri práci s tandemovou technikou ETV-ICP-OES 


Spektrometer Intreprid II XSP 


Druh zobrazenia priame 

Druh budenia indukne viazaná plazma /horizontálna 

Výkon 1150 W, pri optimalizácii menitený 

Expoziná doba 25 s, integraná doba volitená 

Typ lodiky Grafitová 

Program ETV rozdielny pre - 

ažko prchavé (Cr, Fe, Sr, V, Zr):35 s pri 2600 °C 

stredne prchavé (Al, Co, Mn, Ni):25 s pri 2500 °C 

ahko prchavé (Cd, Cu, Pb, Zn):15 s pri 2400 °C 

Vyhodnocovací softvér TEVA TM 


integrovaná intenzita s individuálnou 

vobou hraníc integrácie pre každý prvok 

Prvková analýza gravitaných prašných spadov 

Výsledky anorganickej prvkovej analýzy, realizovanej mesanými odbermi po dobu viac ako 10 rokov umožnili 

komplexné chemometricko-štatistické zhodnotenie [18]. V rámci hodnotenia sa porovnali (obr.6) dlhodobé mesané 

priemery obsahu Fe s celkovými množstvami gravitaného spadu, porovnanie poukázalo na priamu súvislos medzi týmito 

parametrami, t.j. že prevládajúcou a charakteristickou zložkou gravitaného spadu v HSA Košice je prvok Fe. 

celkový gravitaný spad 

160 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

celkový spad vs. Fe 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

mesiac 

spad // T/km2/rok Fe // kg/km2/rok 

Obr.6: Porovnanie vzahu obsahov Fe a celkového spadu na základe 10-roných mesaných priemerov (poda [18]) 

Hodnotenie umožnilo aj štúdium mesaných výkyvov obsahu jednotlivých sledovaných prvkov poas sledovaných 

rokov v porovnaní s ronými priemermi, príklad takéhoto hodnotenia je na obrázku 7/a pre Ti v roku 2000, resp. na obrázku 

7/b pre Cu v roku 2002 (poda [18]). 




- 9 - 

900 

800 

700 

600 

500 

400 

300 

200 

100 

0 

Fe 


11. - 14. 10. 2010

m/ t. km-2.rok-1 

Ti 2000 

52,7 

16,9 

-76,8 

-63,3 -56,3 

-105,3 

31,4 160 

120 

133,7 

99,7 

80 

40 

0 

21,9 

-40 

-80 

-120 

-160 

1 2 3 4 5 

-42,7 

6 7 8 9 10 11 12 

-12,2 

mesiac 

m / t. km -2.rok-1 

50 

30 

10 

-5,22 

Cu 2002 

37,55 

27,93 

-5,74 

-10 

1 2 

-12,51 

-9,77 

-30 

3 4 5 

-11,34 

6 7 8 9 10 11 12 

-9,81 -8,93 

mesiac 

a b 

Obr.7: Štatistické zhodnotenie roných výkyvov v obsahoch Ti (a), resp. Cu (b) v gravitanom spade (poda [18]) 

Výsledky priamej spektrometrickej analýzy slúžili aj k posúdeniu súvislostí medzi obsahmi jednotlivých prvkov 

a celkovým množstvom gravitaného spadu. Hodnotenie poukázalo (obr.8) dos presvedivo, že kým medzi obsahom Fe 

a množstvom spadu je vysoká korelácia poas všetkých sledovaných rokov, v prípade Cr už takáto korelácia prakticky 

neexistuje o napovedá tomu, že obsahy Cr v spade môžu pochádza z kampaovitých inností niektorých zneisovateov, 

ovplyvujúcich situáciu v HSA Košice. 

Obr.8: Štatistické zhodnotenie korelácií medzi obsahom Fe (a), resp. Cr (b) a celkovým množstvom gravitaného 

prašného spadu (poda [18]). 

Priama spektrometrická analýza sedimentov – rôzne kalibrané postupy 

Pri analytickej kalibrácii sa vychádzalo bu z lineárnej funkcie int . I A Bw, alebo z jej váženej varianty (váhy 

boli reciprokou hodnotou štandardnej odchýlky opakovaných meraní) a jedine v prípade kedy nebola potvrdená vhodnos 

lineárneho modelu sa použil model kvadratický. Hlavnými validanými charakteristikami boli tzv. presnos metódy, 

vyjadrená pomocou smernice kalibranej funkcie (B) a reziduálneho rozptylu (sres) ako 

sres 

RSDmetóda 

100 

/ % 

B w 

alej limit stanovitenosti (LOQ) a návratnos urená použitím alšieho CRM NIST 2704. Výsledky oboch spôsobov 

kalibrácie zohaduje tabuka IV, resp. V. Kvôli názornosti sú na obrázku 9 uvedené aj kalibrané grafy pre Ni. 

Tabuka IV: Výsledky kalibrácie – variabilné navážky jediného štandardu (0.48 až 11.5 mg, spolu 50 navážok) 

prvok Cr Ni Cu Zn 

lineárny vážený lineárny vážený lineárny vážený kvadra- lineárny vážený 

model 

lineárny lineárny lineárny tický 

lineárny 

A 2,41 2,61 20,3 18,5 11,9 6,47 -2,308 6,98 7,3 

B 0,047 0,047 0,243 0,257 0,061 0,070 0,111 0,014 0,014 

C -3,062 

r 0,980 0,979 0,979 0,972 0,949 0,938 0,970 0,971 0,970 

sres. 2,21 2,21 6,3 6,6 9,1 10,0 7,0 2,8 2,8 

RSDmetóda /% 12,1 12,1 13,7 13,5 19,8 19,0 8,3 15,0 15,0 

LOQ / ng 

(ISO 11843-2) 

75 73 26 22 171 117 72 255 239 

Návratnos/% 94,6 95,3 133 111 

model 

akceptovaný? 

ÁNO ÁNO NIE ÁNO NIE NIE ÁNO ÁNO ÁNO 




- 10 - 

9,7 

-6,73 

-4,88 


11. - 14. 10. 2010

Tabuka V : Výsledky kalibrácie – konštantné navážky štandardu (12 – 10 – 8 – 6 – 4 – 2 – 1 mg, každá 10 x) 

prvok Cr Ni Cu Zn 

lineárny vážený lineárny kvadra- lineárny vážený kvadra- lineárny vážený 

model 

lineárny 

tický 

lineárny tický 

lineárny 

A 3,71 3,54 28,7 23,5 21,2 9,96 2,81 20,8 21,9 

B 0,030 0,031 0,105 0,163 0,081 0,114 0,168 0,026 0,026 

C -0,001 -6,74 

r 0,994 0,994 0,989 0,997 0,964 0,822 0,997 0,996 0,996 

sres. 2,79 2,87 3,1 1,5 10,1 21,8 3,0 5,6 5,7 

RSDmetóda /% 8,8 8,8 12,3 4,0 22,2 34,0 3,2 6,1 6,2 

LOQ / ng 

(ISO 11843-2) 

152 49 69 26 232 34 48 446 382 

Návratnos/% 96 96 116 96 111 108 105 102 

model 

akceptovaný? 

integ. intenzita / s.j. 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

ÁNO 

SEDIMENT,konšt.navážok: Ni 

ÁNO NIE ÁNO NIE ÁNO ÁNO ÁNO ÁNO 

y = 0,1053x + 28,689 

R 2 = 0,9775 

0 200 400 600 

w / ng 

integr.intenzita / s.j. 

SEDIMENT,variabilné navážky: Ni 

y = 0,2429x + 20,322 

R 2 140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

= 0,9479 

0 100 200 300 400 500 

w / ng 

a b 

Obr. 9: Priebeh kalibraných funkcií pre kalibráciu s konštantným navážkom (a), resp. variabilným navážkom 

(b) kalibranej vzorky (CRM) pre Ni v sedimente 

Prezentované výsledky nasvedujú tomu, že oboma spôsobmi kalibrácie je možné dospie k akceptovateným 

hodnotám validaných kritérií. V prípade Cu je s ohadom na vysoké hodnoty integrovaných intenzít pri vyšších látkoých 

množstvách najvhodnejším nelineárny model. Celkove hodnoty presnosti metódy sú v optimálnych prípadoch pod hranicou 

10%, o je pre metódy priamej spektrometrickej analýzy akceptovatené. Limit stanovitenosti je vždy výhodnejší za použia 

váženej metódy najmenších štvorcov, o naznauje výhodnos použitia tohto postupu už aj preto, že väšinou nie je pri 

analýzach tohto typu potvrdená podmienka homoskedasticity (zhodnosti rozptylov), ktorá je základnou podmienkou 

aplikácie metódy najmenších štvorcov [19]. 

Priama spektrometrická analýza biofilmov 

integ. I 

60 

45 

30 

15 

0 

y = 36,175x + 7,1447 

R 2 = 0,9993 

AC-2000 : Cu 

0 0,25 0,5 0,75 1 

c (Cu) /% 

kalibr.vzorky 

bf 003 

bf 004 

BCR 144 

BCR 146 

CR 277 

GBW 07312 

integ.I 

50 

40 

30 

20 

10 

AC 2000: Cr 

y = 1213,2x + 18,554 

R 2 = 0,9974 

0 

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 

c(Cr) / % 

a b 

Kalibr. 

bf 003 

Bf 004 

BCR 277 

GBW 07312 

Lineární (Kalibr.) 

Obr. 10 : Výsledky analytickej kalibrácie pri analýze biofilmov pre Cu (a), resp. Cr (b) – poda [18]. 




- 11 - 


11. - 14. 10. 2010

Výsledky, prezentované pre dva vybrané prvky Cr a Cu na obrázku 10 dokumentujú jednak vhodnos zvoleného 

postupu kalibrácie, lebo obe reálne vzorky (BF-03, BF-04) sa nachádzajú prakticky v strede pracovného rozsahu, jednak 

správnos kalibrácie, lebo väšina kontrolných vzoriek (CRM sedimentov, resp. kalov) sa taktiež nachádza bu priamo na 

preloženej kalibranej priamke, alebo v akceptovatenej blízkosti. Metóda priamej spektrometrickej analýzy s inštrumentalizáciou 

Atomcomp-2000 je teda použitená na úely sledovania biofilmov. 

Multimatrixová kalibrácia (ETV-ICP-OES) 

Analytická kalibrácia pri priamej spektrometrickej analýze tandemovou technikou (oddelené vyparovanie a budenie 

vzorky) ETV-ICP-OES za použitia certifikovaných referenných materiálov najrozmanitejšieho environmentálneho pôvodu 

potvrdila pre rad prvkov (na obrázku 11 sú uvedené najpriaznivejšie výsledky pre Co, resp. Cu) túto možnos. Po dôslednej 

optimalizácii a validácii postupu pre všetky environmentálne relevantné prvky môže táto metóda slúži ako rýchla 

charakterizujúca metóda v celej oblasti anorganických environmentálnych analýz . 

2000,00 

Intensität 

1800,00 

1600,00 

1400,00 

1200,00 

1000,00 

Cu3273 

800,00 

600,00 

STD0605 

STD 2909 

gr Algae 

Apple-le 

SiC 933 

400,00 

SJ soil 

GBW 305 

SL-1 

200,00 

Soil 7 

0,00 

Konzentration [ng abs.] 

BCR 277 

Trend 

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 

a b 

Obr.11: Výsledky mnohomatrixovej kalibrácie metódou viacerých navážok jednotlivých kalibraných vzoriek (CRM: 

algae – žralok – pee – sediment – pôda – jazerný sediment – rieny sediment - popolek) pre Co (a), resp. Cu (b) 

(poda prezentácie [17]). 

Záver 

Na konkrétnych príkladoch environmentálne relevantných aplikácií sa dokumentovali možnosti využitia priamych (bez- 

rozkladových) spektrometrických analýz pre najrozmanitejšie typy vzoriek, resp. analytických úloh. Moderná inštrumentalizácia, 

vychádzajúca z klasických spektrochemických poznatkov ale využívajúca dnešné možnosti riadenia procesov, 

prípadne aj ich automatizáciu umožuje široké využitie týchto metód práve v oblastiach, kde je použitie roztokových metód 

analýzy spojené s problémami bu v dôsledku malého množstva vzorky ( gravitaný prašný spad, biofilmy), alebo kvôli 

samotnému charakteru vzoriek. Nádejné sú aj už publikované a iastone aj v praxi aplikované automatizácie metód ETV- 

ICP-OES, ale aj oblúkový výboj v spojení so spektrometrom, ako to naznauje aj obrázok 12. 

a b 

Obr. 12: Automatizovaný podáva vzoriek pre oblúkový výboj (a – poda [20] a automatizovaný systém ETV-ICP- 

OES (b – poda [17]. 

Poakovanie 

Autori sú zaviazaní vakou za podporu APVV v rámci projektu SK-HU-0012-08, ako aj VEGA v rámci projektov 

1/0459/08 a 1/0461/08, ako aj prof.RNDr.M.Melounovi,DrSc. z Univerzity v Pardubiciach a firme TriloByte za poskytnutie 

programu QC Expert na testovacie úely. . 




- 12 - 


11. - 14. 10. 2010

LITERATÚRA 

[1] A. M.Ure, C. M. Davidson, Metal Speciation in the Environment, London, 1995 

[2] D.M.Templeton et al., Guidelines for Terms Related in Chemical Speciation and Fractionation of Elements, Pure Appl. 

Chem.72 (2000) 1456. 

[3] J.Kubová a kol., Špeciácia, špecianá analýza a frakcionácia chemických prvkov v životnom prostredí, Univerzita 

Komenského, Bratislava, 2008. 

[4] E.Denkhaus, S.Meisen, U.Telgheder, J.Wingender, Microchim. Acta 158 (2007) 1. 

[5] Nariadenie vlády SR .269/2010 Z.z. z 25.mája 2010 

[6] Vyhláška MŽP SR . 263/2010 Z.z. z 28. mája 2010 

[7] Vyhláška MPŽPaRR SR .360/2010 Z.z. z 12. augusta 2010. 

[8] U.Kurfürst, Solid Sample Analysis, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, 1998 

[9] J.Hassler, P.R Perzl, GIT Labor-Fachzeitschrift 40 (1996) 989. 

[10] J.Hassler, A.Detcheva, O.Förster, P.R.Perzl, K.Flórián, Annali di Chimica (Rome) 89 (1999) 827. 

[11] K. Flórián, J.Hassler, P.Rutarová, Gy.Záray, Chem.Papers 57 (2003) 151. 

[12] K.Flórián, J.Hassler, O.Förster, V.Boková, Microchim. Acta 156 (2007) 89. 

[13] I.Ebersbach, Bakalárska práca, Universität Duisburg-Essen / TU Košice, 2008 

[14] J.Hassler, Doktorandská dizertaná práca, HF TU v Košiciach, 2002 

[15] VDI/DIN-Handbuch:Reinhaltung der Luft, Band 4, VDI 2119,Blatt 2, Beuth Verlag, Berlin, 1996 

[16] P.Rutarová, S.Meisen, K.Flórián, Ekológia a environmentalistika – Zborník príspevkov doktorandov z 5. Študentskej 

vedeckej konferencie, TU vo Zvolene (2008) str. 45. 

[17] J.Hassler, P.Barth, Gy.Záray, K.Flórián, Zborník konferencie VII. European Furnace Symposium – XII. Solid Sampling 

Colloquium, St. Petersburg, Rusko (2006) s. 51. 

[18] K. Uhrinová, K. Flórián, M.Matherny, Chem.Papers 59 (2005) 230. 

[19] K.Danzer, L.A.Currie, Pure & Appl. Chem. 70 (1998) 993. 

[20] P.Barth, K. Flórián, J.Hassler, R.Matschat, P.R. Perzl, Zborník konferencie Colloquium Spectroscopicum Internationale 

XXXV., Xiamen, China. Xiamen University Press (2007) p. 72. 




- 13 - 


11. - 14. 10. 2010

APLIKÁCIA EXTRAKCIE S VYUŽITÍM TEPLOTY ZÁKALU MICELÁRNYCH ROZTOKOV NA 

STANOVENIE STOPOVÝCH KONCENTRÁCIÍ CHRÓMU VO VODNÝCH VZORKÁCH METÓDOU 

ELEKTROTERMICKEJ ATÓMOVEJ ABSORPNEJ SPEKTROMETRIE 

LENKA MACHÁKOVÁ* a MÁRIA ŽEMBERYOVÁ 

Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina CH-2, 842 15 

Bratislava, Slovenská republika 

e-mail: machackoval@fns.uniba.sk 

1 ÚVOD 

Chróm patrí k hlavným polutantom životného prostredia, zvyajne ako výsledok priemyselného zneistenia vo forme 

emisií z priemyselnej innosti a v podobe odpadovej vody z procesov tavenia kovov, galvanického pokovovania, hutníckeho, 

kožiarskeho a farbiarenského priemyslu [1]. Chróm je zaujímavým analytom predovšetkým z hadiska prevahy a stability 

svojich špécií v životnom prostredí ako aj ich odlišných biologických a toxikologických vlastností. Z možných oxidaných 

stupov chrómu sa v environmentálnych vzorkách vyskytujú predovšetkým dva, a to Cr(III) a Cr(VI) s rozdielnym 

fyziologickým úinkom. Cr(III) je považovaný za esenciálny stopový prvok, ktorý sa v udskom tele významne podiea 

na metabolizme cukrov, tukov a bielkovín a v zložkách životného prostredia nepodlieha výraznému transportu. Na druhej 

strane Cr(VI) je známy svojou mobilitou v životnom prostredí a navyše ako silné oxidané inidloje vysoko toxický pre 

biologické systémy a má mutagénne a karcinogénne úinky [2]. Z uvedených dôvodov je preto vemi dôležité kontrolova 

obsah chrómu vo všetkých zložkách životného prostredia. Koncentrácia chrómu v prírodných vodách sa pohybuje na nízkej 

koncentranej úrovni, preto je nevyhnutné využi na jeho stanovenie vysoko citlivé metódy. 

Stanovenie toxických kovov na nízkej koncentranej úrovni v reálnych vzorkách s komplexnou matricou je predmetom 

rastúceho záujmu analytických chemikov. Najefektívnejšou cestou ako eliminova nežiaduce interferencie matrice je použitie 

vhodnej techniky predúpravy vzorky s cieom odseparova a zakoncentrova analyt. Medzi najpoužívanejšie separané 

predúpravné techniky aplikované pri stanovení chrómu patrí extrakcia v systéme kvapalina-kvapalina [3,4], extrakcia 

v systéme tuhá látka-kvapalina [5], spoluzrážanie [6] a iné. V poslednom období sú oraz astejšie publikované práce 

popisujúce využitie micelárnych roztokov na separáciu, skoncentrovanie a v niektorých prípadoch i špeciáciu rôznych 

analytov vo vzorkách [7,8]. Práve metóda extrakcie s využitím teploty micelárnych roztokov (Cloud Point Extraction, CPE) 

je výnimonou alternatívnou metódou ku konvennej extrakcii v systéme kvapalina-kvapalina, hlavne vaka schopnosti 

eliminova jej hlavné nedostatky, ako napr. možná tvorba emulzií, spotreba vekého množstva vzorky, spotreba vekého 

množstva väšinou toxických organických rozpúšadiel s vysokou istotou a taktiež vysoká tvorba polutantov. Metóda CPE 

je založená na schopnosti väšiny neiónových tenzidov vytvára vo vodných roztokoch po zahriatí na uritú teplotu (kritická 

teplota zákalu micelárnych roztokov, CPT), ktorá je charakteristická pre každý tenzid, zákal následkom preskupenia 

micelotvorných zložiek za vzniku novej fázy obohatenej tenzidom. Jednotlivé zložky prítomné vo vzorke vrátane analytu sa 

následne prednostne distribuujú poda svojich vlastností a chemickej štruktúry do jednej alebo druhej fázy [9]. V literatúre sa 

môžeme stretnú s mnohými prehadovými lánkami zaoberajúcimi sa teóriou a aplikáciami CPE v stopovej analýze kovov 

[10-12]. 

Boli vyvinuté viaceré citlivé postupy stanovenia chrómu vo vodách spájajúce CPE ako separanú techniku s rôznymi 

deteknými metódami, ako napr. UV-VIS spektrometria [13], plameová atómová absorpná spektrometria (FAAS) [14,15], 

elektrotermická atómová absorpná spektrometria (ETAAS) [16-19], atómová emisná spektrometria s indukne viazanou 

plazmou (ICP-OES) [20], ICP-OES s elektrotermickým vyparovaním (ETV-ICP-OES) [21], vysokoúinná kvapalinová 

chromatografia (HPLC) [22] alebo prietoková injekná analýza s chemiluminescennou detekciou [23]. Výhodou spojenia 

CPE a ETAAS detekcie je to, že používané organické inidlá a tenzidy sú kompatibilné s ETAAS, a teda nie sú oakávané 

žiadne vážnejšie problémy [10]. Skoncentrovanie chrómu vo vzorkách vôd metódou CPE bolo dosiahnuté aplikáciou rôznych 

selektívnych komplexotvorných inidiel, ako napr. 1-fenyl-3-metyl-4-benzoylpyrazol-5-ón (PMBP) [16], pyrolidín 

ditiokarbamát amónny (APDC) [17], dibromofenylfluorón (Br-PF) [18] a 8-hydroxychinolín (8-HQ) [19]. 

V predloženej práci bola vyvinutá nová metóda extrakcie s využitím teploty zákalu micelárnych roztokov 

na separovanie a skoncentrovanie chrómu z vodných vzoriek pred jeho stanovením metódou atómovej absorpnej 

spektrometrie s elektrotermickou atomizáciou. Selektívna extrakcia oboch špécií chrómu, Cr(III) a Cr(VI), bola dosiahnutá 

prídavkom komplexotvorného inidla kupferónu (amónna so N-nitrózo-N-fenylhydroxylamínu), ktorý vytvára s chrómom 

stabilný hydrofóbny komplex. Ten je následne separovaný a zakoncentrovaný do micelárneho roztoku neionogénneho 

tenzidu Tritonu X-114 (oktyl-fenoxy-polyetoxy-etanol). V priebehu optimalizácie experimentálnych podmienok CPE boli 

študované viaceré parametre ovplyvujúce úinnos metódy: vplyv pH vzorky, koncentrácie komplexotvorného inidla, 

koncentrácie tenzidu, rovnovážnej teploty a asu zotrvania na danej teplote. Zoptimalizovaný postup bol aplikovaný 

pri analýze prírodných vôd. 




- 14 - 


11. - 14. 10. 2010

2 EXPERIMENTÁLNA AS 

2.1 Použité prístroje a zariadenia 

Na stanovenie chrómu bol použitý atómový absorpný spektrometer firmy Perkin-Elmer ® model 5100 PC (Norwalk, 

USA) s elektrotermickým atomizátorom 5100 ZL v spojení s automatickým podávaom vzoriek AS-71 a tlaiarou LQ-860 

tej istej firmy. Pre odstránenie špecifickej absorpcie bola použitá Zeemanovská korekcia pozadia. Merania boli robené 

na priene vyhrievaných pyrolytických grafitových kyvetách s vloženou platformou od firmy Perkin-Elmer ® . Ako ochranný 

plyn bol použitý argón. Ako zdroj žiarenia bola použitá výbojka s dutou katódou, napájací prúd výbojky 25 mA, vlnová džka 

357,9 nm a šírka štrbiny 0,7 nm. Vyhodnotenia boli robené z integrovaných hodnôt absorbancie. 

alej boli použité analytické váhy Sartorius 1702 (Sartorius, Nemecko), pH meter InoLab 720 s kombinovanou 

elektródou SenTix 81 (WTW, Nemecko), vodný kúpe (Avalier, R) a centrifúga mlw T30 (Janetzki, Nemecko). 

2.2 Chemikálie a roztoky 

Kalibrané roztoky Cr(VI) (2-10 g l -1 ) boli pripravené postupným riedením zásobného roztoku K2CrO4 o koncentrácii 

1000 mg l -1 v 0,2 % (v/v) HNO 3. Kalibrané roztoky Cr(III) (2-10 g l -1 ) boli pripravené postupným riedením zásobného 

roztoku Cr(NO 3)3 o koncentrácii 1000 mg l -1 v 0,5 mol l -1 HNO3 (Merck, Nemecko) v 0,2 % (v/v) HNO3. Ako chemický 

modifikátor bol použitý roztok Mg(NO3) 2 v deionizovanej vode o koncentrácii 1,5 g l -1 (dávkovaný objem 10 l). 

Na overenie spoahlivosti merania bol analyzovaný štandardný referenný materiál vody SRM 1643e „Trace Elements 

in Water” (NIST, USA) s certifikovaným obsahom celkového chrómu 20,40 ± 0,24 g l -1 . 

Roztok neiónového tenzidu bol pripravený rozpustením odpovedajúceho množstva Tritonu X-114 p.a. (Sigma-Aldrich, 

Nemecko) v deionizovanej vode. Roztok komplexotvorného inidla bol pripravený rozpustením odpovedajúceho množstva 

kupferónu p.a. (Lachema, R) v 10 ml metanolu p.a. (AFT Bratislava, SR) a následne doliatím na požadovaný objem 

deionizovanou vodou. Pre úpravu pH v oblasti pH 3-5,5 bol použitý 0,2 mol l -1 octanový tlmivý roztok pripravený 

z CH 3COOH p.a. a CH 3COONa.3H 2O p.a. (Merck, Nemecko) a pre oblas pH 6-10 bol použitý 0,1 mol l -1 fosforenanový 

tlmivý roztok poda Sörensena pripravený z KH2PO4 p.a. a Na2HPO4 p.a. (Slavus, SR). 

Všetky použité chemikálie boli definovanej analytickej istoty a na prípravu roztokov bola použitá deionizovaná voda 

pripravená systémom Water Pro PS (Labconco, USA). 

2.3 Vzorky 

Syntetické roztoky o koncentrácii 6 g l -1 použité na optimalizané štúdie CPE metódy boli pripravené postupným 

riedením zásobného roztoku Cr(VI) (1000 mg l -1 ) v deionizovanej vode. 

Vzorka vodovodnej vody bola odobratá po 10-minútovom odtekaní studenej vody, prefiltrovaná cez 0,45 m 

membránový filter a okyslená prídavkom koncentrovanej HNO 3 (5 ml 65% HNO 3/1 l vzorky). 

Modelová riena voda bola pripravená rozpustením adekvátnych množstiev 294 mg CaCl 2.2H2O p.a., 216 mg NaCl 

p.a., 8,6 mg MgSO4.7H 2O p.a., 9,5 mg KCl p.a. a 7,3 mg (NH 4) 2HPO 4 istý (Lachema, R) v 1 l deionizovanej vody [24]. 

Modelová morská voda bola pripravená rozpustením adekvátnych množstiev 23,9 g NaCl p.a., 5,07 g MgCl 2 p.a., 

3,99 g Na2SO 4 p.a., 0,667 g KCl p.a., 0,196 g NaHCO 3 p.a., 0,098 g KBr p.a., 0,027 g H 3BO 3 p.a., 0,024 g SrCl 2 p.a., 

0,003 g NaF p.a. (Lachema, R) a 1,12 g CaCl 2 p.a. (Fluka AG, Switzerland) v 1 l deionizovanej vody [24]. 

Minerálna voda Korytnica lieivá bola upravená okyslením prídavkom koncentrovanej HNO3 (5 ml 65% HNO 3/1 l 

vzorky). 

2.4 Optimálny postup CPE 

Pre extrakciu bolo použitých 10 ml syntetického roztoku chrómu alebo vzorky priom pH vzorky bolo upravené 

s 0,2 mol l -1 octanovým tlmivým roztokom na hodnotu 4. Následne bol pridaný 1 ml komplexotvorného inidla 0,4% (m/v) 

roztoku kupferónu a 1 ml tenzidu 7% (m/v) roztoku Tritonu X-114. Zmes sa ohrievala 15 min v termostatovanom vodnom 

kúpeli pri teplote 70°C. Pre urýchlenie separácie fáz sa ešte horúca zmes centrifugovala 10 min pri 3500 rpm, a potom sa 

10 min chladila v adovom kúpeli. Vodná fáza sa odstránila jednoduchým obrátením skúmavky. Pred samotným stanovením 

chrómu metódou ETAAS sa k extraktu pridalo 750 l 0,2% (v/v) HNO3 v etanole p.a. (Slavus, SR) pre zníženie viskozity. 

3 VÝSLEDKY A DISKUSIA 

3.1 Optimalizácia podmienok stanovenia chrómu metódou ETAAS 

Pre spoahlivé stanovenie prvkov metódou ETAAS je jedným z kúových krokov optimalizácia teplotného programu, 

ktorá si vyžaduje dôkladnú optimalizáciu parametrov atomizácie, a to so zvláštnym zreteom na teplotu pyrolýzy a teplotu 

atomizácie, na výber vhodného modifikátora a na množstvo aplikovaného modifikátora. Krivky pyrolýzy a atomizácie 

v prítomnosti modifikátora Mg(NO 3) 2 (15 g v dávkovaných 10 l) pre štandardné roztoky Cr(VI) a Cr(III) o koncentrácii 

10 g l -1 v 0,2% HNO3 a pre modelové CPE roztoky Cr(VI) a Cr(III) o koncentrácii 10 g l -1 v deionizovanej vode (10 ml 

roztoku, pH=4,0 upravené 0,2 mol l -1 octanovým tlmivým roztokom, koncentrácia Kupferónu 0,04%, koncentrácia TX-114 

0,7%) sú uvedené na Obr. 1a a Obr. 1b. S cieom zabráni peneniu vzorky poas dávkovania do elektrotermického 

atomizátora boli alšími dôležitými optimalizovanými faktormi teplota a rýchlos dávkovania. 




- 15 - 


11. - 14. 10. 2010

Na základe získaných výsledkov optimalizácie teplotného programu grafitovej kyvety a podmienok dávkovania vzorky 

boli pre alšie merania za optimálne zvolené teplota pyrolýzy 1300°C, teplota atomizácie 2300°C, teplota grafitovej pece 

poas dávkovania 25°C a 40% rýchlos dávkovania vzorky. Aplikovaný teplotný program je uvedený v Tabuke 1. 

a) 

b) 

Obr. 1 Porovnanie kriviek pyrolýzy (KP) a atomizácie (KA): a) modelových roztokov Cr(VI); 

b) modelových roztokov Cr(III) 

Tabuka 1 

Teplotný program grafitovej pece použitý pre stanovenie chrómu v extraktoch metódou ETAAS 

Krok Teplota as nárastu teploty as zotrvania teploty prietok Ar 

[°C] 

[s] 

[s] 

[ml min -1 ] 

Sušenie 

100 10 30 250 

200 10 30 250 

Pyrolýza 600 15 20 250 

900 15 20 250 

1500/1300 a 15 20 250 

Atomizácia 2300 0 5 0 

istenie 2500 1 3 250 

a teplota pyrolýzy 1500°C bola použitá pre merania štandardných roztokov chrómu a teplota 1300°C pre extrakty po CPE 

Správnos navrhnutého teplotného programu grafitovej pece bola overená analýzou štandardného referenného 

materiálu SRM 1643e s certifikovaným obsahom Cr 20,40 ± 0,24 g l -1 (NIST, USA). Priemerná stanovená koncentrácia 

chrómu (n=5) SRM 1643e bola 19,57 ± 1,05 g l -1 a relatívna chyba stanovenia bola 4,07%. 




- 16 - 


11. - 14. 10. 2010

3.2 Optimalizácia experimentálnych podmienok pre CPE chrómu 

V rámci optimalizácie experimentálnych podmienok CPE boli študované vplyvy pH vzorky, koncentrácie 

komplexotvorného inidla, koncentrácie tenzidu, teploty a asu zotrvania na danej teplote. Pri meraniach boli použité 

syntetické roztoky Cr(III) a Cr(VI) v deionizovanej vode o koncentrácii 6 g l -1 a objeme 10 ml, ku ktorým sa pridával 

1 ml 0,4% (m/v) roztoku kupferónu a 1 ml 7% (m/v) roztoku Tritonu X-114 a pH vzorky bolo upravované na požadovanú 

hodnotu príslušným tlmivým roztokom. 

3.2.1 Vplyv pH 

Vznik hydrofóbneho komplexu kovu a jeho chemická stabilita predstavujú dva dôležité faktory vplývajúce na úinnos 

CPE. Tvorba a stabilita hydrofóbneho komplexu kovu je závislá od pH prostredia. Práve preto je pH vzorky jedným 

z najvýznamnejších parametrov ovplyvujúci extrakný výažok v CPE. 

Sledovaný bol vplyv pH na extrakný výažok CPE v rozsahu pH od 2 do 10, pre oblas pH 3-5,5 bol použitý 

0,2 mol l -1 octanový tlmivý roztok a pre oblas pH 6-10 bol použitý 0,1 mol l -1 fosforenanový tlmivý roztok poda 

Sörensena. Výsledky sú graficky znázornené na Obr. 2a. Na úpravu pH v rozmedzí hodnôt 2,5-8 bol testovaný aj 

fosforenano-citrátový tlmivý roztok poda McIlvaina pripravený z monohydrátu kyseliny citrónovej p.a. a Na 2HPO 4 p.a. 

(Slavus, SR), avšak dosiahnutá výažnos extrakcie nebola dostatoná (vi Obr. 2b). Maximálny extrakný výažok pre 

Cr(III) a Cr(VI) bol dosiahnutý v rozmedzí hodnôt pH 3,5-4,5. Pre naše alšie experimenty bola zvolená hodnota pH 

prostredia 4, ktoré sme upravovali s použitím 0,2 mol l -1 octanového tlmivého roztoku. 

a) 

b) 

Obr. 2 Vplyv pH na extrakný výažok CPE 6 g l -1 Cr(III) a 6 g l -1 Cr(VI) (10 ml roztoku; 1 ml 

0,5% Kupferónu; 1 ml 10% TX-114; 60°C; 15 min): a) s použitím octanového príp. fosforenanového 

tlmivého roztoku; b) s použitím fosforenano-citrátového tlmivého roztoku 




- 17 - 


11. - 14. 10. 2010

3.2.2 Vplyv koncentrácie komplexotvorného inidla – kupferónu 

alším študovaným parametrom bola koncentrácia komplexotvorného inidla. Pre vytvorenie stabilného hydrofóbneho 

komplexu chrómu sme použili kupferón (amónnu so N-nitrózo-N-fenylhydroxylamínu). Bol pozorovaný rozsah 

koncentrácií pridávaných v objeme 1 ml v rozmedzí od 0,005% do 0,5% (m/v) (vi Obr. 3). Pre alšie merania bola použitá 

koncentrácia kupferónu 0,4% (m/v) v prídavku 1 ml. 

Obr. 3. Vplyv koncentrácie komplexotvorného inidla - Kupferónu na extrakný výažok CPE 

6 g l -1 Cr(III) a 6 g l -1 Cr(VI) (10 ml roztoku; pH=4; 1 ml 10% TX-114; 60°C; 15 min) 

3.2.3 Vplyv koncentrácie tenzidu – Tritonu X-114 

V našej štúdii sme si ako neiónový tenzid zvolili Triton X-114 (oktyl-fenoxy-polyetoxy-etanol), ktorý má vynikajúce 

fyzikálno-chemické vlastnosti, ako napr. teplota zakalenia 23–25 °C, kritická micelárna koncentrácia 0,2–0,35 mmol l -1 [9], 

vysoká hustota fázy bohatej na tenzid (ktorá uahuje separáciu fáz pri centrifugácii), komerná dostupnos, relatívne nízka 

cena a malá toxicita. Na obrázku 4 je znázornený študovaný vplyv koncentrácie Tritonu X-114 na extraknú výažnos 

chrómu v rozmedzí koncentrácií pridávaných v objeme 1 ml od 1% do 10% (m/v). Kvantitatívna extrakcia komplexu 

Cr-kupferón bola dosiahnutá pri prídavku 1ml roztoku 7% (m/v) Tritonu X-114. 

Obr. 4. Vplyv koncentrácie Tritonu X-114 na extrakný výažok CPE 6 g l -1 Cr(III) a 6 g l -1 Cr(VI) 

(10 ml roztoku; pH=4; 1 ml 0,4% Kupferónu; 60°C; 15 min) 

3.2.4 Vplyv inkubanej teploty a asu 

K jedným z najdôležitejších skúmaných parametrov v CPE patrí teplota ustaovania rovnováhy a inkubaný as. Práve 

tieto faktory sú nevyhnutné pre dosiahnutie separácie fáz a skoncentrovanie analytov. Na zlepšenie úinnosti CPE je 

vhodnejšie extrakciu uskutoni pri vyššej teplote ako je teplota zakalenia (Cloud Point Temperature, CPT) daného použitého 




- 18 - 


11. - 14. 10. 2010

tenzidu. CPT Tritonu X-114 je okolo 22°C. V našom prípade bol sledovaný vplyv teploty v rozmedzí od 30°C do 80°C. Ako 

vidie z obrázku 5, maximálny extrakný výažok bol dosiahnutý v prípade Cr(III) pri teplote 80°C a pre Cr(VI) 70°C. 

Rovnako bol študovaný i vplyv inkubaného asu na extrakný výažok CPE v rozmedzí od 5 min do 30 min, avšak nebol 

pozorovaný významný vplyv tohto parametra. Za optimálne boli zvolené teplota 70°C a inkubaný as 15 min pre obe špécie 

chrómu. 

Obr. 5. Vplyv inkubanej teploty na extrakný výažok CPE 6 g l -1 Cr(III) a 6 g l -1 Cr(VI) 

(10 ml roztoku; pH=4; 1 ml 0,4% Kupferónu; 1 ml 7% TX-114; 15 min) 

3.3 Analytické charakteristiky 

Na vyhodnotenie výsledkov jednotlivých optimalizaných štúdií CPE a tiež pri stanovení chrómu v reálnych vodných 

vzorkách metódou ETTAS bola použitá metóda kalibranej krivky. Porovnania základných analytických charakteristík 

kalibraných závislostí pre štandardné roztoky Cr(VI) v 0,2% HNO 3, pre modelové CPE kalibrané roztoky a pre kalibrané 

roztoky po extrakcii sú uvedené v Tabuke 2. 

Tabuka 2 

Analytické parametre kalibraných závislostí pre štandardné roztoky Cr(VI) s použitím CPE v spojení s ETAAS 

Kalibraná závislos a a 2 b 

R 

mchar. c 

LOD d 

g l -1 

KZ roztokov v 0,2% HNO3 0,00988 0,9982 

pg 

8,76 0,58 

KZ modelových CPE roztokov e 0,00852 0,9987 10,5 0,72 

KZ roztokov po CPE, FS=10 f 0,11075 0,9887 0,78 0,13 

a – smernica kalibranej závislosti; b – štvorec korelaného koeficienta; c – charakteristická koncentrácia; d – limit detekcie; 

e - modelové CPE roztoky Cr(VI) o koncentráciách 2-10 g l -1 v deionizovanej vode (10 ml roztok, pH=4,0 upravené 

prídavkom 0,2 mol l -1 octanového tlmivého roztoku, koncentrácia Kupferónu 0,04% (m/v), koncentrácia TX-114 0,7% 

(m/v)); f – faktor skoncentrovania 

Pri 10-násobnom skoncentrovaní Cr(VI) bol dosiahnutý limit detekcie 0,13 g l -1 , limit kvantifikácie 0,44 g l -1 

a charakteristická koncentrácia 0,78 pg. 

3.4 Stanovenie chrómu v reálnych vzorkách 

Navrhnutá metóda bola aplikovaná na stanovenie a skoncentrovanie Cr(VI) v reálnych vzorkách vôd. Použité boli štyri 

rôznorodé vodné vzorky: vodovodná voda, modelová riena voda, modelová morská voda a minerálna voda Korytnica 

lieivá. Výsledky sú zhrnuté v Tabuke 3, priom výažnosti CPE postupu sa pohybovali v rozmedzí 92,5-103%. 




- 19 - 


11. - 14. 10. 2010

Tabuka 3 

Výsledky stanovenia Cr(VI) v prírodných vodách použitím CPE 

Vzorka vody 

Koncentrácia 

pridaného Cr(VI) 

g l -1 

Faktor 

skoncentrovania 

Stanovená 

koncentrácia Cr(VI) 

g l -1 

Výažnos SPE 

% 

Vodovodná voda 0,6 10 5,55 ± 0,15 92,5 ± 2,55 

Syntetická riena voda 0,6 10 5,73 ± 0,65 95,5 ± 10,9 

Syntetická morská voda 0,6 10 5,97 ± 0,27 99,5 ± 4,43 

Minerálna voda Korytnica lieivá 0,6 10 6,15 ± 0,32 103 ± 5,35 

4 ZÁVER 

Extrakcia s využitím teploty zákalu micelárnych roztokov je v súasnosti trendovou technikou skoncentrovania 

analytov. CPE je výnimonou alternatívnou metódou konvenným kvapalinovým extrakciám, priom poskytuje vysoké 

extrakné úinnosti a faktory skoncentrovania a hlavne v porovnaní s klasickou extrakciou v systéme kvapalina-kvapalina 

používa lacné netoxické rozpúšadlá. V predloženej práci bola navrhnutá metóda vhodná na stanovenie a skoncentrovanie 

celkového chrómu na stopovej až ultrastopovej koncentranej úrovni vo vodných matriciach s uplatnením extrakcie 

s využitím teploty zákalu micelárnych roztokov v spojení s metódou ETAAS. Metóda bola aplikovaná na skoncentrovanie 

chrómu (VI) v reálnych vzorkách vôd, dosiahnuté extrakné výažky Cr(VI) sa pohybovali v rozmedzí 92,5–103%. 

Táto práca vznikla za podpory Vedeckej grantovej agentúry Ministerstva školstva SR a Slovenskej akadémie vied v rámci 

projektu . VEGA 1/0430/08 a Agentúry na podporu výskumu a vývoja v rámci projektu . VVCE-0070-07. 

LITERATÚRA 

1. V. Gómez, M.P. Callao, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 1006. 

2. M.J. Marque´ s, A. Salvador, A. Morales-Rubio, M. de la Guardia, Anal. Bioanal. Chem. 367 (2000) 601. 

3. H. Chen, P. Du, J. Chen, S. Hu, S. Li, H. Liu, Talanta 81 (2010) 176. 

4. P. Hemmatkhah, A. Bidari, S. Jafarvand, M.R.M. Hosseini, Y. Assadi, Microchim. Acta 166 (2009) 69. 

5. V. Camel, Spectrochim. Acta, Part B 58 (2003) 1177. 

6. A. Karatepe, E. Korkmaz, M. Soylak, L. Elci, J. Hazard. Mater. 173 (2010) 433. 

7. E. K. Paleologos, D. L. Giokas, M. I. Karayannis, Trends Anal. Chem. 24 (2005) 426. 

8. M. F. Silva, E. S. Cerutti, L. D. Martinez, Microchim. Acta 155 (2006) 349. 

9. R. Halko, M. Hutta: Chem. Listy 94 (2000) 990. 

10. I. Hagarová: Chem. Listy 103 (2009) 712. 

11. C.B. Ojeda, F.S. Rojas, Anal. Bioanal. Chem. 394 (2009) 759. 

12. M.A. Bezerra, A.A.Z. Arruda, S.L.C. Ferreira, App. Spectrosc. Rev. 40 (2005) 269. 

13. F. Dondurmacioglu, H. Filik, J. Anal. Chem. 64 (2009) 455. 

14. G. D. Matos, E.B. dos Reis, A.C.S. Costa, S.L.C. Ferreira, Microchem. J. 92 (2009) 135. 

15. K. Kiran, K.S. Kumar, B. Prasad, K. Suvardhan, L.R. Babu, K. Janardhanam, J. Hazard. Mater. 150 (2008) 582. 

16. P. Liang, H. Sang, J. Hazard Mater. 154 (2008) 1115. 

17. Y. Ebihara, T. Shimizu, K. Jinno, N. Uehara, Bunseki Kagaku 56 (2007) 737. 

18. X. Zhu, B. Hu, Z. Jiang, M. Li, Water Res. 39 (2005) 589. 

19. X. Zhu, Z. Jiang, B. Hu, M. Li, Fenxi Huaxue 31 (2003) 1312. 

20. Y. Yamini, M. Faraji, S. Shariati, R. Hassani, M. Ghambarian, Anal. Chim. Acta 612 (2008) 144. 

21. Y. Li, B. Hu, Z. Jiang, Y. Wu, Anal. Lett. 39 (2006) 809. 

22. A.N. Tang, D.Q. Jiang, Y. Jiang, S.W. Wang, X.P. Yan, J. Chromatogr. A 1036 (2004) 183. 

23. E.K. Paleologos, A.G. Vlessidis, M.I. Karayannis, N.P. Evmiridis, Anal. Chim. Acta 477 (2003) 223. 

24. D. Chakraborti, F. Adams, W. Van Mol, K.J. Irgolic, Anal. Chim. Acta 196 (1987) 23. 




- 20 - 


11. - 14. 10. 2010

MOŽNOSTI VYUŽITIA KOMBINÁCIE TECHNÍK TLC A IEC SPOLU S BEŽNE DOSTUPNÝM SKENEROM 

NA ANALÝZU HUMÍNOVÝCH LÁTOK Z PÔDY POMOCOU METÓDY HPLC 

JANKA RÁCZOVÁ, MILAN HUTTA* a JURAJ PESSL 

Univerzita Komenského, Prírodovedecká fakulta, Katedra analytickej chémie, Mlynská dolina CH-2, 842 15 Bratislava, 

Slovenská republika 

hutta@fns.uniba.sk 

Úvod 

Analýza humínových látok zohráva dôležitú úlohu v oblasti analytickej chémie ale nielen v nej. V súasnosti je analýza 

týchto najrožšírenejších prírodných organických zlúenín na zemskom povrchu, vyskytujúcich sa vo vekom množstve 

v pôde, sedimentoch a vodách ako produkty chemickej a biologickej premeny zvieracích a rastlinných zvyškov vemi 

žiadaná. Analýza zložitých látok patrí v súasnom období medzi aktuálne problémy, ktoré vedú k vývoju novej 

inštrumentácie a nových separaných techník. Napriek tomu, že humínové látky sú študované už dlhší as a našli široké 

využitie v rôznych smeroch, ešte nie sú komplexne vo všetkých detailoch spoznané. Táto skutonos súvisí s ich chemickou, 

štruktúrnou a fyzikálnou polydisperzitou, ktoré majú potom za následok vekú neuritos analytického signálu takmer vo 

všetkých analytických metódach, ktoré sa zaoberajú výskumom a meraním humínových látok z makromolekulového pohadu 

[1,2]. 

Napriek dôležitosti pre ekológiu, pôdohospodárstvo, prvotnú úpravu vôd a ohromnému záujmu výskumných vedcov, 

zloženie a štruktúra humínových látok ešte nie je úplne objasnená. Tieto látky s formálne neustálenou a nestálou štruktúrou 

silne ovplyvujú fyzikálno-chemické vlastnosti pôdy. Medzi takéto vlastnosti patrí napríklad štruktúra zn pôdy a jej sorpná 

kapacita. Humínové látky sú schopné viaza živiny pre rastliny a remobilizova ažké kovy. 

Humínové látky (HSs) sú všadeprítomné prírodné materiály vyskytujúce sa vo vekom množstve v pôde, 

sedimentoch a vodách ako produkty chemickej a biologickej premeny zvieracích a rastlinných zvyškov. Kvôli ich schopnosti 

interagova s rôznymi zložkami životného prostredia, humínové látky hrajú dôležitú úlohu v pôdnej a vodnej chémii a z toho 

dôvodu priahujú pozornos výskumníkov. Napriek vekému úsiliu, ktoré má za následok obrovský poet publikácií, 

štruktúra a funkcia humínových látok nie sú dodnes dobre pochopené [1,2]. 

Vo všeobecnosti sú humínové látky amorfné (beztvaré), hnedé alebo ierne, kyslé a polydisperzné zhluky a majú relatívne 

molekulové hmotnosti v rozsahu od niekoko sto až do niekoko desiatok tisíc. Môžu pozostáva zo substituovaných 

aromatických kruhov, ktoré sú navzájom spojené pomocou alifatických reazcov. Avšak, je nejasnos pokia ide o to i sú 

humínové látky skutone polyméry, t.j. i sa v nich pravidelne opakujú jednoduchšie štruktúrne jednotky. Na základe štúdia 

degradaných produktov po chemickej alebo fyzikálnej degradácii humínových látok sa za ich stavebné jednotky považujú 

rôzne jednoduché organické zlúeniny, z ktorých je zložená komplexná štruktúra humínových látok. Takýmito jednoduchými 

organickými zlúeninami, ktoré získavame ako zvyšky po oxidanej deštrukcii humínových látok sú napríklad: kyselina 

salicylová, kyselina ftalová, kyselina šavelová a alšie [3]. 

Mnohé štúdie ukázali, že humínové látky majú aj aromatické aj alifatické vlastnosti. Hlavné funkné skupiny, ktoré 

prispievajú k povrchovému náboju a reaktivite humínových látok sú fenolové hydroxyskupiny a karboxylové skupiny [4-6]. 

Humínové látky môžu tvori cheláty s viacvalentnými katiónmi ako sú Mg 2+ , Ca 2+ a Fe 3+ . Tvorba chelátov zvyšuje 

dostupnos týchto katiónov organizmom, vrátane rastlín. 

Z literárneho prehadu vyplýva, že najastejšie používané separané metódy pre analýzu a charakterizáciu 

humínových látok sú kolónové chromatografické metódy (najmä RP-HPLC, SEC a ich kombinácie HPLC-SEC) [7-9] 

a elektroseparané metódy (najmä CZE, PAGE at.) [10-13]. 

V dôsledku neustáleho vývoja a zlepšovania v oblasti analýzy a charakterizácie humínových látok a ich frakcií, 

dochádza k snahe zaleni do metód používaných na ich analýzu a charakterizáciu doposia málo používané metódy ako sú 

napríklad iónovo-výmenná chromatografia (IEC) [14], tenkovrstvová chromatografia (TLC) [15], afinitná chromatografia 

s imobilizovanými iónmi kovu (IMAC) [16,17] a alšie metódy. Ale k týmto postupom nie dostatok dostupných publikácií. 

Z chromatografických metód, sa ako najefektívnejšie javia techniky založené na rozmerovo vyluovacom efekte, 

pretože umožujú distribúciu molekulových hmotností humínových látok. Pre ich štúdium boli použité už takmer všetky 

bežné analytické metódy, z LC techník najmä SEC and RP-HPLC mechanizmy. Napriek priamemu dôkazu možného IEC 

mechanizmu, je nedostatok lánkov k tejto téme. Preto sme sa rozhodli vyhodnoti úinnos a citlivos aniónovo výmennej 

a katiónovo výmennej tenkovrstvovej chromatografie (TLC) na charakterizáciu humínových kyselín (rôzneho pôvodu) 

kombinovaných so spracovaním obrázkov a údajov. 


TLC analýza: 

Pri tejto práci sme používali dva typy TLC platní: FIXION 50X 8 (silne kyslý katex v sodnom cykle) a POLYGRAM 

IONEX 25 SB-Ac (silne zásaditý annex v octanovom cykle). Na chromatografickú analýzu boli používané rôzne typy 

komerne dostupných humínových kyselín (akými sú napríklad Aldrich, Ecohum, Cerová a iné). TLC platne boli vyvíjané 




- 21 - 


11. - 14. 10. 2010

v uzavretých komorách, priom ako mobilné fázy boli používané rôzne typy vodných roztokov a pufrov (H 2O, NaCl, 

Na2SO4, citrónan sodný), priom tieto mali rôznu iónovú silu a pH. Taktiež sme porovnávali dva spôsoby nanášania vzorky – 

na suché TLC platne a na mokré TLC platne. 

Pre kvantitatívne získanie údajov z TLC vrstiev sme využili poíta, ktorý bol vybavený skenerom. Zo získaných 

obrázkov sme následne získali chromatogramy (ktoré predstavovali grafickú závislos retardaného faktora od intenzity 

signálu). Tieto chromatogramy sme získali použitím programu Microcal® ORIGIN® Pro 8. 

Obr.1: Princíp získania a spracovania údajov z IEX-TLC platní na charakterizáciu 

HPLC a IEC analýza: 

V tejto práci sme používali 2 typy skokových gradientov, ktorých tvar a zloženie sú na nasledujúcich obrázkoch: 




- 22 - 


11. - 14. 10. 2010

Pre iónovo-výmennú chromatografiu sme používali kolóny od firmy TESSEK Ltd. Praha, eská republika 

Separon HEMA – BIO 1000 Q 10 um (150 x 3 mm) 

Separon HEMA – BIO 1000Q 60 um (30 x 3 mm) 

Separon HEMA – BIO 1000 DEAE 60 um (30 x 3 mm) 


Z prevedených pokusov ako aj z nameraných výsledkov vyplýva, že IEC TLC metóda nám umožuje získa 

spoahlivé a reprodukovatené údaje na charakterizáciu humínových látok. Kvôli definovaným a obmedzeným separaným 

priestorom je IEC TLC využitená najlepšie ako frakcionaná alebo ako predúpravná technika a umožuje tiež archívne 

zálohovanie fyzicky separovaných humínových kyselín. 

alšou možnosou je prenies získané údaje do IEC HPLC kolónových techník alebo alej analyzova TLC 

frakcie pomocnými technikami. 

Intensity, A.U. 

100000 

80000 

60000 

40000 

20000 

humínová kyselina (Sigma Aldrich) 

1. pokus 


2. pokus 


3. pokus 

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 

Retardation factor (R F ) 

Obr. 4: Reprodukovatenos retardaných faktorov humínovej kyseliny (Sigma Aldrich) 




- 23 - 


11. - 14. 10. 2010

Intensity, A.U. 

30000 

20000 

10000 

0 

humínová kyselina (Sigma 

Aldrich) v 0.1M NaCl 

humínová kyselina (Sigma 

Aldrich) v 0.01M NaCl 

humínová kyselíina (Sigma 

Aldrich) vo vode 

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 

Retardation factor (R F ) 

Obr. 5: Porovnanie retardaných faktorov humínovej kyseliny (Sigma Aldrich) v rôznych tlmivých roztokoch s rôznou 

iónovou silou 

Obr. 6: Skúmanie vplyvu koncentrácie (0,01; 0,1 mol/L) NaCl ako roztoku mobilnej fázy na retenciu HA ALDRICH za 

použitia tenkej vrstvy Polygram Ionex 25 SB-Ac. Polygram Ionex 25 SB-Ac. 

Z vyššie uvedeného obrázku vyplýva, že so zvyšujúcou sa koncentráciou NaCl z istej vody až po 0,1 mol/L sa zvyšuje 

aj eluná sila mobilnej fázy. Z obrázku tiež vyplýva, že aj pri vekej koncentrácii (0,1 mol/L), zostáva relatívne veký podiel 

humínových látok na štarte neeluovaných. Vyššie koncentrácie chloridu sodného vo vode nemali výrazný vplyv na elúciu 

humínových látok, pravdepodobne preto, že dochádzalo k ich vysoovaniu na povrch stacionárnej fázy, alebo k zníženiu ich 

rozpustnosti v tomto prostredí 

Zdá sa že v prípade humínových kyselín a fulvokyselín existuje medzná iónová sila, pri ktorej dochádza k prevládaniu 

tendencií agregácie a zrážania sa na povrchu, o sa na tenkej vrstve prejavuje rovnako, akoby sa humínové látky neeluovali. 

Z toho dôvodu sme alej testovali možnosti zvyšenia elunej sily mobilnej fázy v prostrediach s definovanou hodnotou pH 

a elektrolytmi ktoré majú za týchto podmienok vyššie nábojové íslo ako chloridy. Prirodzeným výberom z hadiska 

dostupnosti a vzhadom na závislos vekosti negatívneho náboja vybraných typov kyselín ako potenciálnych zložiek 

mobilných fáz v IEC, od pH hodnôt [18], je kyselina citrónová. 




- 24 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 7: Skúmanie vplyvu koncentrácie (0,01; 0,05; 0,1; 0,5 mol/L) kyseliny citrónovej (MF), ztitrovanej roztokom NaOH na 

pH 12, na retenciu HA ALDRICH za použitia tenkej vrstvy Polygram Ionex 25 SB-Ac. 

Pri vyvíjaní chromatogramov rôznymi koncentráciami citrónanu sodného pri pH 12,0 sme pozorovali nárast elunej sily 

MF so zvyšovaním koncentrácie, priom pri koncentrácii 0,1 mol/L boli dosiahnuté rovnaké hodnoty ela zóny humínových 

látok ako pri 0,1 mol/L NaCl v neutrálnom prostredí. alšie zvýšenie koncentrácie citrónanu až na hodnotu 0,5 mol/L malo 

za následok zvýšenie elunej sily bez toho, aby dochádzalo k vysoovaniu zložiek HA ALDRICH. 

Meranie závislosti retardaného faktora HA ALDRICH ako aj iných humínových kyselín od pH mobilnej fázy 

obsahujúcej 50 mmol/L kyselinu citrónovú titrovanú hydroxidom sodným poukazuje na to, že najväšiu elunú silu je možné 

dosiahnú pri pH 12 a pri poklese hodnoty pH dochádza aj k znižovaniu elunej sily. Vzhadom na príliš komplikované 

vzahy medzi efektívnými nábojmi (stupom disociácie HA) a kyseliny citrónovej, nie je možné interpretova tieto výsledky 

jednoznane. 

Obr.8: Skúmanie vplyvu pH mobilnej fázy (kyselina citrónová 50 mmol/L stitrovaná poda potreby roztokom NaOH) na HA 

ALDRICH použitím anexu Polygram Ionex 25 SB-Ac. 




- 25 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 9: Záznam separácie HA ALDRICH na tenkej vrstve Polygram Ionex 25-SB Ac, zhotovený použitím programu 

OriginPro8, MF 50 mmol/L EDTA, pH12. Preložené sú TLC chromatogramy vyvíjané paralelne v dvoch odlišných pozíciach 

na platni. 

Po vyvíjaní platní kyselinou citrónovou s rôznymi koncentráciami pri pH 12, sme s úmyslom zvýšenia Rf hodnôt. 

jednotlivých zložiek HL, zvolili za mobilnú fázu kyselinu etyléndiamíntetraoctovú o koncentrácii 50 mmol/L, ktorá by už pri 

pH 11 mala ma náboj -4 na rozdiel od kyseliny citrónovej, ktorá poda vykazuje náboj -3. Anión EDTA4- by takto mal 

väšiu šancu konkurova humínovým látkam pri iónovej výmene na funkných skupinách sorbentu a to by sa mohlo prejavi 

na zvýšení Rf hodnôt asti eluovaných zložiek HA. Podobné schopnosti by sme mohli oakáva aj u kyseliny 

dietyléntriamínpentaoctovej (DTPA), ktorá nám môže poskytnú výhodu nábojového ísla až -5 (vi Obr. 10). Relatívnou 

nevýhodou je však cena v porovnaní s EDTA. 

A) B) C) 

Obr.10: Štruktúrne vzorce aniónových foriem polyelektrolytov ( A – kyselina citrónová, B – EDTA) využitých v IEC TLC 

a možného adepta na zvýšenie elunej sily mobilnej fázy pri rovnakej koncentrácii (C – DTPA). 

Poiatoné RP-HPLC pokusy boli robené s kolónou HEMA BIO 1000 Q, plnenou silným anexom s kvartérnymi 

amóniovými funknými skupinami, ktoré sú obdobou používaných TLC anexov. Tento typ kolóny je vhodný pre 

vysokoúinné separácie biomakromolekúl až do relatívnej molekulovej hmotnosti 1000000 (vyluovacia medza). Vekos 

astíc anexu bol 10 m a rozmery kolóny boli 150 x 3 mm. Pri výbere mobilnej fázy sme zohadnili dosiahnuté výsledky z 

IEC TLC. Ako mobilnú fázu sme v celej alšej práci použili roztok EDTA s pH 12,0. 

Za konkurenný anión potrebný pri aniónovej výmene sme si po predošlých pokusoch na tenkej vrstve zvolili roztok 

EDTA stitrovaný na pH 12 roztokom NaOH. Za týchto podmienok aj EDTA vykazuje negatívny náboj disociáciou jej 

funkných skupín a je dobrým konkurentom humínovým látkam pri iónovej výmene. Predpokladali sme, že použitím 

roztokov EDTA ako mobilných fáz, využijeme aj ich komplexanú, resp. dekomplexanú schopnos viaza resp. vyleni zo 

štruktúry humínových látok naviazané kovy. 

Humínové látky použité na separáciu týmto typom kolóny, však ani pri relatívne vysokých hodnotách prietoku mobilnej 

fázy a vysokých iónových silách mobilnej fázy, neboli ani po dvoch hodinách z kolóny eluované. V kolóne naviac prudko 

stúpol tlak a kvôli ochrane kyvety v detektore, nebola táto kolóna použitá na alšie merania. Po preskúmaní kolóny, bolo 

jasne vidie že z dávkovaných humínových látok je dos veký podiel týchto humínových látok zadržaný vrchnou 

vrstvou silného anexu na zaiatku kolóny. A naviac dôsledkom zvýšenia prietoku, za úelom eluova HL z kolóny 

a samotnými rozmermi kolóny sa ukázalo že nápl je v kolóne stlaená, o bolo príinou prudkého nárastu tlaku. Silná 

retencia humínových látok na spomínanej náplni a rozmermi astíc 10 m je pravdepodobne spôsobená silnou interakciou 

záporne nabitých funných skupín HL s kladne nabitým kvartérnym amínom. Toto pravdepodobne vysvetluje preo je tak 

málo prác zaoberajúcich sa analýzou HL pomocou iónovej výmeny. 




- 26 - 


11. - 14. 10. 2010

Po týchto skúsenostiach sme sa rozhodli použi na separáciu menšiu, nami naplnenú kolónu, s rozmermi 30 x 3 mm. 

Použitý sorbent bol HEMA BIO 1000 Q s tým rozdielom, že tento mal šes krát väšie rozmery astíc (60 m). Vekos 

medziasticových pórov sa taktiež zväšila, o znamenalo zmenšenie tlaku za použitia vysokých prietokov (0,5 – 2 ml/min). 

Tomuto mala pomôc aj menšia džka kolóny. Do takejto kolóny sa sa zmestilo menej sorbentu a tým sme zmenšili aj 

množstvo funkných skupín, kvartérnych amínov, schopných interagova s funknými skupinami HL. Oakávali sme menšiu 

retenciu humínových látok. Ukázalo sa že výber bol správny. Pre alšie optimalizovanie separaných podmienok, sme si 

zvolili nasledujúce kritéria: teplota, rýchlos analýzy a rozlíšenie jednotlivých zložiek humínových látok pri využití 

skokových gradientov. 

Obr.11: Vplyv teploty na separáciu zložiek HA ALDRICH, použitá kolóna HEMA BIO 1000 Q (30 x 3 mm), použité teploty 

40; 55 a 70°C, Skokový gradient ..., MF: A = 500 mmol/L EDTA, pH 12; D = 5 mmol/L EDTA, pH 12, Rýchlos 

prietoku MF = 0,5 ml/ min, spektrofluorimetrická detekcia (ex. 480 nm; em. 530 nm). 

Vplyv teploty separaného prostredia na správanie sa humínových látok bol skúmaný za použitia gradientu .1 na 

chromatografickej kolóne Separon HEMA BIO 1000 Q (30 x 3 mm) a Separon HEMA BIO 1000 DEAE (30 x 3 mm) pri 

prietoku mobilnej fázy 0,5 ml/min na vzorkách HA Aldrich a alších humínových kyseín. Skúmali sme vplyv teplôt 40; 55 

a 70 °C. Z nameraných záznamov je vidie, že pri zvyšovaní teploty sa retencia látok prakticky nemení a tvar 

chromatografického záznamu je ovplyvnený len málo. 

Vplyv prietoku mobilnej fázy na správanie sa humínových látok bol skúmaný za použitia gradientu .1 na 

chromatografickej kolóne Separon HEMA BIO 1000 DEAE (30 x 3 mm) pri prietoku mobilnej fázy 0,5; 1; 1,5 a 2 ml/min, 

na vzorkách HA Aldrich, HA Ekohum, HA Cerová a HA Suchá Hora. Pracovali sme pri teplote vybranej z vyhodnotení 

z predošlých pokusov a to pri 40°C. Celkový as analýzy bol 38 min. Elúciu látok sme detekovali s FLD. 

Obr.12: Vplyv prietokovej rýchlosti mobilnej fázy na chromatografické profily HA ALDRICH. 

Po prevedení pokusov sme zistili, že zmena rýchlosti prietoku mobilnej fázy má zásadný vplyv na retenciu humínových 

látok za popísaných podmienok. Zvyšovanie rýchlosti prietoku mobilnej fázy má za následok zníženie retenných asov pre 

každú z našich použitých vzoriek HL. Priom popri znižovaniu retenných asov nastáva aj znižovanie plochy jednotlivých 




- 27 - 


11. - 14. 10. 2010

zložiek HL (zadržaných aj nezadržaných) Zvýšenie rýchlosti prietoku má za následok, že viac materiálu sa eluuje a 

chromatogramy zostupujú až na nulovú líniu. Rozlíšenie jednotlivých píkov sa zvyšuje. 

Záver 

Spôsob, ktorý sme si vybrali sa javí ako užitoný základný nástroj na charakterizovanie rôznych typov humínových 

kyselín. Potenciál tejto vybranej metódy budeme aj naalej skúmaný. 

Úplne a záver možno skonštatova, že navrhnutá metóda aniónovo - výmennej chromatografie využivajúca krátke 

kolóny naplnené stredne silným anexom nesúcim dietylaminoetylové funkné skupiny je v kombinácii s skokovou 

gradientovou elúciou roztokmi EDTA s pH tlmeným na hodnotu pH=12,0 vhodnou metódou umožujúcou charakterizova 

humínové kyseliny a fulvokyseliny rôzneho typu.. Táto pracovná hypotéza vyplývajúca z profilovania štandardnej 

humínovej kyseliny (ALDRICH), technického produktu (EKOHUM), rašelinových humínových kyselín (Cerová, Suchá 

Hora) a alkalických extraktov 6 typov pôd si však vyžaduje potvrdenie v experimentoch s dobre operane definovanými 

fulvokyselinami a humínovými kyselinami, najlepšie izolovanými z analyzovaných pôd a charakterizovanými nezávislými 

metódami. 

Táto práca bola podporovaná projektmi VEGA 1/0870/09, APVV-0597-07, VVCE-0070-07 

a Grantom univerzity Komenského . UK/338/2010 

LITERATÚRA 

[1] J. Ráczová, Písomná práca k dizertanej skúške, Univerzita Komenského, Prírodovedecká fakulta, Bratislava, 2010. 

[2] P. Janoš, J., Chromatogr. A 983 (2003) 1. 

[3] S.A. Wood, Ore Geol. Rev. 11 (1996) 1. 

[4] http://en.wikipedia.org/wiki/Humic_acid 

[5] M. H. B. Hayes Emerging concepts of the compositions and structures of humic substances. Hayes In Hayes M.H.B., 

Wilson W.S. (eds), Humic Substances, Peats, and Sludges. Health and Environmental Aspects. The Royal Society of 

Chemistry, Cambridge, 1997. 

[6] K. H. Tan Humic Matter in Soil and the Environment. Principles and Controversies. Marcel Dekker Inc. New York, 

Basel, 2003. 

[7] M. Hutta, R. Góra, J. Chromatogr.A 1012 (2003) 67. 

[8] P. Janoš, I. Zatepálková, J. Chromatogr. A 1160 (2007) 160. 

[9] V. D'Orario, N. Senesi, Soil Biology and Biochemistry 41 (2009) 1775. 

[10] P. Kopáek, D. Kaniansky, J. Hejzlar, J. Chromatogr. A 545 (1991) 461. 

[11] I. Nagyová, D. Kaniansky, J. Chromatogr. A 916 (2001) 191. 

[12] M. Lourdes Pacheco, J. Havel, Electrophoresis 23 (2002) 268. 

[13] L. Cavani, C. Ciavatta, O.E. Trubetskaya, O.I. Reznikova, G.V. Afanaseva, O.A. Trubetskoj, J. Chromatogr. A 983 

(2003) 263. 

[14] P, Klouda. Moderní analytické metody, Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, R, 2003. 

[15] M.Y.Z. Aboul Eish, M.J.M. Wells, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 272. 

[16] T. Neúroný, Diplomová práca, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava, 2009. 

[17] R Halko, T. Neúroný, M. Hutta, Proceedings of the 8 th International Conference "Humic Substances in Ecosystem 

8" Šopora, SR, (2009) 66. 

[18] J. Pessl, Diplomová práca, Univerzita Komenského, Prírodovedecká fakulta, Bratislava, (2010). 




- 28 - 


11. - 14. 10. 2010

IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE VE SKOKOVÉM GRADIENTU pH 

 

ELIŠKA ŠIŠPEROVÁ, ELIŠKA GLOVINOVÁ, JAN POSPÍCHAL* 

UCHAB, AF MZLU v Brn, Zemdlská 1 , 61300 Brno, R 

E-mail: posp@mendelu.cz 

ABSTRAKT 

Byla vyvinuta a ovena kapilární metoda pro izoelektrickou fokusaci a selektivní pedkoncentraci amfolyt 

v nesymetrickém skokovém gradientu pH s následnou izotachoforetickou analýzou. Metoda je založena na fokusaci ve 

stacionárním reakním rozhraní, vytvoeném v kolon. 

Nesymetrický skokový gradient pH byl vytvoen pídavkem vhodného amfolytu do pufru na jednu stranu 

neutralizaního reakního rozhraní, na stran druhé elektrolyt obsahoval pouze jednoduché neamfolytické pufry. 

Klasické systémy jednoduchých neamfolytových pufr musí pokrývat celou oblast pH od kyselé po zásaditou. 

Pedkládaný elektrolytový systém má výhodnjší vlastnosti oproti jednoduchým neamfolytovým pufrm [1]. Pvodní pH 

rozptí mže být redukováno na polovinu, mžeme tedy fokusovat pouze v oblasti hodnot od neutrální do kyselé, nebo od 

neutrální do zásadité. Snížení rozsahu pH obecn zvyšuje selektivitu fokusace. 

Elektrolytový systém mže být nastaven tak, že na jedné stran rozhraní je možno udržet hodnotu pH konstantní, 

zatímco na druhé mžemen hodnotu pH mnit a pitom je stále zachována stacionarita rozhraní. Toto je velkou výhodou 

zvlášt pi kontinuálním dávkování, kdy pH v dávkovacím elektrolytu musí být po celou dobu fokusace konstatní, aby byla 

zachována reprodukovatelnost. Naopak pH v protilehlém - primárním elektrolytu mže být mnno, ímž je dosženo vtší 

selektivity, zafokusování pouze žádaného amfolytu. V našem pípad se jedná o amfolyt s pI 8,6.. 

Pro ovení metody jsme použili sms syntetických nízkomolekulárních amfolyt [2] , které byly selektivn ze 

smsi pedkoncentrovány a posléze analyzovány bznou ITP metodou. Pi pH 6,95 dávkovacího elektrolytu byl zájmový 

ampholyt pI 8,6 pedkoncentrován 14,4 krát, zatímco balastní ampholyty pI 7 a pI 6,2 byly pedkoncentrovány 4,1 a 1,4 

krát za dobu 7000sec. 

ÚVOD 

Rozvoj analytických metod v posledních letech je spjat pedevším s potebou analyzovat složité vzorky biologického 

charakteru. Tato matrice je pro bžné analytické metody pomrn složitá a z tohoto dvodu dochází k vývoji nových separaních 

metod a jejich kombinací. Mezi nejpokroilejší metody patí elektromigraní separaní metody, které umožují provést v jednom 

analytickém bhu nejenom vlastní analýzu-separaci, ale také pedkoncentraci a pedseparaci. Cílem naší práce bylo vyvinou 

takovouto ideální analytickou metodu se selektivní on-line pedkoncentrací a pedseparací založenou na výhodných analytických 

vlastnostech stojícího neutralizaního rozhraní – pH skoku. 

Pro stanovení a úspšné zakoncentrování jednotlivých amfolyt byl vyvinut vhodný elektrolytový systém, vytváející 

neutralizaní rozhraní. Toto neutralizaní rozhraní vzniká mezi kyselou a zásaditou ástí elektrolytu pomocí H + a OH - iont. 

Dochází zde k selektivní pedkoncentraci jednotlivých amfolyt, podle jejich rozliných pI bod. Na základ pI jsou 

amfolyty zakoncentrovány více, mén, i vbec. Pokud pI jednotlivých amfolyt spadá mezi hodnoty pH obou krajních 

elektrolyt dojde k jejich úspšnému zafokusování. Ostatní amfolyty pak rozhraním bu procházejí nebo do nho 

nedomigrují. 

 




- 29 - 


11. - 14. 10. 2010

Jsou-li analyzované amfolyty pítomny v ásti elektrolytového systému- v tzv. dávkovacím elektrolytu, pak jsou 

prchodem elektrického proudu kontinuáln elektromigran dávkovány do rozhraní, kde se selektivn fokusují - akumulují 

do stojících zón, jejichž efektivní náboj je nulový. Po naakumulování dostateného množství analytu jsou zóny mobilizovány 

a analyzovány. Selektivita fokusace je dána rozdílným pI jednotlivých amfolyt a zvoleným pH obou krajních elektrolyt, 

tvoících neutralizaní rozhraní - pH skok. Z matematického modelu popisujícího neutralizaní rozhraní vyplývá, že v 

doposud popsané elektrolytové systémy, založené na jednoduchých anorganických solích, musí mít symetrický rozsah pH 

krajních elektrolyt se stedem pH 7,12. Pro zvýšení selektivity pedkoncentrace jsme vyvinuli elektrolytový systém 

s nízkomolekulárním amfolytem, který umožuje použít asymetrický rozsah pH krajních elektrolyt se stedem v kyselé 

oblasti pH. Na obrázku 1. je znázornn typický prbh gradientu pH v klasickém uspoádání izoelektrické fokusace 

s amfolyty - A, prbh symetrického gradientu pH v uspoádání izoelektrické fokusace bez amfolyt –B a modifikovaná 

metoda izoelektrické fokusace v nesymetrickém skokovém gradientu pH. 

Obrázek 1. Prbh gradientu pH pro jednotlivé typy izoelektrické fokusace. A - klasická fokusace v pítomnosti amfolyt, 

B- fokusace bez amfolyt CAF-IEF, C – fokusace ve skokovém gradientu pH. 

MATERIÁL A METODIKA 

Elektrolyty - Elektrolyty byly vyvinuty a pufrovány protiionty tak, aby mobilita H + a OH - iont v kyselém a alkalickém 

prostedí byla menší než u ostatních iont stejného náboje. To umožnilo korektní migrace iont a také následné použití H + a 

OH - iont jako terminátoru pi mobilisaci. Zvolené pH bylo nastaveno s ohledem na nejlepší pufrovací schopnost na hodnotu 

pK protiionu. 

Základní elektrolyty pro tvorbu neutralizaního rozhraní se skládají z alkalické a kyselé ásti. Jako alkalický základní 

elektrolyt byl zvolen octan amonný upravený hydroxidem amonným na pH=8,62. Kyselá ást elektrolytu - octan amonný 

upravený kyselinou octovou má mít standardn hodnotu pH 5,4. Pi tchto hodnotách pH elektrolyt jsou velikosti opaných 

tok H + a OH - iont v rovnováze a neutralizaní rozhraní stojí. Pídavkem vhodné koncentrace aminokyseliny histidinu do 

kyselého elektrolytu dojde ke zvýšení pH na hodnotu 6,95 a zárove k vázání solvolytického toku H + iontu na histidinový 

kation, pi zachování jeho velikosti a smru pohybu. To umožní i pi zmn pH jednoho elektrolytu zachovat stojící 

neutralizaní rozhraní. Místo H + iont jsou neutralizovány histidinové kationy za tvorby zvitteriontového histidinu 

s efektivním nulovým nábojem. Schematický popis situace na rozhraní je znázornn na obr. 2. 

 




- 30 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr.2. Schéma neutralizaního reakního rozhraní. V pravé katodické ásti je zásaditý primární elektrolyt, octan 

amonný pH 8,6. V levé anodické ásti je dávkovací elektrolyt s pídavkem histidinu, pH 6,95, obsahující amfolyty A, pI 8,6 

a amfolyt B, pI 7. Amfolyt A se na rozhraní fokusuje, amfolyt B je z rozhraní naopak odstrann. 

Pídavkem vzorku do jednoho elektrolytu / v našem pípad do elektrolytu s histidinem/ se tento stává dávkovacím 

elektrolytem a psobením elektrického proudu jsou z nj elektrokinetiky dávkovány jednotlivé amfolyty. Systém byl 

nastaven tak, aby se z dávkovacího elektrolytu, umístného v terminaní komrce, o pH 6,95, selektivn nadávkovaly jen 

nkteré amfolyty viz. obr.3. Po zafokusování zón lze provést mobilizaci a detekci jednotlivých amfolyt ve vytvoených 

barevných zónách. 

Obr.3. Schéma procesu kontinuálního dávkování. Amfolyty nespadající svým pI do oblasti rozptí pH krajních 

elektrolyt do rozhraní bu nedomigrují (tmavý oválek), nebo rozhraním prochází (svtlý oválek). Amfolyt spadající svým 

pI do oblasti rozptí pH krajních elektrolyt se fokusuje (kroužek). 

Jako mobilizaní elektrolyt mžeme použít pro kationtovou mobilizaci H + iont ( kyselinu octovou), pro aniontovou 

mobilizaci OH - iont ( hydroxid amonný). V našem pípad jsme používali pouze kationtovou mobilizaci. 

 




- 31 - 


11. - 14. 10. 2010

Povrchov aktivní látka, polyethylenglykol (PEG) - Umožuje zvýšit viskozitu, což omezí elektroosmózu roztoku a dosažení 

ostejších zón. 

Vzorek – Nízkomolekulární syntetické barviva o pI 8,6, 7 a 6,2. 

Pístroj - Izotachoforetický analyzátor Spišská Nová Ves, byl použit ve dvoukolonovém uspoádání. V horní tzv. separaní 

kapiláe probhla fokusace a pedkoncentrování, ve spodní analytické kapiláe byl vzorek analyzován. 

Konce každé kapiláry jsou pipojeny k elektrodovým komrkám, které obsahují vedoucí elektrolyt a koncový 

elektrolyt (v horní ásti pístroje). Vzorek se dávkuje injekní stíkakou (v horní ásti pístroje). Zóna prochází pes 

detektor, který vyhodnotí údaje a pošle elektrický signál do zapisovae. V jednotlivých kolonách jsme mli procházející 

proud 250 μA a 75 μA. 

Složení elektrolyt: 

Vedoucí elektrolyty: L1: 0,01M NH4OH + 0,01M NH4Ac + 1% PEG + 400ppm povrchov aktivní látky, pH=8,62 

L2: 0,01M NH4Ac + 1% PEG + 400ppm povrchov aktivní látky, pH=6,75 

Zakonující a mobilizaní elektrolyt: 0,03M HAc, pH=3,12 

Dávkovací elektrolyt: 0,002M HIS + 0,01M NH4Ac + vzorek amfolyt, pH=6,95 

Vzorek: nízkomolekulární syntetické barvy o pI=8.6+7+6.2 

Postup analýzy – Do spodní analytické kapiláry nalijeme vedoucí elektrolyt, do vrchní separaní kapiláry alkalický 

fokusaní elektrolyt a do vrchní terminaní komrky dávkovací kyselý elektrolyt s velmi zedným roztokem vzorku. pH 

dávkovacího elektrolytu upravíme tak, aby spolu s fokusaním elektrolytem vytvoil v kolon stojící rozhraní. Po zapnutí 

proudu jsou pak, v prvním kroku jednotlivé ionty vzorku selektivn dávkovány prchodem elektrického proudu do 

vytvoeného stojícího rozhraní, kde se mezi elektrolyty fokusují ve form iont s nulovým efektivní nábojem. Po 

naakumulování dostateného množství vzorku, což je viditelné opticky, je ve druhém kroku analýzy vymnn elektrolyt 

v horní elektrodové komrce pístroje za mobilizaní, konkrétn za kyselinu octovou. Psobením kyseliny dojde ke zmn 

nulového efektivního náboje v zónách na pozitivní, které psobením elektrického proudu zvolna putují ve form ostrých zón 

do separaní kapiláry. Ve tetím kroku se stává v separaní kapiláe mobilizaní elektrolyt terminaním a zóny podstupují 

v ITP módu bžnou izatochoforetickou analýzu. 

VÝSLEDKY A DISKUZE 

ZÁVISLOST DÉLKY ZÓNY NA DÁVKOVACÍM ASE 

Funknost metody byla ovena sestrojením kalibraní závislosti délky zóny na dávkovacím ase, která je rovnž 

lineární - obr.4. Výsledné závislost délky zón na dávkovacím ase jsou uvedeny v tabulce 1. V zónách dochází k rozdílnému 

zakoncentrování jednotlivých barevných amfolyt. Nejvíce je zkoncentrován amfolyt o pI 8,6, délka zóny je pímo úmrná 

dávkovacímu asu. Barevný amfolyt o pI 7se zakoncentrovává již mén díky jeho nižšímu pI a amfolyt o pI 6,2 se 

nezakoncentrovává již skoro vbec. Na obr. 5. jsou porovnány ITP záznamy analýzy vzork amfolyt bez fokusace - kivka 

A a s fokusací 7000 sec. kivka B. Fotografický záznam fokusovaných zón je na obr. 6. Je patrné viditelné a ostré rozhraní 

mezi jednotlivými zónami, vzniklé zóny jsou dokonale oddlené a isté. 

 




- 32 - 


11. - 14. 10. 2010

Tab 1: Závislost délky zóny na dávkovacím ase 

as dávkování (s) pI 8,6 pI 7 pI 6,2 

0 0,139 0,106 0,109 

1000 0,369 0,142 0,115 

2000 0,585 0,158 0,105 

3000 0,972 0,208 0,118 

4000 1,248 0,29 0,134 

7000 1,997 0,438 0,156 

Obr. 4: Závislost délky zóny na dávkovacím ase 

Zone lenght (arb iounit) 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

Dependence of the zone lenght 

on the dosing time/constant conc of LMW pI markers 

(8.6,7,6.2) 

time (s) vs pI 8,6 

time (s) vs pI 7 

time (s) vs pI 6,2 

Plot 1 Regr 

0 2000 4000 6000 8000 

Dosing time (s) 

Obr.5: ITP analýza amfolyt bez a s fokusací 7000s 

U (mV) 

1800 

1600 

1400 

1200 

1000 

800 

600 

400 

200 

Porovnání ITP analýzy smsi amfolyt pI 8,6-7-6,2 

A - bez pedkoncentrace 

B - s 7000 sec. pedkoncentrací 

L1 

pI 8,6 

A 

HIS 

L2 

pI 7 pI 6,2 

pI 8,6 

pI 7 

pI 6,2 

HIS 

0 2 4 6 8 10 12 14 

as (s) 

 




B 

- 33 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 6: Fotografický záznam fokusovaných zón. 

ZÁVR 

pI 6,2 

pI 7 

HIS 

pI 8,6 

Byl vytvoen elektrolytový systém a metoda fokusace v asymetrickém skokovém gradientu pH, který byl oven na modelových 

nízkomolekulárních syntetických barevných amfolytech. Dosažený stupe zakoncentrování závisí na pI jednotlivých amfolyt a dob 

fokusace, za dobu 7000 sec. došlo k zakoncentrování amfolyt o pI 8,6 14,4krát, pI 7 4,1krát a pI 6,2 1,4krát . Tím jsme prokázali správnost 

a použitelnost metody pro selektivní pedkoncentraci amfolyt. Tato metoda ádov rozšiuje analytické možnosti standardních 

elektromigraních metod a mže najít uplatnní pi pokroilých analýzách biologických vzork. 

LITERATURA 

[1] Pospíchal J., Glovinová E. (2001): Analytical Aspects of Carrier Free Isoelectric Focusing, Journal of Chromatography, 918(1): 195-203. 

[2] Slais, K., Friedl, Z. (1994): Low-Molecular-Mass pI Markers For Isoelectric-Focusing , Journal of Chromatography A, 661 (1-2): 249- 

256. 

Podkování: Práce byly podpoena granty IGA MZLU, Grant . TP 1/2010 a GAR, Grant . 06/10/1219. 

 




- 34 - 


11. - 14. 10. 2010

BIOAKUMULÁCIA TOXICKÝCH PRVKOV MIKROSKOPICKOU HUBOU ASPERGILLUS NIGER A JEJ 

VYUŽITIE NA ELIMINÁCIU ENVIRONMENTÁLNEJ ZÁAŽE 

JANA BARTEKOVÁ 1* , LENKA MACHÁKOVÁ 1 , MÁRIA ŽEMBERYOVÁ 1 , ALEXANDRA ŠIMONOVIOVÁ 2 , 

KATARÍNA GÁPLOVSKÁ 3 

1Univerzita 

Komenského, Prírodovedecká fakulta, Katedra analytickej chémie, Mlynská dolina CH-2, 842 15 Bratislava 4 

e-mail bartekova@fns.uniba.sk 

2 

Univerzita Komenského, Prírodovedecká fakulta, Katedra pedológie, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava 4 

3 Univerzita Komenského, Prírodovedecká fakulta, Chemický ústav, Mlynská dolina CH-2, 842 15 Bratislava 4 

1. Úvod 

Antropogénnou innosou postupne narastá zaaženie životného prostredia ažkými kovmi. Tieto kovy majú vaka 

svojej toxicite a schopnosti akumulova sa v živých organizmoch ekologicky významné postavenie. Ich negatívny vplyv na 

životné prostredie je znásobený ich biologickou nedegradovatenosou. Svetový monitoring je zameraný najmä na prvky As, 

Cd, Hg a Pb, ktoré sa považujú za najškodlivejšie pre udí a zvieratá. Ke sa niektoré alšie prvky, ktoré sú v malom 

množstve pre rôzne druhy živých organizmov esenciálne, nahromadia vo vekom množstve, stávajú sa toxickými. Takto sa 

môžu prejavi Cr, Co, Sn, Sb, Cu, Ni, Ag, Au, Zn, Mo, W, Mn, Fe a iné. ažké kovy ako Cu, Pb, Zn, Cd a Ni sú prítomné 

v morskej vode, pôde a priemyselných odpadových vodách [1]. 

Dekontaminácia zložiek životného prostredia zneistených toxickými kovmi je jednou z dôležitých úloh súasnej vedy 

[2]. Chemická precipitácia, koagulácia, iónová výmena, kvapalinová extrakcia, membránové procesy, reverzná osmóza 

a adsorpcia predstavujú konvenné metódy používané na úpravu zneistených vôd kontaminovaných ažkými kovmi. 

Nevýhodami niektorých z uvedených metód sú vysoká cena, potreba plynulého privádzania chemikálií a produkcia toxického 

kalu [3]. 

Alternatívne metódy používané na odstránenie toxických kovov zo zneistených vôd využívajú schopnos uritých 

biologických materiálov viaza kovy [2]. Biologické substráty, ako napr. baktérie, kvasinky, riasy, chaluhy, machy a huby, sú 

materiály schopné nahromadi kovy z vodných roztokov. Zložitos štruktúry mikroorganizmov naznauje, že existuje vea 

spôsobov interakcií katiónov kovov s bunkami. Interakcie závisia najmä od typu mikroorganizmu, formy prvku, ako aj od 

toho, i je organizmus živý alebo mtvy. Ak sú kovy transportované živými bunkami cez bunkové membrány, ide 

o bioakumuláciu, ktorej mechanizmus je závislý od bunkového metabolizmu [4]. Ak dochádza k pasívnemu zachyteniu iónov 

kovov na povrchu mtvej biomasy, ide o biosorpciu, ktorej mechanizmus je nezávislý od bunkového metabolizmu. Najlepšie 

výsledky biosorpcie kovov boli dosiahnuté použitím biomasy obsahujúcej chitín, ako chaluhy a riasy, a mikroorganizmov, 

ako huby a baktérie [5]. 

Rôzne druhy mikroskopických húb sú schopné akumulova a sorbova mnohé prvky vrátane ažkých kovov [4, 6-10]. 

Biotechnológie stále vo väšej miere využívajú špecifické vlastnosti mikroorganizmov pri procesoch odstraovania 

toxických kovov najmä z vodného prostredia [11]. Vpráci bola študovaná bioakumulácia ažkých kovov (Cu, Mn, Zn, Cd, Cr 

(VI) a Fe) bunkami rôznych kmeov mikroskopickej huby Aspergillus niger z modelových roztokov a z reálnej vzorky – 

kyslej banskej vody (AMD) z oblasti Smolníka. V minulosti sa v tejto oblasti ažila strieborná a medená ruda. Po zatopení 

bane v roku 1994 vytekajú zo šachty Pech kyslé banské vody, ktoré obsahujú zvýšené koncentrácie Cu, Zn, Mn, Mg, Ca, Al a 

síranových aniónov. Tieto vody vtekajú do Smolnického potoka a sú nesené do vodnej nádrže Ružín, predstavujú rizikové 

polutanty životného prostredia [12]. 

2. Materiál a metodika 

V experimentoch sa použili štyri rôzne kmene mikroskopickej huby druhu Aspergillus niger, ktoré sa líšia miestom 

výskytu. Kme An-G bol izolovaný z pôdy lužného lesa v Gabíkove, kme An-P z rieneho sedimentu potoka Blatina 

v Hrubej doline s prirodzeným obsahom As a Sb v banskej oblasti Pezinok-Kolársky vrch. Kme An-N bol izolovaný priamo 

z uhlia z bane Nováky s prirodzeným obsahom As, Zn a Mn. Kme An-Š bol izolovaný z kambizeme kultizemnej var. 

kontaminovanej, formy erodovanej v lokalite Šobov [9]. Kmene sú deponované na Katedre pedológie PRIF UK v Bratislave 

a v Zbierke mikroskopických húb na Ústave pdni biologie v eských Budjoviciach ako . 1670 (An-G), . 1671 (An-P), . 

1669 (An-N) a . 1674 (An-Š). Kmene boli izolované zrieovacou platovou metódou z príslušných substrátov. 

Porovnávací kme An-G pochádza zo slabo alkalickej až alkalickej (pH H 2O/KCl = 7,7/7,4) fluvizeme modálnej 

v Gabíkove. Prostredie rieneho sedimentu potoka Blatina, z ktorého pochádza kme An-P, je silne kyslé až vemi silne 

kyslé (pH H 2O/KCl = 5,3/4,8) s prirodzeným obsahom As (363 mg kg -1 ) a Sb (93 mg kg -1 ) po dlhoronej banskej innosti. 

Ultra kyslé prostredie (pH H2O/KCl = 3,3/2,9) a prirodzený obsah As (400 mg kg -1 ), Zn (21,4 mg kg -1 ) a Mn (302 mg kg -1 ) 

má uhlie z bane Nováky, z ktorého pochádza kme An-N. Sulfidické zvetrávanie výrazne ovplyvnilo plochu v lokalite 

Šobov, z ktorej pochádza kme An-Š. Pôda výrazne poškodená acidifikáciou a bez vegetácie je ultra kyslá (pH H 2O/KCl = 

3,0/2,7). 

Testované kmene druhu Aspergillus niger sa naokovali v množstve 5 ml konídií z istej kultúry do 45 ml živného 

roztoku - tekuté SAB médium (Himedia, Mumbai, India), do ktorého boli pred naokovaním pridané jednotlivé ažké kovy 

samostatne a v zmesi s ostatnými kovmi. Do živného roztoku (celkový objem 500 ml) sa pridávali rôzne objemy zo 




- 35 - 


11. - 14. 10. 2010

štandardných roztokov prvkov Cu (2 ml), Cd (0,5 ml), Mn (1 ml), Zn (0,5 ml) a Cr (VI) (3,5 ml) (koncentrácie kovov 1000 

mg.l -1 , fy Merck). Výsledné koncentrácie prvkov pridaných jednotlivo aj v zmesi boli 4 mg.l -1 Cu, 1 mg.l -1 Cd, 2 mg.l -1 Mn, 

1 mg.l -1 Zn a 7 mg.l -1 Cr (VI). Mycélium rástlo v takto pripravených roztokoch 18-42 dní. V niektorých prípadoch pridané 

ažké kovy výrazne predžili as kultivácie. Rovnakým spôsobom sa testované kmene naokovali do reálnej vzorky – kyslej 

banskej vody (AMD) z oblasti Smolníka. V kyslej banskej vode (AMD) bola stanovená priemerná koncentrácia Cu 

0,79±0,07 mg.l -1 , Mn 22,76±0,48 mg.l -1 , Zn 6,61±0,31 mg.l -1 a Fe 128±9 mg.l -1 .Kultivácia trvala 18 dní. Dozreté mycélium 

sa vybralo, premylo destilovanou vodou a vysušilo pri teplote do 40 °C. Následne sa roztoky mineralizovali použitím 

mikrovlnového žiarenia a analyzovali. Do teflónových nádobiek mikrovlnového zariadenia MARS Xpress fy CEM sa 

napipetovalo 15 ml roztoku po odstránení mycélia, 3 ml konc. HNO 3 (fy Merck) a 1 ml H 2O 2 (fy Slavus). V priebehu 13 min 

dosiahla teplota v nádobkách hodnotu 140 o C, na ktorej bola udržovaná ešte 10 min. Po ochladení sa mineralizované roztoky 

preliali a doplnili na objem 25 ml. 

Roztoky sa analyzovali metódou atómovej absorpnej spektrometrie s atomizáciou v plameni prístrojom fy Perkin- 

Elmer 1100 B s prietokom acetylénu 2,5 l.min -1 a prietokom vzduchu 8,0 l.min -1 (5,0 l.min -1 pre Cr). Koncentrácie prvkov 

boli vyhodnotené metódou kalibranej krivky. Všetky experimenty prebiehali v trojnásobnom opakovaní. 

Tabuka 1 

Pracovné podmienky pre stanovenie prvkov na atómovom absorpnom spektrometri PERKIN-ELMER 1100B s atomizáciou 

v plameni acetylén-vzduch 

Prvok Zdroj žiarenia 

Napájací prúd 

lampy 

(mA) 

Analytická iara 

(nm) 

Šírka štrbiny 

(nm) 

Rozpätie kalibraných 

roztokov 

(mg.l -1 ) 

Cu HCL* 15 324,7 0,7 1,0-4,0 

Cd HCL 4 228,7 0,7 0,2-2,0 

Mn HCL 20 279,4 0,2 0,2-3,0 

Zn HCL 20 213,8 0,7 0,2-1,0 

Cr HCL 25 357,8 0,7 1,0-4,0 

Fe HCL 30 248,2 0,2 1,0-4,0 

*HCL - výbojka s dutou katódou (Hollow cathode lamp) 

3. Výsledky a diskusia 

V laboratórnych podmienkach bola sledovaná schopnos štyroch kmeov mikroskopickej huby druhu Aspergillus niger 

akumulova ažké kovy pridané do tekutého SAB média, ktorý bol použitý pre rast mycélia. Jednotlivé ažké kovy (Cu, Mn, 

Zn, Cd, Cr (VI)) sa do živného roztoku pridávali samostatne a v zmesi s ostatnými kovmi. Sledovala sa aj schopnos týchto 

kmeov akumulova Cu, Mn a Zn z reálnej vzorky – kyslej banskej vody (AMD) z oblasti Smolníka (Tabuky 2-4, Obr. 1-3). 

V tejto vzorke bola vyhodnotená aj bioakumulácia Fe (Tabuka 5). Pri všetkých postupoch bola vyhodnotená a porovnaná 

bioakumulácia sledovaných kovov na základe úbytkov z pôvodných modelových roztokov a z reálnej vzorky (Tabuky 2-7, 

Obr. 1-6). 

Tabuka 2 

Bioakumulovaná Cu jednotlivými kmemi druhu Aspergillus niger z modelových roztokov a z reálnej vzorky AMD zo 

Smolníka 

Pôvodná 

An-G An-P An-N An-Š 

koncentrácia Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 

mg.l množstvo 

množstvo 

množstvo 

množstvo 

-1 

mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % 

Cu 3,75±0,13 2,26±0,17 60 0,48±0,09 13 1,15±0,10 31 0,81±0,12 22 

Cu zo zmesi 3,72±0,02 1,78±0,17 48 1,47±0,08 40 1,34±0,12 36 1,48±0,10 40 

Cu z AMD 0,79±0,07 0,22±0,02 28 0,25±0,03 31 0,24±0,07 30 0,18±0,03 23 

Tabuka 3 

Bioakumulovaný Mn jednotlivými kmemi druhu Aspergillus niger z modelových roztokov a z reálnej vzorky AMD zo 

Smolníka 

Pôvodná 



Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 


množstvo 

množstvo 

množstvo 

-1 

mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % 

Mn 2,07±0,06 0,40±0,03 20 0,17±0,05 8,0 0,24±0,07 12 0,16±0,01 7,5 

Mn zo zmesi 2,06±0,02 1,46±0,03 71 0,41±0,04 20 0,31±0,05 15 0,59±0,08 29 

Mn z AMD 22,76±0,48 1,67±0,30 7,3 1,57±0,06 6,9 1,31±0,19 5,7 1,11±0,34 4,9 




- 36 - 


11. - 14. 10. 2010

Tabuka 4 

Bioakumulovaný Zn jednotlivými kmemi druhu Aspergillus niger z modelových roztokov a z reálnej vzorky AMD zo 

Smolníka 

Pôvodná 



Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 


množstvo 

množstvo 

množstvo 

-1 

mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % 

Zn 0,95±0,03 0,90±0,01 93 0,73±0,06 77 0,28±0,09 29 0,64±0,05 67 

Zn zo zmesi 0,98±0,05 0,82±0,04 83 0,47±0,07 47 0,30±0,09 31 0,66±0,07 67 

Zn z AMD 6,61±0,31 1,05±0,13 16 1,19±0,06 18 0,63±0,07 9,6 0,91±0,10 14 

Tabuka 5 

Bioakumulované množstvá Fe jednotlivými kmemi druhu Aspergillus niger z reálnej vzorky AMD zo Smolníka 

Pôvodná 



Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 


množstvo 

množstvo 

množstvo 

-1 

mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % 

Fe z AMD 128±9 12±4 9,1 58±3 45 45±8 36 20±4 16 

Kme An-G má najlepšiu schopnos akumulova Zn (93 % a 83 %), Cu (60 % a 48 %) a Mn (20 % a 71 %) 

z modelových roztokov. Bioakumulácia Cu z reálnej vzorky AMD zo Smolníka je pri tomto kmeni 28 %, Zn 16 %, Mn len 

7,3 % a Fe 9,1 %. Sledované kmene akumulujú 23-31 % Cu, 10-18 % Zn, 4,9-7,3 % Mn a 9,1-45 % Fe z AMD. Množstvo Zn 

v AMD je 7-násobne väšie a množstvo Mn je 10-násobne väšie ako v modelových roztokoch. Pri akumulácii ažkých 

kovov sa so zvyšujúcou koncentráciou znižuje úbytok kovu v %. 

Úbytok kovu v % 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

Bioakumulácia Cu z modelových roztokov a z AMD 


Cu Cu zo zmesi Cu z AMD 

Obr. 1 Bioakumulácia Cu z modelových roztokov a z AMD 


100 

80 

60 

40 

20 

0 

Bioakumulácia Mn z modelových roztokov a z AMD 


Mn Mn zo zmesi Mn z AMD 

Obr. 2 Bioakumulácia Mn z modelových roztokov a z AMD 




- 37 - 


11. - 14. 10. 2010


100 

80 

60 

40 

20 

0 

Bioakumulácia Zn z modelových roztokov a z AMD 


Zn Zn zo zmesi Zn z AMD 

Obr. 3 Bioakumulácia Zn z modelových roztokov a z AMD 

Tabuka 6 

Bioakumulované množstvá Cd jednotlivými kmemi druhu Aspergillus niger z pôvodných modelových roztokov 

Pôvodná 



Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 


množstvo 

množstvo 

množstvo 

-1 

mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % 

Cd 0,97±0,01 0,42±0,03 44 0,64±0,11 66 0,28±0,07 29 0,46±0,11 47 

Cd zo zmesi 1,07±0,02 0,61±0,07 57 0,39±0,09 36 0,33±0,09 30 0,26±0,05 25 

Tabuka 7 

Bioakumulované množstvá Cr (VI) jednotlivými kmemi druhu Aspergillus niger z pôvodných modelových roztokov 

Pôvodná 



Bioakum. 

Bioakum. 

Bioakum. 


množstvo 

množstvo 

množstvo 

-1 

mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % mg.l -1 % 

Cr 6,64±0,05 0,51±0,25 7,6 1,08±0,25 16 1,39±0,38 21 1,19±0,38 18 

Cr zo zmesi 6,82±0,11 0,54±0,13 7,9 2,75±0,52 40 1,84±0,24 27 2,39±0,34 35 

Pri prvom postupe (kovy pridávané samostatne) testované kmene najlepšie akumulovali Zn (29–93 %) a Cd (29–66 %), 

nasledovali Cu (13–60 %), Mn (8–20 %) a Cr (VI) (8–21 %). Pri druhom postupe (kovy pridávané v zmesi) bola najvyššia 

akumulácia Zn (31–83 %) a Cu (36–48 %), potom Cd (25–57 %), Mn (15–71 %) a Cr (VI) (8–40 %). Akumulácia Cr (VI) je 

pri kmeni An-G najmenšia (8 % pre obidva postupy). Je ovplyvnená hodnotou pH prostredia, v ktorom prebieha. Tento kme 

ako jediný pochádza zo slabo alkalickej fluvizeme modálnej. Ostatné kmene pochádzajú zo silne kyslého až vemi silne 

kyslého prostredia. 


100 

80 

60 

40 

20 

0 

Bioakumulácia Cd z modelových roztokov 


Cd Cd zo zmesi 

Obr. 4 Bioakumulácia Cd z modelových roztokov 




- 38 - 


11. - 14. 10. 2010


100 

80 

60 

40 

20 

0 

Bioakumulácia Cr(VI) z modelových roztokov 


Cr (VI) Cr (VI) zo zmesi 

Obr. 5 Bioakumulácia Cr(VI) z modelových roztokov 

Pre sledované kmene je v Tabuke 8 a na Obrázkoch 6-8 porovnaná statická 24-hodinová bioakumulácia Cu, Cd a Mn 

z vodného prostredia (1) a bioakumulácia týchto kovov pridaných v zmesi do živného roztoku (2). Pridaním sledovaných 

ažkých kovov do rastového média sa v niektorých prípadoch výrazne zlepšila bioakumulácia týchto kovov pri všetkých 

kmeoch. Poas rastu mycélia živé, aktívne bunky transportujú kovy prítomné v rastovom médiu cez plazmatickú membránu 

až do bunky. Pri prvom postupe stailo na kultiváciu 10 dní. Pri druhom postupe trvala kultivácia kmeov An-G a An-Š 18 

dní a kmeov An-P a An-N 21 dní. 

Tabuka 8 

Porovnanie 24-hodinovej akumulácie ažkých kovov z vodného prostredia (1) a akumulácie ažkých kovov pridaných do 

roztoku SAB použitého pre rast mycélií (2) 

Bioakumulované množstvo kovu v % 

Prvok 


1 2 1 2 1 2 1 2 

Cu 27 48 10 40 6,8 36 12 40 

Cd 23 57 11 36 7,2 30 13 25 

Mn 25 71 11 20 11 15 13 29 


80 

60 

40 

20 

0 

Porovnanie bioakumulácie Cu 


1 2 

Obr. 6 Porovnanie bioakumulácie Cu testovanými kmemi druhu Aspergillus niger 




- 39 - 


11. - 14. 10. 2010

Úbytok kovu v% 

80 

60 

40 

20 

0 

Porovnanie bioakumulácie Cd 


1 2 

Obr. 7 Porovnanie bioakumulácie Cd testovanými kmemi druhu Aspergillus niger 


80 

60 

40 

20 

0 

Porovnanie bioakumulácie Mn 


1 2 

Obr. 8 Porovnanie bioakumulácie Mn testovanými kmemi druhu Aspergillus niger 

4. Záver 

Sledované kmene mikroskopickej huby druhu Aspergillus niger je možné využi na odstránenie toxických kovov najmä 

z vodného prostredia. Bioakumulácia Zn, Cu a Mn je najväšia pri kmeni An-G. Tento kme pochádza z prostredia 

neovplyvneného ažkými kovmi (fluvizem modálna z lužného lesa v Gabíkove). Pri kmeoch pochádzajúcich z prostredia, 

v ktorom banská innos (An-P a An-N) alebo sulfidické zvetrávanie (An-Š) výrazne ovplyvnilo a posunulo pH pôdneho 

roztoku na úrove silne kyslú až ultra kyslú, je bioakumulácia týchto kovov menšia. V bioakumulácii Cu, Zn a Mn z kyslej 

banskej vody zo Smolníka sa medzi testovanými kmemi neprejavuje výrazný rozdiel. Bioakumulácia Cr (VI) je najmenšia 

pri kmeni An-G (slabo alkalická hodnota pH pôdneho roztoku). 

Práca bola vypracovaná za finannej podpory Vedeckej grantovej agentúry MŠ SR a Slovenskej akadémie vied 

(VEGA/1/0430/08), (VEGA/1/0159/08) a Agentúry na podporu výskumu a vývoja MŠ SR (VVCE-0070-07). 

Autorky akujú firme AMEDIS spol. s r. o. za podporu a požianie zariadenia na mikrovlnový rozklad MARS Xpress firmy 

CEM. 

5. Literatúra 

[1] P.X. Sheng, Y.P. Ting, J. Colloid Interf. Sci. 275, 1 (2004) 131. 

[2] K. Dercová, J. Makovníková, G. Baraníková, J. Žuffa, Chem. Listy 99 (2005) 682. 

[3] F.A. Abu Al-Rub, M.H. El-Naas, F. Benyahia, I. Ashour, Process Biochem. 39 (2004) 1767. 

[4] M. Žemberyová, A. Shearman, A. Šimonoviová, I. Hagarová, Intern. J. Environ. Anal. Chem. 89 (2009) 569. 

[5] B. Volesky, Sorption and biosorption, BV Sorbex, Inc, Montreal-St. Lambert, Quebec, Canada, 2003. 

[6] A. Kapoor, T. Viraraghavan, Bioresource Technol. 53 (1995) 195. 

[7] A. Kapoor, T. Viraraghavan, D.R. Cullimore, Bioresource Technol. 70 (1999) 95. 

[8] A. Šimonoviová, Czasopismo Techniczne, Chemia 16 (2008) 207. 

[9] A. Šimonoviová, Soil microscopic fungi of Slovakia I. Letter of alphabet from A to N, Kežmarok (2008) 127. 

[10] A. Šimonoviová, L. Macháková, M. Žemberyová, A. Luptáková, Zborník prednášok a posterov, Mikrobiológia vody 

2009, Poprad 2009. 

[11] M. Kušnierová, Minerálne biotechnológie, Mineralia Slov.4, 25 (1993) 2. 

[12] A. Simonovicova, J, Bartekova, L. Janovova, A. Luptakova, Zborník prednášok a posterov, Biotechnology and Metals, 

1 st International Conference, Košice 2009. 




- 40 - 


11. - 14. 10. 2010

DEVELOPMENT OF THE SOLID SAMPLING ETAAS METHOD FOR THE DETERMINATION OF TIN IN 

SOILS AND THE COMPARISON WITH DISSOLUTION BASED LIQUID SAMPLING ETAAS 

PÉTER TÖRÖK * and MÁRIA ŽEMBERYOVÁ 

Comenius University in Bratislava, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Natural Sciences, 842 15 Bratislava, 

Slovak Republic 

e-mail torok@fns.uniba.sk 

1. Introduction 

One of the most important properties of metals is their ability to accumulate in soils and other parts of environment. 

For these reasons, special attention should be paid particularly to the analytical determination of environmentally relevant 

elements. The analysis of soil samples is difficult task for the analytical chemist [1]. Total dissolution of soils requires 

development of time-consuming procedures, which usually involve the use of hazardous reagents [2]. Moreover, depending 

on the procedure selected, satisfactory results are not always guaranteed, due to the possible occurrence of analyte losses, 

contamination or to an incomplete analyte recovery [3,4]. 

The direct determination of elements in solid samples by methods of atomic spectromery without prior digestion is in 

many cases more efficient and reliable, faster, easier, more cost-effective and less time-consuming than other methods that 

requires sample dissolution [5]. Therefore, the solid sample analysis using atomic absorption spectrometry with 

electrothermal atomization (SS ETAAS) is a very promising trace analysis strategy [6]. Although it seems obvious that SS 

ETAAS is a powerful technique it is rather limited by matrix effect of analyzed samples [7,8]. It can be mentioned that most 

of the works published to date have dealt with situations in which the volatilities of the analyte and the matrix are very 

different [9-13], while those situations in which the volatility of the analyte and the matrix are almost similar have been less 

often promoted [14]. 

In the present work our intention was to develop rapid and simple solid sampling analytical method for direct 

determination of tin in three different type of soils by ETAAS. Determination of Sn in environmental samples is problematic, 

because of complicated chemical behavior of the analyte [15]. During decomposition a part of total Sn can lost as a volatile 

SnCl 4 and the other part of analyte can be converted to the insoluble SnO2 by oxidizing mineral acids [16]. It is therefore 

obvious that the development of solid sampling methods for the direct determination of Sn in soils would be covertable in 

order to improve both the ability to obtain rapid results and the reliability of the results obtained. A study was carried out for 

selection of the most appropriate working conditions: to study the use of alternative, less sensitive, resonance lines; selection 

of the suitable chemical modifiers for achieving successful in situ analyte/matrix separation; the optimization of the sample 

mass; to study the potential interferences and other adverse effects, and the ways for their elimination. 

2. Experimental 

2.1. Instrumentation 

The solid sampling analysis were carried out using an AAS 5EA atomic absorption spectrometer (Analytik Jena AG, 

Jena, Germany) equipped with a deuterium arc background correction and transversely heated graphite tube atomizer 

(THGA). A laboratory made device was used for direct sample introduction. Hollow cathode lamp (Photron Pty. Ltd., 

Australia) was the line source (wavelength 300.9 nm, spectral band pass 0.5 nm, lamp current 7.5 mA) during Sn 

determination. Pyrolytically coated graphite tubes without dosing hole (Analytik Jena AG, Jena, Germany) and pyrolytically 

coated graphite platforms (Analytik Jena AG, Jena, Germany) designed for solid sampling, were used for all experiments. An 

M500P ultra-micro balance (Sartorius, Goettingen, Germany) was used for weighing the samples directly into the solid 

sampling platforms. To obtain the same heating conditions with solid samples, the aqueous standards were pipetted manually 

on to the same platforms as solid samples. Aqueous standards and modifiers were pipetted by a variable Eppendorf 

micropipette (maximum pipettable volume 200 L). Precision of micropipette and microbalance are ±0.5 L and ±0.005 mg, 

respectively. High purity argon (99,999%) was used as the purge gas with maximum flow rate of 1 2 L.min -1 during all 

stages, except auto zero and atomization, when gas flow was reduced to 0.1 L min -1 . Established optimum working 

conditions and furnace heating program for direct determination of tin in soil samples is presented in Table 1, the same 

optimized heating program can be applied for analysis of all reference materials. Quantification of Sn in solid samples was 

performed by calibration against aqueous standards, which were pipetted onto the matrix residue remaining from a previous 

sample run. 

The analysis of digested samples was performed on a Perkin-Elmer (Norwalk, CT, USA) model 1100B atomic 

absorption spectrometer with deuterium arc background correction, equipped with an HGA-700 graphite furnace, and an AS- 

60 autosampler. Pyrolytically coated HGA graphite tubes (Perkin-Elmer, USA) with preinserted pyrolytic platforms were 

employed. An electrodeless discharge lamp (Perkin-Elmer, USA) operating at 8 W was used as radiation source. The 286.3 

nm resonance line of Sn was used for the analysis (spectral band pass of 0.7 nm) which is actually not the most sensitive 

wavelength. The reason for using the less sensitive wavelength was that the concentration of tin in samples was relatively 




- 41 - 


11. - 14. 10. 2010

high. In addition, the blank values with the most sensitive wavelength were too high to be controlled. Ammonium-fluoride 

(100 g) in combination with citric acid (1000 g) was used (10 L injected volume) to eliminate interfering matrix elements 

(Al, Fe, Si) and excess acids from the sample. In case of analysis of totally dissolved sample S-SP a matrix matching 

calibration is needed by co-injecting of 2.5 g Ca (as Ca(NO 3)2) with the calibration solutions. The argon flow rate of 300 

mL min -1 was used during all stages, except atomization, when gas flow was reduced to 10 mL min -1 . The concentration of 

Sn in digested samples was calculated using external calibration curve, however the elimination of matrix effect was checked 

by standard addition method. 

2.2. Reagents 

All solutions used in this study were made with deionized water form Water PRO-PS system (Labconco, Kansas City, 

USA). Concentrated nitric acid was purchased from Merck (Darmstadt, Germany) and used without further purification. All 

glassware were soaked in 1.4 mol L -1 nitric acid for at least 24 h and rinsed with deionized water before used. Calibration 

standards were prepared by appropriate dilution from stock solution containing 1.0 g L -1 of Sn by 0.14 mol L -1 nitric acid. 

Palladium and silicon (10.0 g L -1 ) solution was from Merck. The chemicals: NH4NO3, Ca(NO3)2.4H2O, Fe(NO3)3. 9H2O, 

Al(NO 3) 3. 9H 2O, NH 4F were of analytical grade and were purchased from Lachema (Brno, Czech Republic). Crystalline 

Mg(NO3) 2.6H 2O, NH 4H 2PO 4 and citric acid, monohydrate was “suprapur” (Merck) quality and used for preparation of some 

mixed modifier solutions. Scintillation grade Triton X-100 (Fluka, Buchs, Switzerland) nonionic surfactant was added to 

modifier solutions used in solid sampling for ensure homogenous contact between modifier and solid sample. Final 

concentration of Triton X-100 in all modifier solutions was 0.1% m/v. 

2.3. Samples 

The different types of soil reference materials (according to the Food and Agriculture Organization classification) with 

certified total values of the elements, S-VM No. 12-1-07 Soil Eutric Cambisol (Hills of Medzev near the town Košice), S-MS 

No. 12-1-08 Soil Orthic Luvisols (Interhill of Šariš near the town Prešov), S-SP No. 12-1-09 Soil Rendzina (Plateau of Silica 

near the town Rozava) produced by the Institute of Radioecology and Applied Nuclear Techniques, Košice, Slovakia, were 

used for this study. 

2.4. Procedure for SS-ETAAS 

Prior to the analysis, approximately 10 g was taken from the reference materials and dried to the constant weight at 

105°C. After cooling down to the ambient temperature the samples were placed in borosilicate glass flasks. For solid 

sampling, the empty platform was rst transported to the microbalance using a pair of tweezers. After taring, an appropriate 

amount of sample was deposited onto the platform and weighed. The platform containing the sample was then transferred to 

the graphite furnace by means of manual solid sampling accessory and was subsequently subjected to the temperature 

program. The calibration was carried out using 10 L of an aqueous solution of the appropriate concentration, added with a 

micropipette onto the sampling platform. For every determination, three solid samples were analyzed and the median of the 3 

results was taken as a representative value. 

2.5. Dissolution and analysis of the soil samples for comparison purposes 

The contents of Sn in the reference materials used in this study are not certified. For this reason the determination of Sn 

was investigated using following wet digestion procedures, namely total digestion using concentrated HNO3+HF+HClO 4; 

aqua regia digestion (ISO norm 11466) and microwave assisted aqua regia digestion [17]. For the total digestion of samples, 

0.5 g of reference materials were digested in Teflon vessel using 40 mL of HNO3+HF+HClO 4 (1+2+1) mixture (dissolution 

procedure labeled as “Total dissolution”) on sand bath. The liquid was carefully let to evaporate nearly to dryness, while the 

temperature of sandbath did not exceed 100°C, to minimize the loss of the analyte. The solution was transferred to the 50 mL 

calibrated flask, set up to 50 mL volume and filtered through 0.22 m filter. After dilution appropriately, the tin content was 

determined by ETAAS using optimized experimental conditions listed in Table 1. 

Table 1. Temperature program for determination of tin in soils by ETAAS 

Solid sampling ETAAS (AAS 5EA) Liquid sampling ETAAS (HGA700) 

Step Temperature Ramp 

(°C) (°C.s -1 Hold 

) (s) 

Temperature Ramp time Hold time 

(°C) 

(s) 

(s) 

Drying 110/150 a 20/20 a 20/40 a 120 1 60 

Pryrolysis 600/1000 b 100/100 b 30/30 b 1200 30 30 

Auto zero 1000 0 10 - - - 

Atomization 2400 >2500 5 2200 0 5 

Cleanout 2700 1000 3 2500 1 3 

a b 

two step drying for solid samples, two step pyrolysis for solid samples 




- 42 - 


11. - 14. 10. 2010

3. Results and discussion 

3.1. Method development for liquid sampling ETAAS 

A study of the best conditions for graphite furnace determination was carried out. Several mixed chemical modifiers: 5 

g Pd + 3 g Mg(NO3) 2 [18], 5 g Pd + 1000 g citric acid + 100 g NH 4F [19], 1000 g citric acid + 100 g NH 4F, 1000 

g ascorbic acid + 100 g NH4F and 100 g NH4NO3 + 100 g NH4F were tested in order to improve atomization signal 

profile, sensitivity and overcome matrix effects. The operating conditions were optimized considering the maximum 

pyrolysis temperature, atomization temperature, atomic peak shape and the best separation between the atomic and 

background profiles for each modifier. For the study of optimal furnace parameters 1.0 ng of Sn in standard solution, aqua 

regia extract and total dissolution of S-SP sample were used. The elimination of the matrix effect was checked by comparing 

the slope of calibration curve and standard addition method (10 L of 50 and 100 g L -1 concentrations of Sn as standard 

additions). 

Table 2. The analytical performance of tested modifiers 

Optimal temperature of (°C) Slope of (s ng -1 ) 

Modifier 

Pyrolysis Atomization 

Aqueous 

cal. curve 

Standard addition of 

aqua regia extract (S SP) 

Standard addition 

of tot. diss. (S-SP) 

5g Pd + 3g Mg(NO3) 2 2500 1400 0.105 0.086 (82% a ) 0.055 (52% a ) 

5g Pd + 1000g CA + 

100g NH4F 

2500 1400 0.127 0.075 (59% a ) 0.046 (36% a 1000g CA+ 

+ 100g NH4F 

2200 1200 

0.145 

0.132 

) 

b 0.136 (96% a ) 

0.126 (87% a ) 

(95% a ) b 

1000g AA+ 

+ 100g NH4F 

2200 1200 

0.148 

0.136 b 0.144 (97% a ) 

0.129 (86% a ) 

(94% a ) b 

100g NH4NO3 + 

+ 100g NH4F 2300 1100 0.076 0.053 (70% a ) 0.049 (65% a ) 

a 

slope difference calculated as (slopestandard addition/ slopecalibration curve).100%, b matrix matching calibration by co-injecting of 

2.5 g Ca (as Ca(NO3) 2) with the calibration solutions, CA citric acid, AA ascorbic acid 

Absorbance 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

2a 

1b 

1c 

1d 

0 1 2 3 4 5 

Time, s 

Fig. 1.: Signal profiles of Sn in aqueous standard and 5-times diluted dissolved soil samples in presence of mixed modifier 

consisting of 1000 g CA and 100 g NH 4F (pyrolysis temperature 1200°C, atomization temperature 2200°C, 1a-1.0 ng Sn 

in aqueous standard, 1b-20 L of dissolved soil S-MS, 1c-20 L of dissolved soil S-MS, 1d-20 L of aqua regia extract of 

soil S-MS, 2a-1.0 ng Sn in aqueous standard in presence of 2.5 g Ca, 2b-20 L of dissolved soil S-SP) 

The pyrolysis temperatures varied between 700-1600°C. Pyrolysis temperatures lower than 700°C could not be used, 

since matrix components were not eliminated efficiently under these conditions, and background was considerable, leading in 

some cases to over-correction and, as a consequence, erroneous absorption values for the analytes. The ramp time for the 




- 43 - 

1a 

2b 


11. - 14. 10. 2010

pyrolysis stage was carefully adjusted to allow gradual elimination of the matrix, avoiding any analyte loss by a sudden 

increase in temperature. The optimal charring temperatures were 1400°C for modifiers containing palladium and between 

1100-1200°C for modifiers without palladium. 

The atomization stage was studied in the temperature range of 2000–2500°C. The optimum atomization temperatures 

were 2500°C for Pd containing modifiers, 2300°C for NH4NO3/NH4F mixed modifier and 2200°C for modifiers consisting of 

citric acid or ascorbic acid and NH4F. The optimal atomization temperatures for standards and samples were not very 

different, however the atomic absorption peak from sample has appeared sooner comparing to the peak from the aqueous 

standard. This shift of the peak to the shoter time is more significant when palladium free modifiers were used. 

The analytical results and performance of tested modifiers are summarized in the Table 2. From Table 2 it is evident 

that the best analytical performance was reached when 1000 g of organic modifier (citric acid or ascorbic acid) plus 100 g 

NH 4F were co-injected with the sample, while the universally recommended modifier Pd/Mg(NO 3) 2 and the ternary modifier 

consisting of Pd, citric acid and NH4F recommended by Husáková et al. [18] showed insufficient modifying action. The poor 

analytical performance of palladium containing modifiers is possible, because the different type of atomizer is used (HGA 

instead of THGA), hence optimal atomization temperatures (2500°C) are significantly higher than reported (2200°C) [18,19]. 

The mixed modifier containing 10% (w/V) of citric acid and 1% (w/V) NH 4F was finally adopted, because of lowest optimal 

atomization temperature reached and also for stability of citric acid against oxidation compared to ascorbic acid. The relative 

low atomization temperature helps to separate the analyte effectively from the vaporization of the interfering matrix 

components. 

3.2. Method development for solid sampling ETAAS 

Based on characteristic mass of Sn measured on its main analytical line, recommended by the manufacturer’s working 

conditions, we have found out, that primary analytical line is not suitable for direct determination of Sn in soil samples. An 

aspect that is very important for solid sampling ETAAS is the possibility of selecting working conditions that allow 

decreasing the sensitivity in order to expand the working range, because diluting the samples is troublesome. The approach, 

most often proposed, is the selection of alternative lines and/or the maintenance of the Ar-ow during the atomization step. 

For Sn there are many lines that could serve as an alternative to that most frequently used (224.6 nm). A systematic study was 

carried out to evaluate the analytical characteristics (sensitivity, linear range) of the most promising lines for direct 

determination of Sn in soils. The lines of choice would be 270.7; 284.0 [20], 300.9 and 303.4 nm, respectively. The analytical 

line at 300.9 nm was finally selected due to wide linear working range, appropriate sensitivity and relatively low background 

from the solid samples. 

Table 3. Characteristics of the resonance lines studied 

Spectral line 

(nm) 

Spectral transition 

Transition probability 

(10 8 s -1 ) 

Slope a 

(s ng -1 ) 

Linear range a 

(ng) 

270.7 b 5p6s( 3 P2) 5p 2 ( 3 300.9 

P1) 0.539 0.0624 0.5-10.0 

b,d 5p6s( 3 P1) 5p 2 ( 3 303.4 

P1) 0.355 0.0315 2.0-20.0 

b 5p6s( 3 P0) 5p 2 ( 3 284.0 

P1) 1.89 0.0564 0.6-12.0 

c 5p6s( 3 P2) 5p 2 ( 3 P2) 1.57 0.0690 0.5-8.0 

a -1 b -1 

established with a Ar flow-rate of 0.1 L min , non-resonance lines with elevated ground state at 1692 cm (270.7; 300.9; 

303.4 nm) or c 3428 cm -1 (284.0 nm), d analytical spectral line used in this work under the conditions shown in Table 2 

We noticed that without modifier Sn gives approximately two times lower integrated absorbance in pure aqueous 

solution when are pipetted on the new platform compared to the same platform, but after a few solid sample runs. When the 

measurements are carried out under optimized stabilized temperature platform furnace (STPF) conditions, the effect of the 

atomization mechanism should not have much influence on the peak area. This indicates that some of the matrix components 

remain on the platform and modify its surface permanently. It is generally known that the formation of thermally stable and 

volatile SnO causes reduction in sensitivity for this element. The formation of tin atoms from SnO that can occur via different 

processes, such as intercalation of SnO into the graphite layers and reduction at elevated temperatures, dissociation of SnO(g) 

in the gaseous phase at high temperatures. After atomization of some solid samples, the morphology of the pyrocoated 

surface clearly changes. The active sites on the graphite surface where the formation of Sn from SnO and SnO 2 occurs are 

now, completely uncovered, leading to a more effective formation of tin atoms. 

When solid samples are analyzed directly a large amount of matrix is introduced into the atomizer, requiring the use of 

high pyrolysis temperatures for fusing the matrix components. We found out that tin present in the all soil samples under the 

study is stabilized up to 1500°C without modifier. However the maximum charring temperature that could be applied to 

aqueous solution without loss of Sn is only 1200°C. Although the stabilization of tin in the solid samples is acceptable the 

analyte can not be determined without the use of chemical modifiers, because the relative standard deviation (RSD) for 10 

measurements was > 10% for all samples analyzed. The relatively high temperature (2500°C) needed for Sn atomization 

from the soil samples seems to be due to the formation of refractory compounds between the analyte and carbides and/or 

matrix compounds. Moreover the Sn atomic absorption peaks form aqueous standard and from the solid samples shows 




- 44 - 


11. - 14. 10. 2010

different atomization signal profiles, which indicates that the solid matrix has significant influence on the appearance time 

and atomization kinetics. Even using atomization temperature of 2500°C the atomic signal of Sn from the soil samples is 

showing high asymmetry and long tailing, which is probable due to the several different chemical forms of the analyte 

presented in the sample. The matrix effect and incomplete analyte recovery was confirmed comparing the slopes of 

calibration curve and standard addition method. The mentioned comparison gives difference 22±3% for solid sample S-SP. 

Because of several adverse effects a modifier is required to suppress these phenomena. 

Some experiments were carried out in order to check the possible elimination of the adverse effects that could be 

derived from the use of a modier. The furnace heating parameters were fixed at 1000°C (pyrolysis temperature) for 30 s 

with 50°C s -1 heating ramp and 2400°C (atomization temperature) for 6 s with 3000°C s -1 heating ramp during preliminary 

studies. Palladium (10; 25; 50 g), Mg(NO 3) 2 (1; 5; 10 g), ammonium dihydrogen phosphate (200; 500g) were evaluated 

for this purpose using aqueous solutions of tin (20.0 ng) and a soil sample S-SP. It was found that ammonium dihydrogen 

phosphate hardly produces any variation in the tin signal, palladium produces an increased sensitivity and Mg(NO 3)2 

considerably improved the signal prole of Sn in solid sample. The enhanced atomization profile may be caused by matrix 

depletion by MgO. When 50 g of palladium were added to solid or liquid samples a significant tailing of Sn signal was 

obtained from both medium due to over-stabilization of the Sn. Taking into consideration these results, the combination of 

palladium (25g) and magnesium nitrate (10 g) was used in further experiments. 

As can be seen from Fig. 2., the use of Pd and magnesium nitrate mixture made the signal obtained from tin solutions 

similar regardless of whether they contained potentially interfering matrix elements in solution (mixture of 5 g Ca, 10 g 

Al, 2.5 g Fe, 25 g Si, 0.1 g P) or not. However, when these conditions were applied to solid samples the atomic signal of 

Sn shows moderate tailing compared to the Sn signal from solutions. It seems obvious that the modier is less effective with 

a solid sample than with solutions, probably due to the fact that in a solution the palladium-tin interaction begins already 

during the drying step whereas in solid samples it cannot take place until the matrix is destructed in the pyrolysis step. The 

interaction is thus limited because not all the tin is liberated from the matrix. In order to facilitate the action of the modier, 

the atomization programe was modied by splitting the pyrolysis in two steps. The first pyrolysis step was performed with 

addition of 10 g Mg(NO3) 2 at 500°C, the minimum temperature which permits fusing the matrix with MgO. The magnesium 

oxide (from thermal decomposition of Mg(NO3)2) may help to destroy the siliceous matrix and release the Sn trapped in the 

matrix. The temperature selected is below the boiling point of SnCl 2, thus avoiding tin losses. During the second pyrolysis 

step palladium modifier is applied to obtain a well-dened signal. As we can see in Fig. 2., using a double pyrolysis step the 

absorption signal of tin appears sooner and is better dened, the most important is, there is an increase in the peak height of 

the absorbance signal, so that the signal obtained from the solid sample is similar to that obtained from solution under the 

same conditions. The background absorption becomes insignificant even when the atomization temperature is high as 

2400°C. 

Absorbance 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

0 1 2 3 4 5 

Time, s 

Fig. 2.: Atomic absorption signal profiles of Sn in aqueous standard and solid samples in presence of mixed modifier 

consisting of 25 g Pd and 10 g Mg(NO 3) 2 (1a-10.0 ng Sn in aqueous standard, 1b-9.8 ng Sn in 0.487 mg soil S-SP, 1c-10.0 

ng Sn in aqueous standard in presence of mixture of potentially interfering elements: 2.5 g Ca, 10 g Al, 2.5 g Fe, 25 g 

Si, 0.1 g P, 2a-10.0 ng Sn in aqueous standard, 2b-10.2 ng Sn in 0.507 mg soil S-SP; 1: one step pyrolysis, 2: two step 

pyrolysis.) 




- 45 - 

1c 

1a 

2b 

2a 

1b 


11. - 14. 10. 2010

The pyrolysis curves (both for aqueous standard and solid sample S-SP) were evaluated in presence of 25 g Pd plus 

10 g Mg(NO 3) 2 using atomization temperature of 2400°C. It can be stated that in presence of mixed modifier the analyte is 

stable up to 1500°C regardless of sample state (solid or liquid). However for pyrolysis temperatures above 1000°C significant 

peak shifts for later atomization times (higher temperatures) with peak height sensitivity increase and peak area sensitivity 

decrease was obtained for solid samples and also for aqueous standards. This is presumably due to a more effective bonding 

of Sn to intermetallic compounds with Pd at elevated pyrolysis temperatures, which resulted in a more difficult releasing of 

Sn during atomization. Still the exact mechanism of this phenomenon is unknown for us. Due to mentioned peak shift an 

(increased) 8 second atomization time is mandatory for pyrolysis temperatures above 1100°C. As a consequence a moderate 

pyrolysis temperature of 1000°C was chosen for further experiments, which ensures a relatively low appearance time for Sn 

together with effective matrix elimination. 

Obtaining satisfactory results with aqueous calibration curve have been considered problematic in SS-ETAAS because 

the analyte vaporization process from solid sample might be affected by the strong matrix effect. Although several studies 

have shown that calibration against aqueous standards is acceptable in SS-ETAAS, however by analysis of some inorganic 

materials, it has been found out, that the pipetting of the standard solution onto the matrix residue remaining on the platform 

from a previous sample run is essential. The soil contains various amounts of inorganic substances, while the organic content 

of soils is destructed during the pyrolysis stage leaving the anorganic content; therefore, we have used the mentioned 

calibration mode. From this calibration mode we have expected that the analyte elements originally contained in the standard 

solution are trapped in the matrix residue and then undergo similar atomization processes as those being constituents of the 

sample. Calibration curves were established using blank and three calibration solutions with concentrations 0.5; 1 and 2 mg 

L -1 of Sn (5.0; 10.0; 20.0 ng of Sn) using the optimized conditions introduced in Table 1. 

3.3. Comparison of analytical results using solid and liquid sampling ETAAS 

The analytical results obtained for the determination of Sn in three samples of soils are presented in Table 4. 

Comparing the results obtained from the solution after the dissolution of the soils, based liquid ETAAS determination with 

results obtained by direct solid sampling ETAAS it is evident, that for satisfactory recovery total digestion is needed 

(utilizing HNO 3+HF+HClO 4 mixture). After total decomposition of calcium rich soil sample (S-SP) a matrix matching 

calibration (calibration standards in solution containing 1 g L -1 of Ca) is mandatory for achieving satisfactory results. Also it 

can be can stated that microwave assisted aqua regia digestion gives higher recovery than the “classical” aqua regia digestion 

according to ISO norm. 

Conclusion 

Table 4. Comparison of the results obtained by solid sampling and liquid sampling ETAAS 

Liquid sampling ETAAS (g.g -1 Soil 

) 

Solid sampling 

sample 

Aqua regia digestion 

Microwave assisted 

aqua regia digestion 

Total dissolution 

ETAAS (g.g -1 ) 

S-VM 

5.53 ±0.05 

37% a 

9.56±0.21 

64% a 

13.8±0.3 

93% a 

14.9±1.8 

S-MS 

S-SP 

5.07±0.16 

33% a 

7.48±0.53 

37% a 

8.31±0.59 

53% a 

10.8±0.3 

54% a 

14.6±0.2 

94% a 

16.7±0.8 

83% a 

18.5±0.4 a,b 

92% a,b 

15.5±2.0 

20.1±2.2 

a recovery calculated as (slopesolid sampling / slopeliquid sampling).100%, b matrix matching calibration 

by co-injecting of 2.5 g Ca (as Ca(NO3) 2) with the calibration solutions 

From the results it yealds, that SS-ETAAS can be successfully used for the determination of Sn in soil samples. The 

homogeneity of the samples under investigation in the range between 0.2 mg and 1.0 mg sample weight is good enough to 

make possible relative standard deviations around 10%. For determination of Sn in dissolved or solid samples a chemical 

modification was necessary to achieve quantitative recovery, enhance atomization profile, to overcome analyte losses during 

pyrolysis and minimizing matrix effects during atomization. For solid samples palladium and magnesium mixed modifier 

were used. The utilization of two stage pyrolysis resulted in improved signal profiles. Less sensitive resonance line and mini 

flow conditions are used to keep the absorbance in the linear calibration range. 

For decomposed samples the combination of citric acid and ammonium nitrate give interference and matrix effect free 

determination of Sn, however for calcium rich soil sample a matrix matching calibration is needed to achieve satisfactory 

results. In comparison with the results obtained using solid sampling ETAAS and those obtained with liquid sampling 

ETAAS, it can be stated, that for soil samples under the study only total dissolution gives satisfactory recovery, while aqua 

regia dissolution procedures achieves only up to 64% of total tin present in the soil reference materials. 




- 46 - 


11. - 14. 10. 2010

Financial support from the Scientific Grant Agency of the Comenius University UK/337/2010, from the Scientific Grant 

Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic VEGA/1/0430/08 and Centre of Excelence AP VVCE-0070-07 is 

highly acknowledged. 

We would like to express our gratitude to Prof. Ing. Viliam Krivá,PhD. for the generous loan of the instrument for the Solid 

Sampling-ETAAS and so we had the possibility to develop this technique at the Department of Analytical Chemistry, Faculty 

of Natural Sciences Comenius University in Bratislava.. 

REFERENCES 

[1] M. Hoenig, A.-M. de Kersabiec, Spectrochim. Acta, Part B 51 (1996) 1297. 

[2] J. Sastre, A. Sahuquillo, M. Vidal, G. Rauret, Anal. Chim. Acta 462 (2002) 59. 

[3] M. Stoeppler, Sample preparation: an introduction, in: M. Stoeppler (Ed.), Sampling and Sample Preparation: Practical 

Guide for Analytical Chemists, Springer-Verlag, Berlin-Heildelberg-New York, 1997. 

[4] C.J. Ritter, S. C. Bergman, R.C. Cothern, E.E. Zamierowsky, At. Absorp. Newslet. 17 (1978) 70. 

[5] U. Kurfürst (Ed.), Solid Sample Analysis - Direct and Slurry Sampling using GF-AAS and ETV-ICP, Springer-Verlag, 

Berlin, 1998. 

[6] U. Kurfürst, M. Kempeneer, M. Stoeppler, O. Schuierer, Fresenius J. Anal. Chem. 337 (1990) 248. 

[7] C. Bendicho, M.T.C. de Loos-Vollebregt,. J. Anal. At. Spectrom. 6 (1991) 353. 

[8] M.G.R. Vale, N. Oleszczuk, W.N.L. dos Santos, Appl. Spectrosc. Rev. 41 (2006) 377. 

[9] M.A. Belarra, I. Lavilla, J.R. Castillo, Analyst 120 (1995) 2813. 

[10] R. Dobrowolski, J. Mierzwa, Fresenius J. Anal. Chem. 344 (1992) 340. 

[11] E. Aadland, J. Aaseth, B. Radziuk, K. Saeed, Y. Thomassen, Fresen. Z. Anal. Chem. 328 (1987) 362. 

[12] M. A. Belarra, M. Resano, S. Rodríguez, J. Urchaga, J.R. Castillo, Spectrochim. Acta Part B 54 (1999) 787. 

[13] M. Resano, E. Garciá-Ruiz, M. Aramendiá, M.A. Belarra, J. Anal. At. Spectrom. 20 (2005) 1374. 

[14] M.A. Belarra, C .Crespo, M.P. Martnez-Garbayo, M. Resano, Spectrochim. Acta, Part B 58 (2003) 1847. 

[15] R. Dobrowolski, M. Otto, A. Adamczyk, Microchim. Acta 168 (2010) 355. 

[16] P. Bermejo-Barrera, C. Barciela-Alonso, C. Gonzalez-Sixto, A. Bermejo-Barrera, Fresen. J. Anal. Chem. 357(1997) 

274. 

[17] J. Barteková, M. Žemberyová, Comparison of Conventional and Microwave Dissolution Procedures for Determination 

of Heavy Metals in Soil Samples by AAS, Proceedings, Contemporary State and Trends of Decomposition Methods in 

Analytical Chemistry, Slovak-Austrian Symposium, Košice, 1997. 

[18] V.I. Slaveykova, M. Hoenig, Analyst 122 (1997) 337. 

[19] L. Husáková, J. Šrámková, T. ernohorský, I. Urbanová-Doležalová, Talanta 77 (2009) 1504. 

[20] M.A. Belarra, M. Resano, J.R. Castillo, Spectrochim. Acta, Part B 51 (1996) 697. 




- 47 - 


11. - 14. 10. 2010

GC-FID STANOVENIE CELKOVÉHO OBSAHU ESTEROV KYSELINY FTALOVEJ PO ICH KONVERZII NA 

DIMETYL FTALÁT V POTRAVINÁCH 

RÓBERT KUBINEC*, JANKA KUBINCOVÁ, PETER PODOLEC, ALEXANDRA SZABÓOVÁ, IVAN 

OSTROVSKÝ, RENÁTA GÓROVÁ, JOZEF VIŠOVSKÝ 

Chemický ústav, Prírodovecká fakulta Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovensko 

ÚVOD 

V potravinách sú okrem živín prítomné látky, ktoré majú negatívny vplyv na výživu loveka, dokonca sú toxické. Patrí 

medzi ne aj skupina esterov kyseliny ftalovej tzv. ftaláty. Sú bežnou súasou životného prostredia a tiež udského 

potravinového reazca. Kontrola obsahu ftalátov v potravinách poda legislatívnych predpisov je obmedzená a vzahuje sa 

len na niektoré aspekty neškodnosti. Požiadavky na bezpenos potravín ohadom obsahu ftalátov poda platnej legislatívy 

sú vymedzené kontrolou len niektorých najpoužívaných ftalátov, ako di-2-etylhexyl ftalát (DEHP), di-n-butyl ftalát (DBP), 

di-n-oktyl ftalát (DOP) a butylbenzyl ftalát (BBP) [1, 2, 3]). Avšak vzhadom na nové vedecké poznatky o charaktere a 

úinku týchto látok, posudzovanie rizík používaných ftalátov ostáva jednou z úloh plnených na poli prevencie [4]. Z toho 

vyplýva potreba ich stáleho monitorovania v životnom prostredí, najmä v oblasti potravinového reazca. 

Samotná chemická analýza ftalátov resp. ich toxikologické zhodnotenie v potravinách sú asto obtiažne [5]. Väšina 

publikácií sa zaoberá stanovením obsahu ftalátov vo vode [6] alebo biologických tekutinách [7]. Práce o obsahu ftalátov vo 

vzorkách tukových matríc [8] sú zriedkavejšie. V literatúre je opísaných mnoho spôsobov extrakných techník vybraných 

ftalátov [9]. 

Cieom tejto práce je vývoj separanej metódy vhodnej pre sledovanie obsahu všetkých ftalátov v tukových matriciach. 

Slúži ako predbežný krok kontroly celkovej kontaminácie ftalátmi. Metóda je založená na alkalickej hydrolýze všetkých 

ftalátov na kyselinu ftalovú (PA), následnom selektívnom odstránení lipofilných látok a stanovení dimetyl ftalátu metódou 

GC-FID po derivatizácii PA diazometánom. Inovácia prezentovanej metódy je práve v selektívnom oddelení tukovej matrice 

od PA. Na sledovanie obsahu ftalátov sa zvolili potraviny s majoritným zastúpením tukov (maslo, oleje, ryby). Tukové 

matrice boli vybrané z dôvodu akumulácie ftalátov v tukoch, ktoré sú dôležitou súasou udského potravinového reazca. 

Okrem toho, stanovenie nízkych koncentrácií ftalátov v prítomnosti vekého množstva tuku je výzvou pre všetkých 

analytických chemikov. 

EXPERIMENTÁLNA AS 

GC FID analýza 

Na analýzu bol použitý GC 6890 N od Agilent Technologies (Waldbronn, Nemecko) vybavený autosamplerom, 

split/splitless injektorom a FID. Ako nosný plyn sa použilo He s tlakom na vstupe 60kPa. Teplota injektora bola 280 °C 

a detektora 320 °C. Vzorky o objeme 1 l boli dávkované v splitless móde poas 1 minúty. Teplotný program použitý na 

separáciu ftalátov zaínal na 40 °C s teplotným gradientom 20 °C/min do 320 °C. Použila sa kolóna DB 5 MS s džkou 30 m, 

0,25 mm I.D a 0,25 m hrúbkou filmu J& W Scientific (Agilent Technologies, Palo, Alto, CA, USA. 

Príprava vzoriek 

Navážil sa približne 1 g zhomogenizovanej vzorky (v prípade istého tuku resp. oleja sa vzorka priamo hydrolyzovala), 

pridali sa 4 ml zmesi chloroformu s metanolom (2:1, v/v). Obsah sa extrahoval 1 hodinu trepaním a po extrakcii sa 

scentrifugoval pri 1000 RPM. K 2 ml supernatantu sa pridal 1 ml roztoku NaCl (9%, w/v). Po oddelení dvoch fáz, sa spodná 

chloroformová vrstva odparila do sucha pri 50 °C. K vzorke získaného tuku sa pridali 2 ml zmesi NaOH (2mol/l) 

s metanolom (1:1, v/v). Obsah sa hydrolyzoval pri 80 °C poas vybraného asového obdobia. Hydrolyzát sa okyslil s 500- 

600 l HCl (36%) a preextrahoval s 1 ml hexánu. Horná hexánová vrstva sa odstránila a k spodnej okyslenej vodnej frakcii sa 

pridal 1 ml chloroformu. Nasledovala derivatizácia diazometánom v dvojfázovom systéme poas 30 min poda Glastrupa 

[10]. Po derivatizácii sa chloroformová vrstva obsahujúca DMP odobrala na GC-FID analýzu. 

VÝSLEDKY A DISKUSIA 

Kritické kroky prezentovanej metódy predstavujú: hydrolýza, selektívna extrakcia vzniknutých lipofilných produktov a 

derivatizácia PA na DMP. 

Hydrolýza by mala zarui kvantitatívnu premenu všetkých ftalátov vo vzorke na PA. 

Optimalizácia podmienok bola uskutonená s ohadom na teplotu a as hydrolýzy. Bolo zistené, že 80 °C je optimálna 

teplota na hydrolýzu, pretože hydrolýza pri teplote 40 °C a 60 °C bola príliš pomalá a vyžadovala si dlhý as na jej úplný 

priebeh a pri 100 °C je príliš veké riziko odparenia obsahu do sucha. Úinnos hydrolýzy bola testovaná po 0, 5, 1, 2, 5, 8, 

16 a 24 hodine. 




- 48 - 


11. - 14. 10. 2010

Zhydrolyzované ftaláty boli derivatizované a spracované poda postupu opísaného v asti príprava vzoriek, kým 

nehydrolyzované ftaláty boli urené priamou analýzou v hexánovej fáze. Závislos plôch píkov hydrolyzovaných DEP, DBP, 

DEHP a DDP a vzniknutého DMP od asu hydrolýzy sú na Obr. 1. 

Obr. 1. Závislos plochy píkov jednotlivých hydrolyzovaných ftalátov prevedených na DMP od asu hydrolýzy. 

Selektívne oddelenie interferujúcich lipofilných produktov t.j. mastných kyselín od PA po hydrolýze je založené na 

skutonosti, že lipofilné látky – mastné kyseliny, sú dobre rozpustné v nepolárnych rozpúšadlách. Na ich preextrahovanie sa 

po hydrolýze použil n-hexán. Na selektívnu extrakciu mastných kyselín z reakného média bolo nutné jeho okyslenie. Pri pH 

1 približne len 0,5 % PA prešlo do n-hexánovej fázy, kým mastné kyseliny boli preextrahované výraznou mierou. Extrakný 

proces bol ukonený s chloforomom, do ktorého sa extrahovalo približne 60 % PA. Preto bola derivatizácia diazometánom 

vykonávaná bez odstránenia vodnej frakcie, ktorá obsahovala zvyšok PA, teda v dvojfázovom systéme. DMP vzniknutý 

derivatizáciou má relatívne obmedzenú rozpustnos vo vode v porovnaní s PA a poas esterifikácie prechádza z vodnej do 

chloroformovej fázy. 

Stopová analýza ftalátov môže by zaažená náhodnou a systematickou kontamináciou a môže ma za následok falošne 

pozitívne výsledky. Na otestovanie pozadia bola uskutonená analýza bez vzorky, ktorá prezentuje len vplyv krokov 

predúpravy na obsah DMP. Rovnako bola uskutonená analýza so známym prídavkom kyseliny ftalovej o koncentrácii 200 

g/ml, ktorá zárove kontroluje výažnos celého postupu. Výsledky sú znázornené na obr. 2. Hodnoty koncentrácie DMP 

namerané ako pozadie boli 1,4 g/ml a odpoítali sa z DMP hodnôt v reálnych vzorkách. 

Obr.2. Chromatografický záznam GC FID pozadia (vplyv predúpravy na odozvu) bez prídavku (A) 

a s prídavkom kyseliny ftalovej (B). 

V tabuke 1 sú uvedené namerané hodnoty ftalátov vyjadrených ako obsah DMP vo vybraných vzorkách s vysokým 

obsahom tuku. 




- 49 - 


11. - 14. 10. 2010

Tab. 1. Koncentrácie DMP stanovené v reálnych vzorkách. 

ZÁVER 

Vzorka Koncentrácia ± SD 

g/g 

baltický sle 5,6 ± 0,7 

maslo 12,5 ± 0,6 

bravová mas 7,2 ± 0,4 

husací tuk 1,8 ± 0,2 

kaací tuk nedetekované 

slnenicový olej 2,1 ± 0,2 

olivový olej 1,5 ± 0,2 

Vypracovaná metóda umožuje stanovenie všetkých bežne používaných ftalátov a ich metabolitov po hydrolýze 

a derivatizácii na DMP. Metóda je vhodná na sledovanie obsahu ftalátov vo všetkých lipofilných matriciach ako sú rastlinné 

a živoíšne tuky a oleje. Stanovenie neovplyvuje prítomnos nízkych mastných kyselín nachádzajúcich sa napr. v mlienych 

tukoch, ktoré sú polaritou podobné kyseline ftalovej a taktiež vysoký obsah viacnenasýtených mastných kyselín prítomných 

najmä v anovom oleji. 



LITERATÚRA 

[1] Council directive 88/378/EEC of 3 May 1988 on the approximation of the laws of the member state concerning the 

safety of toys (1988). European Union, Brussels. 

Council regulation (EEC) no. 793/93 of 23 March 1993 on the evaluation and control of the risks of existing 

[2] substances (OJ L 84, 5 April 1993). European Union, Brussels.· 

[3] ·Phthalates information centre Europe (2008). and phthalate information centre USA – 

.· 

[4] ··Official Journal of the European Union (2006). C 90/4. 

[5] Grob, K. (2008). Analytical chemistry does not support the food safety consumers expect. In Abstract book of the 32nd 

ISSC and 5th GCxGC symposium (pp. 44–45). Italy: Riva del Garda. 

[6] Ballesteros, O., Zafra, A., Navaloon, A., & Vilchez, J. L. (2006). Sensitive gas chromatographic–mass spectrometric 

method for the determination of phthalate esters, alkylphenols, bisphenol A and their chlorinated derivatives in wastewater 

samples. Journal of Chromatography A, 1121, 154. 

[7] ·Kato, K., Silva, M. J., Needham, L. L., & Calafat, A. M. (2005). Determination of total phthalates in urine by isotopedilution 

liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 814, 355. 

[8] Feng, Y.-L., Zhu, J., & Sensenstein, R. (2005). Development of a headspace solidphase microextraction method 

combined with gas chromatography–mass spectrometry for the determination of phthalate esters in cow milk. Analytical 

Chimica Acta, 538, 41. 

[9] Tienpont, B., David, F., Dewulf, E., & Sandra, P. (2005). Pitfalls and solutions for the trace determination of phthalates 

in water samples. Chromatographia, 61(7–8), 365.Glastrup, J. (1998). Diazomethane preparation for gas chromatographic 

analysis. Journal of Chromatography A, 827, 133. 




- 50 - 


11. - 14. 10. 2010

UVONENIE PRCHAVÝCH ORGANICKÝCH ZLÚENÍN (VOCs) Z PÚCNYCH RAKOVINOVÝCH BUNIEK 

WOJCIECH FILIPIAK 1,2 *, ANNA FILIPIAK 2 , ANDREAS SPONRING 1,2 , CLEMENS AGER 1,2 , ANTON 

AMANN 1,2 , JAKOB TROPPMAIR 3 , ALEXANDRA SZABÓOVÁ 4 , RÓBERT KUBINEC 4 

1 Department of Operative Medicine, Innsbruck Medical University Anichstr. 35, A-6020 Innsbruck, Austria 

2 Breath Research Unit of the Austrian Academy of Sciences, Innrain 66, A-6020 Innsbruck, Austria 

3 Daniel-Swarovski Research Laboratory, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical 

University, Innrain 66, A-6020 Innsbruck, Austria 

4 Chemický ústav, Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovensko 

e-mail: wojciech.filipiak@oeaw.ac.at 

Úvod 

Analýza vydychovaného vzduchu na rozpoznanie udských chorôb ponúka možnos neinvazívnej diagnostiky [1-4]. Je 

to obzvláš zaujímavé pre kriticky chorých pacientov [5], rovnako ako pre rozsiahle vyšetrenie, v prípade poškodenia 

obliiek a ochorenia peene [6-10], alebo nádorových ochorení [11-17]. Vzorky vydychovaného vzduchu môžu by odobraté 

bez obmedzenia. Dokonca tento odber môže by vykonaný u novorodenca alebo u pacientov na jednotke intenzívnej 

starostlivosti. Je možná aj on-line analýza vydychovaného vzduchu s kontinuálnym odberom vzoriek [18-21]. 

Najviac známe prchavé látky vo vydychovanom vzduchu sú metanol, etanol, acetón, acetaldehyd a izoprén. Napriek 

tomu, ani pre tieto zlúeniny nie je podrobný mechanizmus produkcie, metabolizácie a vyluovania presne známy. Subná je 

on-line analýza vydychovaného vzduchu (test na ergometri s rôznym pulzom a srdcovou frekvenciou, prijímanie potravy 

a pod.), ktorá poskytuje informácie vedúce k lepšiemu kvantitatívnemu pochopeniu biochemických procesov v rámci 

udského tela. 

V tomto príspevku sa sústredíme na zlúeniny nachádzajúce sa vo vydychovanom vzduchu pacientov s rakovinou. 

Pacienti s rakovinou púc majú zmenený profil koncentrácie viacerých prchavých zlúenín. Niektoré zlúeniny vo 

vydychovanom vzduchu sa objavujú vo zvýšenej koncentrácii, koncentrácia niektorých je nižšia [12-14]. Pre skríning 

rakoviny je dôležité vedie, ktoré z týchto zlúenín nádorové bunky v tele v skutonosti produkujú alebo odbúravajú. Iný 

zdroj pre prchavé zlúeniny sú imunologicky spôsobilé bunky alebo mikroorganizmy v reve alebo v púcach. Tieto alšie 

zdroje tu nie sú uvedené. 


Bunkové kultúry 

Ako línie púcnych rakovinových buniek sme testovali udské epiteliálne bunkové línie CALU-1, ktoré pochádzali zo 

spinocelulárneho karcinómu púc. Táto bunková línia pozostáva z množstva mikroklkov (malé výnelky bunkovej 

membrány), významného endoplazmatického retikula, lyzozómov a tukových inklúzii. Okrem toho, bunky CALU-1 

vykazujú mutant K-ras génu. Pestujú sa v kultivanom médiu DMEM s vysokou koncentráciou glukózy (4,5 g/l) 

obsahujúcom pyruvát (PAA) a doplnenom 10% FCS, penicilínom (100 000 jednotiek/l), streptomycínom (100 mg/l) a L 

glutamínom (293 mg/l). Bunky boli kultivované za štandardných podmienok v konvennom inkubátore pri teplote 37 °C vo 

vlhkom prostredí s 92,5% vzduch/7,5 % CO 2. Pre meranie VOC bolo naokovaných 50 miliónov trypsínových buniek 

v prostredí 100 ml fermentanej bunkovej kultúry bez fenolovej ervene (DMEM s vysokou koncentráciou glukózy), úplne 

zaplavenej, syntetický vzduch bol odobratý z plynovej faše (50 l definovanej zmesi plynov, Linde, Stadl-Paura, Rakúsko), 

obsahujúci 5% CO 2 po dobu najmenej 10 minút pri prietoku 100 ml/min a pri uzatvorení po dobu 4 - 18 h. Po skonení 

inkubanej doby sa 200 ml headspace vzduchu použilo na GC-MS analýzu. Poítanie životaschopnosti buniek (použitím 

tryptánovej modrej) sa uskutonilo na konci inkubanej doby. 

Odber vzoriek 

Sklené trubice (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko) plnené nasledujúcimi sorbentami boli použité pre zachytenie 

a nakoncentrovanie vzoriek: 25 mg Tenax TA (60/80 vekos zn), 35 mg Carboxen 569 (20/45 vekos zn), 250 mg 

Carboxen 1000 (80/100 vekos zn) (každý od Supelco, Bellefonte, PA, USA). Sorbenty boli oddelené sklenou vatou. 

Vzorka vzduchu bola zriedená v pomere 1:6 so suchým a preisteným syntetickým vzduchom, aby sa zabránilo zvýšenej 

vlhkosti pri termodesorpcii. Objem získanej vzorky z fermentora bol 200 ml a celkový prietok sorpnej pasce bol 30 ml/min. 

Tepelná desorpcia 

Vzorky analytov boli uvoované zo sorbentov tepelnou desorpciou v TDS3 jednotke vybavenej automatickým 

dávkovaom TDSA2 (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko). Prietok nosného plynu cez sorpnú pascu poas desorpcie 

bol 90 ml/min. Poiatoná teplota bola 30 °C a bola zvýšená na 300 °C, rýchlos ohrevu bola 100 °C/min (plató po dobu 10 

min). Pre kryofokusáciu desorbovaných analytov (- 90 °C) bol použitý kvapalný dusík. Pre alšie dávkovanie vzorky do 




- 51 - 


11. - 14. 10. 2010

kapilárnej kolóny CIS-4, ktorá obsahovala sklený liner vyplnený Carbotrapom B (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko), 

bola kolóna vyhrievaná rýchlosou 12 °C/s až do 320 °C (po dobu 2 minút v splitless móde). 

GC-MS analýza 

TD-GC-MS analýzy boli vykonané na plynovom chromatografe 6890N s hmotnostným detektorom 5973N (Agilent 

Technologies, Waldbronn, Nemecko) s dávkovaním vzorky pomocou termickej desorpcie (opísané vyššie). MS analýzy boli 

vykonané vo full scan móde, s rozsahom skenovania 20-200 amu, napätie na EI zdroji bolo 70eV. Zber chromatografických 

údajov sa uskutonil pomocou Agilent Chemstation Software (GC-MS analýza dát z Agilent, Waldbronn, Nemecko) a pre 

identifikáciu bola použitá knižnica hmotnostných spektier NIST 2005 (Gatesburg, USA). Bola použitá kapilárna kolóna 

PoraBond Q 25 m × 0,32 mm × 5 μm (Varian, Palo Alto, CA, USA). Teplotný program bol nasledujúci: poiatoná teplota 

50 °C po dobu 5 minút, potom stúpanie do 140 °C pri 5 °C/min, potom 5 min izotermicky, opä stúpanie 5 °C/min na 280 

°C potom 4 min izotermicky. Konštantný prietok hélia ako nosného plynu bol 2 ml/min. 

Výsledky 

Identifikácia a kvantifikácia VOCs uvonených z buniek CALU-1 

Životaschopnos 50 miliónov buniek po 4 hodinách inkubácie bola 98,6 ± 1,1 % a po 18 hodinách inkubácie bola 98,7 

± 0,7 %. Preto takmer žiadna bunka za daných podmienok neuhynula, o zabezpeuje, že uvoovanie potenciálnych VOCs 

je väšinou kvôli prežitiu a nie smrti bunky. 

Zo všetkých detegovaných látok sme zaznamenali celkom 60 látok, ktoré mohli by identifikované nielen pomocou 

spektrálnej knižnice NIST 2005, ale aj z retenného asu založenom na kalibrácii zmesí príslušnej istej látky (tabuka 1A). 

Vzorový chromatogram headspace CALU-1 rakovinových buniek je znázornený na obrázku 1. V tabuke 1B sú uvedené 

látky, pre ktoré bola identifikácia vykonaná len pomocou spektrálnej knižnice, bez potvrdenia ich retenných asoch. Píky, 

pre ktoré nebola možná správna identifikácia (príliš nízka zhoda so spektrálnou knižnicou a nezhoda retenných asov) sa 

nebrali do úvahy. Všeobecne platí, že aplikovaná TD-GC-MS metóda sa vyznauje dobrou linearitou (dokonca aj pre 

najnižšie koncentrácie) s korelanými koeficientmi väšinou vyššími ako 0,99. Limity detekcie (LODs) pre takmer všetky 

zlúeniny boli nízke, na úrovni ppt. Najnižší detekný limit bol pozorovaný u 2,3,3-trimetylpentánu (127 ppt = 5,725.10 

μg/l) a 2,3,5-trimetylhexánu (137 ppt = 7,583.10 -4 μg/l), ale aj polárne zlúeniny mali vemi nízky detekný limit, napr. 2 - 

metylpropanal (143 ppt = 3,912.10 - 4 μg/l) a acetonitril (147 ppt = 1,166.10 -7 μg/l). Našli sa iba dve zlúeniny s LOD na 

úrovni ppb (najvyššie pozorované hodnoty), a to acetaldehyd (1,517 ppb = 1,312.10 -3 μg/l) a 4-metyloktán (1,168 ppb = 

5,578.10 -3 μg/l). Podrobnejšie informácie sú uvedené v tabukách 2 a 3A-B. Takéto nízke limity detekcie s paralelnými 

nízkymi chybami (vyjadrené korelanými koeficientmi) svedia o vemi dobrej presnosti a citlivos použitej TD-GC-MS 

metódy. 

Obrázok 1: Ukážkový chromatogram prchavých látok z headspace rakovinových buniek CALU-1. 200 ml headspace 

bunkovej kultúry v 100 ml médiu boli zachytené na sorpnej pasci plnenej Tenaxom TA, Carboxénom 569, Carboxénom 

1000 a následne tepelne desorbované v GC-MS systéme. Píky, ktoré prislúchajú zlúeninám, opísaných v tomto lánku, sú 

oznaené písmenami (vi tabuka 1). 

TD-GC-MS analýzy použitia headspace buniek CALU-1 

V troch nezávislých experimentoch použitia TD-GC-MS po koncentrácii vzorky vzduchu pomocou adsorpcie na pevné 

sorbenty, bolo preukázané, že koncentrácia 4 zlúenín sa zvýšila (tabuka 2) a pre alších 12 zlúenín sa znížila (tabuka 3A 




- 52 - 

- 4 


11. - 14. 10. 2010

a 3B) v headspace bunkách CALU-1 v porovnaní len s headspace prostredia. Tieto zlúeniny sú tie, ktoré boli detegované vo 

všetkých sledovaných vzorkách rakovinových buniek, rovnako ako v prostredí. Ostatných 44 (= 60-16) identifikovaných 

zlúenín sa podrobne nespomína, pretože sa objavili "nepravidelne", t.j. nie trvalo zvýšené alebo znížené s ohadom len na 

prostredie. Jedinou výnimkou je 2-metyl-2-butenal, ktorý bol vždy nájdený > LOD v médiu bunkovej kultúry vzorky, zatia 

o jeho koncentrácia bola nižšia ako LOD v každej vzorke bunky CALU-1. 

Uskutonilo sa priame porovnanie koncentrácie prchavých organických zlúenín zistených v bunke a v okolí vzoriek. 

Spomínali sme iba zlúeniny, ktoré sú prítomné v každej bunkovej vzorke CALU-1 vo vyššej (trvalej) alebo nižšej (trvalej) 

úrovni, než v okolí každej vzorky. Pomery priemerných koncentrácii z oboch typov vzoriek sú uvedené v tabukách 2 a 3A- 

B. 

Po 4 hodinách inkubácie by mohla by vo fermentanej nádobe nájdená zvýšená koncentrácia izopropylalkoholu. 

Avšak, koncentrácia 2-propanolu po 4 hodinách inkubácie sa zvýšila len v 3 zo 4 meraní, kým u vzoriek inkubujúcich sa 18 h 

nie je žiadny významný rozdiel medzi meraným množstvo 2-propanolu v headspace rakovinových buniek a v headspace 

prostredia. Po 18 hodinách inkubácie sa koncentrácie 2,3,3-trimetylpentánu (priemer ppb v bunkách/priemer ppb v okolí = 

1,89), 2,3,5-trimetylhexánu (1,71), 2,4-dimetylheptánu (3,04) a 4-metyloktánu (1,71) výrazne zvýšili v headspace buniek 

CALU-1 (obr. 2). Po 4 h inkubácie došlo k zníženiu koncentrácie u zlúenín metakroleín (0,10), 2-metylpropanal (0,08), 2metoxy-2-metylpropán 

(0,39), 3-metylbutanal (0,01), 2-metyl-2-butenal (0) a n-butyl-acetát (0,14) v rakovinových bunkách 

(obr. 3 a obr. 4A). Po 18 h inkubácie sa výrazne znížila koncentrácia acetaldehydu (priemer ppb v bunkách/priemer ppb v 

okolí = 0,22), acetonitrilu (0,48), akroleínu (0,57), metakroleínu (0,12), 2-metylpropanalu (0,07), 2-butanónu (0,47), 2metoxy-2-metylpropánu 

(0,41), 3-metylbutanalu (0,01), 2-metyl-2-butenalu (0), 2-etoxy-2-metylpropánu (0,40), hexanalu 

(0,37) a n-butyl-acetátu (0,17) (obr. 3 a obr. 4B). 

Diskusia 

V našich experimentoch boli prchavé organické zlúeniny uvoované z línie buniek rakoviny púc CALU-1, odobraté 

a koncetrované prostredníctvom adsorpcie na pevných sorbentoch s následnou termálnou desorpciou a analyzované pomocou 

GC-MS. Vo výskumoch s líniou buniek CALU-1 boli testované dlhšie a kratšie inkubané asy (18 h a 4 h) vzhadom na to, 

že v predchádzajúcich experimentoch museli by vyvinuté technické zariadenia a protokol pre toto experimentálne 

nastavenie. Výsledky pokusov s bunkami CALU-1 potvrdzujú existenciu látok, ktoré sú bu uvoované alebo 

spotrebované týmito bunkami. Spomínané sú len analyty, ktoré boli detegované vo všetkých vzorkách prostredia, ako aj v 

rakovinových bunkách. alej sa uvádza, že uvoované zlúeniny môžu by detegované po dlhšej inkubanej dobe, ale 

zatia nebolo sledované žiadne významné uvoovanie po 4 hodinách inkubácie. Na druhej strane, spotreba niekokých 

aldehydov, ako aj n-butyl-acetátu a metyl-terc-butyléteru z headspace roztoku buniek by mohla by detegovaná už po krátkej 

dobe inkubácie. Aj pre zlúeniny ako je acetaldehyd a najmä 3-metylbutanal a n-butyl-acetát, ktoré majú vysoké pozadie z 

prostredia, bola pozorovaná silná redukcia koncentrácie už po 4 hodinách inkubácie (tabuka 3A). Vplyv inkubanej doby na 

množstvo zistených látok je znázornený na obrázku 3. Vzhadom na veké rozdiely v meranej ploche píku acetaldehydu, 

nebola potvrdená dôležitos pre túto látku po 4 h inkubácie. 

Tabuka 1: 

A: Súhrn všetkých látok potvrdených spektrálnou knižnicou a retenným asom 

íslo Zlúenina t R [min] CAS 

1 Metylalkohol 8,778 67-56-1 

2 Dimetyléter 10,323 115-10-6 

3 Acetaldehyd 11,936 75-07-0 

4 Metántiol 13,130 74-93-1 

5 Izobután 15,785 75-28-5 

6 2-Metyl-1-propén 16,118 115-11-7 

7 Etyl alkohol 16,517 64-17-5 

8 Acetonitril (a) 17,423 75-05-8 

9 2-Butén (Z alebo E izomér) 17,009 107-01-7 

10 Bután 17,186 106-97-8 

11 2-Butén (E alebo Z izomér) 17,360 115-11-7 

12 2-Propénal (b) 19,310 107-02-8 

13 Furán 19,741 110-00-9 

14 Propanal 20,170 123-38-6 

15 Acetón 20,469 67-64-1 

16 Izopropylalkohol 21,720 67-63-0 

17 2-Metylbután 23,229 78-78-4 

18 Etyléter 23,503 60-29-7 

19 1-Propanol 23,696 71-23-8 

20 Pentán 24,224 109-66-0 




- 53 - 


11. - 14. 10. 2010

íslo Zlúenina tR [min] CAS 

21 Metakroleín (c) 25,375 78-85-3 

22 2-Metylpropanal (d) 25,917 78-84-2 

23 Metyl vinyl ketón 26,795 78-94-4 

24 Trichlórmetán 27,561 67-66-3 

25 Tetrahydrofurán 27,920 109-99-9 

26 2-Butanón (e) 28,124 78-93-3 

27 Etyl acetát 29,829 141-78-6 

28 2-Metoxy-2-metylpropán (f) 30,377 1634-04-4 

29 2-Metyl-1-pentén 31,692 763-29-1 

30 Benzén 32,418 71-43-2 

31 Hexán 33,003 110-54-3 

32 2-Etylakroleín 34,049 922-63-4 

33 3-Metylbutanal (g) 34,587 590-86-3 

34 2-Etoxy-2-metylpropán (h) 35,346 637-92-3 

35 2-Pentanón 35,868 107-87-9 

36 Metyl-metakrylát 36,121 80-62-6 

37 2-Metyl-2-buténal 37,277 1115-11-3 

38 3-Metylhexán 38,434 589-34-4 

39 Cyklopentanón 38,750 120-92-3 

40 Toluén 39,466 108-88-3 

41 Furfural 40,044 98-01-1 

42 Metylizobutylketón 40,262 108-10-1 

43 Hexanal (i) 42,001 66-25-1 

44 Butyl-acetát (j) 42,624 123-86-4 

45 2,3,4-Trimetylpentán 42,949 565-75-3 

46 2,3,3-Trimetylpentán (k) 43,202 560-21-4 

47 4-Metylheptán 43,385 589-53-7 

48 3-Etylhexán 43,580 619-99-8 

49 Oktán 44,465 111-65-9 

50 p-Xylén 44,721 106-42-3 

51 Styrén 45,195 100-42-5 

52 p-Xylén 45,363 106-42-3 

53 3-Metyl-2(5H)-furanón 45,779 22122-36-7 

54 2,3,5-Trimetylhexán (l) 46,456 1069-53-0 

55 2,4-Dimetylheptán (m) 46,647 2213-23-2 

56 Benzaldehyd 46,799 100-52-7 

57 4-Metyloktán (n) 47,697 2216-34-4 

58 Oktanal 50,921 124-13-0 

59 Limonén 52,217 138-86-3 

60 Dekán 52,572 124-18-5 

Uvedené látky boli pozorované v headspace prostredia ako aj v headspace rakovinových buniek CALU-1. Písmená 

v zátvorkách sa vzahujú na píky v chromatograme na obrázku 1. 

B: Zoznam látok potvrdených iba spektrálnou knižnicou 

Zlúenina tR [min] CAS M +. 

Propén 7,939 115-07-1 42 

Chlórmetán 8,259 74-87-3 50 

Acetofenón 51,165 98-86-2 120 

(1E)-1-Butenylbenzén 53,069 824-90-8 132 

Nonanal 54,630 124-19-6 144 

Uvedené zlúeniny boli zistené v headspace prostredia a rakovinových buniek CALU-1. Relatívna molekulová 

hmotnos (RMM) sledovaného molekulového iónu je uvedená pri každej prezentovanej zlúenine. 

Zaujímavé je, že výsledky našich experimentov ukázali, že väšina detegovaných prchavých látok, ktoré majú výrazne 

zvýšené koncentrácie v headspace bunkovej kultúry v porovnaní s kontrolným prostredím sú nasýtené uhovodíky. Z buniek 

CALU-1 boli uvoované 2,3,3-trimetylpentán, 2,3,5-trimetylhexán, 2,4-dimetylheptán a 4-metyloktán (obr. 2). Namerané 

koncentrácie týchto zlúenín sú uvedené v tabuke 2. Phillips et al. zistili, že v dychu pacientov s rakovinou púc sa zvýšila 




- 54 - 


11. - 14. 10. 2010

koncentrácia niekokých alkánov a rozvetvených uhovodíkov, tiež vrátane 4-metyloktánu v porovnaní so zdravými osobami 

[12,13]. 

Tabuka 2: Kvantifikácia prchavých organických zlúenín uvoovaných z rakovinových buniek CALU-1 po adsorpcii na 

pevných sorbentoch s následnou TD-GC-MS analýzou. 

Koncentrácia [ppb] po 18 h 

inkubácie 

priemer 

ppb 

prostredie 

priemer 

ppb 

bunky 

Zlúenina CAS R 2 LOD 

[ppb] 

Prostredie Bunky 

2,3,3- 

560- 0,998 0,127 0,37 0,45 0,40 0,60 0,84 0,86 0,41 0,77 1,89 

trimetylpentán 21-4 

2,3,5- 

1069- 0,997 0,149 0,43 0,42 0,29 0,79 0,67 0,50 0,38 0,65 1,71 

trimetylhexán 53-0 

2,4- 

2213- 0,996 0,179 0,33 0,35 0,20 1,25 0,77 0,65 0,29 0,89 3,04 

dimetylheptán 23-2 

4-metyloktán 2216- 

34-4 

0,985 1,168 1,33 1,51 2,02 4,03 2,09 2,17 1,62 2,76 1,71 

ppb 

bunky/ 

ppb 

prostredie 

Koncentrácie uvedených VOCs sú zvýšené v headspace buniek CALU-1 v porovnaní s prostredím po 18 hodinách 

inkubácie. Koncentrácie uvedených VOCs sú znázornené pri každej meranej vzorke (headspace buniek CALU-1 a 

prostredia). Sú tu prezentované korelané koeficienty a limity detekcie (LODs). 

Tabuka 3: A a B: Kvantifikácia prchavých organických zlúenín spotrebovaných rakovinovými bunkami CALU-1 po 

adsorpcii na pevných sorbentoch s následnou TD-GC-MS analýzou. 

A Koncentrácia [ppb] po 4 h inkubácie priemer 

ppb 

prostredie 

Zlúenina R 2 LOD 

[ppb] 


priemer 

ppb 

bunky 

metakroleín 0,999 0,466 5,66 9,38 3,93 0,63 0,34 0,84 0,34 0,34 4,898 0,469 0,10 

2- 

0,998 0,143 19,80 12,98 39,53 9,12 1,21 pod 3,35 2,03 20,357 1,649 0,08 

metylpropanal 

LOD 

metyl terc-butyl 

éter 

0,999 0,293 1,68 3,43 3,56 1,60 0,67 0,94 1,30 1,11 2,567 1,004 0,39 

3-metylbutanal 0,994 0,234 142,3 184,19 218,74 73,14 0,08 2,44 3,02 2,13 154,588 1,916 0,01 

n-butyl acetát 0,999 0,134 60,47 105,13 66,58 58,08 2,01 14,70 11,27 13,08 72,566 10,26 0,14 

B 

Zlúeniny R 2 LOD 

[ppb] 

Koncentrácia [ppb] po 18 h inkubácie priemer 

ppb 

prostred 

ie 

priemer 

ppb 

bunky 


acetaldehyd 0,993 1,517 257,527 335,818 315,063 pod LOD 116,472 81,692 302,803 66,054 0,22 

acetonitril 0,998 0,147 11,344 7,540 5,764 4,183 3,633 4,100 8,216 3,972 0,48 

akroleín 0,998 0,718 5,703 3,462 4,079 2,185 2,071 3,238 4,415 2,498 0,57 

metakroleín 0,999 0,466 5,933 4,975 4,723 0,811 0,344 0,702 5,210 0,619 0,12 

2-metylpropanal 0,998 0,143 30,915 11,773 21,277 0,532 3,573 0,083 21,322 1,396 0,07 

2-butanón 0,999 0,149 3,523 5,206 3,084 1,114 2,812 1,669 3,938 1,865 0,47 

Metyl-terc-butyl 

éter 

0,999 0,293 2,126 4,202 2,089 0,753 1,654 1,023 2,806 1,143 0,41 

3-metylbutanal 0,994 0,234 157,462 206,895 78,027 2,226 2,215 1,529 147,461 1,990 0,01 

etyl terc-butyl 

éter 

0,999 0,215 6,168 11,281 5,121 2,060 4,805 2,229 7,523 3,032 0,40 

2-metyl-2- 0,985 0,430 1,839 1,024 1,163 pod LOD pod pod 1,342 0,000 0,00 

butenal 

hexanal 0,981 0,540 2,043 2,805 1,980 0,791 1,016 0,711 2,276 0,839 0,37 

n-butyl-acetát 0,999 0,134 43,949 31,381 26,348 11,084 3,032 3,324 33,892 5,813 0,17 




- 55 - 

LOD 

LOD 

ppb 

bunky/ 

ppb 

prostredie 

ppb 

bunky/ 

ppb 

prostred 

ie 


11. - 14. 10. 2010

Koncentrácie uvedených prchavých organických látok sa znížili v headspace buniek CALU-1 v porovnaní s prostredím. 

Uvádzajú sa dve rôzne inkubané doby: 4 h (A) a 18 h (B). Koncentrácie uvedených VOC sú zaznamenané pre meranú 

vzorku (headspace buniek CALU-1 a prostredia). Sú tu prezentované korelané koeficienty a limity detekcie (LODs). 

Obrázok 2: Porovnanie koncentrácií VOCs prítomných vo vyššej koncentrácii v headspace buniek CALU-1 (modrý stpec) 

v porovnaní s kontrolným prostredím (ervený stpec) po 18 h inkubácie. Prezentované sú priemerné koncentrácie (n = 3) so 

smerodajnou odchýlkou. Významné rozdiely sú oznaené hviezdikou. 

Obrázok 3: Porovnanie koncentrácii VOCs prítomných v nižšej koncentrácii v headspace bunkovej kultúry (CALU-1) 

(svetlo modrý a tmavo modrý stpec) v porovnaní s kontrolným prostredím (žltý a ervený stpec) po 4 h a 18h inkubácie. 

Prezentované sú priemerné koncentrácie (n = 4 pri 4 h inkubácii, n = 3 pri 18 h inkubácii) so smerodajnou odchýlkou. 

Významné rozdiely sú oznaené hviezdikou. 




- 56 - 


11. - 14. 10. 2010

Obrázok 4: A a B: Porovnanie koncentrácií VOCs prítomných v nižšej koncentrácii v headspace bunkovej kultúry (CALU- 

1) (modrý stpec) v porovnaní s kontrolným prostredím (ervený stpec) po 4 h (obr. 4a) a 18 h (obr. 4b) inkubácie. 

Prezentované sú priemerné koncentrácie (n = 4 pri 4 h inkubácii, n = 3 pri 18 h inkubácii) so smerodajnou odchýlkou. 

Významné rozdiely sú oznaené hviezdikou. 

Záver 

Táto práca je prvým krokom k získaniu lepšieho porozumenia metabolizmu VOCs z nádorových buniek. Zistili sme, že 

2,3,3-trimetylpentán, 2,3,5-trimetylhexán, 2,4 -dimetylheptán a 4-metyloktán sú uvoované z bunkovej línie CALU-1, a 

preto by sa mali bra do úvahy ako tumoru - príbuzné zlúeniny. Bolo tiež jasne preukázané, že tieto bunky spotrebovávajú 

niekoko typov aldehydov, ale aj látok z iných skupín. Znížená hladina aldehydov môže by iastone vysvetlená vyššou 

aktivitou aldehyd dehydrogenázy v nádorových bunkách. Tieto výskumy môžu poskytnú rady, ktoré látky sú vhodné ako 

biomarkery nádorového ochorenia, a tak sa môže stanovi technicky realizovatená metóda pre vasnú a neinvazívnu 

diagnostiku rakoviny púc. Avšak, malo by by objasnené biochemické pozadie všetkých spomínaných zlúenín pred ich 

použitím ako plne zabezpeených biomarkerov. 

Táto práca vznikla s podporou Projektu pre rakúsko-slovenskú vedecko-technickú spoluprácu (Grant SK-AT-0014-08) 

Literatúra 

[1] Amann A, Smith D, (eds): Breath Analysis for Clinical Diagnosis and Therapeutic Monitoring. Singapore: World 

Scientific; 2005. 

[2] Amann A, Spanel P, Smith D: Breath analysis: the approach towards clinical applications. Mini Rev Med Chem 2007, 

7(2):115-129. 

[3] Schubert J, Miekisch W, Nöldge-Schomburg G: VOC breath markers in critically ill patients: potentials and limitations. 

In Breath Analysis for Clinical Diagnosis and Therapeutic Monitoring Edited by: Amann A, Smith D. Singapore: World 

Scientific; 2005:267-292. 

[4] Risby T: Current status of clinical breath analysis. In Breath Analysis for Clinical Diagnosis and Therapeutic Monitoring 

Edited by: Amann A, Smith D. Singapore: World Scientific; 2005:251-265. 

[5] Schubert JK, Miekisch W, Geiger K, Noldge-Schomburg GF: Breath analysis in critically ill patients: potential and 

limitations. Expert Rev Mol Diagn 2004, 4(5):619-629. 

[6] Davies S, Spanel P, Smith D: A new 'online' method to measure increased exhaled isoprene in end-stage renal failure. 

Nephrol Dial Transplant 2001, 16(4):836-839. 

[7] Davies S, Spanel P, Smith D: Quantitative analysis of ammonia on the breath of patients in end-stage renal failure. 

Kidney Int 1997, 52(1):223-228. 

[8] Davies SJ, Spanel P, Smith D: Quantitative analysis of metabolites on the breath of patients in renal failure. Journal of the 

American Society of Nephrology 1996, 7(9):A0352-A0352. 

[9] Perri F, Marras RM, Ricciardi R, Quitadamo M, Andriulli A: 13Cbreath tests in hepatology (cytosolic liver function). Eur 

Rev Med Pharmacol Sci 2004, 8(1):47-49. 

[10] Candelli M, Armuzzi A, Nista EC, Fini L, Gasbarrini G, Gasbarrini A: 13C-methacetin breath test for monitoring 

hepatic function in cirrhotic patients before and after liver transplantation. Aliment Pharmacol Ther 2004, 19(2):243. 

[11] Phillips M, Altorki N, Austin JH, Cameron RB, Cataneo RN, Greenberg J, Kloss R, Maxfield RA, Munawar MI, Pass 

HI, Rashid A, Rom WN, Schmitt P: Prediction of lung cancer using volatile biomarkers in breath. Cancer Biomark 2007, 

3(2):95-109. 




- 57 - 


11. - 14. 10. 2010

[12] Phillips M, Cataneo RN, Cummin AR, Gagliardi AJ, Gleeson K, Greenberg J, Maxfield RA, Rom WN: Detection of 

lung cancer with volatile markers in the breath. Chest 2003, 123(6):2115-2123. 

[13] Phillips M, Cataneo RN, Ditkoff BA, Fisher P, Greenberg J, Gunawardena R, Kwon CS, Rahbari-Oskoui F, Wong C: 

Volatile markers of breast cancer in the breath. Breast J 2003, 9(3):184-191. 

[14] Wehinger A, Schmid A, Mechtcheriakov S, Ledochowski M, Grabmer C, Gastl G, Amann A: Lung cancer detection by 

proton transfer reaction mass spectrometric analysis of human breath gas. Int J Mass Spec 2007, 265:49-59. 

[15] Machado RF, Laskowski D, Deffenderfer O, Burch T, Zheng S, Mazzone PJ, Mekhail T, Jennings C, Stoller JK, Pyle J, 

Duncan J, Dweik RA, Erzurum SC: Detection of lung cancer by sensor array analyses of exhaled breath. Am J Respir Crit 

Care Med 2005, 171(11):1286-1291. 

[16] Di Natale C, Macagnano A, Martinelli E, Paolesse R, D'Arcangelo G, Roscioni C, Finazzi-Agro A, D'Amico A: Lung 

cancer identification by the analysis of breath by means of an array of nonselective gas sensors. Biosens Bioelectron 2003, 

18(10):1209-1218. 

[17] Poli D, Carbognani P, Corradi M, Goldoni M, Acampa O, Balbi B, Bianchi L, Rusca M, Mutti A: Exhaled volatile 

organic compounds in patients with non-small cell lung cancer: cross sectional 

and nested short-term follow-up study. Respir Res 2005, 6(1):71. 

[18] Amann A, Telser S, Hofer L, Schmid A, Hinterhuber H: Exhaled breath as a biochemical probe during sleep. In Breath 

Analysis for Clinical Diagnosis and Therapeutic Monitoring Edited by: Amann A, Smith D. Singapore: World Scientific; 

2005:305-316. 

[19] Smith D, Spanel P: On-line determination of the deuterium abundance in breath water vapour by flowing afterglow mass 

spectrometry with applications to measurements of total body water. Rapid Commun Mass Spectrom 2001, 15(1):25-32. 

[20] Smith D, Spanel P: On-line determination of the deuterium abundance in breath water vapour by flowing afterglow mass 

spectrometry, FA-MS, with applications to measurements of total body water. Rapid Commun Mass Spectrom 2001, 

15(1):25-32. 

[21] Smith D, Wang TS, Spanel P: On-line, simultaneous quantification of ethanol, some metabolites and water vapour in 

breath following the ingestion of alcohol. Physiological Measurement 2002, 23(3):477-489. 




- 58 - 


11. - 14. 10. 2010

TEPLOTNE PROGRAMOVANÉ PLYNOVO CHROMATOGRAFICKÉ LINEÁRNE RETENNÉ INDEXY 

VŠETKÝCH C4-C23 METYLESTEROV MONOMETYLOVANÝCH NASÝTENÝCH MASTNÝCH KYSELÍN NA 

METYLSILIKÓNOVEJ OV-1 STACIONÁRNEJ FÁZE 

RÓBERT KUBINEC a* , JAROSLAV BLAŠKO a , RENÁTA GÓROVÁ a , GABRIELA ADDOVÁ a , IVAN OSTROVSKÝ a , 

ANTON AMANN b,c , LADISLAV SOJÁK a 

a 

Chemický ústav Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, 842 15 Bratislava 

b 

Innsbruck Medical University, Department of Anesthesia and General Intensive Care, Anichstrasse 35, A-6020 Innsbruck, 

Austria 

c 

Breath Research Unit of the Austrian Academy of Sciences, Dammstrasse 22, A-6850 Dornbirn, Austria 

email kubinec@fns.uniba.sk 

Úvod 

Mastné kyseliny s rozvetveným reazcom sa nachádzajú v mikroorganizmoch, tkanivách zvierat a v stopových 

hladinách vo väšine rastlín [1]. Monometylované mastné kyseliny sú prítomné v mnohých organizmoch od baktérií po 

cicavce. U loveka sa našli v koži, mozgu, dychu, krvi a rakovinových bunkách [2]. Obyajne sa vyskytuje len jedno 

metylové vetvenie, viacmetylované mastné kyseliny sa nachádzajú v tkanivách prežúvavcom a niektorých iných tkanivách. V 

prírode sú najastejšie sa vyskytujúce iso- a anteiso-izoméry, t.j. s metylovým vetvením na predposlednom a 

antepredposlednom atóme uhlíka. Acylový reazec je nasýtený, ale v niektorých baktériách môže by tiež jedna dvojitá 

väzba. Metylované mastné kyseliny C15-C17 majú protirakovinový úinok, ich cytotoxicita je porovnatená s cytotoxicitou 

konjugovanej kyseliny linolovej [3]. Kaneda [4] uverejnil biosyntézu, funkciu a taxonomickú významnos iso a anteiso 

mastných kyselín v baktériách. Metylestery monometylovaných nasýtených mastných kyselín (FAME) sa môžu považova 

za endogénne markery vo výdychových plynoch [5]. Analýza zlúenín vo výdychovom plyne môže poskytnú náhad do 

rôznych biochemických procesov v zdravom a chorobou postihnutom udskom tele. 

GC-MS môže by vhodný prostriedok na identifikáciu a analýzu metylesterov monometylovaných nasýtených mastných 

kyselín. Problém analýzy jednotlivých monometylovaných FAME v širokom rozsahu atómov uhlíka (do C23) je spojený s 

ich mnohozložkovosou a podobnou retenciou izomérov s metylovým vetvením v okolí stredu uhlíkového reazca molekuly. 

Iný problém je nedostatok štandardných referenných materiálov a absencia a/alebo slabá reprodukovatenos publikovaných 

retenných údajom, ako aj obmedzenie GC-MS kombinovaných techník v interpretácii hmotnostných dát neúplne 

separovaných polohových izomérov. Použitie GC retenných indexov, ktoré sa majú použi ako doplnková informácia na 

identifikáciu spolu s hmotnostným spektrom je zaujímavé, pretože niektoré izoméry majú rovnaké alebo takmer rovnaké 

modely fragmentácie. 

Apon and Nicolaides [6] študovali problém stanovenia polohy metylovej skupiny v metylesteroch metylovaných 

mastných kyselín C11-C18 kapilárnou GC/MS. Na štúdium použili úplné sady štandardov metylovaných 

monometyloktadekanoátov v metylovou skupinou v polohe 2 až 17 na uhlíkovom reazci. Tento študijný model bol doplnený 

štandardmi izo kyselín s párnym potom atómov uhlíka od C12 do C20 a anteizo kyselinami s nepárnym potom atómov 

uhlíka C13-C21. Na urenie retenného poriadku blízko seba eluujúcich píkov sa použili publikované hmotnostné spektrá 

rozvetvených FAME a namerané poradie pre C18 [6]. Tieto analytické postupy sa aplikovali v štúdii rozvetvených mastných 

kyselín vo vyluovaní udského tuku [7] a identifikovali sa metylové skupiny len na párnych atómoch uhlíka s výnimkou iso 

zlúenín. V iných prácach sa na lepšie odlíšenie hmotnostných spektier metylovaných izomérov FAME použili ich deriváty. 

Simon a kol. [8] lokalizovali vetvenie v monometyl-rozvetvených mastných kyselinách konverziou FAME na ich 

zodpovedajúce rozvetvené alkány. Blomquist [9] identifikoval osemnás metyl-rozvetvených C15-C19 mastných kyselín z 

muchy domácej (Musca domestica L.) pomocou GC-MS po redukcii na zodpovedajúce uhovodíky. Yu a kol. [10] 

lokalizovali metylové vetvenie v mastných kyselinách pomocou GC-MS derivátov 4,4-dimetyloxazolínu. 

Cieom tejto štúdie bol výskum GC retenného správania sa všetkých 220 C4-C23 metylesterov monometylovaných 

nasýtených mastných kyselín na metylsilikónovej OV-1 stacionárnej fáze. Kvôli nedostatku štandardných materiálov sa 

zmesi monometylovaných FAME pripravili reakciou vsunutia metylénovej skupiny [11] zo zmesi FAME C6-C22 s 

lineárnym reazcom a zmes sa doplnila komernými štandardmi C4-C6 monometyl-rozvetvených FAME. Na GC 

identifikáciu v homologických radoch metylovaných FAME sa použili korelácie štruktúra-retencia [12-14] a identifikácia sa 

potvrdila pomocou GC-MS [5]. Retenné indexy plynovo chromatograficky neseparovaných izomérov sa získali hmotnostno 

spektrometrickou fragmentáciou [13, 14]. 


Monometyl-rozvetvené FAME C7-C23 ako modelová zmes sa pripravili zo zmesi FAME C6-C22 s lineárnym reazcom 

(Supelco, Bellefonte, PA, USA) pomocou reakcie vsunutia metylénovej skupiny [11] v zostave poda Glastrupa [15] 

použitím plynného diazometánu a UV žiarenia, výažnos tejto reakcie bola približne 4%. Táto zmes sa doplnila 

jednotlivými C3–C5 FAME s lineárnym reazcom a C4–C6 monometyl-rozvetvenými FAME (Sigma–Aldrich, Germany). 

Biologická vzorka, biely povlak sa odobrala z korea jazyka (od pacienta trpiaceho imunitnou nedostatonosou) v 

množstve približne 50 l. Aby sa predišlo kontaminácii vzorky jedlom, pacient 24 hodín pred odberom vzorky neprijímal 




- 59 - 


11. - 14. 10. 2010

potraviny obsahujúce tuk. Vzorka sa vysušila do sucha pri 50 °C. Lipidy sa extrahovali s 1 ml chloroformu. Po odstránení 

rozpúšadla z extraktu pod prúdom dusíka pri 50 °C sa pridalo 200 μL hexánu a 40 μL metyl-acetátu a zmes sa premiešala. 

Metylestery mastných kyselín sa pripravili použitím 100 μL 0.5 M metoxidu sodného v suchom metanole, ktorý sa po dobu 

15 minút nechal reagova pri laboratórnej teplote pri obasnom premiešaní. Vialka sa potom ochladila na 20 °C po dobu 10 

min, pridalo sa 60 μL kyseliny šaveovej (0,5 g v 15 mL dietyléteru) a zmes sa premiešala. Vialka sa centrifugovala, aby sa 

usadila zrazenina šaveanu sodného. Horná fáza s roztokom FAME sa použila na GC-MS analýzu. 

GC-MS merania sa uskutonili na plynovom chromatografe Agilent Technologies 6890N s hmotnostným detektorom 

5973 Network (Agilent, Waldbronn, Nemecko). Dávkoval sa 1 μl vzorky do injektora v móde s deliacim pomerom 100:1 a 

teplote 320 °C pri analýze štandardnej zmesi a v móde bez delia pri analyze biologickej vzorky. 

Zmes monometyl-rozvetvených FAME sa separovala použitím kapilárnej kolóny 100 m × 0.25 mm i.d. s 

metylsilikónovou stacionárnou fázou OV-1 s hrúbkou filmu 0.25 μm (Supelco, Bellefonte, PA, USA). Poiatoná teplota 

kolóny bola 30 °C, potom vzrástla na 310 °C rýchlosou 1 °C min 1 , potom sa výsledná teplota 310 °C udržiavala po dobu 5 

min. Ako nosný plyn sa použilo hélium s konštantným prietokom 1,6 ml min 1 . Teplota transfer line bola 330 °C. Podmienky 

kvadrupólu boli nasledovné: energia elektrónov 70 eV a teplota iónového zdroja 230 °C. MS detektor pracoval v SIM móde. 

U každého píku sa kontrolovala jeho MS fragmentaná schéma, aby sa detegovali možné prekrývajúce sa zlúeniny a merali 

sa ich retenné dáta. 

Teplotne programované retenné indexy monometyl-rozvetvených FAME sa vypoítali z troch paralelných meraní s 

priemernou opakovatenosou ±0.04 i.u. Ako porovnávacie štandardy na výpoet retenných indexov sa vybrali metylestery 

mastných kyselín s lineárnym reazcom, ktorých retenný index sa vypoíta ako 100-násobok potu atómov uhlíka v 

molekule. Monometyl-rozvetvené FAME sa identifikovali na základe vzahov štruktúra-retencia,l závislostí homomorfných 

faktorov jednotlivých homologických radov monometyl-rozvetvených FAME od potu atómov uhlíka [12-14] a potvrdili sa 

pomocou GC–MS [6]. 


Získaný chromatogram GC separácie C6–C23 monometyl-rozvetvených FAME pripravených reakciou vsunutia 

metylénovej skupiny do lineárneho reazca FAME s oznaenými píkmi je uvedený na Obr. 1a. Získali sa charakteristické 

OV 1 

zmesi všetkých izomérnych monometyl-rozvetvených FAME. Namerané programovo teplotné lineárne indexy I P a ich 

štandardné odchýlky s z daného chromatogramu pre monometyl-rozvetvené FAME na metylsilikónovej stacionrnej fáze sú 

uvedené v Tabuke 1. 

Tabuka 1. Namerané teplotne programované lineárne retenné indexy IP C4-C23 metylesterov monometylovaných 

OV 1 

mastných kyselín na OV-1 a ich štandardné odchýlky, homomorfné faktory H a špecifické MS ióny m/z 

metyl x-metyl-y-oát 

OV 1 I P 

s OV 1 

H P 

 

MS ióny m/z 

x y 

MeC3 2- propán 353,43 0,078 53,43 57, 88, 101 

MeC4 3- bután 446,58 0,056 46,582 74, 75, 101 

2- bután 448,28 0,075 48,28 57, 88, 101 

MeC5 2- pentán 541,43 0,052 41,43 57, 88, 101 

3- pentán 554,92 0,048 54,92 74, 75, 101 

4- pentán 561,82 0,062 61,82 74, 87, 115 

MeC6 2- hexán 641,28 0,041 41,28 57, 88, 101 

3- hexán 648,61 0,041 48,61 74, 75, 101 

5- hexán 662,85 0,041 62,85 74, 101, 129 

4- hexán 671,66 0,081 71,66 55, 74, 87 

MeC7 2- heptán 740,32 0,030 40,32 57, 88, 101 

3- heptán 746,53 0,066 46,53 74, 75, 101 

4- heptán 762,31 0,041 62,31 74, 87, 115 

6- heptán 763,42 0,047 63,42 74, 115, 143 

5- heptán 769,87 0,057 69,87 74, 101, 129 

MeC8 2- oktán 839,18 0,066 39,18 57, 88, 101 

3- oktán 844,28 0,048 44,28 74, 75, 101 




- 60 - 

P 


11. - 14. 10. 2010


OV 1 I P 

s OV 1 

H P 

 

MS ióny m/z 

x y 

4- oktán 858,23 0,037 58,23 74, 87, 115 

5- oktán 859,30 0,059 59,30 74, 101, 129 

7- oktán 864,75 0,060 64,75 74, 129, 157 

6- oktán 869,17 0,043 69,17 74, 115, 143 

MeC9 2- nonán 938,06 0,018 38,06 57, 88, 101 

3- nonán 942,77 0,032 42,77 74, 75, 101 

5- nonán 954,80 0,055 54,80 74, 101, 129 

4- nonán 955,74 0,037 55,74 74, 87, 115 

6- nonán 958,68 0,049 58,68 74, 115, 143 

8- nonán 964,60 0,067 64,60 74, 143, 171 

7- nonán 971,34 0,032 71,34 74, 129, 157 

MeC10 2- dekán 1038,41 0,038 38,41 57, 88, 101 

3- dekán 1042,57 0,033 42,57 74, 75, 101 

5- dekán 1052,42 0,050 52,42 74, 101, 129 

6- dekán 1054,55 0,038 54,55 74, 115, 143 

4- dekán 1054,71 0,033 54,71 74, 87, 115 

7- dekán 1060,71 0,068 60,71 74, 129, 157 

9- dekán 1065,28 0,050 65,28 74, 157, 185 

8- dekán 1071,45 0,087 71,45 74, 143, 171 

MeC11 2- undekán 1137,63 0,035 37,63 57, 88, 101 

3- undekán 1141,77 0,035 41,77 74, 75, 101 

5- undekán 1150,06 0,075 50,06 74, 101, 129 

6- undekán 1150,90 0,094 50,90 74, 115, 143 

4- undekán 1153,37 0,094 53,37 74, 87, 115 

7- undekán 1155,30 0,055 55,30 74, 129, 157 

8- undekán 1159,69 0,075 59,69 74, 143, 171 

10- undekán 1165,09 0,043 65,09 74, 171, 199 

9- undekán 1171,70 0,096 71,70 74, 157, 185 

MeC12 2- dodekán 1237,14 0,029 37,14 57, 88, 101 

3- dodekán 1241,01 0,018 41,01 74, 75, 101 

5- dodekán 1248,26 0,047 48,26 74, 101, 129 

6- dodekán 1248,40 0,028 48,40 74, 115, 143 

7- dodekán 1251,47 0,047 51,47 74, 129, 157 

4- dodekán 1252,40 0,028 52,40 74, 87, 115 

8- dodekán 1253,98 0,058 53,98 74, 143, 171 

9- dodekán 1259,65 0,045 59,65 74, 157, 185 

11- dodekán 1264,88 0,038 64,88 74, 185, 213 

10- dodekán 1271,74 0,045 71,74 74, 171, 199 

MeC13 2- tridekán 1336,66 0,055 36,66 57, 88, 101 

3- tridekán 1340,50 0,033 40,50 74, 75, 101 

6- tridekán 1346,56 0,033 46,56 74, 115, 143 

5- tridekán 1346,93 0,033 46,93 74, 101, 129 

7- tridekán 1348,59 0,033 48,59 74, 129, 157 

8- tridekán 1349,84 0,055 49,84 74, 143, 171 

4- tridekán 1351,55 0,076 51,55 74, 87, 115 

9- tridekán 1353,77 0,076 53,77 74, 157, 185 

10- tridekán 1359,32 0,076 59,32 74, 171, 199 

12- tridekán 1364,86 0,033 64,86 74, 199, 227 

11- tridekán 1371,75 0,077 71,75 74, 185, 213 




- 61 - 


11. - 14. 10. 2010


x y 

OV 1 s OV 1 

I P 

H P 

 

MS ióny m/z 

MeC14 2- tetradekán 1436,21 0,033 36,21 57, 88, 101 

3- tetradekán 1440,10 0,032 40,10 74, 75, 101 

6- tetradekán 1445,24 0,052 45,24 74, 115, 143 

5- tetradekán 1445,92 0,031 45,92 74, 101, 129 

7- tetradekán 1446,12 0,031 46,12 74, 129, 157 

8- tetradekán 1446,89 0,053 46,89 74, 143, 171 

9- tetradekán 1449,61 0,030 49,61 74, 157, 185 

4- tetradekán 1451,02 0,052 51,02 74, 87, 115 

10- tetradekán 1453,20 0,020 53,20 74, 171, 199 

11- tetradekán 1459,13 0,053 59,13 74, 185, 213 

13- tetradekán 1464,71 0,028 64,71 74, 213, 241 

12- tetradekán 1471,94 0,043 71,94 74, 199, 227 

MeC15 2- pentadekán 1535,95 0,021 35,95 57, 88, 101 

3- pentadekán 1539,77 0,053 39,77 74, 75, 101 

6- pentadekán 1544,09 0,031 44,09 74, 115, 143 

8- pentadekán 1544,60 0,044 44,60 74, 143, 171 

7- pentadekán 1544,81 0,054 44,81 74, 129, 157 

5- pentadekán 1544,96 0,031 44,96 74, 101, 129 

9- pentadekán 1546,49 0,021 46,49 74, 157, 185 

10- pentadekán 1548,93 0,032 48,93 74, 171, 199 

4- pentadekán 1550,61 0,031 50,61 74, 87, 115 

11- pentadekán 1553,00 0,021 53,00 74, 185, 213 

12- pentadekán 1559,22 0,014 59,22 74, 199, 227 

14- pentadekán 1564,77 0,016 64,77 74, 227, 255 

13- pentadekán 1572,15 0,059 72,15 74, 213, 241 

MeC16 2- hexadekán 1635,61 0,022 35,61 57, 88, 101 

3- hexadekán 1639,50 0,035 39,50 74, 75, 101 

8- hexadekán 1642,96 0,059 42,96 74, 143, 171 

6- hexadekán 1643,18 0,058 43,18 74, 115, 143 

7- hexadekán 1643,60 0,059 43,60 74, 129, 157 

9- hexadekán 1643,98 0,034 43,98 74, 157, 185 

5- hexadekán 1644,35 0,022 44,35 74, 101, 129 

10- hexadekán 1645,42 0,035 45,42 74, 171, 199 

11- hexadekán 1648,45 0,022 48,45 74, 185, 213 

4- hexadekán 1650,27 0,013 50,27 74, 87, 115 

12- hexadekán 1652,83 0,033 52,83 74, 199, 227 

13- hexadekán 1659,06 0,032 59,06 74, 213, 241 

15- hexadekán 1664,71 0,031 64,71 74, 241, 269 

14- hexadekán 1672,39 0,029 72,39 74, 227, 255 

MeC17 2- heptadekán 1735,34 0,032 35,34 57, 88, 101 

3- heptadekán 1739,30 0,058 39,30 74, 75, 101 

8- heptadekán 1741,36 0,048 41,36 74, 143, 171 

9- heptadekán 1741,42 0,023 41,42 74, 157, 185 

7- heptadekán 1742,31 0,059 42,31 74, 129, 157 

6- heptadekán 1742,36 0,033 42,36 74, 115, 143 

10- heptadekán 1742,42 0,023 42,42 74, 171, 199 

5- heptadekán 1743,76 0,048 43,76 74, 101, 129 

11- heptadekán 1744,93 0,033 44,93 74, 185, 213 

12- heptadekán 1748,22 0,060 48,22 74, 199, 227 

4- heptadekán 1750,11 0,035 50,11 74, 87, 115 




- 62 - 


11. - 14. 10. 2010


OV 1 I P 

s OV 1 

H P 

 

MS ióny m/z 

x y 

13- heptadekán 1752,56 0,061 52,56 74, 213, 241 

14- heptadekán 1759,14 0,023 59,14 74, 227, 255 

16- heptadekán 1764,72 0,063 64,72 74, 255, 283 

15- heptadekán 1772,63 0,039 72,63 74, 241, 269 

MeC18 2- oktadekán 1835,10 0,039 35,10 57, 88, 101 

3- oktadekán 1839,17 0,038 39,17 74, 75, 101 

8- oktadekán 1840,34 0,038 40,34 74, 143, 171 

9- oktadekán 1840,40 0,024 40,40 74, 157, 185 

10- oktadekán 1840,57 0,065 40,57 74, 171, 199 

7- oktadekán 1841,33 0,024 41,33 74, 129, 157 

6- oktadekán 1841,68 0,038 41,68 74, 115, 143 

11- oktadekán 1842,37 0,065 42,37 74, 185, 213 

5- oktadekán 1843,54 0,024 43,54 74, 101, 129 

12- oktadekán 1844,64 0,037 44,64 74, 199, 227 

13- oktadekán 1847,90 0,062 47,90 74, 213, 241 

4- oktadekán 1849,88 0,065 49,88 74, 87, 115 

14- oktadekán 1852,62 0,049 52,62 74, 227, 255 

15- oktadekán 1859,25 0,034 59,25 74, 241, 269 

17- oktadekán 1864,67 0,033 64,67 74, 269, 297 

16- oktadekán 1872,88 0,032 72,88 74, 255, 283 

MeC19 2- nonadekán 1934,83 0,041 34,83 57, 88, 101 

3- nonadekán 1939,08 0,028 39,08 74, 75, 101 

8- nonadekán 1939,20 0,035 39,20 74, 143, 171 

9- nonadekán 1939,32 0,059 39,32 74, 157, 185 

11- nonadekán 1939,38 0,037 39,38 74, 185, 213 

10- nonadekán 1940,29 0,030 40,29 74, 171, 199 

7- nonadekán 1940,53 0,029 40,53 74, 129, 157 

6- nonadekán 1941,32 0,036 41,32 74, 115, 143 

12- nonadekán 1941,99 0,030 41,99 74, 199, 227 

5- nonadekán 1943,14 0,031 43,14 74, 101, 129 

13- nonadekán 1944,30 0,059 44,30 74, 213, 241 

14- nonadekán 1947,75 0,034 47,75 74, 227, 255 

4- nonadekán 1949,70 0,037 49,70 74, 87, 115 

15- nonadekán 1952,43 0,060 52,43 74, 241, 269 

16- nonadekán 1959,22 0,042 59,22 74, 255, 283 

18- nonadekán 1964,62 0,046 64,62 74, 283, 311 

17- nonadekán 1973,06 0,051 73,06 74, 269, 297 

MeC20 2- eikozán 2034,62 0,043 34,62 57, 88, 101 

10- eikozán 2037,97 0,042 37,97 74, 171, 199 

8- eikozán 2038,28 0,042 38,28 74, 143, 171 

9- eikozán 2038,47 0,070 38,47 74, 157, 185 

11- eikozán 2038,60 0,041 38,60 74, 185, 213 

3- eikozán 2038,79 0,070 38,79 74, 75, 101 

12- eikozán 2039,86 0,042 39,86 74, 199, 227 

7- eikozán 2039,92 0,070 39,92 74, 129, 157 

6- eikozán 2040,87 0,017 40,87 74, 115, 143 

13- eikozán 2041,38 0,042 41,38 74, 213, 241 

5- eikozán 2042,89 0,041 42,89 74, 101, 129 

14- eikozán 2044,09 0,042 44,09 74, 227, 255 

15- eikozán 2047,57 0,040 47,57 74, 241, 269 

4- eikozán 2049,65 0,039 49,65 74, 87, 115 




- 63 - 


11. - 14. 10. 2010


OV 1 I P 

s OV 1 

H P 

 

MS ióny m/z 

x y 

16- eikozán 2052,43 0,039 52,43 74, 255, 283 

17- eikozán 2059,25 0,066 59,25 74, 269, 297 

19- eikozán 2064,69 0,036 64,69 74, 297, 325 

18- eikozán 2073,28 0,034 73,28 74, 283, 311 

MeC21 2- heneikozán 2134,41 0,037 34,41 57, 88, 101 

10- heneikozán 2137,03 0,038 37,03 74, 171, 199 

9- heneikozán 2137,16 0,057 37,16 74, 157, 185 

11- heneikozán 2137,16 0,039 37,16 74, 185, 213 

8- heneikozán 2137,36 0,039 37,36 74, 143, 171 

12- heneikozán 2137,75 0,038 37,75 74, 199, 227 

3- heneikozán 2138,54 0,057 38,54 74, 75, 101 

13- heneikozán 2139,20 0,057 39,20 74, 213, 241 

7- heneikozán 2139,33 0,027 39,33 74, 129, 157 

6- heneikozán 2140,64 0,038 40,64 74, 115, 143 

14- heneikozán 2141,23 0,039 41,23 74, 227, 255 

5- heneikozán 2142,48 0,038 42,48 74, 101, 129 

15- heneikozán 2143,73 0,027 43,73 74, 241, 269 

16- heneikozán 2147,47 0,040 47,47 74, 255, 283 

4- heneikozán 2149,51 0,041 49,51 74, 87, 115 

17- heneikozán 2152,33 0,041 52,33 74, 269, 297 

18- heneikozán 2159,23 0,043 59,23 74, 283, 311 

20- heneikozán 2164,48 0,055 64,48 74, 311, 339 

19- heneikozán 2173,47 0,047 73,47 74, 297, 325 

MeC22 2- dokozán 2234,13 0,028 34,13 57, 88, 101 

10- dokozán 2235,90 0,045 35,90 74, 171, 199 

11- dokozán 2236,04 0,046 36,04 74, 185, 213 

9- dokozán 2236,31 0,057 36,31 74, 157, 185 

12- dokozán 2236,44 0,057 36,44 74, 199, 227 

8- dokozán 2236,65 0,028 36,65 74, 143, 171 

13- dokozán 2236,99 0,057 36,99 74, 213, 241 

3- dokozán 2238,56 0,028 38,56 74, 75, 101 

14- dokozán 2238,83 0,088 38,83 74, 227, 255 

7- dokozán 2238,90 0,028 38,90 74, 129, 157 

6- dokozán 2240,33 0,057 40,33 74, 115, 143 

15- dokozán 2240,80 0,046 40,80 74, 241, 269 

5- dokozán 2242,37 0,057 42,37 74, 101, 129 

16- dokozán 2242,92 0,018 42,92 74, 255, 283 

17- dokozán 2247,21 0,058 47,21 74, 269, 297 

4- dokozán 2249,18 0,028 49,18 74, 87, 115 

18- dokozán 2252,18 0,058 52,18 74, 283, 311 

19- dokozán 2259,20 0,028 59,20 74, 297, 325 

21- dokozán 2264,31 0,028 64,31 74, 325, 353 

20- dokozán 2273,57 0,060 73,57 74, 311, 339 




- 64 - 


11. - 14. 10. 2010

Fig. 1. Chromatogram GC separácie C6-C23 metylesterov monometylovaných nasýtených mastných kyselín na kolóne so 

stacionárnou fázou OV-1; a – produkt reakcie vsunutia metylénovej skupiny, b – vzorka povlaku z jazyka. 

Napriek použitiu 100 m dlhej kolóny s vysokým rozlíšením s úinnosou 345 000 efektívnych priehradiek pri k = 

9.3, priemernej lineárnej rýchlosti 21 cm s -1 a izotermickej teplote 170 °C pre C17 FAME s lineárnym reazcom, sa nezískala 

plynovo chromatografická separácia niektorých monometyl-rozvetvených FAME. Obtiažnos separácie rástla s posunom 

metylovej skupiny k okoliu stredu uhlíkového reazca molekuly a so zvyšujúcim sa potom atómov uhlíka monometylrozvetvených 

FAME. Najobtiažnejšie separovatené izoméry sú izoméry s metylovou substitúciou v okolí stredu uhlíkového 

reazca molekuly a problémy so separáciou narastali so zvyšujúcim sa potom atómov uhlíka FAME. 

Retenné indexy plynovo chromatograficky neseparovaných izomérov monometyl-rozvetvených FAME sa vypoítali 

pomocou MS fragmentácie. GC-MS fragmentácia sa uskutonila použitím charakteristických fragmentaných iónov 

vytvorených štiepením väzby uhlík-uhlík v susedstve terciárnych atómov uhlíka [6]. Prvý charakteristický hmotnostný ión 

pre väšinu metylesterov je m/z 74 (okrem polohy 2-, 4-), ktorý sa skladá z metoxykarbonylovej skupiny esteru, alšej 

metylénovej skupiny a atómu vodíka, ktorý je naviazaný k tretiemu atómu uhlíka v reazci. Druhý vybraný fragmentaný ión 

charakterizuje as molekuly, ktorá zodpovedá metoxykarbonylovej skupine a asti uhlíkového reazca po terciárny uhlíkový 

atóm. Tretí fragmentaný ión charakterizuje as molekuly, ktorá zodpovedá metoxykarbonylovej skupine a zaha terciárny 

atóm uhlíka. Rozdiel medzi tretím a druhým charakteristickým fragmentaným iónom je 28 amu. Obr. 2 zobrazuje 

hmotnostne spektrometrickú fragmentáciu plynovou chromatografiou neseparovaných izomérov metylesterov 2-, 3-, 5- až 

16- monometyl-rozvetvených FAME C22. Všetky tieto izoméry sa hmotnostne spektrometricky fragmentovali detekciou 

špecifických fragmentaných iónov, o umožnilo vypoíta ich retenné asy a retenné indexy. Pre fragmentovaný pár 

izomérov metylesterov 7- a 14-monometyl C22 FAME je rozdiel v retennom ase len 0,01 min, o zodpovedá rozdielu 

retenných indexov 0,068 i.u. 




- 65 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 2 Hmotnostno spektrometrická fragmentácia GC neseparovaných izomérov metyl-monometyldokozanoátov . 

GC identifikácia reakných produktov monometyl-rozvetvených FAME sa získala z merania teplotne programovaných 

lineárnych retenných indexov pomocou vzahov štruktúra-retencia založených na závislosti homomorfných faktorov HP od 

potu atómov uhlíka pre jednotlivé homologické rady, t.j. pre 2-, 3-, 4-, . . .23- monometyl-rozvetvené FAME. Homomorfný 

faktor H P je definovaný ako rozdiel retenného indexu daného homológu monometyl-rozvetveného FAME a FAME 

s lineárnym reazcom s rovnakým potom atómov uhlíka pri programovanej teplote kolóny. Teda hodnota HP charakterizuje 

príspevok metylovej skupiny k retennému indexu FAME [12-14]. 

Závislosti H P = f(Cn) pre jednotlivé homologické rady monometyl-rozvetvených FAME sú uvedené na Obr. 3. Na 

základe pravidelnosti týchto závislostí pomocou ich extrapolácie sa uskutonila relatívne presná (lepšie než 1 i.u.) predikcia 

retencie vyšších homológov. Pre homológy s novou polohou metylovej skupiny so zaiatkom pri vyššom pote atómov 

uhlíka sa hodnoty H získali extrapoláciou hodnôt H pre prvé homologické leny s novou polohou metylovej skupiny (Obr. 4). 

Podobné zvislosti sa použili na predikciu retencie druhého, tretieho, at. lena homologických radov. Závislosti hodnôt H P 

od polohy metylovej skupiny pre všetky študované monometylované FAME sú uvedené na Obr. 5. Získané pravidelné 

závislosti HP = f(Cn) umožujú presnú predikciu retencie metylesterov nasýtených monometylovaných mastných kyselín 

s potom atómov uhlíka >23. Predbežná identifikácia monometyl-rozvetvených FAME ako modelových analytov získaných 

reakciou vsunutia metylénovej skupiny do FAME s lineárnym reazcom sa potvrdila pomocou GC-MS. Charakterizovalo sa 

všetkých 220 C4-C23 nasýtených monometylovaných FAME pomocou plynovej chromatografie a hmotnostnej 

spektrometrie. 




- 66 - 


11. - 14. 10. 2010

OV 1 

Obr. 3. Závislos homomorfných faktorov H P od potu atómov uhlíka homologických radov metylesterov 

monometylovaných mastných kyselín. 

OV 1 

Obr. 4. Závislos homomorfných faktorov H P od potu atómov uhlíka pre prvé, druhé a tretie leny homologických 

radov metylesterov monometylovaných mastných kyselín. 

Apon and Nicolaides [6] publikovali retenné dáta zodpovedajúce džkam reazca (ECL) monometyl-rozvetvených 

FAME s džkou reazca C11 pre 5 izomérov, C12 6 izomérov, C13 6 izomérov, C14 7 izomérov, C15 7 izomérov, C16 8 

izomérov C17 8 izomérov a pre 16 izomérov C18. Takisto boli ECL dáta publikované [6] pre 63 C12-C19 monometylrozvetvených 

FAME namerané na kapilárnych kolónach s džkou 1000 ft alebo 500 ft a i.d. 0.030 in pripravených 

v laboratóriu so stacionárnou fázou Pentasil a prídavkom Igepal-Co-880 a programovanou teplotou kolóny od 170 °C do 210 

°C pri 0.5 °C/min. ECL dáta pre izomérne C18 monometyl-rozvetvené FAME sa merali na 500 ft kolóne pri 200 °C. 

V úplnej zmesi 16 metyl-monometyloktadekanoátov sa neseparovali izoméry 8-, 9-, 10- a 6-, 11- a 5-, 12- a niektoré iné 




- 67 - 


11. - 14. 10. 2010

izoméry sa separovali len iastone. Tiež sa nerozlíšili niektoré izoméry neúplných radov C11-C17, t.j. pri C17 izomérov 5- a 

10-, pri C14 izomérov 6- a 8-, pri C12 izomérov 4- a 8-. 

OV 1 

Fig. 5. Závislos homomorfných faktorov H P od polohy metylovej skupiny homologických radov metylesterov 

monometylovaných mastných kyselín. 

V štúdii Balu a Czarnowskeho [16] sa zistilo, že povlak na jazyku je jeden zo štyroch špecifických klinických markerov 

pre tyfovú horúku, okrem vysokej teploty, straty pohyblivosti kbov a bradykardie a môže poskytnú dôležitý diagnostický 

prostriedok. GHC-MS chromatogram vzorky z povlaku jazyka je uvedený na Obr. 1b. Identifikovali sa C17 monometylrozvetvené 

FAME v polohách 2-, 4-, 6-, 8-, 10-, 12-, 14- a 15 ako najcharakteristickejšie metylestery metylovaných 

mastných kyselín v povlaku jazyka, teda izoméry s párnou polohou, okrem iso. Z Obr. 6 je zrejmé, že spomedzi izomérov 

17:0 FAME je najviac zastúpený anteiso 17:0 a alší v poradí je iso 17:0. Je potrebné spomenú, že anteiso 17:0 je hlavná 

zložka lipidov mnohých bakteriálnych membrán [4]. 

Obr.. 6. Chromatogramy GC separácie izomérnych monometylovaných metyl-heptadekanoátov; a – produkt reakcie vsunutia 

metylénovej skupiny, b – vzorka povlaku z jazyka; x – etylester 




- 68 - 


11. - 14. 10. 2010

Záver 

Namerali sa teplotne-programované GC lineárne retenné indexy všetkých 220 C4-C23 metylesterov 

monometylovaných nasýtených mastných kyselín na metylsilikónovej stacionárnej fáze OV-1 a ich hmotnostné spektrá. GC 

identifikácia syntetických zmesí metylesterov monometylovaných nasýtených mastných kyselín sa uskutonila na základe 

pravidelnosti závislostí homomorfných faktorov od potu atómov uhlíka v hlavnom reazci pre jednotlivé homologické rady, 

ako aj pomocou ich závislostí pre prvé, druhé, tretie a alšie leny homologických radov s novou polohou metylovej skupiny 

pri vyššom pote atómov uhlíka vo FAME. GC identifikácia sa potvrdila GC-MS meraniami. Plynovou chromatografiou 

neseparované izoméry sa rozlíšili pomocou hmotnostne spektrometrickej fragmentácie na základe selektívnych 

hmotnostných iónov polohových izomérov použitím MS-SIM módu. Vo vzorke povlaku jazyka sa zistili ako 

najcharakteristickejšie polohové metylované izoméry metyl-heptadekanoátov s najzastúpenejším anteiso izomérom a alšie 

izoméry s párnou polohou metylovej skupiny. 



Lieteratúra 

[1] B. Vlaeminck, V. Fievez, A.R.J. Cabrita, A.J.M Fonseca, R.J. Dewhurst, Anim. Feed Sci. Technol. 131 (2006) 389. 

[2] M. Kniazeva, Q.T. Crawford, M. Seiber, C-Y. Wang, M. Han, PLoS Biol. 2 (2004) 257. 

[3] A.L. Lock, D.E. Bauman, Lipids 39 (2004) 1197. 

[4] T. Kaneda, Microbiol. Rev. 55 (1991) 288. 

[5] M. Philips, K. Gleeson, J.M. Hughes, J. Greenberg, R.N. Cataneo, L. Baker, W.P. McVay, Lancet 353 (1999) 1930. 

[6] J.M.B. Apon, N. Nicolaides, J. Chromatogr. Sci. 13 (1975) 467. 

[7] N. Nicolaides, Lipids 6 (1971) 901. 

[8] E. Simon, W. Kern, G. Spiteller, Biomed. Env. Mass Spectrom. 19 (1990) 129. 

[9] G.J. Blomquist, L. Guo, P. Gu, C. Blomquist, R.C. Reitz, J.R. Reed, Insect Biochem. Mol. Biol. 24 (1994) 803. 

[10] Q.T. Yu, B.N. Liu, J.Y. Zhang, Z.H. Huang, Lipids 23 (1988) 804. 

[11] M.C. Simmons, D.B. Richardson, I. Dvoretsky, in: R.P.W. Scott (Ed.), Gas Chromatography, Butterworths, London, 

1960, p. 211. 

[12] L. Soják, J. Hrivák, P. Majer, J. Janák, Anal. Chem. 45 (1973) 293. 

[13] L. Soják, R. Kubinec, H. Jurdáková, E. Hájeková, M. Bajus, J. Anal. Appl. Pyrol. 78 (2007) 387. 

[14] Ž. Krkošová, R. Kubinec, L. Soják, A. Amann, J. Chromatogr. A 1179 (2008) 59. 

[15] J. Glastrup, J. Chromatogr. A 827 (1988) 133. 

[16] S.K. Bal, Ch. Czarnowski, CMAJ. JAMC 170 (2004) 1095. 




- 69 - 


11. - 14. 10. 2010

UTILIZATION OF La(NO3)3 TO MINIMIZE THE PHOSPHATE INTERFERENCES BY Pb 

DETERMINATION IN FOOD-STUFFS AT 217.0 NANOMETERS USING SOLID SAMPLING-ETAAS 

PÉTER TÖRÖK* and MÁRIA ŽEMBERYOVÁ 

Comenius University in Bratislava, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Natural 

Sciences, 842 15 Bratislava, Slovak Republic 

e-mail: torok@fns.uniba.sk 


Lead and its compounds even at low concentration levels have serious impact and the high risk to human health. 

Therefore, the determination of lead in all parts of environment at trace, even at ultra-trace levels especially in foods, 

confectionery, drinks, etc. is important and of considerable analytical interest [1,2]. Conventionally, trace metal contents of 

mentioned samples can be easily determined after digesting of the samples with acids and subsequent measurements of 

elements of interest by different instrumental methods [3]. The ultra trace levels of Pb concentration, usually present in food 

samples make it necessary to use preconcentration procedures, to improve the sensitivity of determination. However, 

laborious preconcentration procedures have some disadvantages [4,5]. 

Up to date great number of papers confirmed the applicability of direct analysis of solid samples by methods of atomic 

spectrometry without prior digestion for mentioned samples [6,7]. The solid sampling ETAAS (SS-ETAAS) is in many cases 

more efficient and reliable, faster, easier, more cost-effective and less time-consuming than other methods that require 

sample dissolution. Therefore, SS-ETAAS is a very promising trace analysis strategy, also for food control purposes. 

Although this method is a powerful technique for determination of metals at trace or ultratrace levels, it is rather limited by 

matrix effect of analyzed samples. 

The aim of this work was to develop a rapid procedure for direct solid sampling of lead in phosphorus rich certified 

reference materials of food-stuffs, which contains lead at trace or ultra-trace levels. Several papers dedicated to SS-ETAAS 

determination of Pb in foods reported, that using a mainly recommended line at 283.3 nm can give interference free 

determination with acceptable sensitivity [8-13]. However in the analytical practice, samples which contain lead at ultratrace 

concentration levels must be often analyze and for this case the utilization of main analytical line (217.0 nm) is necessary 

[14,15]. Phosphorus is a well known interfering element on the most sensitive resonance line of lead by generating structured 

background which could be fully eliminated using high resolution continuum source AAS [16], but cannot be corrected at all 

by deuterium arc or Zeeman effect background correction system [14]. It seems that this interference can be overcome by 

chemical modification. Lanthanum chloride as a part of Schinkel’s solution is widely used in flame AAS for eliminating 

phosphate interferences. The mechanism of effect is related to bonding of phosphate to thermally stable lanthanum 

phosphate. That is the reason why we tested a lanthanum salt to eliminate phosphorus interference in SS-ETAAS. 


2.1. Instrumentation 

The solid sampling analysis were carried out using an AAS 5EA atomic absorption spectrometer (Analytik Jena AG, 

Jena, Germany) equipped with a deuterium arc background correction and transversely heated graphite tube atomizer 

(THGA). A laboratory made device was used for direct sample introduction. Super lamp equipped with power supply (both 

from Photron Pty. Ltd., Australia) was the line source (wavelength 217.0 nm, spectral slit 0.2 nm, lamp current 5 mA, boost 

current 6 mA) during Pb determination. Pyrolytically coated graphite tubes without dosing hole and pyrolytically coated 

graphite platforms (both from Analytik Jena AG, Jena, Germany) designed for solid sampling, were used for all experiments. 

An M500P ultra-micro balance (Sartorius, Goettingen, Germany) was used for weighing the samples directly into the solid 

sampling platforms. High purity argon (99,999%) was used as the furnace protective gas with maximum flow rate of 1.2 

L.min -1 during all stages, except auto zero and atomization, when gas flow was reduced to 0.1 L.min -1 . A mini flow 

conditions during atomization slightly reduced the sensitivity but on the other hand helps to decrease the significant 

nonspecific absorption generated by sample matrix. 

2.2. Reagents 

All solutions used in this study were made with deionized water from Water PRO-PS system (Labconco, Kansas City, 

USA). Concentrated nitric acid was purchased from Merck (Darmstadt, Germany) and used without further purification. All 

glassware were soaked in 1.4 mol.L -1 nitric acid for at least 24h and rinsed with deionized water before used. Calibration 

standards were prepared by appropriate dilution from stock solution containing 1.000 g.L -1 of Pb by 0.14 mol.L -1 nitric acid. 

Palladium (10.000 g.L -1 ) modifier solution was from Merck. Analytical grade ammonium nitrate and lanthanum nitrate, 

nonahydrate, was purchased from Lachema (Brno, Czech Republic). Crystalline magnesium nitrate, hexahydrate and sodiumammonium 

hydrogenphosphate was “suprapur” (Merck) quality and used for preparation of some mixed modifier solutions 

or model solutions. Scintillation grade Triton X-100 (Fluka, Buchs, Switzerland) nonionic surfactant was added to all 




- 70 - 


11. - 14. 10. 2010

modifier solutions for ensure homogenous contact between modifier and solid sample. Final concentration of Triton X-100 in 

all modifier solutions was 0.1% (m/v). 

2.3. Samples 

The different types of food stuff reference materials with certified total values of lead, kale (BOWEN, Berks, U.K.), 

cabbage No. GBW 08504, tea No. GBW 07605 (National Research Centre for Certified Reference Materials, NRCRM, 

China), wholemeal flour No. 189 and milk powders No. 150 (BCR, Brussels, Belgium) and A-11 (International Atomic 

Energy Agency, Vienna, Austria) were used for this study. Phosphorus contents of analyzed samples varied between 0.1 to 

0.5 % (m/m). 

2.4. Procedure 

Prior to the analysis, approximately 10 g was taken from the reference materials and dried to the constant weight at 

105°C. After cooling down to the ambient temperature the samples were placed in borosilicate glass flasks. For solid 

sampling, a part of powdered sample was directly put on the platform. It was weighed and introduced in to the furnace by 

means of manual solid sampling accessory. Each sample was weighed and analyzed at least 15 times. The sample weight was 

automatically transmitted to the instrument computer to calculate the normalized integrated absorbance (integrated 

absorbance per mg of sample). The normalized integrated absorbance is commonly used in SS-ETAAS to compare the 

signals, as it is impossible to introduce exactly the same sample mass in a series of sample analysis. Quantification of lead in 

analyzed CRM’s of food stuffs is performed by calibration against aqueous standards and by generalized standard addition 

procedure. It can be stated, that the used spectrometer is well suited to solid sampling. Due to fast modulation frequency (200 

Hz) this spectrometer enables accurate readings of rapidly developing background peaks, which are common in SS-ETAAS 

because large amounts of matrix are introduced into the furnace. Three aqueous standards (10 L injected) in the range of 10 

- 50 g.L 1 of Pb and two standard additions within the concentration range of these standards were throughout employed. 

Calibration curve was linear in the concentration range of these introduced standards. The temperature program used in this 

work is presented in Table 1. 


Table 1. Temperature program for determination of lead in food-stuffs by SS-ETAAS 

Step 

Temperature 

(°C) 

Ramp 

(°C.s -1 ) 

Hold 

(s) 

Drying 1 110 40 30 

Drying 2 200 40 30 

Pryrolysis 1 500 100 10 

Pryrolysis 2 900 200 20 

Cool down 200 200 10 

Auto zero 200 0 10 

Atomization 2000 >2500 5 (3s integration) 

Cleanout 2050 1000 5 

3.1. Possibilities for removal of spectral interferences of phosphate by determination of Pb 

The spectral interferences are caused very frequently in furnaces by the structured absorption of diatomic molecules 

such as CaO, AlO, FeO, NO, PO, SO, and SiO, which were originated by the pyrolysis products of Ca 2+ , Al 3+ , Fe 3+ , NO3 - , 

PO4 3- , SO 4 2- and SiO3 2- ions. Some of these compounds can arise during the pyrolysis, however majority of them are not 

volatilized at this step and remains in the furnace causing serious interferences during atomization. Using 217.0 nm line for 

determination of Pb the fine structured molecular absorption from PO species are the most probably responsible which 

cannot be corrected accurately with deuterium arc or Zeeman effect background correction systems. The effect of different 

chemical modifiers on removal of phosphorus interference was therefore initially investigated with the CRM’s of the tea and 

wholemeal flour samples. Using D 2-background correction either negative errors (for atomization temperatures higher than 

1900 °C) or positive errors (using the lowest atomization temperatures from the plateau atomization range) in the 

measurement of the analyte concentration will occur. The use of different chemical modiers, previously recommended for 

Pb determination, including the use of Pd+Mg(NO3)3 or Pd+NH4NO3 modier mixture allowing pyrolysis temperatures 

within the range of 800–1000 °C cannot overcome the above mentioned problems, since refractory phosphorus species 

cannot be withdrawn from the graphite furnace at all. These interferences can be eliminated by applying a suitable chemical 

compound, which could shift the vaporization of the phosphorus matrix to the higher temperatures. Lanthanum nitrate 




- 71 - 


11. - 14. 10. 2010

appears to be suitable for this purpose, due to its affinity to phosphates, however it was used only in conventional (liquid 

sampling) ETAAS [17]. 

To verify this assumption, molecular absorption at 217.0 nm and atomic absorption at 213.6 nm lines, by which 

presence of PO molecule and phosphorus atoms, respectively were indicated, was measured during atomization (using fixed 

atomization temperature 2000°C) of 0.25 ng Pb in presence of 5 g P (both in solution) without and with the addition of 10 

g La as La(NO3)3 at various pyrolysis temperatures. This temperature was selected to achieve the best separation of the Pb 

atomic absorption from the background signal and was used for all investigations. From Fig. 1 it can be seen, that in the 

absence of La(NO 3) 3 the formation of PO have been observed for whole investigated temperature range (400-1200 °C) and 

only a small amount of phosphorus was left in the graphite furnace. From the figure also follows, that in the presence of 

La(NO 3) 3 the formation of PO have been observed already at the lowest investigated temperature (400 °C). Unfortunately, at 

the temperature over 600 °C an increase of absorbance at the 213.6 nm line was observed indicating the increasing amounts 

of atomic phosphorus. Over 1000 °C this effect is, however, less pronounced. 

Fig. 1a.: Effect of pyrolysis temperature on Pb and P 

vaporization in absence of modifier (atomization 

temperature 2000°C) 

Fig. 1c.: Effect of pyrolysis temperature on Pb and P 

vaporization in presence of 10g Pd + 10 g La 

(atomization temperature 2000°C) 

Fig. 1b.: Effect of pyrolysis temperature on Pb and P 

vaporization in presence of 10 g La (atomization 

temperature 2000°C) 

Lanthanum nitrate has only minor effect on thermal stabilization of Pb, hence the using of another modifier with 

analyte stabilization effect is necessary. If La(NO3)3 is used together with Pd, pyrolysis temperature up to 900°C can be 




- 72 - 


11. - 14. 10. 2010

applied to attain a stabilization of the most phosphorus matrix without any loss of the analyte. In the presence of 10 g of Pd 

plus 10 g of La up to 25g of phosphorus (in the form of NaNH4HPO 4) can be tolerated without changes of sensitivity. It 

can be seen from Fig. 3, that using Pd + La(NO 3) 3 modifier, an increase of absorbance at the 213.6 nm line (phosphorus 

atomic absorption) for temperatures above 600 °C is less pronounced, in comparison with conditions when only La(NO 3)3 

was used as a modifier. 

The optimal amounts of analyte and matrix modifiers were determined by interpretation of dependency of normalized 

integrated absorbance of analyte versus modifier weight. Peak shapes were also taken into consideration for optimization of 

the modifier mass. From figures it is evident, that lanthanum effectively stabilizes phosphorus species in solid samples from 

10 g amount and palladium stabilizes Pb completely fom 10 g per atomization. 

For practical purposes the addition of ammonium nitrate (200 g per atomization) to mixed modifier increased the 

robustness against possible chloride interference and also improves the mineralization of the solid matrix during pyrolysis 

stage. The amount of additional matrix modifier, ammonium nitrate, was not optimized. It can be noticed that the palladiumammonium 

nitrate-lanthanum mixed modifier provided about 5% higher sensitivity compared with palladium-lanthanum 

modifier. 

Fig. 2a.: Optimization of the amount of matrix modifier 

(constant amount 10 g of palladium modifier and 200 

g of NH4NO3 were added, temperature program 

according to Table 1, each point of the graph represents 

the median of 3 independent measurements) 

3.2. Analytical results of the method developed 

Fig. 2b.: Optimization of the amount of analyte modifier 

(Pd) (constant amount 10 g of La and 200 g of 

NH 4NO3 were added, temperature program according to 

Table 1, each point of the graph represents the median of 

3 independent measurements) 

Although calibration in SS-ETAAS has been considered a problematic part, several studies have shown that 

calibrations with aqueous standards were satisfactory. Despite the fact, that application of the standard addition technique in 

SS-ETAAS is more time-consuming than by the conventional ETAAS, it was applied in this study in order to compare the 

results obtained with this technique and the technique of external calibration, using aqueous calibration solutions. To 

investigate the feasibility of aqueous calibration curves for quantification, the atomization profiles of solid samples were 

compared with the peak profiles of the aqueous standards. As it can be seen in Fig. 3a in the presence of food matrix (BCR 

189 wholemeal flour), for both, Pd+ NH 4NO3 and Pd+ NH4NO3+La addition, Pb atomic absorption signal appears before, 

i.e. at the lower temperature when compared with matrix-free conditions. This fact can be attributed to the less efficient 

analyte stabilization due to the presence of high amount of the interfering matrix. By using Pd+ NH4NO3+La ternary modifier 

this effect is more pronounced. Also from Fig. 3a is evident, that some overcorrection is appeared in Pb atomic signal after 

half-time of atomization. This side effect is related to incomplete phosphorus bonding due to lower efficiency of the 

La(NO 3) 3 modifier in solid samples, compared to aqueous solutions. To avoid erratic result caused by mentioned 

phenomenon the integration time was reduced to 3s if solid samples were atomized. On the Fig. 3b it is clearly showed, that 

described mixed modifier has serious limitation, when extremely high amounts (10 mg or more) of solid samples were 

analyzed. 

The detection limit was calculated following the IUPAC recommendations as the concentration of lead which 

corresponds to 3 times the standard deviation of blank. The detection limit obtained was 0.15 pg of Pb using described 




- 73 - 


11. - 14. 10. 2010

modifier mixture. With a maximum sample intake of 1.56 mg the limit of detection in studied food matrices was 0.024 g 

.g 1 . The quantification limit, calculated as the concentration corresponding to 10 times the standard deviation of the blank, 

was 0.51 pg of Pb, considering the maximum applicable sample mass the limit of quantification was 0.079 g.g 1 . The 

characteristic mass was varied around 10.3±0.9 pg, which is approximately a factor of two times higher than the value 

reported for Pb using HRCS-ETAAS at the line at 217.000 nm [15]. 

The analytical results obtained for six food reference materials employing aqueous calibration curve quantification and 

standard addition method are summarized in Table 2. The results are presented as average ± standard deviation. Results 

obtained by calibration curve and results obtained by standard addition technique are compared with certified values, and for 

five food reference materials do not show statistical difference (t-test). 

Fig. 3a.: Dependence of absorbance of lead in aqueous 

standard and solid sample (1-0.5ng Pb in aqueous standard 

+ Pd/NH 4NO 3/La, 2-1mg BCR No. 189 + Pd/NH 4NO 3/La, 

3-1mg BCR No. 189 + Pd/NH4NO 3) on the atomization 

time 

4. Conclusions 

Sample 

Fig. 3b.: Dependence of absorbance of lead in aqueous 

standard and solid sample (1-0.5ng Pb in aqueous 

standard+Pd/NH 4NO 3/La, 2-10mg A-11+ 

Pd/NH4NO 3/La, 3-10mg A-11 + Pd/NH 4NO 3) on the 

atomization time 

Table 2. Temperature program for determination of lead in food-stuffs by SS-ETAAS 

Certified 

content (g.g -1 ) 

Aqueous calibration 

curve (g.g -1 ) 

Standard addition 

technique (g.g -1 ) 

BOWEN’s kale 2.49±0.55 2.62±0.49 2.55±0.37 

GBW 08504 0.28±0.09 0.30±0.02 0.31±0.05 

GBW 07605 4.4 a 4.29±0.21 4.31±0.28 

BCR No.189 0.379±0.003 0.384±0.026 0.380±0.043 

BCR No.150 1.00±0.09 1.04±0.15 1.03±0.18 

A-11 0.054±0.025 0.022±0,010 b n.d. 

a b 

indicative value; result is lower than certified value due to pronounced interference; 

n.d. not determined 

In present work our intention was to test the potential feasibility of lanthanum nitrate as matrix modifier to eliminate 

phosphorus interferences on the determination of Pb at primary analytical line. It has been demonstrated that the 

determination of lead in a phosphorus rich matrix can be carried out using direct solid sampling ETAAS and calibration 




- 74 - 


11. - 14. 10. 2010

against aqueous standards with a proper modifier. Careful optimization of the procedure leads to interference-free conditions, 

making possible calibration against aqueous standard solutions, proving that the calibration problem in direct solid sampling 

analysis is not as severe as is frequently mentioned. However described procedure is not completely free from drawbacks. 

When the matrix content in the furnace is relatively low (in case of sample masses ranged from 1 to 5 mg), lanthanum can 

decreases the phosphorus interference to a acceptable level. On the other hand, in case of extremely high (above 10mg) 

sample masses delivered into furnace any mass of lanthanum added to solid sample cannot suppress the interference, which 

causes erratic results in case of milk powder A-11. From this study it follows, that further research for optimization or 

looking for more effective matrix modifiers is needed. Similarly, the using of La(NO 3)3 as the solely modifier, further 

investigations are needed to obtain a definite explanation regarding the actual mechanism of reactions taking place in a 

graphite furnace. 

Financial support from the Scientific Grant Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic VEGA/1/0430/08 and 

Centre of Excelence AP VVCE-0070-07 is highly acknowledged. 

We would like to express our gratitude to Prof. Ing. Viliam Krivá,PhD. for the generous loan of the instrument for the Solid 

Sampling-ETAAS and so we had the possibility to develop this technique at the Department of Analytical Chemistry, Faculty 

of Natural Sciences Comenius University in Bratislava.. 

REFERENCES 

[1] L.B. Allen, P.H. Sitonen, H.C. Thompson Jr., JAOAC Int. 75 (1998) 477. 

[2] L. Jorhem, C. Astrand, B. Sundström, M. Baxter, P. Stokes, J. Lewis, K.P. Grawe, Food Addit. Contam. 25 (2008) 284. 

[3] J. Sardan, F. Montes , J. Peñuelas, Spectrochim. Acta, Part B 65 (2010) 97. 

[4] J. L. Manzoori, M. Amjadi, J. Abulhassani Anal. Chim. Acta 644 (2009) 48. 

[5] J. Abulhassani, J. L. Manzoori, M. Amjadi, J. Hazard. Materials, 176 (1-3), p.481-486, Apr 2010 

[6] M.G.R. Vale, N. Oleszczuk, W.N.L. dos Santos, Appl. Spectrosc. Rev. 41 (2006) 377. 

[7] B. Velz, M.G.R. Vale, Anal. Bioanal. Chem. 389 (2007) 2085. 

[8] A. Baysal, S. Akman Spectrochim. Acta Part B 65 (2010) 340. 

[9] A. Baysal, N. Ozbek, S. Akman, Food Chem. 123 (2010) 901. 

[10] A. Detcheva, K.-H. Grobecker, Spectrochim. Acta, Part B 61 (2006) 454. 

[11] A. Detcheva, K.-H. Grobecker, Env. Chem. Lett. 6 (2008) 183. 

[12] J. Štupar, F. Dolinšek, Spectrochim. Acta, Part B 51 (1996) 665. 

[13] J. Štupar, F. Dolinšek, Acta Chim. Slov. 51 (2004) 641. 

[14] I.C.F. Damin, M.M. da Silva , M.G.R. Vale, B. Welz, Spectrochim. Acta, Part B 62 (2007) 1037. 

[15] C.S. Nomura, P.V. Oliviera, Quim. Nova 29, 234 (2006). 

[16] L.D. Gallindo Borges, A.F. da Silva, A.J. Curtius, B. Welz1, U. Heitmann, Microchim. Acta 154 (2006) 101. 

[17] P.J. Parsons, W. Slavin, Spectrochim. Acta, Part B 54 (1999) 853. 




- 75 - 


11. - 14. 10. 2010

GC-MS ANALÝZA ZLOŽENIA MASTNÝCH KYSELÍN LETNÉHO A ZIMNÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA 

A OBSAH CLA VO VYROBENOM 

JAROSLAV BLAŠKO* a , IVAN OSTROVSKÝ a , RENÁTA GÓROVÁ a , JANKA KUBINCOVÁ a , JOZEF 

VIŠOVSKÝ a , IGOR FÁBRY b , LADISLAV SOJÁK a 

aChemický 

ústav, Prírodovedecká fakulta UK, Mlynská dolina, Bratislava 842 15 

b 

ORAVA - MILK, združenie, Leštiny 126, Dolný Kubín 027 01 

e-mail blasko@fns.uniba.sk 

Úvod 

Funkné potraviny obsahujú zložky potravy, ktoré majú popri ich tradinej nutrinej hodnote priaznivé úinky na 

zdravie. Pojem mlienych výrobkov ako funkných potravín získal vekú pozornos predovšetkým kvôli zdravotným 

výhodám spojenými s obsahom izomérov konjugovanej kyseliny linolovej (CLA), najmä izoméru CLA cis-9,trans-11 tiež 

nazývaný ako bachorová kyselina (z angl. rumenic acid - RA). RA je najobsažnejší (pripadá 75-90% celkového obsahu CLA 

v mlienom tuku) a najviac biologicky aktívny prírodný izomér CLA v mlienych výrobkoch. Štúdie vykonané na 

bunkových kultúrach, zvieracích modelov a niektoré udské štúdie zistili, že RA je silným antikarcinogénom, rovnako má aj 

antiaterogenné, imuno-modulané, antidiabetické a cholesterol-znižujúce vlastnosti ako aj alšie zdravotné prínosy [1]. 

Mlieny tuk je tiež jedným z mála potravinových zdrojov kyseliny maslovej, úinného inhibítora proliferácie nádorových 

buniek, ktorý podporuje diferenciáciu a apoptózu nádorových buniek [2,3]. 

Mlieko a mliene výrobky sú najbohatším zdrojom CLA, ktoré sú súasne prístupné a prijatené pre väšinu 

spotrebiteov. Priemerný obsah CLA v komerných mliekach v USA sa pohybuje medzi 0,3 g - 0.6 g.100 g -1 z celkového 

obsahu mastných kyselín (FA) [4]. Denný príjem CLA, ktorý by poskytoval ochranu pred rakovinou 3,5 g CLA / de [5], je o 

75% vyšší ako obsah CLA v súasnosti prijímaný v udskej potrave [6]. Ak chceme zvýši príjem CLA, musíme bu 

spotrebováva viac potravín s obsahom CLA, alebo zvýši obsah CLA vo výrobkoch, ktoré konzumujeme. Druhý prístup je 

praktickejší, pretože ho možno dosiahnu, najmä modifikáciou krmiva i selekciou zvierat, zatia o laktácia, parita a 

plemeno zvierat má na obsah CLA v mlienom tuku malý vplyv. Priemerný obsah RA v mlieku pasúcich sa kráv je až 3-krát 

vyšší ako od kráv chovaných v maštali. Obsah CLA v mlienom tuku kráv chovaných na horských pasienkoch je až 2,2 

g.100 g -1 celkového množstva tuku [7]. 

Významný vplyv krmiva na profil FA mlieneho tuku uviedol v štúdii Lynch a kol. [8], kde uviedol, že krmivo 

zodpovedá za 95% zmeny v mlienom tuku. U prežúvavcov, CLA je produkovaná prirodzene z kys. linolovej (LA), linolénovej 

(ALA) a kys. olejovej (OA) (vznik izoméru trans-7,cis-9) v krmive zvierat. K syntéze CLA dochádza v bachore 

pri bachorovej biohydrogenácii krmovinových FA alebo v tkanivách aktivitou enzýmu -9 desaturázy. CLA je syntetizovaná 

v bachore pri biohydrogenácii z LA, zatia o kys. trans vakcénová (TVA) je syntetizovaná poas biohydrogenácie LA, ALA 

a izomerizáciou OA. TVA predstavuje substrát pre endogénnu syntézu CLA prostredníctvom innosti enzýmu -9 

desaturázy, najmä v mlienej žaze a alších telových tkanivách [9]. Zvýšením príjmu týchto FA je možné zvýši produkciu 

CLA u prežúvavcov a príjem CLA u udí možno zvýši bez nutnosti konzumova viac alebo väšie porcie mlienych 

výrobkov. 

Pastva je pravdepodobne najlepší prirodzený prístup k zvýšeniu obsahu CLA v mlieku prežúvavcov. V krmivách 

prevládajú nenasýtené FA, ALA a LA, obsah ALA je 50-75% celkovej lipidovej asti a závisí na fáze vývoja pasienkových 

rastlín [10]. Variabilita v zložení FA pastvy poas celej pastevnej sezóny sa môže minimalizova udržiavaním rastlín vo 

vegetatívnom stave, kedy je obsah ALA najvyšší [10]. Lock a Garnsworthy [11] poukázali na sezónne zmeny v obsahu CLA 

mlieneho tuku, s najvyšším obsahom 1,7 g.100 g -1 u pasúcich sa kráv a najnižší obsah 0,6 g.100 g -1 v zimnom mlieku. 

Elgersma a kol. [12] uviedol sezónne zmeny v obsahu CLA v kravskom mlieku medzi zimným a letným období od 0,3 do 0,7 

g.100 g -1 FA. Autori zistili 300% zníženie obsahu CLA (z 1,5% na 0,5% z celkového obsahu tukov) v posledných štyroch 

desaroiach kvôli zmenám v kmení a chove zvierat, predovšetkým vyšší podiel jadrového krmiva a siláže a nižší podiel 

pasenia. Potenciál chovu na paši a jeho manažment za úelom zvýšenia obsahu ALA v pasienkových trávach a atelinových 

druhoch preskúmal Dewhurst a kol. [13]. 

Ledoux a kol. [14] analyzoval 54 francúzskych masiel od miestnych výrobcov v rôznych roných obdobiach. 

Priemerný obsah CLA v masle bol 0,45 g.100 g -1 FA v zime a 0,80 g.100 g -1 FA v lete. Autori zaznamenali regionálne 

rozdiely v obsahu CLA, maslá z horských oblastí vykazovali najvyššie priemerné roné obsahy CLA a najväší rozdiel medzi 

zimným a letným maslom. Podobné rozdiely boli nájdené aj pre TVA. 

Táto práca bola zameraná na analýzu obsahu jednotlivých FA v rastlinách paše, v letnom a zimnom kravskom mlieku a 

rovnako aj v letnom a zimnom masle vyrobeného na Orave tradiným spôsobom. Cieom bolo porovna letné a zimné maslo 

na obsah zdravie ovplyvujú FA a diskutova o možnostiach výroby masla s vyšším obsahom CLA a iných zdravotných 

ovplyvujúcich FA ako najbežnejšie konzumovaného živoíšneho tuku. 

Materiál a metódy 

Pri štúdiu profilu mastných kyselín letného a zimného kravského mlieka a z nich vyrobeného masla sa vzorky získali z 

fariem v obciach regiónu Orava, Jasenová (1), Žaškov (2), Oravská Poruba (3), Bziny (4), Veliná (5) a regiónu Liptova, 




- 76 - 


11. - 14. 10. 2010

Ludrová (6). Maslo sa vyrobilo zmiešaním bazénových mliek od dodávateov mlieka v mliekarni ORAVA MILK - záujmové 

združenie, Leštiny. Farmári chovajú predovšetkým kravy plemena Holstein v priemere po 200 kusov dojníc, s 

rôznym potom laktácií a rozdielnou dojivosou. Zimné a letné kravské mlieko zo šiestich fariem sa odoberalo 3-krát poas 

rokov 2008-2009. Zimné maslá sa odobrali 5-krát a letné 7-krát v priebehu obdobia 2008-2009. Vzorky rastlín z pasienkov 6 

fariem sa odobrali raz, v júli 2009. Poas zimného obdobia sa kravy kmili zmesnou kmnou dávkou (TMR), ktorej zloženie 

a hmotnos (od 31 do 51 kg/de a kravu) sa líšili v závislosti od dojivosti (6 - 38 l/de a kravu). V lete by kravám s vyššou 

dojivosou energia výlune z pasenia nepostaovala [15], preto boli kravy poda dojivosti prikrmované TMR s rozdielnym 

zložením. 

Lipidy zo vzoriek mlieka, masla a rastlín sa extrahovali zmesou chloroform a metanol (2:1) [16]. Na prípravu 

metylesterov mastných kyselín sa použila bázická transesterifikácia 0,5 M metoxidom sodným v metanole [17]. GC-MS 

analýzy metylesterov mastných kyselín C4-C24 pripravených z mlienych lipidov sa uskutonili na plynovom chromatografe 

Agilent Technologies 6890N s FID a MSD 5973 Network detektorom. Pripravené metylestery sa separovali na kolóne DB- 

23 (60 m x 0,25 mm x 0,25 μm) pri programovanej teplote od 70 °C do 240 °C. Chromatogramy sa kvantitatívne vyhodnotili 

využitím publikovaných odozvových faktorov pre FID detektor na methylestery FA [18]. Na rozlíšenie trans izomérov 18:1 

a izomérov CLA sa použila kolóna CP-Sil 88 (100 m x 0,25 mm x 0,2 μm), separovali sa pri izotermickej teplote 160 °C. 

Neseparovatené izoméry CLA sa rozlíšili využitím chemometrickej dekonvolúcie v programe PFM [19]. 

Štatistická analýza obsahu mastných kyselín v rastlinách paše, mlienych a maslových vzorkách sa vykonala na 

základe troch paralelných meraní. Vzah jednotlivých fariem, obsah FA v rastlinách paše a v letnom a zimnom mlieku sa 

vyhodnotil použitím štatistickej metódy analýzy rozptylu (ANOVA). Významnos rozdielov medzi priemernými letnými a 

zimnými mliekami a zodpovedajúcimi letnými a zimnými maslami sa zhodnotilo T-testom. Za významné rozdiely sa 

považovali rozdiely na hladine významnosti P < 0,05. 


Zloženie mastných kyselín v rastlinách pastvy 

Zloženie FA v mlieku je primárne urované zložením krmiva zvierat a kmnou stratégiou. Obsah nenasýtených 

mastných kyselín (UFA), najmä CLA v mlienom tuku závisí na obsahu polynenasýtených FA (PUFA), hlavne ALA a LA 

v rastlinách paše. Avšak krmivo bohaté na ALA alebo LA môže zvýši obsah CLA v mlieku, len ak sú krmovinové FA 

prístupné bachorovým mikroorganizmom na biohydrogenáciu [4]. 

Zloženie FA pasienkových rastlín zo šiestich mlienych fariem je uvedené v tabuke 10; jednotlivé farmy sú zoradené 

v poradí so stúpajúcim obsahom ALA v pastve. Všetky vzorky obsahovali štyri hlavné FA: ALA, LA, kys. palmitovú (PA) a 

OA s priemerným sumárnym obsahom 90% z celkového obsahu FA. Obsah týchto FA v pasienkových rastlinách 

6 mlienych fariem bol odlišný. ALA bola najzastúpenejšou FA s obsahom od 37,9 g.100 g -1 (farma 1) do 49,6 g.100 g -1 

(farma 6) (P

Jasenova 

1 

Žaškov 

2 

Or. Poruba 

3 

Bziny 

4 

Veliná 

5 

Ludrová 

6 

SEM S 

14:1 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,001 NS 

15:0 

a 

0,35 0,48 

a 

0,34 

a 

0,37 

a 

0,32 

a 

0,27 0,014 * 

16:0 iso 

a 

0,08 0,14 

a 

0,06 

a 

0,05 

a 

0,05 

a 

0,04 0,01 * 

16.0 18,31 19,29 18,19 17,01 17,82 17,86 0,126 NS 

16:1 1,66 2,09 1,50 1,68 1,64 1,94 0,045 NS 

17.0 0,50 0,69 0,61 0,48 0,58 0,42 0,019 NS 

18:0 3,05 2,99 2,71 2,02 2,42 2,09 0,09 NS 

18:1 trans 

ab 

0,67 

a 

0,15 

a 

0,19 1,88 

a 

0,41 

b 

1,38 0,161 *** 

9c-18:1 6,53 

a 

3,69 

a 

2,69 

a 

3,50 

a 

3,07 

a 

1,81 0,343 ** 

12c-18:1 

ab 

0,67 

ab 

0,77 

b 

0,84 

ab 

0,55 

ab 

0,47 

a 

0,35 0,038 * 

18:2 n-6, LA 

a 

25,91 

ab 

24,06 

ab 

24,29 

b 

23,4 

bc 

22,11 

c 

19,58 0,463 ** 

18:3 0,27 0,32 0,32 0,28 0,34 0,36 0,007 NS 

18:3 n-3, ALA 

a 

37,88 

a 

40,67 

ab 

42,78 

b 

44,25 

bc 

46,23 

c 

49,57 0,091 *** 

20:0 0,84 1,04 1,36 0,94 0,90 0,90 0,036 NS 

22:0 0,90 0,97 1,43 1,08 1,12 1,00 0,035 NS 

23:0 0,30 0,46 0,38 0,38 0,25 0,32 0,014 NS 

24:0 0,90 1,26 1,22 1,03 1,13 1,11 0,023 NS 

LA/ALA 0,68 

a 

0,59 

a 

0,57 

ab 

0,53 

b 

0,48 0,39 0,023 *** 

SEM – štandardná chyba priemeru, S – významnos, hladiny významnosti: * – P

Tabuka 2. Zloženie mastných kyselín v kravskom letnom a zimnom mlieku a masle (g.100 g -1 celkového tuku) 

mlieko maslo 

FA 

leto zima leto zima S 

priem. SD priem. SD priem. SD priem. SD 

4:0 2,79 0,34 2,76 0,40 2,76 0,39 2,61 0,28 NS 

6:0 1,64 0,33 1,76 0,22 1,74 0,20 1,73 0,16 NS 

8:0 0,90 0,07 

a 

1,04 0,11 

a 

1,01 0,07 

a 

1,05 0,08 

9:0 0,03 0,02 0,03 0,01 0,03 0,00 0,04 0,01 NS 

10:0 

a 

2,30 0,23 

b 

2,65 0,30 

ab 

2,56 0,12 

b 

2,72 0,19 

10:1 0,22 0,03 

a 

0,28 0,03 

a 

0,25 0,01 

a 

0,27 0,02 

11:0 

a 

0,05 0,02 

b 

0,07 0,02 

a 

0,06 0,01 

ab 

0,07 0,01 

12:0 

a 

2,93 0,32 

b 

3,36 0,39 

ab 

3,14 0,10 

b 

3,52 0,20 

12:1 0,07 0,01 0,09 0,01 0,08 0,00 0,09 0,01 NS 

13:0 iso 0,10 0,01 0,11 0,01 0,11 0,01 0,11 0,01 NS 

13:0 anteiso 0,01 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00 NS 

13:0 0,10 0,03 0,12 0,02 0,12 0,01 0,14 0,02 NS 

14:0 iso 0,13 0,02 0,14 0,03 0,12 0,01 0,13 0,01 NS 

14:0 

a 

10,23 0,68 

b 

11,18 0,57 

a 

10,47 0,15 

b 

11,31 0,29 

14:1 0,91 0,14 1,01 0,10 0,91 0,05 1,01 0,06 NS 

15:0 iso 0,28 0,03 0,29 0,10 0,29 0,01 0,27 0,01 NS 

15:0 anteiso 0,51 0,04 0,48 0,06 0,51 0,01 0,47 0,02 NS 

15:0 1,17 0,17 1,25 0,14 1,20 0,09 1,30 0,11 NS 

15:1 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00 NS 

16:0 iso 0,28 0,03 0,31 0,07 0,28 0,02 0,31 0,02 NS 

16:0 

a 

29,27 1,98 

b 

33,13 2,12 

a 

29,38 0,64 

b 

33,13 0,87 

6-9t-16:1 

a 

0,13 0,05 

b 

0,09 0,02 

a 

0,14 0,01 

b 

0,08 0,01 

10-13t-16:1 

a 

0,24 0,03 

b 

0,20 0,02 

a 

0,25 0,01 

a 

0,20 0,01 

9c-16:1 

a 

1,49 0,12 

b 

1,57 0,12 

a 

1,50 0,04 

b 

1,59 0,06 

10-12c-16:1 0,04 0,03 0,05 0,02 0,02 0,01 0,03 0,01 NS 

c16:1 0,05 0,02 0,04 0,01 0,04 0,00 0,04 0,00 NS 

17:0 iso 

a 

0,48 0,05 

b 

0,40 0,07 

a 

0,49 0,04 

b 

0,39 0,07 

17:0 anteiso 0,44 0,02 0,43 0,05 0,45 0,01 0,44 0,01 NS 

17:0 anteiso 0,44 0,02 0,43 0,05 0,45 0,01 0,44 0,01 NS 

fytánová kys. 0,17 0,02 0,19 0,07 0,16 0,01 0,17 0,04 NS 

9c-17:1 0,27 0,03 0,24 0,03 0,28 0,02 0,26 0,02 NS 

18:0 iso 0,07 0,01 0,06 0,01 0,07 0,00 0,06 0,01 NS 

18:0 

a 

10,20 1,02 

b 

9,03 1,06 

a 

9,92 0,28 

b 

8,98 0,73 

5t-9t-18:1 

a 

0,57 0,08 

b 

0,47 0,10 

b 

0,47 0,07 

b 

0,46 0,04 

10,11,12t-18:1 

a 

2,20 0,61 

b 

1,07 0,25 

a 

1,67 0,14 

b 

1,07 0,15 

9c/10c-18:1 

a 

21,78 1,59 

b 

19,44 1,87 

a 

21,85 0,64 

b 

19,46 1,17 

11c+15t-18:1 0,94 0,13 

a 

0,72 0,09 

a 

0,72 0,05 

a 

0,72 0,02 

12c-18:1 0,29 0,05 0,31 0,07 0,30 0,01 0,31 0,04 NS 

13c-18:1 0,14 0,06 0,10 0,02 0,13 0,01 0,11 0,01 NS 

16t-18:1 

a 

0,41 0,10 

b 

0,31 0,05 

a 

0,40 0,02 

b 

0,30 0,02 

15c-18:1 

a 

0,29 0,05 

b 

0,22 0,05 

a 

0,27 0,02 

b 

0,21 0,02 

8t12c-18:2 

a 

0,09 0,03 

b 

0,06 0,02 

a 

0,08 0,01 

b 

0,06 0,01 

9t13c-18:2 0,11 0,03 0,10 0,03 0,10 0,01 0,09 0,01 NS 

9c12t-18:2 0,08 0,03 0,08 0,01 0,06 0,01 0,07 0,02 NS 

9t12c-18:2 

a 

0,04 0,01 

b 

0,02 0,01 

a 

0,05 0,01 

b 

0,03 0,01 

18:2 n-6 LA 

a 

2,04 0,16 

b 

1,84 0,21 

a 

2,05 0,03 

b 

1,83 0,05 

11t15c-18:2 0,17 0,02 0,18 0,03 0,17 0,01 0,19 0,02 NS 

9c15c-18:2 

a 

0,07 0,02 

b 

0,04 0,01 

a 

0,06 0,01 

b 

0,04 0,01 

19:0 0,03 0,02 0,05 0,04 0,02 0,00 0,05 0,04 NS 

18:2 0,03 0,02 

a 

0,01 0,01 

a 

0,01 0,01 

a 

0,01 0,00 

18:3 n-6 GLA 0,03 0,01 0,03 0,01 0,03 0,01 0,03 0,01 NS 

18:2+19:1 0,06 0,04 0,06 0,06 0,03 0,03 0,07 0,05 NS 




- 79 - 


11. - 14. 10. 2010

mlieko maslo 

FA 

leto zima leto zima S 

priem. SD priem. SD priem. SD priem. SD 

cyklo 19:0 0,07 0,02 0,08 0,02 0,09 0,02 0,07 0,01 NS 

18:3 n-3 ALA 

a 

0,64 0,20 

b 

0,44 0,10 

a 

0,62 0,06 

b 

0,41 0,06 

9c11t-18:2 CLA 

a 

0,80 0,26 

b 

0,41 0,09 

a 

0,84 0,10 

b 

0,44 0,04 

ct CLA 0,02 0,01 0,01 0,00 0,02 0,01 0,01 0,00 NS 

20:0 0,16 0,03 0,16 0,03 0,16 0,02 0,15 0,02 NS 

tt CLA 0,10 0,02 0,11 0,02 0,12 0,01 0,11 0,01 NS 

9c-20:1 0,08 0,04 0,06 0,03 0,08 0,01 0,06 0,01 NS 

20:2 0,02 0,01 0,02 0,00 0,02 0,01 0,03 0,02 NS 

21:0 0,05 0,03 0,03 0,02 0,04 0,01 0,03 0,01 NS 

20:3 n-6 

a 

0,07 0,02 

b 

0,09 0,01 

a 

0,08 0,01 

ab 

0,09 0,01 

20:4 n-6 AA 

a 

0,12 0,02 

b 

0,15 0,02 

a 

0,13 0,01 

ab 

0,14 0,01 

22:0 0,06 0,02 0,06 0,02 0,06 0,01 0,06 0,00 NS 

20:5 n-3 EPA 0,05 0,02 0,04 0,01 0,05 0,01 0,04 0,01 NS 

23:0 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 NS 

24:0 0,03 0,02 0,03 0,01 0,03 0,01 0,03 0,01 NS 

22:5 n-3 DPA 0,07 0,02 

a 

0,10 0,01 

a 

0,09 0,01 

a 

0,10 0,01 

24:1 0,01 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 NS 

22:6 n-3 DHA 0,02 0,01 0,01 0,01 0,03 0,01 0,04 0,01 NS 

SSFA 4:0-24:0 

a 

62,73 2,43 

b 

67,51 2,43 

a 

63,44 0,75 

b 

67,56 1,28 

SSFA 4:0-10:0 

a 

7,66 0,72 

b 

8,25 0,96 

ab 

8,10 0,76 

b 

8,15 0,71 

SSFA 12:0-16:0 

a 

43,72 3,01 

b 

49,05 2,80 

a 

44,31 0,87 

b 

49,35 1,32 

BSFA 2,23 0,88 2,17 1,32 2,25 0,62 2,13 0,61 NS 

MUFA 

a 

30,14 1,96 

b 

26,27 2,16 

a 

29,37 0,68 

b 

26,29 1,24 

PUFA 

a 

4,63 0,59 

b 

3,80 0,37 

a 

4,63 0,17 

b 

3,83 0,09 

LA / ALA 

a 

3,17 1,01 

b 

4,19 1,05 

a 3,34 0,32 b 4,48 0,72 

Index aterogenicity a 

2,10 0,16 

b 

2,70 0,22 

a 

2,19 0,08 

b 

2,72 0,14 

FA – mastná kyselina, SD – smerodajná odchýlka, S – významnos, NS – nevýznamnos, LA – kys. linolová, GLA 

– kys. -linolénová, ALA – kys. -linolénová, cyklo 19:0 – kys. 2-oktyl-cyklopropyloktánová, 9c11t-18:2 CLA – 

suma obsahov cis-9,trans-11 + trans-7,cis-9 + trans-8,cis-10 izomérov konjugovanej kys. linolovej (CLA), AA – 

kys. arachidónová, EPA – kys. eikozapentaénová, DPA – kys. dokozapentaénová, DHA – kys. dokozahexaénová, 

SSFA – suma nasýtených nerozvetvených mastných kyselín, BSFA – suma nasýtených rozvetvených mastných 

kyselín, MUFA – suma mononenasýtených mastných kyselín, PUFA – suma polynenasýtených mastných kyselín. 

Rozdiely pre priemerné obsahy oznaené rovnakým písmenom sú nevýznamné na hladine významnosti menšej ako 

0,05. NS – rozdiel medzi priemermi obsahov nie je štatisticky významný na hladine významnosti P

Tabuka 3. Obsah jednotlivých izomérov konjugovanej kyseliny oktadekadiénovej (CLA) (g.100 g -1 celkových FA) 

v kravských mliekach z dvoch mlienych fariem s najväším rozdielom v obsahu mastných kyselín pasienkov 

izomér CLA 

Kravské mlieko 

pasienok 1 pasienok 6 

cis-7,trans-9 0,007 - 

trans-7, cis-9 0,050 0,027 

cis-9,trans-11 0,560 0,702 

trans-8,cis-10 0,012 0,009 

cis-10,trans-12 0,009 0,004 

trans-9,cis-11 0,017 0,007 

trans-10,cis-12 0,004 0,004 

trans-11,cis-13 0,008 0,016 

cis-9,cis-11 0,007 0,002 

trans-12,trans-14 0,008 0,005 

trans-11,trans-13 0,037 0,010 

trans-10,trans-12 - trans-8,trans-10 0,042 0,021 

V rastlinách pasienka 1 sa v júli nameral najvyšší obsah OA a v rastlinách pasienka 6 najnižší obsah OA (tabuka 1). 

Júlové vzorky mlieka kráv pasúcich sa na pasienkoch 1 a 6 sa analyzovali na obsah izomérov CLA použitím chemometrickej 

dekonvolúcie chromatograficky neseparovaných izomérov CLA pomocou techniky GC/MS-SIM. V rastlinách pasienka 1 

nameraný 3,6-krát vyšší obsah OA v porovnaní s rastlinami pasienka 6 viedol k takmer 2-násobne vyššiemu (0,027 vs 0,050 

g.100 g -1 FA) (P

Sumárny obsah potenciálne pozitívne zdravie ovplyvujúcich MUFA a PUFA bol vyšší v letnom než v zimnom masle. 

Obsah MUFA bol vyšší o 12% (P

[19] J. Blaško, R. Kubinec, I. Ostrovský, E. Pavlíková, J. Krupík, L. Soják, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 2757. 

[20] A. Elgersma, P. Maudet, I.M. Witkowska, A.C. Wever, Annals Appl Biol. 147 (2005) 145. 

[21] J.C. Hawke, Lipids. In: G.W. Butler, R.W. Bailey, (Eds.). Chemistry and biochemistry of herbage. London, Academic 

Press, 1973, 213–263. 

[22] D.E. Bauman, J.M. Griinari, Annual Rev. Nutr. 23 (2003) 203. 

[23] S. Couvreur, C. Hurtaud, C. Lopez, L. Delaby, J.L. Peyraud, J. Dairy Sci. 89 (2006) 1956. 

[24] B.A. Corl, L.H. Baumgard, J.M. Griinari, P. Delmonte, K.M. Morehouse, M.P. Yurawecz, D.E. Bauman, Lipids 37 

(2002) 681. 

[25] W. M. Ratnayake, C. Galli, Annals Nutr. Metab. 55 (2009) 8. 




- 83 - 


11. - 14. 10. 2010

IN-ELECTRODE COULOMETRIC TITRATION TO DETERMINATE SOME COMPONENTS IN WATER 

Alena Manová*, Ernest Beinrohr, František acho, Roman Hudec 

Institute of Analytical Chemistry,Slovak University of Technology, 

Radlinskeho 9, 812 37 Bratislava, Slovakia 

In-Electrode Coulometric Titration (IECT) is new progressive method for determination some componebnts in water 

samples. In comparison with classical titration is IECT simpler, more sensitive and faster. The accuracy of the method 

depends of the working conditions. The electrode has to be made of a material, which is inert and stable in the course of the 

analysis. A porous electrode made of reticulated vitreous carbon was used. The method, flow-through chronopotenciometry, 

allowed determination hydrazine from 23 μg.dm -3 higher due to used electrode and stripping current. Furhtermore it was 

important to optimalize parameters, which rapidly influence the measurement, mostly to deal with a choice of appropriate 

current. Here we decided for 200 μA for microporous electrode E-53C and 10 μA for macroporous electrode E-104C because 

of length of stripping time, which should be the shortest for application in technical practice. We found out the limit of 

detection (LOD) for hydrazine to be 7,8 μg.dm -3 working with system EcaFlow and macroporous electrode E-104C with 

limit of quantification (LOQ) of 23,4 μg.dm -3 or empiric found out 0,2 mg. dm -3 (LOD) and 0,7 mg.dm -3 (LOQ) and for 

microporous electrode E-53C, respectively. Testing of interferences of compounds typical for boiler water from power 

stations showed that determination was mainly influenced cuprous Cu(II), ferrous Fe(II) and ferric Fe(III) cations because of 

precipitates creation with hydrogenphosphosphate natrium and ammonia, which increased the background. Flow-through 

chronopotenciometry is simple, relatively fast, well reproducible and repeatable method. This method gives accurate and 

correct results at microporous electrode. However the results obtained at the macroporous electrode are accurate only in the 

case of stabilized sample. It is suitable for hydrazine determination in boiler waters from power stations together with 

industrial waste waters released into surface water from energetic industry (heating plants and power stations). 

Keywords: hydrazine; boiler water; stripping chronopotentiometry 


Hydrazine is often present in waste waters especially in boiler water from power stations. Oxidation of hydrazine must 

therefore be carried out prior to standard waste treatment processes. Various methods have been used for monitoring of 

hydrazine concentrations such as titration [1], spectrometric [2 - 9], electrochemical [10 - 15]. 

Most of the above methods require the removal of hydrazine from the interfering matrix prior to the measurement either 

through precipitation or evaporation which makes the procedures laborious and time consuming. 

The aim of this work is to demonstrate the utility reticulated vitreous carbon electrodes and a computer controlled flow 

system for the stripping chronopotentiometric determination of hydrazine in boiler waters. Porous electrodes in flow systems 

offer some unique features making them suitable also for routine applications. Owing to the porous character and large 

electrode surface and low internal volume, high electrochemical recoveries, up to 100% can be achieved [16]. This geometry 

of electrodes allows the measurement as well as the voltammetric and coulometric mode and is the basis of many 

techniques, hydrodynamic and static electrochemistry. Due to the high ratio surface / volume running electrochemical action 

extremely rapidly and quantitatively in the whole volume of the electrode. This characteristic of microporous electrodes can 

then be successfully used for effective electrolysis solution in the volume of the electrodes, even for the flow solution. To 

determine the number of substances, this means that they can effectively accumulate in the volume of the electrode and 

subsequently dissolved and measured. Another advantage of the microporous structure of the electrode is able subsequently 

process (oxidized or reduced) analyte in the stationary solution in the electrode volume. Microporous electrodes are very 

sensitive to the presence of suspended and colloidal particles, which are relatively quickly clog pores and lead by them 

inoperative. Therefore, through these electrodes can flow only clear solutions. This microporous electrode allowed us to 

measure the hydrazine at higher concentrations, which was not significant for the proposed method and material. Therefore, 

we subsequently tested as a working electrode - macroporous electrode also produced with porous glassy carbon. Electrode is 

characterized by active surface (10 cm 2 ) and large volume (300 l). The advantage is that it is not so sensitive to the presence 

of suspended and colloidal particles that could clog the pores. This electrode can be measured and not entirely clear solutions 

in comparison with microporous has greater durability. Another advantage of the electrodes is that the use of lower currents 

is more sensitive than microporous electrode and therefore it can be measured in much lower concentrations. What was the 

important objective of this work. The flow system adds an additional advantage, namely the easy exchange of the electrolyte 

after electrodeposition enabling to strip the deposit to an ideal electrolyte, which minimises the adverse influence of the 

sample matrix. The presented procedure makes use of the formation of the hydrazine on the electrode surface from the 

sample during the deposition step. In the next step, the deposit is stripped into an electrolyte solution by applying a constant 

current, whereas the potential of the porous electrode is measured and evaluated. The main goal was to elaborate a simple, 

fast and reliable procedure not demanding a pre-separation step. 




- 84 - 


11. - 14. 10. 2010


Instrumentation 

Flow-through chronopotentiometric measurements were carried out by an electrochemical analyser EcaFlow model GLP 150 

(Istran Ltd., Slovakia) equipped with two solenoid inert valves, a peristaltic pump, 1 mm inner diameter PTFE tubing and a 

microprocessor controlled potentiostat/galvanostat. The block diagram of the system was reported elsewhere [17]. The 

signals were recorded and evaluated by the memory-mapping technique [18, 19]. The measurement consists of two main 

steps: (i) the background signal is measured first by means of a blank sample, (ii) followed by the sample or standard solution 

giving the signal of the sample or standard. The sample or standard is preconcentrated and the cell is rinsed with the carrier 

electrolyte into which the deposit is stripped. The cell is then rinsed again to remove the stripped hydrazine ions enabling the 

next run. The background signal is then subtracted from the signal of the standard or sample yielding the corresponding 

background corrected net signal. A compact flow-through electrochemical cell of type 353 with Pt auxiliary and Ag/AgCl 

reference electrodes was used (Istran Ltd., Slovakia). The working electrode was a reticulated vitreous carbon plug of 100 ppi 

(pores per inch) porosity (Electrosynthesis Co. Inc., Lancaster, New York, USA) of 10 mm and 4 mm in diameter and length, 

respectively. We are used two type of the electrodes: microporous electrode E-53C which is characterized by a large active 

surface (up to 25 cm 2 ) and low internal volume (only 20 l) and macroporous electrode E-104C which is also characterized 

by active surface (10 cm 2 ) and large volume (300 l). 

The operation parameters are listed in Table 1 for microporous electrode and in Table 2 for macroporous electrode, 

respectively. All potentials are expressed versus the silver/silver chloride reference electrode built in the cell. 

Table 1. Operation parameters of the flow-through electrochemical analyser for microporous electrode 

Parameter Dimension Value 

Deposition potential mV 200 

Quiescence potential I mV 200 

Quiescence time I s 5 

Quiescence potential II mV -200 

Quiescence time II s 5 

Terminal potential mV 1000 

Regeneration potential mV 0 

Standby potential mV 0 

Stripping current A 200 

Sample volume mL 4 

Blank volume mL 4 

Rinsing volume mL 4 

Flow rate mL/min 6 

Table 2. Operation parameters of the flow-through electrochemical analyser for macroporous electrode 

Parameter Dimension Value 

Deposition potential mV 200 

Quiescence potential I mV 200 

Quiescence time I s 5 

Quiescence potential II mV -200 

Quiescence time II s 5 

Terminal potential mV 800 

Regeneration potential mV 0 

Standby potential mV 0 

Stripping current A 10 

Sample volume mL 4 

Blank volume mL 4 

Rinsing volume mL 4 

Flow rate mL/min 6 




- 85 - 


11. - 14. 10. 2010

Reagents 

Analytical-reagent grade chemicals were used in all experiments. 

Deionised and degassed water was used for the preparation of all solutions. 

Carrier electrolyte and electrolyte for sample preparation: 0.1 mol L 1 Na 2HPO 4. 

The bulk standard solution hydrazine was 1 g L 1 . The calibration solutions were prepared fresh before the measurement by 

diluting the bulk standard solution in 0.1 mol L 1 Na 2HPO 4. The concentration of the standards was in the range of 1 – 

700 g L 1 for macroporous electrode and 0.7 – 50 mg.L -1 for microporous electrode, respectively. 

Sampling and sample preparation 

The samples were taken into amber glass bottles and stored in a refrigerator. The control measurements were performed at 

the same time as the chronopotentiometric measurements. Prior to analysis, the sample in the bottle was shaken and then let 

to sediment for few minutes. For analysis the supernatant was pipetted. The signal for macroporous electrode E-104C at low 

concentrations of hydrazine decreases because hydrazine is not stable and oxidizes the oxygen present. Therefore, the 

stabilization of a boiler water samples with hydrochloric acid for macroporous electrode E-104C is necessary. After 

stabilization, the signal is higher and more stable for up to several days. 

Sample analysis 

The sample was added to Na 2HPO 4.and on mixing the solution was immediately analysed. 

The boiler water samples were analysed with the elaborated method independently in two laboratories by two different 

operators. 

The accuracy of the results for boiler water samples was checked independently in an accredited laboratory by the titration 

method according to the Slovak Standard STN. 


Optimisation 

The solubility of hydrazine facilitates the electrochemical determination of hydrazine through stripping analysis by making 

use of an electrode material forming such a hydrazine. A porous glassy carbon electrodes offer the best performance. 

Covering the surface with Triton X-100 (helps no to detain bubbles in the pores of electrodes) improved significantly its 

performance. The same electrode could be used for several days virtually without loss of the sensitivity. 

On deposition the cell is flushed with the electrolyte and the deposit is stripped, the latter is washed from the electrode during 

the rinsing step. Porous electrodes possess a unique feature, absent in non-porous structures, namely there is a possibility to 

strip and deposit the analyte many times in a stopped flow regime. This can be used for signal accumulation in order to 

increase the signal to noise ratio [20], or to shift the signal to a potential range with lower background level. 

The first step was to optimize the parameter for the current dependence 3 mg L -1 hydrazine on microporous electrode E-53C. 

Changing the current between 20 A to 1000 A, while we observed in this measurement, in addition to current and stripping 

time, peak symmetry and yield. We decided to stripping current 200 A for optimal stripping time, peak symmetry and yield. 

Owing to the large electrode surface, stripping current larger than 200 A should be used. The measurement time at lower 

currents is longer than 5 min. The current of 200 A ensured the best signal to noise ratio and fast measurement. 

For a sample volume of 4 mL taken for preconcentration on the microporous electrode E53C, the response is linear up to 

about 0.7–50 mg L 1 (regression data: slope 0.0980, intercept -0.0321, correlation coefficient 0.99938) with a limit of 

detection and quantification [21] of 0.2 mg L 1 and 0.7 mg L 1 , respectively. 

The boiler water of power, such a concentration of hydrazine normally occur only in rare cases such as start-or operation is 

also the possibility of using industrial waste water discharged into surface waters of the energy industry (heat and power 

plants), where regulation of the Government .296/2005 Coll is permissible maximum value of 4.0 mg L -1 hydrazine. 

For a sample volume of 4 mL taken for preconcentration on the macroporous electrode E104C., the response is linear up to 

about 1–700 g L 1 (regression data: slope 0.00133, intercept -0.02735, correlation coefficient 0.9989) with a limit of 

detection and quantification [21] of 7.8 g L 1 and 23.4 g L 1 , respectively. 

The boiler water from plants such concentrations of hydrazine already happening, what is important for the proposed method 

and substantially. Their normal value is between 20 g L -1 to 100 g L -1 of hydrazine. 

Testing of interferences of compounds typical for boiler water from power stations showed that determination was mainly 

influenced cuprous Cu(II), ferrous Fe(II) and ferric Fe(III) cations because of precipitates creation with hydrogenphosphate 

and ammonia, which increased the background. It was found that the ratio of N2H4 : interferent equal 1:10 significantly 

affects the signal of hydrazine in all these interferent except ammonia, which affects the signal of hydrazine at a ratio of 

1:1000. 




- 86 - 


11. - 14. 10. 2010

Analysis of real samples 

The boiler water samples from a power stations contained dispersed colloidal substances and solids, so the key question was 

whether the sample preparation procedure (see Section 2) would ensure repeatable results. The relative standard deviation of 

the results for these samples was found to be 1.52 % and 1.44 %, respectively. Hence, the repeatability did not significantly 

differed from that for homogenous hydrazine solutions. 

The elaborated procedure was used for analyses of boiler water samples taken from different locations of a power stations 

(Table 3). In all cases, satisfactory agreement was found between the results obtained by the proposed procedure and the 

control method. In samples No. 3 and No. 5 (Laboratory A) the chronopotentiometric method provided much lower 

hydrazine content than the control method because sample do not stabilizated prior to analysis. 

Table 3. Analyses of boiler water samples from a power stations 

Sample 

Laboratory A 

(g L 1 ) 

Laboratory B 

(g L 1 ) 

Control analysis 

(g L 1 ) 

1 107.6 ± 4.6 99.1 ± 7.2 97.3 ± 7.8 

2 84.8 ± 10.8 81.8 ± 9.2 76.1 ± 6.3 

3 1.5 ± 0.3 a 

3.5 ± 1.3 a 27.5 ± 2.7 

4 25.8 ± 3.2 23.9 ± 2.9 28.5 ± 2.8 

5 3.0 ± 0.5 a 

27.5 ± 1.5 26.5 ± 1.7 

Note: a Sample without stabilization prior to analysis. 

4. Conclusion 

The stripping chronopotentiometric determination of hydrazine provided reliable results for boiler water samples from a 

power stations. The sample preparation is simple the prepared sample should be stabilizated prior to the measurement to 

obtain values corresponding with the control method. There is no need for a pre-separation step such as in titrimetric and 

photometric methods. The automatic on-line matrix exchange in the flow system after deposition minimises possible 

interferences from the sample matrix making this technique advantageous over the static batch ones. 

The main advantages of the elaborated procedure are the simple sample preparation, no significant interference from sample 

matrix, low detection limit, fast and full automatic measurement. 

Acknowledgement 

The authors appreciate the financial support of the Slovak Grant Agency of Science VEGA (Project No. 1/0500/08). 

References 

[1] T.R. Crompton, Analysis of solids in natural waters , Springer, Berlin, 1996. 

[2] A. Afkhami and A.R. Zarei, Talanta 62 (2004) 559. 

[3] A. Safavi, H. Abdollahi, F. Sedaghatpour and M.R. Hormozi Nezhad, Talanta 59 (2003) 147. 

[4] A. Safavi and A.A. Ensafi, Analytical Chimica Acta 300 (1995) 307. 

[5] A. Afkhami and A. Afshar-E-Asl, Analytical Chimica Acta 419 (2000) 101. 

[6] P. Ortega-Barrales, A. Molina-Díaz, M.I. Pascual-Reguera and L.F. Capitán-Vallvey, Analytical Chimica Acta 

353 (1997) 115. 

[7] A.A. Ensafi and B. Naderi, Microchemical Journal 56 (1997) 269. 

[8] A.A. Ensafi and M.A. Chamjangali, Journal of Analytical Chemistry 59 (2004) 129. 

[9] M. George, K.S. Nagaraja, and N. Balasubramanian, Talanta 75 (2008) 27. 

[10] He Xia, Electroanalysis 9 (1997) 1429. 

[11] Ming Yang and Hu Lin Li, Talanta 55 (2001) 479. 

[12] Z. K. He, B. Fuhrmann and U. Spohn, Analytical Chimica Acta 409 (2000) 83. 

[13] T.J. Pastor, V.V. Antonijevi and D.D. Manojlovi, Microchimica Acta 70 (1978) 131. 

[14] T.J. Pastor, V.J. Vajgand and V.V. Antonijevi, Microchimica Acta 81 (1983) 203. 

[15] E. Bishop, Microchimica Acta 48 (1960) 803. 

[16] E. Beinrohr, Accred. Qual. Assur. 6 (2001) 321. 

[17] E. Beinrohr, M. Cakrt, J. Dzurov, L. Jurica and J.A.C. Broekaert, Electroanalysis 11 (1999) 1137. 

[18] J. Mortensen, E. Ouziel, H.J. Skov and L. Kryger, Anal. Chim. Acta 112 (1979) 297. 

[19] A. Hu, R.E. Dessy and A. Graneli, Anal. Chem. 55 (1983) 320. 

[20] E. Beinrohr, P. Csemi, A. Manova and J. Dzurov, Fresenius Z. Anal. Chem. 349 (1994) 625. 

[21] J. Mocak, A.M. Bond, S. Mitchell and G. Scollary, Pure Appl. Chem. 69, 625 1997) 625. 




- 87 - 


11. - 14. 10. 2010

POSSIBLE DIAGNOSIS OF OVARIAN CANCER BY SYNCHRONOUS FLUORESCENCE SPECTRA OF URINE 

1 MILAN ZVARÍK*, 1 LIBUŠA ŠIKUROVÁ and 2 UBA HUNÁKOVÁ 

1 

Division of Biomedical Physics, FMPHI Comenius University, Mlynská dolina, 842 48, Bratislava, Slovakia 

2 

Cancer Research Institute Slovak Academy of Sciences, Vlárska 7, 833 91 Bratislava, Slovakia 

zvarikmilan@gmail.com 

Introduction 

Urine is a complex biological fluid containing a range of chemical compounds produced by the body, some of which 

are fluorescent. The concentration of fluorophores in urine is influenced by many factors including body metabolism, dietary 

intake, age, and various diseases [1] what might be used for quick diagnostic test. 

In this contribution, we have examined synchronous fluorescence spectra of urine for possible detection of ovarian cancer. 

Material and methods 

Samples of urine were obtained from healthy (control) and experimental BALB/c athymic nude mice. Human ovarian 

cancer cells SKOV-3 were implanted into the peritoneal cavities of experimental mouse. Urine samples were centrifuged at 

3000 rpm for 10 min at room temperature (22 ± 1ºC) and supernatants were used undiluted or diluted with deionized water 

(1:1 - 1:1024) for spectral analysis. The fluorescence spectra were obtained on a LS45 (PerkinElmer) luminescence 

spectrometer at room temperature (22 ± 1ºC). Synchronous fluorescence spectra (SFS) were collected by simultaneously 

scanning the excitation and emission monochromator in the excitation wavelength range 250 - 550 nm, with constant 

wavelength differences between them. Spectra were recorded for interval from 20 to 100 nm, in steps of 10 nm. 

Concentration matrices were made of synchronous fluorescence spectra of urine with various dilutions. Fluorescence 

excitation/emission matrices (EEMs) were acquired of excitation wavelength range from 250 to 550 nm in intervals of 20 

nm, where emission spectra were taken in intervals of 250 - 650 nm. Obtained spectral data were processed using FL WinLab 

software. 

Results and discussion 

The excitation/emission matrices (EEMs) of diluted mouse urine for both control and experimental animals showed 

three fluorescence emission peaks at around 390, 420 and 520 nm (Fig 1). 

In the control sample the first fluorescence emission peak at around 390 nm was created by changing the excitation 

wavelength from 250 nm to 290 nm and it reached the maximal fluorescent intensity with excitation at 290 nm (Fig 2a). 

The second emission fluorescence peak of control sample was shifted from 410 nm to 450 nm with increasing the 

excitation wavelength from 310 nm to 390 nm and it completely disappeared above 390 nm excitation (Fig 2b). 

The third (weak) fluorescence peak occurred in the area of 520 nm and reached its maximum by excitations at 370 nm 

and 450 nm (Fig. 2b). 

The experimental sample as well as control one showed the first fluorescence peak at 390 nm, while its intensity was 

lower than in the control (- 44 %) (Fig 2a). 

The second fluorescence peak of the cancer sample was of the same nature as in the control sample, but the intensity of 

fluorescence was higher (Fig. 2b). 

The third fluorescence peak at 520 nm reached its maximum by excitation at 370 nm and 450 nm, too, however the 

intensity of fluorescence for experimental mouse urine was much higher than it was in the control group (ex 370 -55%, ex 

450 -70%) (Fig. 2b). 




- 88 - 


11. - 14. 10. 2010

a) b) 

2 2 

1 1 

3 3 

3 3 

Fig. 1 The excitation/emission matrices (EEMs) of diluted urine of (a) control and (b) experimental mouse; 1, 2, 3 - 1 st , 2 nd 

and 3 rd fluorescence emission maximum; dilution 1:30, excitation wavelengths: 250 – 550 nm, emission wavelengths: 250 – 

650 nm. 

 

1 

Fig. 2 Emission fluorescence spectrum of diluted urine of control and experimental mouse, (a) excitation 290 nm, (b) 

excitation 370 nm; 1, 2, 3 - 1 st , 2 nd and 3 rd fluorescence emission maximum; dilution 1:30. 

The concentration matrices of synchronous fluorescence spectra of urine were obtained for control and experimental 

animals (Fig. 3). Synchronous spectral scanning revealed fluorescence (excitation/emission) bands at 363/383 nm and 

484/504 nm for both control and experimental mice (Fig 4a). The synchronous fluorescence peak 363/383 nm corresponds to 

the second emission fluorescence peak (330/416 nm) probably caused by 4-pyridoxic acid (317/420 nm) presence and the 

synchronous fluorescence peak 484/504 nm belongs likely to the third emission fluorescence peak (450/520 nm) which may 

by caused by flavins (450/525 nm) and its metabolites (Tab. 1). 

The synchronous fluorescence spectrum of control urine exhibited two other fluorescence peaks, namely at 280/300 nm 

by dilution 1:32 and at 393/413 nm by dilution 1:128, presumably due to suppressed concentration quenching of fluorophores 

and reduced inner filter effect [3] (Fig. 4). The peak at 280/300 nm probably comes from proteins and the other peak 383/413 

nm comes from NADH (340/460 nm) and from pterins (350/450 nm) (Tab. 1). 

The position of fluorescence band at 363 nm is moved to short wavelength with dilution. This shift probably comes 

from indol metabolites fluorescence (290/380 nm) and belongs to the first fluorescence peak (290/390 nm). 

Implantation of human ovarian cancer cells SKOV-3 into the experimental mouse caused changes in the spectral 

appearance: The intensity of fluorescence at 363/383 nm and 484/504, increased when compared to control (Fig4a). 

Concomitantly, the new fluorescence peaks at 280/300 nm and 303/323 nm by dilution 1:128 have appeared (Fig. 4b) in 

experimental mouse urine. These fluorescence bands can be preliminary attributed to the fluorescence of proteins. 




- 89 - 

2 

3 


11. - 14. 10. 2010

1,2 

2 

3 

Fig. 3 Concentration matrices from synchronous fluorescence spectra of urine of (a) control and (b) experimental mouse; 1, 

2, 3 - 1 st , 2 nd and 3 rd fluorescence emission maximum; excitation wavelengths: 250 – 550 nm, 20 nm, dilution 1:4 – 

1:1024. 

1 

2 

3 

Fig. 4 Synchronous fluorescence spectrum of diluted urine of control and experimental mouse, = 20 nm, a) dilution 1:30, 

b) dilution 1:128; 1, 2, 3 - 1 st , 2 nd and 3 rd fluorescence emission maximum. 

Fluorescent compounds of urine Excitation wavelength (nm) Emission wavelength (nm) 

Indol-type urinanry metabolites 290 380 

5-hydroxyindole-3-acetate 300 345-355 

Tryptophan 280 350 

Indolyl-3-acetate 290 360 

Skatol-5-sulphate 290 380 

Skatol-6-sulphate 290 360,370 

Indoxyl sulphate 290 380 

4-pyridoxic acid 317 420 

3-hydroxythranilic acid 320 415 

pterins 350 450 

NADH 340 460 

Flavins 450 525 

Tab. 1 Fluorescent compounds of urine [1,2] 




- 90 - 

1 

1,2 

2 

3 


11. - 14. 10. 2010 

3

Conclusion remarks 

The identification of the fluorescence features from single scan fluorescence data of urine samples is difficult due to the 

similarities in the spectral properties of the component fluorophores and large spectral widths; however, the spreading of the 

spectral features in two-dimensional excitation/emission matrices (EEMs) makes the task easier. Wide additional information 

can be also obtained from the synchronous fluorescence spectra, which are useful in detecting spectral features hidden in the 

conventional spectra. Our analysis of all presented spectral data showed that the 520 nm fluorescence peak (excitation at 370 

nm and 450 nm) offers a possible distinguishing mark between urine specimens obtained from healthy and cancer samples. 

This method is simple, rapid and cheep and can be expected to be developed as a preliminary test for cancer diagnosis. 

Acknowledgements 

This contribution is a result of implementation of the project "CENTRE OF EXCELLENCE FOR EXPLOITATION OF 

INFORMATIONAL BIOMACROMOLECULES IN THE DISEASE PREVENTION AND IMPROVEMENT OF QUALITY OF 

LIFE" supported by the Research & Development Operational Programme funded by the ERDF (Contract No. ITMS: 

26240120003) and by the Comenius University Grant No. UK/531/2010. 

References 

[1] K. Dubayová, J. Kušnír, L. Podracká, J. Biochem. Biophys. Methods 55 (2003) 111. 

[2] A.G. Anwer, P.M. Sandeep, E.M. Goldys, S. Vemulpad, Clin. Chim. Acta 401 (2009) 73. 

[3] S.M. Perinchery, U. Kuzhiumparambil, S. Vemulpad, E.M. Goldys, Talanta 80 (2010) 1269. 




- 91 - 


11. - 14. 10. 2010

COMPUTER-AIDED OPTIMIZATION OF MICROEXTRACTION TECHNIQUE 

MIROSLAVA BURSOVÁ*, RADOMÍR ABALA 

Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech 

Republic. 

bursova.mirka@seznam.cz 


The presented work deals with a facilitation of an optimization process of general liquid-liquid microextraction 

technique (LLME). For that purposes, a comparison of two commercial software packages (NCSS and Design Expert) in 

their default settings was used and compared to demonstrate their ability to provide experimental designs (plans), to analyze 

and evaluate the experimental results (responses) by a set of mathematical and statistical methods generally called response 

surface methodology (RSM) [1]. 

Response surface methodology is based on the fit of a polynomial equation to the experimental data, which must 

describe the behavior of a data set with the objective of making statistical prevision [2]. RSM is a general approach for design 

of experiments which effectively reduce the method development time and costs. The main advantage of the RSM compared 

to a widely used one-factor-at-a-time approach (OFAT, one parameter is changed while the others are fixed during 

optimization) is that only the most important experimental parameters are selected and optimized, and that more than one 

parameter is changed simultaneously in one experiment according to the software proposed plan of experiments. Generally, 

RSM consists of several consecutive steps: screening, modeling and optimization [3]. 

Before using the RSM, it is important to define the analytical goals and select the appropriate parameters and responses 

[2]. As an example, we selected a procedure of the microextraction of 10 ml of aqueous solution of 8 analytes (toluene, 

ethylbenzene, mesitylene, phenol, nitrobenzene, n-octanol, naphthalene and dimethylphthalate, all 1 g l -1 ) by several 

hundreds l of heptane (internal standard in heptane was methylhexanedecanoate) in 15 ml glass vial. The organic phase was 

analyzed by fast-GC method with FID and the analyte peak areas determined. 

The selected experimental parameters of interest were the extraction time, the volume of extraction solvent, the addition 

of salt, the stirring rate and the diameter of extraction vial. The extraction was performed at ambient temperature. As the 

analytical response, either the peak areas of single analytes or the sum of peak areas of all analytes measured are used. 

Response surface methodology 

Screening 

Reduced factorial designs are commonly recommended for the screening to limit the large number of experimental 

parameters to be optimized. Generally, Plackett-Burman design is applied for screening of independent experimental 

parameters in order to determine the parameters that significantly affect the extraction efficiency. The Plackett-Burman 

design assumes that the interactions among the selected parameters can be completely ignored so, their main influence on the 

analytical response is evaluated with a considerably reduced number of experiments [4]. 

Modeling 

In this step, experiments are designed with the purpose of modeling the measured responses as a function of significant 

parameters, usually by a second-order polynomial fit [3]. One of several possible designs of experiments is a central 

composite design (CCD) which involves two–level full factorial, fractional factorial and star design [1, 4]. In contrast to the 

 




- 92 - 


11. - 14. 10. 2010

screening, possible interactions among the main parameters are included as well as their squares owing to an eventual 

curvature of the response surface of the mathematical model. 

Optimization 

During optimization, the mathematical model is analyzed within the selected experimental constrains to determine the 

parameter settings at which the optimum analytical response (e.g. extraction efficiency of LLME) is achieved [1]. In the 

default settings, the selected statistical software packages use different ways to search the optimal conditions: NCSS applies 

Hooke and Jeeves method whereas Design Expert uses desirability function. 

The desirability function approach is the most currently used multicriterial methodology in the optimization of 

analytical procedures. Desirability approach is based on constructing a desirability function for each individual response and 

the measured properties related to each response are transformed into a dimensionless individual desirability scale (< d >). 

The scale of the individual desirability function ranges between d = 0, for a completely undesirable response and d = 1, for a 

fully desired response, above which further improvements would have no importance [2]. A combination of parameter values 

with d approaching 1 are than searched and selected. 

On contrary to the desirability approach, the Hooke and Jeeves method is based on repetition of two consecutive steps: 

search and projection. First, the initial parameters are shifted by a predefined step in the direction of axes and define a new 

point. In the projection, the point is projected on the model surface and the response value compared with the experimental 

value. These steps are repeated until the optimum is found and the residuals of the model minimized [5]. 


2.1. Chemicals and solvents 

Ethylbenzene, nitrobenzene, n-octanol and dimethylphthalate (all 99 %) were purchased from Aldrich (Steinheim, 

Germany). Toluene and phenol (both p.a.) were purchased from Lachema (Neratovice, Czech Republic) and mesitylene 

(99 %) was obtained from Fluka (Denmark, Germany). The internal standard in extraction solvent (methylhexadecanoate) 

was provided by PolyScience (USA). NaCl (p.a.) was obtained from Lach-Ner (Neratovice, Czech Republic). Methanol (p.a., 

Lachema) and heptane (99.5 %, Fluka) were used as solvents. Water was purified using a Mille-Q Plus (Millipore, Billerica, 

MA, USA). 

2.2. Stock solutions 

The stock solution (10 ml) of mixture of analytes was prepared in methanol at concentration 1 mg ml -1 of each analyte. 

Heptane and methylhexadecanoate (100.2 μg ml -1 ) were used as the extraction solvent and as the internal standard, 

respectively. All stock solutions were stored at 4 °C. 

2.3. GC Instrumentation 

Analyses were performed on a GC-2010 gas chromatograph (Shimadzu) with FID. Separation was performed on a 9,7 

m x 0,15 mm ID Chromacol CP-Sil 5CB capillary column coated with 5% diphenyl-95 % dimethyl-polysiloxane (0,12 μm). 

The fast-GC temperature program was: 40 °C (1 min), at 50°C/min to 100 °C, at 100°C/min to 250 °C (1 min). The carrier 

gas (hydrogen, 99.99%, Linde, Czech Republic) flow rate was in constant linear speed mode at 70 cm s -1 . The temperature of 

detector and injector was 300 °C. Nitrogen (99.999%) and synthetic air were from Linde, Czech Republic. The GC Solutions 

program (Shimadzu), ver. 2.30. was used for acquisition and data evaluation. 

The new microextraction technique is being applied for the patent therefore no details could be presented at the 

moment. 

 




- 93 - 


11. - 14. 10. 2010

2.4. Statistical software 

The data and experimental design were processed by statistical program NCSS 2004 (Number Cruncher Statistical 

Systems, Kaysville, Utah, USA) and Design Expert (ver. 8.0.10., Stat-ease, Inc., Minneapolis, USA). 


3.1. Screening 

Five experimental parameters (extraction time, volume of extraction solvent, stirring rate, diameter of extraction vial 

and addition of salt) were selected in order to obtain the optimum conditions for the microextraction process and their low 

and high values are showed in Table 1. The number of screening experiments was 16, whereas for OFAT approach 32 

experiments would be necessary. The Plackett-Burman design was used for screening of these variables in both the software 

packages. The analysis of variance (ANOVA) was used to evaluate the data (relative area of all analytes) and statistically 

significant effects were determined using t-test (95 % probability) [6]. The normalized results are showed in Pareto chart 

(Fig. 1) [6]. According to Pareto chart, the volume of extraction solvent (heptane) was the most significant parameter having 

the highest effect on the extraction efficiency of all analytes, followed by the extraction time. The salt effect (weight of 

sodium chloride) showed non-significant effect on overall extraction efficiency, but it showed significant effect for some 

separate analytes and therefore it was added to the following procedure (Modeling). Stirring rate, diameter of vial had no 

significant effects on the extraction efficiency. The stirring rate of 850 rpm and the extraction vial with diameter 1.9 cm were 

held constant. Both the used software yielded the same results in this step. 

Based on screening, three significant parameters (extraction time, extraction volume of solvent and salt effect) were 

used for modeling. 

Table 1 The experimental variables and their levels in the Plackett-Burman design. 

Factor Factor Low (-1) High (+1) 

A Stirring rate (rpm) 500 850 

B Extraction volume (heptane) (μL) 100 300 

C Weight of sodium chloride (g) 0 2 

D Extraction time (min) 5 20 

E Dummy 1 * -1 +1 

F Diameter of vial (cm) 1.9 2.7 

G Dummy 2 * -1 +1 

* Dummy are artificial parameters which are necessary for the Plackett-Burman design [7]. 

3.2. Modeling 

The significant parameters were used in the central composite design for investigation of their interactions and their 

examined levels are listed in Table 2. The design permitted the response to be modeled by fitting a second-order polynomial 

equation: 

RESPONSE axbxcxaxbxcxdxxdxxdxxe 

2 2 2 

1 1 1 2 1 3 2 1 2 2 2 3 12 1 2 13 1 3 23 2 3 

where a, b, c, and d are the coefficients, e is the intercept, x1, x2, and x3 are the experimental parameters to be optimized, 

and is the residual error of the model fit. 

 




- 94 - 


11. - 14. 10. 2010

The design consists of a factorial design with star points located at + and – values from the center of the experimental 

domain [1, 4]. There is the main difference between used statistical software because NCSS uses spherical design (= ±1.73) 

and Design Expert consists the rotatability CCD (= ±1.68). The distinction is due to the selection of star points (the axial 

distance) [1] 

Term 

B 

D 

E 

C 

F 

G 

A 

0 

1 

Pareto Chart of the Standardized Effects 

(Alpha = 0,05) 

2,306 

2 

3 4 

Standardized Effect 

Factor Name 

A stirring rate 

B extraction volume 

C sodium chloride 

D time 

E dummy 1 

F diameter 

G dummy 2 

Fig.1. Standardized main effect Pareto chart for the Plackett-Burman design. Vertical line in the chart defines 95 % 

confidence level. 

The overall number of runs was 20 (8-factorials, 6-central and 6-star experiments). The results were evaluated by 

ANOVA test and a second-order polynomial regression model was used to calculate the response surface for each parameter 

separately (Figs. 2-4). The coefficients of the polynomial fitting equation are presented in Tab.3 

Table 2 The experimental variables, their levels and star points in the central composite design. (Design Expert) 

Factor - (-1.68) -1 0 +1 + (+1.68) 

Extraction time (min) 16 20 25 30 34 

Extraction volume (heptane) (μl) 115 150 200 250 285 

Weight of sodium chloride (g) 0.07 0.8 1.8 2.8 3.53 

 




- 95 - 

5 

6 


11. - 14. 10. 2010 

7

elative 

area 

15 

10 

5 

1,68 

1,00 

0,00 

time 

-1,00 

-1,68 

1,00 

1,68 

-1,68 

-1,00 

0,00 

volume 

Figure 2. Response surface plot for the extraction solvent volume vs. the extraction time for the total relative peak area 

(addition of sodium chloride was 1.8 g). 

15 

relative 10 

area 

5 

1,68 

1,00 -1,68 

0,00 

-1,00 

0,00 

time -1,00 

-1,68 

1,00 sodium 

1,68 

chloride 

Figure 3. Response surface plot for the extraction time vs. the salt effect for the total relative peak area (extraction 

volume was 200 μL). 

 




- 96 - 


11. - 14. 10. 2010

elative 

area 

15 

10 

5 

-1,68 -1,00 

0,00 1,00 

sodium 1,00 

1,68 

1,68 

chloride 

0,00 

-1,68 

-1,00 

volume 

Figure 4. Response surface plot for the solvent extraction volume vs. the salt effect for the total relative peak area 

(extraction time was 25 min). 

Table 3 The values of coefficients of the second-order polynomial equation from the CCD. 

Parameter 

Value 

Design Expert NCSS 

e (Intercept) 11.62 11.61 

a1 (time) 1.79 1.78 

a2 ns ns 

b1 (volume) -2.62 -2.60 

b2 ns ns 

c1 (salt) -1.52 -1.50 

c2 -1.41 ns 

d12 (time · volume) 1.22 1.22 

d13 (time · salt) ns ns 

d23 (volume · salt) ns ns 

R 2 0.8807 0.8884 

ns-not significant 

It can be seen that both the programs calculated almost the same model, but NCSS gave slightly higher value of R 2 . 

As can be seen on Figs.2-4 it is not possible to localize visually the optimal responses on the three-dimensional (two 

parameters and one response) representations of the four-dimensional (three parameters and one response) mathematical 

model, therefore only a mathematical approach could be applied for that goal. 

 




- 97 - 


11. - 14. 10. 2010

3.3. Optimization 

The second order polynomial model was used to fit the optimal conditions. Applying (a) the desirability function, 

Design Expert software located the optimal condition as follows: the extraction time was 16 min, the volume of heptane 

115 μL and the addition of NaCl was 1.24 g. Applying (b) the Hooke and Jeeves method in NCSS the optimum was found at 

extraction time 25 min, extraction solvent volume 200 μl and 1.26 g NaCl (Table 4). 

Table 4 The optimal values of significant parameters found by two commercial software packages 

Software Method 

Optimal values of significant parameters 

Extraction time 

(min) 

Extraction volume 

(heptane) (μl) 

Weight of sodium 

chloride (g) 

NCSS Hooke and Jeeves 25 200 1.26 

Design 

Expert 

Desirability 16 115 1.24 

To test the reliability of both the theoretical models the computer predicted optima were used for the real measurements 

and the results were very good for both programs. Comparing the predicted results (dimensionless) with the real ones we can 

see that: (a) NCSS program predicted the response value of 12.02 (sum of relative peak areas) and the experiment yielded 

12.34 (102.7 % of the predicted value), and (b) Design Expert predicted 16.86 and the measurement gave 17.54 (104.0 %) 

(Fig.5). 

Response 

20 

18 

16 

14 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

NCSS Design Expert 

Predicted Measured 

Figure 5. Comparison between predicted and measured results for used statistical programs. 

 




- 98 - 


11. - 14. 10. 2010

It can be seen that the programms differs in both the predicted and the measured values by approximately 29%. This 

fact indicates that the mathematical model posseses more than one local optima depending on the selected experimental 

conditions. The agreement between the predicted and measured values is very good and the differences are below 5% for 

both the programs. The real values are even higher than the predicted ones which fact demonstrates some small residual 

uncertainty of the model. From the practical point of view, the experimental conditions predicted by Design Expert yield 

higher response (sensitivity), therefore, they will be more suitable for the measurements. 

Conclusion 

The study successfully demonstrated the easy applicability of NCSS and Design Expert chemometric software packages 

to fast and reliable optimization of liquid-liquid microextraction technique (LLME) connected with GC-FID for 

determination of selected environmental pollutants in aqueous samples. The predicted values of the extraction differ by 

almost 30% between the programs but are in very good agreement with the real measurements - 102.7 and 104.0 % for NCSS 

and Design Expert, respectively. This simple and straightforward example shows that there is no reason to be afraid of the 

application of the chemometrical approaches and software in the solving of analytical tasks. 

Acknowledgement 

The authors thank for financial support the Grant Agency of Charles University in Prague (GA UK-21210) and the Grant 

Agency of the Czech Republic (GAR-203/08/1428). 

References 

[1] R. H. Myers, D. C. Montgomery, Response Surface Methodology. Process and Product Optimization Using Designed 

Experiments, John Wiley & Sons, New York, 2002. 

[2] M. A. Bezerra, R. E. Santelli, E. P. Oliveira, L. S. Villar, L. A. Escaleira, Talanta 76 (2008) 965. 

[3] N. R. Costa, Z. L. Pereira, J. Chemometrics 24 (2010) 333. 

[4] R. L. Mason, R. F. Gunst, J. L. Hess: Statistical Design and Analysis of Experiments. With Applications to Engineering 

and Science, John Wiley & Sons, New York, 2003. 

[5] M. Javrek, I. Taufer, CHEMagazín 6 (2006) 34. 

[6] C. Stalikas, Z. Fiamegos, V. Sakkas, T. Albanis, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 175. 

[7] J. Zichová, Plánování experiment a predikní vícerozmrná analýza, Karolinum, Praha, 2007. 

 




- 99 - 


11. - 14. 10. 2010

KRYŠTÁLOVÁ ŠTRUKTÚRA A BIOLOGICKÁ AKTIVITA CHIRÁLNYCH DERIVÁTOV INDOLIZÍNU 

VIKTOR VRÁBEL a* , UBOMÍR ŠVORC a a ŠTEFAN MARCHALÍN b 

aÚstav 

analytickej chémie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava 

b 

Ústav organickej chémie, katalýzy a petrochémie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 

Bratislava, 812 37 

e-mail viktor.vrabel@stuba.sk 

Úvod 

Organické zlúeniny obsahujúce dva kondenzované uhlíkové kruhy (pä a šeslenný) a dusík ako heteroatóm sú vo 

všeobecnosti známe pod názvom indolizíny. Indolizínový kruh s rozlinými stupami nasýtenia má vemi nízky oxidaný 

potenciál a je súasou vekého potu prírodných zlúenín, nachádzajúcich sa v rastlinnej a živoíšnej ríši, so širokým 

spektrom biologickej aktivity. Sú to dôležité bioaktívne látky, ktoré majú široké použitie v biológii, farmakológii a 

agrochémii. Nasýtené oktahydroindolizíny sa nachádzajú v indolizidínových alkaloidoch, ktoré boli izolované hlavne z 

rastlín, mikroorganizmov alebo živoíchov (mravce, chrobáky, obojživelníky). Najvýznamnejšiu skupinu predstavujú 

polyhydroxy-indolizidíny (Obr. 1), ktoré sa ukázali by úinnými inhibítormi dôležitých biologických procesov, ako je 

inhibícia glykozidáz [1,2]. 

OH 

H 

N 

OH 

OH 

HO 

H O 

OH 

H 

(-)-Swainsonín (+)-Kastanospermín (+)-Lentiginozín 

N 

OH 

Obr. 1. Chemické vzorce najvýznamnejších polyhydroxyindolizidínov 

Tieto alkaloidy, vykazujú protirakovinovú, protihubovú a protivirálnu aktivitu in vitro aj in vivo, vrátane HIV vírusu [3-5]. 

Toto ich široké spektrum užitonej biologickej aktivity ich predurilo ako objekt intenzívneho výskumu vo farmácii v oblasti 

organickej syntézy a hadaní nových lieiv. 

Príprava neprírodných epimérov a modifikovaných štruktúrnych analógov týchto alkaloidov má veký význam, pretože 

sa zistilo, že sa ich biologická aktivita výrazne mení v závislosti od potu, polohy a stereochémie hydroxy-skupín na skelete 

alkaloidu. Syntetické indolizíny majú niekoko zaujímavých biologických úinkov napr. na centrálny nervový a 

kardiovaskulárny systém [6]. Taktiež majú zaujímavé fyzikálne vlastnosti (nové farbivá a spektrálne senzitizátory). 

Indolizíny boli testované aj ako antimykobakteriálne inidlá (hlavne pri liebe tuberkulózy) [7] a potenciálne antioxidanty 

inhibujúce peroxidáciu lipidov [8]. Doteraz bolo vypracované pomerne veké množstvo syntetických postupov prípravy 

mono- a poly-hydroxyindolizínov, ale väšina z nich je vhodná na prípravu jedného alebo v lepšom prípade viacerých 

cielených molekúl. Spomínané farmakologické úinky prírodných alkaloidov viedli v posledných rokoch k intenzívnemu 

štúdiu a rozvoju nových syntetických metód na ich prípravu. Aromatické indolizínové deriváty sa nenachádzajú v prírode, ale 

ich syntetické analógy sú dôležité pre ich farmakologické a fyzikálne vlastnosti. Izochinolínové a benzochinolínové deriváty 

patria do skupiny indolizínov, ktoré sa v klinickej praxi osvedili ako lieivá pri liebe cukrovky [9] resp. ako inhibítory 

testosterónu 3-reduktázy-1 [10]. Majú veký význam pri liebe rôznych kožných ochoreniach (akné) alebo pri nadmernom 

vypadávaní vlasov [11]. V súasnosti 1-sulfonylindolizíny z hadiska významnosti predstavujú nové typy blokátorov 

vápnikových kanálov a práve vaka tomu by mohli by v budúcnosti potenciálnou náhradou za niektoré dnes bežne 

používané 1,4-dihydropyridíny [12,13]. 


Použitím röntgenoštruktúrnej analýzy sme študovali kryštálovú a molekulovú štruktúru derivátu indolizínu: monohydrát 

(6S,7S,8S,8aS)-6-etyl-7,8-dihydroxyhexahydro-indolizín-3(2H)-on; ktorého príprava je popísaná v literatúre [14]. Všetky 

merania boli uskutonené na difraktometri Gemini R firmy Oxford Diffraction s Ruby CCD detektorom za podmienok 

grafitom monochromatizovaného žiarenia MoK ( = 0.71069 ) pri teplote 298K. Namerané dáta boli spracované 

programovým balíkom Oxford Diffraction CrysAlis RED [15] (redukcia dát, korekcia na absorpciu). Na riešenie kryštálovej 

štruktúry sa použili priame metódy pomocou programu SHELXS-97[16]. Ako vstupné údaje sa použili štvorce štruktúrnych 

faktorov prislúchajúce jednotlivým difrakciám hkl a základné kryštalografické údaje o zlúenine: elementárne zloženie, typ 

kryštalografickej sústavy, typ priestorovej grupy symetrie a základné mriežkové parametre (Tabuka 1). Postupným riešením 

sa získali polohy všetkých nevodíkových atómov (C, N, O) ako maximá vo Fourierovej mape elektrónových hustôt. Na 

spresovanie polôh týchto atómov sa použila metóda najmenších štvorcov. Polohy nevodíkových atómov sa spresnili najskôr 

izotropne, následne anizotropne (Tabuka 3). Polohy atómov vodíka, ktoré sú difraknými metódami ažšie a asto nie 

jednoznane identifikovatené, boli vypoítané za predpokladu sp 3 hybridizácie atómov uhlíka a kyslíka a spolu s 




- 100 - 

H 

N 

OH 

OH 


11. - 14. 10. 2010

nevodíkovými atómami izotropne spresnené (Tabuka 2). Na geometrickú analýzu (výpoet väzbových vzdialeností, 

valenných a torzných uhlov (Tabuka 4)) sa použil program PARST[17], obrázky štruktúr boli pripravené programom 

DIAMOND[18], podklady a editovanie pre publikané úely sa robili pomocou programu enCIFer[19]. 

Tabuka 1. Základné kryštalografické a štruktúrne údaje zlúeniny (I) 

C 10H 17NO 3·H 2O F(000) = 472 poet elektrónov v základnej bunke 

M r = 217.26 Dx = 1.325 Mg m 3 

Ortorombická sústava, grupa symetrie P212121 Žiarenie Mo K , = 0.71073 Å 

a = 7.1398 (3) Å = 3.4–29.5° 

b = 7.3169 (2) Å μ = 0.10 mm 1 

c = 20.8466 (9) Å T = 298 K 

V = 1089.05 (7) Å 3 Kryštál prizmatický a bezfarebný 

Z = 4 poet vzorcových jednotiek v zákl. bunke Vekos kryštálu 0.55 × 0.25 × 0.09 mm 

17428 poet celkových reflexií 1308 poet nezávislých reflexií 

R[F 2 > 2(F 2 )] = 0.029 1161 reflexie s I > 2(I) 

wR(F 2 ) = 0.081 

S = 1.06 

max = 0.16 e Å 

Rint = 0.028 

max = 26.4°, min = 4.1° 

3 min = 0.14 e Å 

h = 88 

3 Tmin = 0.945, Tmax = 0.991 

(/)max < 0.001 

k = 99 

l = 2626 

w = 1/[ 2 2 2 

(Fo ) + (0.0511P) + 0.0923P] 

kde P = (Fo 2 + 2Fc 2 )/3 

Tabuka 2. Zlomkové atómové súradnice a ekvivalentné izotropné teplotné parametre (Å 2 ) 

x y z U iso*/Ueq 

C2 0.7971 (2) 0.5950 (2) 0.21098 (8) 0.0301 (4) 

C3 0.7338 (3) 0.7182 (2) 0.26470 (8) 0.0347 (4) 

H3B 0.8405 0.7649 0.2884 0.042* 

H3A 0.6524 0.6529 0.2941 0.042* 

C4 0.6288 (3) 0.8728 (3) 0.23202 (9) 0.0454 (5) 

H4B 0.6617 0.9895 0.2510 0.054* 

H4A 0.4946 0.8553 0.2358 0.054* 

C5 0.6903 (2) 0.8652 (2) 0.16126 (8) 0.0314 (4) 

H5A 0.5790 0.8736 0.1339 0.038* 

C6 0.8300 (3) 1.0102 (2) 0.14059 (8) 0.0331 (4) 

H6A 0.9284 1.0227 0.1731 0.040* 

C7 0.9168 (3) 0.9620 (2) 0.07610 (9) 0.0359 (4) 

H7A 0.8175 0.9664 0.0437 0.043* 

C8 1.0011 (2) 0.7695 (3) 0.07524 (8) 0.0341 (4) 

H8A 1.0387 0.7430 0.0310 0.041* 

C9 0.8502 (3) 0.6316 (2) 0.09368 (8) 0.0339 (4) 

H9B 0.7529 0.6298 0.0612 0.041* 

H9A 0.9043 0.5102 0.0963 0.041* 

C10 1.1765 (3) 0.7517 (3) 0.11756 (10) 0.0399 (4) 

H10B 1.2577 0.8557 0.1098 0.048* 

H10A 1.1390 0.7552 0.1623 0.048* 

C11 1.2854 (3) 0.5778 (3) 0.10545 (10) 0.0514 (5) 

H11C 1.3930 0.5743 0.1331 0.062* 

H11B 1.3255 0.5745 0.0615 0.062* 

H11A 1.2070 0.4741 0.1141 0.062* 

N1 0.7703 (2) 0.68207 (18) 0.15522 (7) 0.0292 (3) 

O21 0.8643 (2) 0.44131 (16) 0.21682 (6) 0.0420 (3) 

O22 0.7283 (2) 1.17774 (17) 0.13508 (8) 0.0473 (4) 

H22A 0.776 (4) 1.257 (4) 0.1571 (12) 0.057* 

O23 1.0557 (2) 1.0928 (2) 0.05882 (8) 0.0565 (4) 

H23A 1.015 (4) 1.177 (4) 0.0304 (13) 0.068* 

O24 0.9507 (2) 1.3468 (3) 0.03262 (8) 0.0559 (4) 

H24A 1.013 (4) 1.312 (4) 0.0684 (13) 0.067* 

H24B 0.851 (4) 1.369 (4) 0.0451 (13) 0.067* 




- 101 - 


11. - 14. 10. 2010

Tabuka 3. Anizotropné teplotné parametre nevodíkových atómov (Å 2 ) 

U 11 U 22 U 33 U 12 U 13 U 23 

C2 0.0274 (8) 0.0256 (8) 0.0373 (9) 0.0042 (7) 0.0022 (7) 0.0007 (7) 

C3 0.0365 (9) 0.0329 (8) 0.0346 (9) 0.0024 (8) 0.0014 (7) 0.0006 (7) 

C4 0.0523 (11) 0.0395 (10) 0.0444 (11) 0.0134 (10) 0.0139 (9) 0.0010 (9) 

C5 0.0312 (8) 0.0270 (8) 0.0359 (9) 0.0044 (7) 0.0026 (7) 0.0004 (7) 

C6 0.0355 (9) 0.0251 (8) 0.0387 (9) 0.0008 (8) 0.0106 (7) 0.0016 (7) 

C7 0.0325 (9) 0.0376 (9) 0.0375 (9) 0.0057 (8) 0.0061 (8) 0.0108 (8) 

C8 0.0354 (9) 0.0404 (9) 0.0265 (8) 0.0020 (8) 0.0011 (7) 0.0010 (7) 

C9 0.0378 (9) 0.0327 (9) 0.0312 (9) 0.0021 (8) 0.0004 (7) 0.0064 (7) 

C10 0.0323 (9) 0.0396 (10) 0.0478 (11) 0.0019 (9) 0.0005 (8) 0.0035 (9) 

C11 0.0504 (12) 0.0576 (13) 0.0462 (12) 0.0150 (11) 0.0002 (10) 0.0036 (10) 

N1 0.0316 (7) 0.0230 (6) 0.0330 (7) 0.0003 (6) 0.0019 (6) 0.0007 (6) 

O21 0.0514 (8) 0.0282 (6) 0.0465 (7) 0.0091 (6) 0.0047 (7) 0.0021 (6) 

O22 0.0560 (9) 0.0234 (6) 0.0624 (9) 0.0034 (7) 0.0181 (7) 0.0010 (6) 

O23 0.0418 (8) 0.0553 (9) 0.0726 (10) 0.0098 (8) 0.0016 (7) 0.0328 (8) 

O24 0.0482 (9) 0.0650 (10) 0.0546 (9) 0.0009 (9) 0.0021 (7) 0.0157 (8) 

Tabuka 4. Väzbové vzdialenosti, valenné a torzné uhly (Å, º) 

C2—O21 1.228 (2) C7—H7A 0.9800 

C2—N1 1.339 (2) C8—C9 1.525 (2) 

C2—C3 1.507 (2) C8—C10 1.538 (3) 

C3—C4 1.518 (3) C8—H8A 0.9800 

C3—H3B 0.9700 C9—N1 1.452 (2) 

C3—H3A 0.9700 C9—H9B 0.9700 

C4—C5 1.540 (2) C9—H9A 0.9700 

C4—H4B 0.9700 C10—C11 1.513 (3) 

C4—H4A 0.9700 C10—H10B 0.9700 

C5—N1 1.462 (2) C10—H10A 0.9700 

C5—C6 1.519 (2) C11—H11C 0.9600 

C5—H5A 0.9800 C11—H11B 0.9600 

C6—O22 1.429 (2) C11—H11A 0.9600 

C6—C7 1.522 (3) O22—H22A 0.82 (3) 

C6—H6A 0.9800 O23—H23A 0.90 (3) 

C7—O23 1.425 (2) O24—H24A 0.91 (3) 

C7—C8 1.532 (3) O24—H24B 0.78 (3) 

O21—C2—N1 125.27 (16) C8—C7—H7A 107.9 

O21—C2—C3 126.23 (16) C9—C8—C7 109.13 (14) 

N1—C2—C3 108.50 (14) C9—C8—C10 112.01 (14) 

C2—C3—C4 105.09 (15) C7—C8—C10 113.01 (15) 

C2—C3—H3B 110.7 C9—C8—H8A 107.5 

C4—C3—H3B 110.7 C7—C8—H8A 107.5 

C2—C3—H3A 110.7 C10—C8—H8A 107.5 

C4—C3—H3A 110.7 N1—C9—C8 109.40 (14) 

H3B—C3—H3A 108.8 N1—C9—H9B 109.8 

C3—C4—C5 105.20 (14) C8—C9—H9B 109.8 

C3—C4—H4B 110.7 N1—C9—H9A 109.8 

C5—C4—H4B 110.7 C8—C9—H9A 109.8 

C3—C4—H4A 110.7 H9B—C9—H9A 108.2 

C5—C4—H4A 110.7 C11—C10—C8 113.21 (17) 

H4B—C4—H4A 108.8 C11—C10—H10B 108.9 

N1—C5—C6 111.06 (13) C8—C10—H10B 108.9 

N1—C5—C4 103.10 (13) C11—C10—H10A 108.9 

C6—C5—C4 115.70 (15) C8—C10—H10A 108.9 

N1—C5—H5A 108.9 H10B—C10—H10A 107.7 

C6—C5—H5A 108.9 C10—C11—H11C 109.5 

C4—C5—H5A 108.9 C10—C11—H11B 109.5 

O22—C6—C5 106.74 (14) H11C—C11—H11B 109.5 




- 102 - 


11. - 14. 10. 2010

O22—C6—C7 109.57 (15) C10—C11—H11A 109.5 

C5—C6—C7 110.85 (14) H11C—C11—H11A 109.5 

O22—C6—H6A 109.9 H11B—C11—H11A 109.5 

C5—C6—H6A 109.9 C2—N1—C9 126.13 (14) 

C7—C6—H6A 109.9 C2—N1—C5 114.67 (13) 

O23—C7—C6 110.54 (16) C9—N1—C5 117.56 (13) 

O23—C7—C8 109.97 (14) C6—O22—H22A 110.7 (18) 

C6—C7—C8 112.57 (14) C7—O23—H23A 113.7 (16) 

O23—C7—H7A 107.9 H24A—O24—H24B 104 (3) 

O21—C2—C3—C4 169.29 (17) C6—C7—C8—C10 68.92 (19) 

N1—C2—C3—C4 11.57 (19) C7—C8—C9—N1 55.28 (18) 

C2—C3—C4—C5 17.83 (19) C10—C8—C9—N1 70.64 (19) 

C3—C4—C5—N1 17.48 (19) C9—C8—C10—C11 69.5 (2) 

C3—C4—C5—C6 103.96 (16) C7—C8—C10—C11 166.77 (16) 

N1—C5—C6—O22 167.96 (14) O21—C2—N1—C9 14.3 (3) 

C4—C5—C6—O22 74.98 (18) C3—C2—N1—C9 164.90 (15) 

N1—C5—C6—C7 48.69 (18) O21—C2—N1—C5 179.17 (16) 

C4—C5—C6—C7 165.76 (15) C3—C2—N1—C5 0.02 (19) 

O22—C6—C7—O23 65.90 (18) C8—C9—N1—C2 108.10 (19) 

C5—C6—C7—O23 176.56 (14) C8—C9—N1—C5 56.43 (19) 

O22—C6—C7—C8 170.69 (13) C6—C5—N1—C2 113.25 (16) 

C5—C6—C7—C8 53.14 (19) C4—C5—N1—C2 11.28 (19) 

O23—C7—C8—C9 179.85 (15) C6—C5—N1—C9 53.04 (19) 

C6—C7—C8—C9 56.42 (18) C4—C5—N1—C9 177.56 (15) 

Tabuka 5. Intermolekulové vodíkové väzby (Å, º) 

D—H···A D—H H···A D···A D—H···A 

O22—H22A···O21 i 0.82 (3) 1.94 (3) 2.751 (2) 173 (3) 

O24—H24A···O22 ii 0.91 (3) 2.07 (3) 2.919 (2) 155 (2) 

O24—H24B···O23 iii 0.78 (3) 2.14 (3) 2.907 (2) 167 (3) 

Symmetry codes: (i) x, y+1, z; (ii) x+1/2, y+5/2, z; (iii) x1/2, y+5/2, z. 

Popis štruktúry a diskusia 

Na základe röntgenoštruktúrnej analýzy sme študovali kryštálovú a molekulovú štruktúru derivátu indolizínu: 

monohydrát (6S,7S,8S,8aS)-6-etyl-7,8-dihydroxyhexahydro-indolizín-3(2H)-on (I). Vzhadom na rôznorodé vlastnosti 

derivátov indolizinu, uvedená zlúenina (I), bola vybraná ako súas štúdovania konformaných zmien spôsobených 

rôznymi substituentami v rôznych polohách v indolizínovom systéme prstencov. Absolútna konfigurácia bola urená a 

potvrdená na základe východzích zložiek pri syntéze. Oakávaná konformácia S, S, S, S atómov C5, C6, C7, C8 bola 

potvrdená (Obr. 2). 

Centrálny šeslenný kruh nie je planárny a vykazuje stolikovú konformáciu [20]. Preloženie roviny metódou 

najmenších štvorcov cez tento kruh ukazuje, že štyri atómy C5, C6, C8 a C9 sú koplanárne, zatia o atómy N1 a C7 sú 

signifikantne odchýlené z tejto roviny na opaných stranách o hodnoty -0,578 (2) a 0,651 (1) Å. Pälenný oxopyrolidínový 

kruh indolizínu má obálkovú konformáciu s atómom C4 vo vrchole [21]. Odchýlka atómu C4 od strednej roviny preloženej 

cez zostávajúce štyri atómy N1/C2/C3/C5 je 0,294 (1) Å. 

Väzbové vzdialenosti N1-C5 a N1-C9 sú približne rovnaké a obidve sú signifikantne dlhšie ako väzbová vzdialenos 

N1-C2. Atóm dusíka N1 vykazuje sp 2 hybridizáciu, o je evidentné z hodnoty sútu troch väzbových uhlov okolo atómu N1 

(358,4 (2)°). Tieto fakty sú v súlade s tvrdením, že dochádza ku konjugácii voného elektrónového páru na atóme N1 so 

susednou karbonylovou skupinou C2 = O21, ktorej väzbová vzdialenos je dlhšia ako je typická vzdialenos tejto skupiny. 

Túto skutonos si môžeme vysvetli práve participáciou atómu kyslíka O21 na inermolekulovej vodíkovej väzbe O22— 

H22A···O21 i (Tabuka 5). Okrem tejto vodíkovej väzby v kryštálovej štruktúre sa pozorovali aj inermolekulové vodíkové 

väzby na ktorých sa zúastuje molekula vody s atómami kyslíka O22 a O23. Takto spojené molekuly tvoria nekonené 

reazce v smere osi b (Obr. 3). 




- 103 - 


11. - 14. 10. 2010

Záver 

Obr. 2. Molekulová štruktúra zlúeniny (I) s oznaením atómov 

Obr. 3. Pozorované intermolekulové vodíkové väzby pozdž osi b v základnej bunke kryštálu 

Dosiahnuté výsledky, ktoré boli získané vyriešením kryštálovej a molekulovej štruktúry pomocou röntgenoštruktúrnej 

analýzy novozosyntetizovaných derivátov môžeme v krátkosti zhrnú do nasledujúcich bodov: 

- centrálny šeslenný kruh N1-C5-C6-C7-C8-C9 nie je planárny a vykazuje vo väšine prípadoch stolikovú konformáciu a 

vo zvyšných prípadoch má obálkovú konformáciu. 

- pälenný N1-C2-C3-C4-C5 oxopyrolidínový kruh nie je vo väšine prípadoch planárny, ale tiež vykazuje obálkovú 

konformáciu. 

- džky väzieb N1-C5 a N1-C9 sú približne rovnaké, pretože dochádza ku konjugácii voného elektrónového páru na atóme 

N1, ktorý je v sp2 hybridizácii. 

- v kryštálových štruktúrach dominujú intermolekulové O-H...O vodíkové väzby 

- karbonylová skupina C2=O je v dôsledku participácii atómu O1 na intermolekulových vodíkových väzbách o nieo dlhšia 

ako je jéj typická džka. 

Autori akujú Grantovej agentúre Ministerstva školstva Slovenské republiky (grant ísla 1/0161/08) za finannú podporu, 

táto práca bol podporovaná Agentúrou na podporu vedy a techniky na základe zmluvy APVV-0210-07. 

LITERATÚRA 

[1] P. Sears, C.H. Wong, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38 (1999) 2300. 

[2] T.D. Heightman, A. Vaella, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38 (1999) 750. 

[3] S. Medda, P. Jaisankar, R.K. Manna, B. Pal, V.S. Giri, M.K. Basu, J. Drug. Target. 11 (2003) 123. 

[4] S. Gerber-Lemaire, L. Juillerat-Jeanneret, Mini-Rev. Med. Chem. 6 (2006) 1043. 

[5] Y. Liu, H.-Y. Hu, Q.-J. Liu, H.-W. Hu, J.-H. Xu, Tetrahedron 63 (2007) 2024. 

[6] S.P. Gupta, A.N. Mathur, A.N. Nagappa, D. Kumar, S. Kumaran, Eur. J. Med. Chem. 38 (2003) 867. 

[7] L.L. Gundersen, A.H. Negussie, F. Rise, O.B. Ostby, Arch. Pharm. (Weinheim) 336 (2003) 191. 




- 104 - 


11. - 14. 10. 2010

[8] S. Teklu, L.L. Gundersen, T. Larsen, K.E. Malterud, F. Rise, Bioorg. Med. Chem. 13 (2005) 3127. 

[9] H. Kubo, J. Kobayashi, K. Higashiyama, J. Kamel, Y. Fujii, S. Ohmiya, Biol. Pharm. Bull. 23 (2000) 1114. 

[10] A. Guarna, E.G. Occhiatro, F. Machetti, A. Trabocchi, D. Scarpi, G. Danza, R. Mancina, A. Comerci, M. Serio, Bioorg. 

Med. Chem. 9 (2001) 1385. 

[11] G.S. Harris, J.W. Kozarich, Curr. Opin. Chem. Biol. 1 (1997) 254. 

[12] A. Schmid, G. Romey, J. Barhanin, M. Lazdunski, Mol. Pharmacol. 35 (1989) 766. 

[13] P. Polster, B. Christophe, M. Van Damme, A. Houlliche, P. Chatelain, J. Pharm. Exp. Ther. 255 (1990) 593. 

[14] P. Šafa, J. Žúžiová, Š. Marchalín, N. Prónayová, . Švorc, V. Vrábel, S. Comesse, A. Daich, Tetrahedron Asymmetry, 

21 (2010) 623. 

[15] Oxford Diffraction. CrysAlis CCD and CrysAlis RED. Oxford Diffraction Ltd, Abingdon, Oxfordshire, England, 2006. 

[16] G.M. Sheldrick, Acta Cryst. A64 (2008) 112. 

[17] M. Nardelli, PARST, A System of Computer Routines for Structure Analysis, University of Parma, Italy, 1984. 

[18] K. Brandenburg, DIAMOND (Version 2.1e.). Crystal Impact GbR, Bonn, Germany, 2001. 

[19] F.H. Allen, O. Johnson, G.P. Shields, B.R. Smith, M. Towler, J. Appl. Cryst. 37 (2004) 335. 

[20] D. Cremer, J.A. Pople, J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 1354. 

[21] M. .Nardelli, Acta Cryst. C39 (1983) 1141. 




- 105 - 


11. - 14. 10. 2010

ŠTÚDIUM MOŽNOSTI VYUŽITIA AFINITNEJ CHROMATOGRAFIE S IMOBILIZOVANÝMI IÓNMI KOVU 

NA FRAKCIONÁCIU HUMÍNOVÝCH LÁTOK 

RADOSLAV HALKO*, KATARÍNA KROVÁ, LUCIA KOZÁKOVÁ a MILAN HUTTA 

Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta UK v Bratislave, Mlynská dolina CH-2, 842 15 BRATISLAVA 

e-mail: halko@fns.uniba.sk 

Úvod 

V súasnosti pri izolácii, frakcionácii a charakterizácii humínových látok (HL) sa využívajú viaceré analytické 

separané metódy. Významnú úlohu v tejto oblasti hrajú chromatografické separané metódy, z ktorých najširšie uplatnenie 

našla gélová chromatografia (SEC) [1]. Menej zriedkavým prístupom na frakcionáciu HL je využitie kvapalinovej 

chromatografie v systéme obrátených fáz (RP-HPLC) [2]. Jednou z potenciálnych možností je aj využitie afinitnej 

chromatografie s imobilizovanými iónmi kovu (IMAC) [3]. V IMAC, separaný mechanizmus je založený na špecifických 

interakciách medzi molekulami analytu v roztoku a iónmi kovu naviazanými na vhodné funkné skupiny nepohyblivej fázy. 

Molekuly analytov sú potom separované poda ich rozdielnej afinity ku chelatujúcim iónom kovov, t.j. ich funkné skupiny 

s elektrodonornými vlastnosami majú schopnos vytvára koordinané komplexy s iónmi kovov. Podmienkou IMAC 

separácie je, aby funkné miesta analyzovanej molekuly vytvárali s imobilizovanými iónmi kovu dostatone stabilné 

komplexy. Vzhadom na to, že štruktúra HL pozostáva z množstva funkných skupín (napríklad karboxylové, fenolové, 

aminoskupiny, at.), HL môžu poskytova miesta pre naviazanie iónov kovu a tým spajú spomenutú podmienku separácie 

látok v IMAC metóde. Vaka tomu, našla IMAC uplatnenie aj pri separácii a charakterizácii humínových látok. 

Cieom tejto práce bolo štúdium možností využitia IMAC metódy na frakcionáciu HL. Pre tento výskum bol zvolený 

model hlinitých iónov naviazaných na dve chelatotvorné ligandové skupiny: 1. kyselinu salicylovú (Salicyl) a 2. kyselinu 

dietyléntriamíntetraoctovú (DTTA). 


Všetky vodné roztoky boli pripravené v demineralizovanej vode (Labconco, USA). Vodné octanové tlmivé roztoky s 

rôznymi hodnotami pH boli pripravené z 99% (v/v) kyseliny octovej (Merck, Darmstadt, Nemecko), z ktorej bol pripravený 

vodný roztok s koncentráciou 0,1 mol l -1 . Požadované pH bolo upravené titráciou s 25% (v/v) roztokom amoniaku (Merck) 

a odmerané na pH-metry WTW InoLab pH 730 (Wellhelm, Nemecko). 0,1 mol l -1 vodný roztok Al(III), okyslený 1 ml 0,01 

mol l -1 roztokom HCl (Merck), bol pripravený z Al(NO 3) 3.9H 2O (Lachema, Brno, R) do 250 ml umelohmotnej nádoby. 

Sorpné charakteristiky Al(III) iónov pre chelataný sorbent boli merané dynamickou metódou pomocou peristaltickej 

pumpy PCR 01 a fotometra VD 104, VIS detektor (Labeco, Spišská Nová Ves, SR) s on-line pokolónovou 

spektrofotometrickou detekciou použitím chelataného inidla SPADNS (Lachema), ktoré s Al(III) vytváralo ervenofialový 

komplex v molovom pomere 1:1 ( max = 587 nm). Pracovný postup bol nasledujúci: 1. naplnenie (približne 200-250 mg 

sorbentu); 2. ekvalibrácia chromatografickej kolóny (5 ml vody a 10 ml octanového tlmivého roztoku); 3. imobilizácia iónov 

kovu (10 ml roztoku hlinitej soli); 4. on-line pokolónová derivatizácia (SPADNS) a 4. regenerácia kolóny 10 ml 0,05 mol l -1 

roztoku EDTA (Lachema, Brno, R). Na naplnenie chelataným sorbentom Iontosorb Salicyl resp. Iontosorb DTTA 

(Iontosorb, s.r.o., Ústí nad Labem, R) boli použité sklenené chromatografické CGC kolóny (30 x 3 mm, Tessek, Praha, 

R). 

Na prípravu pracovných štandardov humínových kyselín boli použité vzorky humínových kyselín (HK): 1. štandard HK 

Aldrich (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemecko) a 2. HK izolované z rašeliny z oblasti Cerová, SR. Odvážené množstvo 10 mg 

vzorky HK Aldrich na analytických váhach AR 0640 (Ohaus, USA) sme rozpustili v 10 ml demineralizovanej vody. 

Odvážené množstvo 10 mg HK Cerová sme vzhadom na jej nižšiu rozpustnos vo vode rozpustili v 10 ml octanového 

tlmivého roztoku (pH = 3,0) a pridali 2 ml 0,5 mol l -1 NaOH. Takto pripravené vzorky boli homogenizované 5 min 

v ultrazvukovej vani UCM 9 (Ecoson, Nové Mesto nad Váhom, SR) a následne boli ich tuhé asti oddelené v centrifúge 

Janetzki T30 (Lipsko, Nemecko). Vodná as zmesi bola odobraná a prefiltrová cez 32 mm diskový filter s priemerom pôrov 

0,2 m (Acrodisc, Pall, USA). Takto upravená vzorka bola použitá pre IMAC merania. 

Chromatografické analýzy boli robené na HPLC systéme Elite LaChrom (Merck–Hitachi, Darmstadt, Nemecko), ktorý 

sa skladal z nasledujúcich zariadení: L-2130 pumpa s kvartérnym nízkotlakovým gradientom s odplyovaom rozpúšadla, 

L-2200 automatický dávkova vzoriek, L-2455 DAD spektrofotometrický detektor, L-2300 termostat, organizér a PC 

s chromatografickým softvérom EZChrom Elite 3.1.7. 


V IMAC metóde má najväší vplyv na separáciu látok typ použitého chelataného sorbentu, imobilizovaného iónu kovu 

ako aj pH eluného prostredia. Vzhadom na to, že afinita komplexotvorných funkných skupín analytu ku imobilizovaným 




- 106 - 


11. - 14. 10. 2010

iónom kovu môže by ovplyvnená aj typom chelatotvorného ligandu, bolo v prvom kroku dôležité vybra vhodný 

chelatotvorný ligand. Pokia by boli ióny kovu príliš silne imobilizované na nepohyblivú fázu, znížila by ich schopnos 

interagova s funknými miestami analytu. Naopak, ak by boli ióny kovu slabo viazané, mohli by sa uvoni s nepohyblivou 

fázou do roztoku pohyblivej fázy. V našom prípade sme sa rozhodli použi chelatané sorbenty Iontosorb DTTA a Iontosorb 

Salicyl. Iontosorb DTTA obsahuje dietyléntriamíntetraoctovú kyselinu, zatia o Iontosorb Salicyl obsahuje salicylovú 

skupinu viazanú cez azo skupinu . Obe chelatané ligandy sú kovalentne naviazané na boných reazcoch perlovej celulózy 

(obr. 1). 

A) B) 

Celulóza 

Celulóza 

Obr. 1. Štruktúra chelataných sorbentov: A) Iontosorb DTTA a B) Iontosorb Salicyl 

Koncentrácia aktívnych funkných skupín sorbentu Iontosorb DTTA je 0,4 mmol g -1 a sorbentu Iontosorb Salicyl je 0,2 

mmol g -1 . Obe chelatotvorné ligandy majú vysokú selektivitu k iónom kovov ako sú Cu(II), Co(II), Ni(II), Fe(III) a Al(III). 

Tieto chelatotvorné ligandy boli vybrané aj z dôvodu, že ich funkné skupiny sa prirodzene vyskytujú v humínových 

látkach. Tento prístup môže reprezentova model mobilizácie iónov kovu vyskytujúceho sa v HL v prírodných systémoch. 

V alšej fáze optimalizácie metódy bol skúmaný vplyv pH prostredia na imobilizáciu hlinitých katiónov na 

nepohyblivú fázu. Hlinitý katión sme si zvolili z dôvodov, že hliník je najastejšie sa vyskytujúci kovový prvok v zemskej 

litosfére a Al(III) ióny sú schopné interagova s HL za vzniku komplexných zlúenín (majú vysokú hodnotu nábojovej 

hustoty a relatívne nízky sklon k vytváraniu kovalentných interakcií). Zárove chelát Al(III)-salicyl má vysokú hodnotu 

konštanty stability (log = 14,1). V prípade DTTA sa nám v literatúre nepodarilo nájs jej hodnotu, ale podobný chelát 

Al(III)-dietyléntriamínpentaoctovej kyseliny (DTTA) má hodnotu log = 18,5. 

Vzhadom na to, že sa nám v literatúre nepodarilo nájs hodnoty sorpných kapacít nami zvolených sorbentov pre 

hlinitý ión, uskutonili sme experimenty založené na meraní prienikových kriviek hliníka v závislosti od zmeny pH eluného 

inidla (rozsah pH hodnôt od 3,0 do 7,0). Na kvantitatívne stanovenie Al(III) iónov sme kvôli jednoduchosti použili on-line 

pokolónovú derivatizáciu so selektívnym chelatotvorným inidlom SPADNS, ktoré s hliníkom vytvára erveno-fialový 

komplex v pomere 1:1. Na detekciu chelátu Al(III)-SPADNS sme použili jednoduchú fotometrickú detekciu pri 587 nm. Pri 

meraniach sme použili sklenené CGC kolóny, ktoré sme plnili na sucho zvolenými sorbentami (približne 200 - 250 mg 

sorbentu). 

A) B) 

Obr. 2. Sorpné kapacity sorbentov 

A) Iontosorb DTTA a B) Iontosorb Salicyl pre Al(III) pri rôznych hodnotách pH prostredia 




- 107 - 


11. - 14. 10. 2010

Z nameraných prienikových kriviek sme následne vypoítali sorpné kapacity zvolených sorbentov pre hlinité ióny 

v závislosti od pH eluného prostredia. Z vypoítaných hodnôt a priebehu prienikových kriviek (obr. 2) vyplýva, že sorpná 

kapacita sorbentu Iontosorb DTTA pre hlinité ióny sa zvyšuje so zvyšujúcou sa hodnotou pH eluného prostredia. Najvyššia 

sorpná kapacita DTTA sa dosiahla pri hodnote pH = 7,0. V prípade sorbentu Iontosorb Salicyl, najviac hliníka sa nám sa 

nám nasorbovalo pri hodnote pH = 6,0. Následne sme si tieto hodnoty pH eluného inidla (pH 7,0 pre DTTA a pH 6,0 pre 

Salicyl) zvolili pre alšie IMAC merania na imobilizáciu hlinitých iónov. 

A) B) 

Obr. 3. Chromatografické záznamy nezadržanej a zadržanej frakcie humínových látok získaných v Al(III)-IMAC 

experimente pri pH = 6,0 s chelataným sorbentom Iontosorb DTTA 

A) B) 

Obr. 4. Chromatografické záznamy nezadržanej a zadržanej frakcie humínových látok získaných v Al(III)-IMAC 

experimente pri pH = 6,0 s chelataným sorbentom Iontosorb Salicyl 




- 108 - 


11. - 14. 10. 2010

V alšej asti práce sme študovali vplyv pH eluného prostredia na zadržanie humínových látok na IMAC kolónach so 

zvolenými chelatanými sorbentami. Ako vzorky HL sme si zvolili: 1. štandard HK Aldrich a 2. HK izolované z rašeliny z 

oblasti Cerová, Slovensko. Štandardná IMAC procedúra pozostáva s nasledujúcich piatich krokov: 1. naplnenie 

a ekvalibriácia chromatografickej kolóny; 2. imobilizácia iónov kovu na chelatotvorný ligand; 3. nadávkovanie vzorky HL; 

4. elúcia vzorky a 5. regenerácia IMAC kolóny. Všetky experimenty boli uskutonené na rovnakej 3 cm CGC sklenenej 

kolóne naplnenej jedným zo sorbentov Iontosorb DTTA resp. Iontosorb Salicyl. 

Naše merania sme uskutonili pri troch rôznych hodnotách pH eluného inidla a to pH = 3,0; 6,0 a 8,0. Nezadržanú 

as vzorky HL sme eluovali z IMAC kolóny 5 ml zvoleného tlmivého roztoku. Zadržanú as vzorky sme následne eluovali 

5 ml 0,01 mol l -1 vodného roztokom HCl s pH hodnotou 2,0. 

Pre obidve vzorky HL (Aldrich a Cérová), najväšia as HL sa zadržala pri pH hodnote 6,0, ako v prípade sorbentu 

Iontosorb DTTA resp. Iontosorb Salicyl. Analýza vzoriek HL pri pH hodnote 6,0 je znázornená na chromatografických 

záznamov (obr. 3. A obr. 4). Dá sa predpoklada že humínové látky s vekým potom funkných skupín budú viac 

interagova s iónmi Al(III) pri tejto hodnote pH prostredia. 

Záver 

Rozdielna schopnos humínových kyselín zadržiava sa na nepohyblivej fáze s imobilizovaným Al(III) pri rôznych 

hodnotách pH eluného prostredia bola využitá na navrhnutie IMAC metódy so skokovou zmenou pH pohyblivej fázy. Na 

základe prezentovaných výsledkov môžeme konštatova, že navrhnutá IMAC metóda je vhodná na frakcionáciu humínových 

látok poda ich rôznej afinity ku hlinitým iónom. Získané frakcie môžu by alej charakterizované inými 

chromatografickými metódami resp. deteknými technikami. Využitím týchto analytických prostriedkov bude potom možné 

získa alšie informácie o humínových látkach: ich charaktere, štruktúre, funknosti a možnosti ich alšieho použitia 

v rôznych oblastiach priemyslu, ponohospodárstva a medicíne. Zárove dané štúdium môže slúži ako potenciálny model 

iastkových pôdnych procesov. 

Táto práca vznikla za finannej podpory grantov vedeckej grantovej agentúry Ministerstva školstva SR a Slovenskej 

akadémie vied VEGA 1/0329/10, APVV-0595-07 a VVCE-0070-07. 

LITERATÚRA 

[1] P. Janoš, I. Zatepálková, J. Chromatogr. A 1160 (2007) 160. 

[2] R. Góra, M. Hutta, J. Chromatogr. A 1084 (2005) 39. 

[3] R. Halko, T. Neuroný, M. Hutta, Pol. J. Soil Sci. 42 (2009) 149. 




- 109 - 


11. - 14. 10. 2010

ŠTÚDIUM OFF-LINE ÚPRAVY VZORKY PÓDY METÓDOU DISPERZIE MATRICE NA TUHEJ FÁZE 

(MSPD) PRED RP-HPLC ANALÝZOU VYBRANEJ SKUPINY PESTICÍDOV 

MÁRIA CHALÁNYOVÁ*, IVANA PROCHÁCKOVÁ 

Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra analytickej chémie, Mlynská dolina CH-2, 842 15 

Bratislava 

e-mail chalanyova@fns.uniba.sk 

Úvod 

Súasné trendy naznaujú, že na jednej strane sa urbanizácia vo svete rozširuje, ale na strane druhej sa znižuje plocha 

ornej pôdy. Aby sa udržala úrove ponohospodárskej produkcie je potrebné zabezpei, aby ponohospodárstvo bolo 

životaschopné. Aby sa zabezpeila produkcia kvalitných potravín v dostatonom množstve za dostupné ceny je jedným 

z viacerých dôvodov preo je potrebné analyzova reziduá pesticídov a ich metabolitov v potravinách i v zložkách 

životného prostredia (vzduch, voda, pôda, sedimenty). Prevažná as týchto metód je založená na metódach separaných, 

priom vo väšine prípadov pracujeme s metódami stopovej až ultrastopovej analýzy v komplexných matriciach. Pre 

komplexné matrice je charakteristické, že v kroku uvoovania analytu z matrice sa spolu s analytom uvoujú koextrakty, 

ktoré asto spôsobujú interferenciu s analytickým signálom analytu. V prípade analýzy pôd veký podiel extrahovatených 

látok tvoria humínové látky pozostávajúce z humínových kyselín a fulvokyselín, ktoré sú charakterizované ako amorfné, 

aromatické silne sfarbené polyelektrolyty so širokou distribúciou mólových hmotností. Stanoveniu pesticídov v zložkách 

životného prostredia v pevných vzorkách analytickej koncovke predchádza úprava vzorky pozostávajúca z viacerých 

krokov ako je príprava vzorky , uvonenie analytov z matrice, istenie alebo úprava kvapalného extraktu (zakoncentrovanie 

alebo redukcia objemu extraktu), rozpustenie analytu v rozpúšadle alebo zmesi rozpúšadiel vhodnom pre HPLC analýzu, 

samotná HPLC analýza, vyhodnotenie nameraných výsledkov merania a ich interpretácia. 

Herbicídy (atrazín, simazín, metoxuron, propazín a terbutrín) sa používajú na nienie burín. Cloquintocet-mexyl patrí 

medzi herbicídne safenery [2]. Sú to prídavné látky k herbicídom, ktoré cielene pôsobia na nežiaduce rastliny [3]. Z tejto 

skupiny pesticídov atrazín je od 1. augusta 2005 zakázané používa na základe rozhodnutia Európskej komisie 2004/248/EC 

nakoko medzinárodná agentúra pre výzkum rakoviny (IARC) ho klasifikuje ako možný karcinogén. 

Insekticídy sú prípravky urené na hubenie hmyzu v jeho rôznych vývojových štádiách [4]. Do tejto skupiny patria i 

syntetické pyretroidy (cypermetrín a permetrín), ktoré patria medzi široko používané úinné insekticídy. V minulosti sa 

predpokladalo, že sú málo toxické voi cicavcom, o sa pripisovalo obmedzenej absorpcii niektorých pyretroidov a ich 

rýchlej biodegradácii peeovými enzýmami. Nové štúdie však spájajú leukémiu a rakovinu lymfatických uzlín s 

pyretroidmi. Dlhodobé vystavenie udského organizmu úinkom pyretroidov môže naruši životne dôležité metabolické 

procesy, ktoré prebiehajú v peeni [5]. 

Izolácia pesticídov z pôd predstavuje komplexný analytický problém. Zložitos problematiky analýzy rezíduí pesticídov 

vyplýva z rôznorodosti ich fyzikálno-chemických vlastností, stopovej až ultrastopovej koncentrácie a z rôznorodosti matrice 

[6]. Metóda disperzie matrice na tuhej fáze (Matrix Solid Phase Dispersion MSPD) bola publikovaná Barkerom v roku 

1989 a poas posledných rokov si našla významné miesto medzi úpravnými technikam. MSPD je založená na zmiešaní 

tuhej vzorky so sorbentom. Pri homogenizovaní sa využívajú mechanické sily vytvárané trením vzorky so sorbentom, priom 

sa rozruší matrica vzorky a disperguje sa na povrch sorbentu. Z takto upravenej zmesi vznikne špecifický chromatografický 

materiál, ktorý sa naplní do kolóny [7]. Proces MSPD ovplyvuje viacero faktorov ako: použitý sorbent, charakter matrice 




- 110 - 


11. - 14. 10. 2010

vzorky, pomer hmotností vzorky a sorbentu, použité extrakné inidlo, modifikátory matrice, miešanie vzorky s 

modifikátormi (kyselinami, zásadami, konzervanými prísadami). Z práce autorov [8], ktorí sa zaoberali metódou MSPD 

vyplynuli tieto závery: vekos pórov sorbentu nemá významný vplyv na úinnos MSPD, ale vekos astíc vzorky je vemi 

dôležitým faktorom. astice s vekosou do 20 μm môžu spôsobi predženie asu extrakcie a zníženie prietokovej rýchlosti 

cez MSPD kolónu. Optimálna vekos astíc vzorky je 40-60 μm [12,13]. Barker [10] odporúa pomer hmotností 

vzorka:sorbent 1:4. V niektorých prípadoch je optimálny pomer hmotností vzorka:sorbent 1:1. Prídavok kyseliny, zásady 

alebo chelátotvorného inidla môže ovplyvni istiaci alebo eluný krok v MSPD, v závislosti od charakteru analytu. MSPD 

sa využíva pre širokú škálu aplikácií v multireziduálnej analýze [9], pri analýze rastlinných, biologických, potravinárskych 

vzoriek, lieiv, pesticídov a potravín [10,11]. Použitie MSPD má výhody ako skrátenie doby potrebnej na úpravu vzorky, 

nezanedbatenou výhodou je nízka spotreba organických rozpúšadiel v izolanom a prípadne istiacom kroku úpravu 

vzorky, ktoré môžu by spojené do jedného kroku [10]. 

Príspevok poskytuje prehad výsledkov, ktoré vyplynuli zo štúdia off-line prístupu úpravy vzorky pôdy metódou 

disperzie matrice na tuhej fáze (MSPD) zameraným na elimináciu koextraktov pred RP-HPLC analýzou vybranej skupiny 8 

pesticídov v pôdach ktoré patria do skupiny herbicídov a insekticídov. 


Chemikálie 

Atrazín (99,5 %, Novartis), Simazín (98 %, VÚCHT, Bratislava, SR), Propazín (98 %, VÚCHT, Bratislava, SR), 

Terbutrín (98 %, VÚCHT, Bratislava, SR), Metoxuron (99,4 %, Dr. Ehrenstorfer GmbH, Augsburg, Nemecko), 

Cloquintocet-mexyl (99,5 %, Ciba Geigy, Ltd.),Cypermetrín (95,8%, Riedel-de Haën, SRN) a Permetrín (97,3%, Riedel-de 

Haën, SRN) boli použité ako štandardy pesticídov. Ako extrakné inidlo a organický modifikátor v mobilnej fáze bol 

použitý metanol HPLC grade, Merck, SRN. Na úpravu pH mobilnej fázy bol použitý tlmivý roztok obsahujúci NaH2PO4 a 

Na2HPO4 p.a. (LaChema Brno, R) pripravený v ultraistej vode z istiaceho systému Labconco (Water, Pro-PS, Labconco, 

Cansas City, USA). Sorbent Silikagél L 40/100 (Lachema, Brno, R). 

Prístroje 

Extrakty boli analyzované na kvapalinovom chromatografe Lichrograph (Merck – HITACHI, Darmstadt, SRN) s UV- 

VIS detektorom Model L-4250 (Merck – HITACHI, Darmstadt, SRN) pri vlnovej džke 235nm. Extrakty analytov boli 

separované na analytickej kolóne Purospher Star RP 18e (50 x 4)mm, 3μm astice (Merck, Darmstadt, SRN). 

Príprava kontaminovanej pôdnej vzorky 

Pôdne vzorky boli kontaminované na koncentrané úrovne 1 a 2,5 μg/g pôdy nasledovným pracovným postupom: 10 g 

pôdy bolo zvlhených 10 ml 100 % metanolu. Do zmesi boli pridané vypoítané objemy štandardnej zmesi 8 pesticídov. 

Pôda bola sušená v tme pri laboratórnej teplote 4 dni. Kontaminované vzorky pôdy boli uchovávané v tmavých 

prachovniciach zabalené v hliníkovej fólii pri izbovej teplote. Nekontaminovaná pôdna vzorka pripavená za rovnakých 

podmienok, bez kontaminácie pesticídmi. 

Disperzia matrice na tuhej fáze MSPD 

Na dno striekaky bolo navážených 0,05 g Silikagélu L 40/100. Na vrstvu sorbentu bola nanesená homogénna zmes 

kontaminovanej pôdy a sorbentu v pomere hmotností 1:1 (0,5 g: 0,5 g). Na takto získaný chromatografický stpec bol 

aplikovaný metanol ako extrakné inidlo. Po zachytení 2; 2,5 a 3 ml frakcií metanolického roztoku bol extrakt odparený na 




- 111 - 


11. - 14. 10. 2010

objem 0,2 alebo 0,5 ml. Odparok bol zriedený na konený objem 0,5 alebo 1 ml tak, aby pomer voda:metanol v získanom 

roztoku bol 1:1 (v/v). Úinnosti extrakcie kontaminovanej pôdy boli porovnané s meraniami s nekontaminovanou pôdou s 

prídavkom zmesi štandardov do extraktov pôdy na rovnakých koncentraných úrovniach ako kontaminovaná pôda. Získané 

extrakty boli analyzované metódou HPLC. 


Optimalizácia podmienok analýzy 

V rámci optimalizácie separaných podmienok sme skúmali vplyv obsahu organického modifikátora (metanolu) a pH 

mobilnej fázy na retenciu študovaných analytov. Na úpravu pH mobilnej fázy bol použitý fosfátový tlmivý roztok v rozmedzí 

pH 2,5-5,5. Z nameraných závislostí vyplynulo, že zmena pH nemá významný vplyv na retenciu študovaných analytov, 

s výnimkou terbutrínu, kde v rozmedzí pH 2,5-4,8 došlo k zmene retenného asu zo 6,6 na 18,3 min. Pri alšom zvyšovaní 

pH nebola pozorovaná zmena retenného asu terbutrínu. Na Obrázku .1 je chromatografický záznam HPLC analýzy 

ôsmich štandardov študovaných pesticídov. Na tomto chromatografickom zázname je vidie, že cypermetrin poskytuje tri 

navzájom neoddelené píky. Signál cypermetrinu bol vyhodnotený ako skupina. Permetrin poskytuje dva oddelené píky trans 

a cis. Pomer foriem trans a cis je 75,5:21,8. Na všetkých nameraných chromatografických záznamoch bol vyhodnotený len 

trans-permetrin. Výažnosti analytov boli vyhodnotené na kalibranú iaru. 

Obrázok . 1 Chromatografický záznam zmesi štandardov 

Experimentálne podmienky: analytická kolóna Purospher Star C18 (50 x 4 mm, I.D., 3 μm vekos astíc), mobilná fáza: 

z metanol:voda (50:50, v/v) do metanol:voda (90:10, v/v) za 35 minút, v=0,5 ml/min, =235 nm, dávkovaný objem 20 μl, 

c=2,5 μg/ml.1-metoxuron, 2-simazín, 3-atrazín, 4-propazín, 5-terbutrín, 6-cloquintocet-mexyl, 7-cypermetrin, 8-transpermetrin. 

Úinnos exrakcie pre techniku disperzie matrice na tuhej fáze 

Z povahy humínových kyselín vyplýva, že sú rozpustné v zriedených roztokoch zásad, kým fulvokyseliny sú rozpustné v 

roztokoch kyselín. Za úelom minimalizácie množstva koextraktov v desorbáte bol ako desorpné inidlo použitý metanol. V 

metanole sa rozpúšajú len himatomelánové kyseliny. O ich percentuálnom zastúpení v humínových látkach sme v dostupnej 




- 112 - 


11. - 14. 10. 2010

literatúre nenašli informácie. Metanol má vysokú elunú silu pre uvonenie študovaných pesticídov zo vzoriek pôd, a preto v 

bol použitý ako desorpné inidlo. Pracovné postupy izolácie, odparenia a doriedenia na definovaný objem boli aplikované 

pre vzorku pôdy MP/20 kontaminovanej pesticídmi na koncentranej úrovni 2,5 μg/g. Rovnako boli uskutonené 

experimenty s nekontaminovanou vzorkou pôdy, kedy extrakt z nekontaminovanej pôdy bol kontaminovaný na rovnakú 

koncentranú úrove ako pôda. U oboch typoch experimentov pre rôzne kombinácie parametrov (objem desorpného inidla, 

objem odparku, konený objem) boli vypoítané úinnosti extrakcie a vyhodnotené vzhadom na kalibrané závislosti. 

Úinnos extrakcie bola poítaná vo všetkých prípadoch z 3 paralelných experimentov. 

Úinnosti extrakcie pre nekontaminovaný extrakt pôdy s prídavkom zmesného štandardu adekvátnemu koncentranej 

úrovni 2,5 μg/g pôdy pre rôzne kombinácie parametrov ako je objem preteeného desorpného inidla cez stpec tuhej 

vzorky zhomogenizovanej so sorbentom, objem odparku a objem dávkovaného analytu sa nachádzajú na Obrázku . 2. Na 

Obrázku .3 sú znázornené úinnosti extrakcie pôdnej vzorky pôdy kontaminovanej na koncentranej úrovni 2,5 μg/g 

v závislosti od parametrov popísaných na Obrázku .2. 

Obrázok . 2 Výažnosti extrakcie nekontaminovanej vzorky pôdy s prídavkom zmesného štandardu do extraktu pôdy pre 

rôzne kombinácie objemov desorpného inidla, objemov odparku a objemov analyzovanej vzorky. 

Experimentálne podmienky: analytická kolóna Purospher Star C18 (50 x 4 mm, I.D., 3 μm vekos astíc), mobilná fáza: 

z metanol:voda (50:50, v/v) do metanol:voda (90:10, v/v) za 35 minút,v=0,5 ml/min, =235 nm, dávkovaný objem 20 μl. 

Obsah pesticídov v extrakte je 1,25 μg. Legenda: 1.údaj- objem desorpného inidla, 2.údaj- objem odparku, 3.údaj- finálny 

objem roztoku analytov 




- 113 - 


11. - 14. 10. 2010

Obrázok . 3 Úinnos extrakcie kontaminovanej pôdy pre rôzne kombinácie objemov desorpného inidla, objemov 

odparku a objemov analyzovanej vzorky 

Experimentálne podmienky vi Obrázok . 3. Kontaminácia pôdy je na koncentranej úrovni c=2,5 μg/g pôdy. Legenda: 

1.údaj- objem desorpného inidla, 2.údaj- objem odparku, 3.údaj- konený objem roztoku analytov 

Z obrázkov . 2 a 3 vyplýva, že najvyššie výažnosti extrakcie analytov boli dosiahnuté extrakciou vzorky pôdy 3 ml 

metanolu s odparením extraktu na objem 0,5 ml so zriedením roztoku vzorky na 1 ml. Za týchto podmienok úinnosti 

extrakcie pre prídavok zmesi štandardov do extraktu nekontaminovanej pôdnej vzorky sa pohybujú v rozmedzí 84-109 % 

a pri extrakcii kontaminovanej vzorky pôdy na 2,5 μg/g sa pohybovali úinnosti extrakcie 

v rozmedzí hodnôt 62-94 %. Na Obrázku . 4 sú chromatografické záznamy kontaminovanej pôdnej vzorky pre koncentranú 

úrove 1,0 a 2,5 μg/g pôdy. Extrakciou pôdnej vzorky 2 ml metanolu odparením na 0,2 ml 

a doriedením na objem 0,5 ml sme dosiahli najnižšie výažnosti. 

Obrázok . 4 Chromatografický záznam kontaminovanej pôdnej vzorky pre koncentrané úrovne 1,0 a 2,5 μg/g pôdy 

Experimentálne podmienky: vi Obrázok . 2. 1-metoxuron, 2-simazín, 3-atrazín, 4-propazín, 5-terbutrín, 6-cloquintocetmexyl, 

7-cypermetrin, 8-permetrin. a- koncentrácia 2,5 μg/g; b- koncentrácia 1,0 μg/g. 




- 114 - 


11. - 14. 10. 2010

Záver 

Pri úprave vzorky pôdy metódou disperzie matrice na tuhej fáze okrem špecifického chromatografického stpca 

pozostávajúceho zo vzorky pôdy homogenizovanej so sorbentom v pomere hmotností 1:1 sa na dno kolóny za sucha 

poklepkávaním plní vrstva sorbentu. Pomer hmotnosti sorbentu ku hmotnosti vzorky pôdy 1:1 vyplynul zo štúdia v práci 

[14]. V dôsledku toho získaný desorbát je íry a nie je potrebné ho pred odparením filtrova alebo centrifugova. Práca je 

zameraná na optimalizáciu extrakných parametrov a to objemu extrakného inidla, objemu zachytenej frakcie, objemu 

odparku, koneného objemu vzorky a prietokovej rýchlosti extrakného inidla. Pri MSPD sa na koncentranej úrovni 2,5 

μg/g úinnosti extrakcie pohybovali pre prídavok zmesného štandardu do extraktu nekontaminovanej vzorky pôdy v 

rozmedzí 84-109 % a pre kontaminovanú pôdnu vzorku 62-94%. Detekné limity pesticídov sa pohybovali v rozmedzí 31- 

87 ng/ml dávkovaného roztoku zmesi analytov. 

Práca vznikla za podpory projektov APVV-0597-07 , VVCE-0070-07, VEGA 1/0870/09. 

Literatúra 

[ 1] http://www.alanwood.net/pesticides , 13:00, 11.10.2008. 

[ 2] http://www.agrocourier.com/bayer/cropscience/cscms.nsf/id/Safener_ 10:00, 20.2.2009. 

[ 3] www.wikipedia.org , 10:00, 30.9.2008. 

[ 4] http://www.beyondpesticides.org/infoservices/pesticidefactsheets/toxic/pyrethroid.htm , 25.3.2005. 

[ 5] J. Garey, M. S. Wolf, Biochemical and Biophysical research communications 251, (1998) 855. 

[ 6] http://www.land.gov.sk/sk/index.php?navID=21&navID2=21&sID=23&id=385 , 16:00, 8.3.2009. 

[ 7] M. Kirchner, E. Matisova: Súasné metódy a nové trendy v izolácii reziduí pesticídov z beztukových potravín, Chem. 

Listy 98, (2004) 396405. 

[ 8] S.A. Barker, A.R. Long, in: V.K. Agarwal (Ed.), Analysis of Antibiotic Drug Residues in Food Products of Animal 

Origin, Plenum Press, New York, (1992) 119. 

[ 9] S.A. Barker, LC-GC Int. 11 (1998) 719. 

[10] Steven A. Barker.: Matrix solid-phase dispersion, Journal of Chromatography A, 885, (2000) 115-127. 

[11] G. Karasová, E. Brandšteterová, M. Lachová, Czech J. Food Sci. Vol. 21 (2003) 219. 

[12] S.A. Barker, Chemtech 23 (1993) 42. 

[13]. S.A. Barker, Z.E. Floyd, in: J. Pesek, M. Matyska, R. Abuelafiya (Eds.), Chemically Modified Surfaces: Recent 

Developments, Royal Society of Chemistry, (1996) 66. 

[14] Z. Michaloviová, Diplomová práca, Prif UK Bratislava (2005). 




- 115 - 


11. - 14. 10. 2010

SIMULTANOUS DETERMINATION OF GALACTITOL AND GALACTOSE IN AQUEOUS SAMPLES BY GAS 

CHROMATOGRAPHY – MASS SPECTROMETRY 

IVAN OSTROVSKÝ*, RÓBERT KUBINEC, JAROSLAV BLAŠKO, JOZEF VIŠOVSKÝ, RENÁTA GÓROVÁ, 

GABRIELA ADDOVÁ, PETER PODOLEC, ALEXANDRA SZABÓOVÁ 

Chemical Institute, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Mlynská dolina CH-2, SK-845 45 Bratislava, Slovakia 

e-mail: ostrovsky@rec.uniba.sk 

Abstract 

Galactosemia, a metabolic disorder associated with the intolerance of dietary galactose due to an inherited enzymatic 

deficiency, is indicated by heightened levels of galactose and galactitol in urine. Gas chromatography (GC) with mass 

spectrometry (MS) detection was evaluated for its ability to screen urinary carbohydrates, particularly galactose and 

galactitol. The described method uses trimethylsilyl derivates of galactitol and galactose, and needs 100 l of urine for a 

single run. Spontaneous urine was obtained from 25 healthy subjects (classified into 5 age groups), from 4 treated patients 

with classical galactosaemia. The age dependences of galactose and galactitol excretion in urine was found in healthy 

subjects and treated galactosaemic patients by using reported method. 

Recognizing the clinical need for the simultaneous measurement of galactitol and galactose in urine for galactosaemic 

subjects, we developed the new GC/MS method, permits for the first time, measurement in urine by an accurate and precise 

single step procedure. This method does not require urine pretreatment before the silylation. 

Introduction 

Metabolism is the sum of all continuous biochemical reactions of breakdown and renewal of tissues of the body. 

Enzymes play an indispensable role in facilitating the process by serving as catalysts in the conversion of one chemical 

(metabolite) to another, often extracting the energy required for the reaction from a suitable high energy source, such as ATP 

[1]. 

Figure 1 shows the various possible mutation–sensitive defects affecting the compartmentalization and metabolism of 

compound A. This figure shows schematically the relationship between various defect types and their pathophysiologically 

and diagnostically important consequences [1]. 

Membrane 

1 

2 

Holoenzyme 

Aoutside Ainside B C 

E 

6 

Fig. 1. The primary consequences of inborn errors of metabolism. 

1–transporter-mediated movement of A from one compartment to another, 2–defect in the conversion of B to C, 3–increased 

conversion of B to D caused by accumulation of B, 4–defect in the interaction between an apoenzyme and an obligatory 

cofactor, 5–decreased feedback inhibition of the conversion of Ain to B as a result of deficiency of C, 6–secondary inhibition 

of the conversion of E to F caused by accumulation of D [1]. 

D 

5 

- 

F 

4 

Apoenzyme 

+ 

cofactor 

“Inborn metabolic diseases” (IMDs) is the term applied to genetic disorders caused by loss of function of an enzyme. 

Enzyme activity may be low or lacking for variety of reasons. Some IMDs produce relatively unimportant physical features 

or skeletal abnormalities, but others produce serious diseases and even death. Most inborn errors of metabolism are 

monitored by blood or urine tests [2]. The phrase “inborn errors of metabolism” had been first used by A. E. Garrod in the 

Croonian Lectures of 1908, and published as a monograph with this title in 1909 [3]. 

Traditionally the IMDs are categorized as disorders of carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, organic acid 

metabolism, or lysosomal storage diseases [4]. 

Galactosemia was first "discovered" in 1908, when Von Ruess reported on a breast-fed infant with failure to thrive, 

enlargement of the liver and spleen, and "galactosuria" in publication entitled "Sugar Excretion in Infancy". This infant 

ceased to excrete galactose through urine when milk products were removed from the diet. The toxic syndrome, 

galactosemia, is associated with an intolerance to dietary galactose as a result of certain enzymatic deficiencies [5]. 

Malfuctions in the following three enzymes, which participate in the normal metabolism of galactose (Fig. 2), are known to 

be causes of galactosemia: galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT), galactokinase and uridine diphosphate- 




- 116 - 


11. - 14. 10. 2010

galactose-4-epimerase [6, 7]. First described in a variant patient in 1935 by Mason and Turner, galactose-1-phosphate 

uridyltransferase (GALT) deficiency is the most common enzyme deficiency that causes hypergalactosemia. Removal of 

lactose largely eliminates the toxicity associated with newborn disease, but long-term complications routinely occur, as 

reported by Komrower and Lee in 1970 and then delineated in a 1990 retrospective survey by Waggoner et al [8]. Inborn 

errors of metabolism are categorized according to defects in these enzymes as: type I (classical, galactose-1-phosphate 

uridyltransferase deficiency), type II (galactokinase deficiency) and type III (uridine diphosphate-galactose-4-epimerase 

deficiency) galactosemias, respectively. 

Increased galactitol concentration is a common feature in GALT deficiency and has been implicated in galactosaemic 

cataract formation. As conversion of galactose to galactitol by aldose reductase represents a dead–end metabolic pathway, 

galactitol removal is confined to renal excretion. The recently observed age–dependent decrease of endogenous galactose 

formation in galactosaemic patients shows that correlative changes in galactitol excretion occur in galactosaemia [5]. 

Classical galactosemia (GALT deficiency), an autosomal recessive disorder occurs in the population with an incidence of 

approximately 1:40–60 000. Galactose-1-phosphate, a metabolite derived from ingestion of galactose, is considered to be 

toxic in several tissues particularly in the liver, brain and renal tubules [9]. 

Galactose is a monosaccharide present in many polysaccharides, where the most clinically important source is the 

disaccharide lactose. Lactose is the predominant carbohydrate in human milk and milk of most animals, including cow’s 

milk, therefore many commercially available infant formulas contain lactose. 

Galactose 

ATP 

Galactokinase 

ADP 

Galactose-1-phosphate 

Galactose 1-phosphate 

uridylyl transferase 

Glucose-1-phosphate 

Glucose-6-phosphate 

Phosphoglucomutase 

UDPglucose 

UDPgalactose 

UDP-galactose 

4-epimerase 

Glycolysis 

Fig. 2. Major steps in the intermediary metabolism of galactose. 

There are several well established derivatization methods [10], for sugar identification and quantification either with 

high–performance liquid chromatography (HPLC) [11, 12], with enzymatic [13] and with gas chromatographic (GC) [14 – 

17] procedures. All these methods are time consuming and suffer numerous limitations [18]. 

The most important technique for carbohydrate structural determination is GC–MS. The first application of GC to 

carbohydrates was reported in 1958 and it described the separation of fully methylated monosaccharides [19, 20]. 

Monosaccharide analysis by GC (with FID or MS detection) requires derivatization to increase their volatility and decrease 

their excessive interactions with the analytical system. The simplest and most rapid method for routine analysis is silylation 

to trimethylsilyl (TMS) derivates [18]. 

GC faced problems of multiple peaks due to the anomers of cyclic forms [21] and long reactions times and multiple 

steps sample preparation [22, 23, and 24]. The multiple peak problems was solved by reduction of the C1 position of the 

acyclic form to alditols or by means of oxime formation with hydroxylamine prior to the derivatization step [23, 24, 25, 26] 

as published in the early studies of Sweeley et al. [27]. Reduction to alditols has the advantage that each sugar generates only 

one peak, while trimethylsilyl (TMS) oximes give 2 peaks, but hydroxylamine reactions are more selective. Alditols 

preparation also include cation-exchange steps and boric acid removal [22], whereas in the TMS-oxime preparation, all 

reactions are consecutively carried out in the same vial. 

This report describes the presence of both galactitol and galactose in urine from galactosaemic as well as normal 

subjects. 

Experimental 

Patients 

Spontaneous urine was obtained from 25 healthy subjects (classified into 5 age groups) and from 4 patients treated with 

classical galactosaemia. 




- 117 - 


11. - 14. 10. 2010

Chemicals 

All chemicals were of analytical reagent grade. Carbohydrate standards (D-glucose, D-fructose, D-mannitol) were 

purchased from Merck (Bratislava, Slovakia) and carbohydrate standards (D-galactose, D-galactitol) were purchased from 

CMS Chemicals (Bratislava, Slovakia). Derivatizations of carbohydrates were performed using hexamethyldisilane (HMDS) 

with trimethylchlorsilane (TMCS) and pyridine as catalyst, all supplied from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). 

Urine samples were obtained from Department of Laboratory Medicine of Comenius University Children´s Hospital, 

Bratislava, Slovakia. 

Sample preparation 

Urine samples from patients were frozen immediately after collection and kept at –20 °C until analyzed. 100 l aliquots 

of each urine sample were taken and were trimethylsilylated with 3 ml silylating reagent HMDS: TMCS: Pyridine in the 

volume ratio of 1: 1: 1 at 70 °C for 70 min. 1 l portion of derivatized sample (model and sample solution) was injected to 

the chromatograph. 

GC – MS analysis 

The analysis was performed on 6890 N/5973 N GC–MS Agilent Technologies (USA) by electron ionization at 70 eV 

using an DB–Dioxin column 60 m x 250 m x 0.25 m (J&W Scientific, Folson, CA, USA). The injector was held at 300 °C 

and was operated in splitless mode. The purge flow of 9.5 ml min -1 was started 2 min after the sample injection. The initial 

column temperature was 90 °C, then the temperature was increased to 250 °C at rate of 10 °C.min -1 , and kept at the final 

temperature of 250 °C for 5 min. High purity helium was used as carrier gas with inlet pressure of 200 kPa. MS data were 

obtained in SIM-mode (m/z–73, 204, 205, 217, 319, 422, 435, 437). Transfer line temperature was 280 °C. Quadrupole 

conditions were as follows: electron energy 70 eV and ion source temperature 230 °C. 

Compound identification was performed by comparison with the chromatographic retention characteristics and mass spectra 

of authentic standards, reported mass spectra and mass spectral library of GC-MS data system. Compounds were quantified 

by SIM peak area, and converted to compound mass using calibration curves of galactitol and galactose. 

Results and discussion 

Figure 3 shows typical GC-MS chromatogram of fructose, glucose, galactose, mannitol and galactitol TMS derivates 

obtained using silylation reagent (HMDS: TMCS: Pyridine: 1: 1: 1). Chromatographic analysis can be accomplished in less 

than 16 min, without loss of resolution between critical pairs. 

Abundance 

25000000 

20000000 

15000000 

10000000 

5000000 

Fructose 

Mannitol 

Galactitol 

Glucose Galactose 

Galactose 

Glucose 

0 

12 13 14 

Time[min] 

15 16 

Fig. 3. Total ion GC-MS chromatogram of TMS carbohydrate derivatives. 

Due to the and configurations of the OH group on pyrano-ring galactose and glucose yields two major GC peaks, 

whereas fructose produced three GC major peaks due to the and configurations of the OH group on pyrano- and furanorings. 

These isomers are also present in urine samples and are commonly summed to report one value. The mass spectra of 

saccharide with the pyrano-ring (5C) are characterized by the fragment ion of m/z 204 (galactopyranose as trimehtylsilyl, Fig. 

4) and therewith the furano-rings (4C) are characterized by the m/z 437 fragment ion, whereas the fragmentation of alcohol 

saccharides (galactitol and mannitol) are yield the m/z 319 (galactitol as TMS, Fig. 4). 

These three fragments are used as key ions for identification of these two sugars as TMS derivatives. 




- 118 - 


11. - 14. 10. 2010

Abundance 

Abundance 

Abundance 

1x10 6 

8x10 5 

6x10 5 

4x10 5 

2x10 5 

4x10 5 

3x10 5 

2x10 5 

1x10 5 

8x10 3 

6x10 3 

4x10 3 

2x10 3 

m /z 319 A 

G a la c tito l 

0 

12 13 14 

Time [min] 

15 16 

m /z 204 

Galactose 

Galactose 

0 

12 13 14 

Time [min] 

15 16 

m /z 437 

Fructose 

Fructose 

0 

12 13 14 

Time [min] 

15 16 

Fig. 4. SIM GC-MS chromatograms of galactitol (A), galactose (B) and fructose (C) TMS-derivates of untreated patient 

(sample number 78). 

Calibration 

Calibration of galactitol and galactose was done in the range of 1-1000 mg.l -1 , which encompass concentrations, known 

to exist in urine of healthy individuals. The calibrators were treated by the same procedure as described above. 

Typical calibration curves of galactitol and galactose are shown in the Figure 5 . 




- 119 - 

C 

B 


11. - 14. 10. 2010

Abundance 

7,E+08 

6,E+08 

5,E+08 

4,E+08 

3,E+08 

2,E+08 

1,E+08 

0,E+00 

Galactitol m/z 319 

Galactose m/z 204 

y = 653518x - 465286 

R 2 = 0,9997 

y = 183019x - 160264 

R 2 = 0,9995 

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 mg.l -1 

Fig. 5. Calibration curves of galactitol and galactose. 

Quantitation of galactose and galactitol in urine samples from 41 subjects were determined by application of the 

calibration curve and some of the results are presented in Table 1. 

The creatinine level of each sample was determined using the enzymatic method. 

Repeatability 

Repeatability of the proposed analytical procedure was assigned by the relative standard deviation (RSD) of replicate 

measurements. The RSD values ranged from 3.61 to 9.74 %, and demonstrated reasonable repeatability of the method. 

Table 1. The repeatability of the analytical procedure. 

28 

29 

30 

1 2 3 4 5 Average 

RSD 

[%] 

Galactitol 240.5 227.9 213.9 206.9 228.6 223.6 5.9 

Galactose 29.8 30.4 25.9 24.9 27.6 27.7 8.5 

Galactitol 

Galactose 

[mg.l 

31.1 

69.6 

37.5 

72.4 

29.9 

66.5 

31.4 

70.3 

35.3 

65.4 

33.0 

68.8 

9.7 

4.2 

Galactitol 142.0 159.6 163.9 149.1 157.9 154.5 5.7 

-1 ] 

Galactose 

3.2 3.2 3.5 3.2 3.2 3.3 3.6 

Age dependence 

Age dependence of urine concentration of galactitol corrected to creatinine content in healthy subjects is shown in Fig. 

6. The age dependences of urinary galactitol and galactose are very similar. Urinary galactose and galactitol excretion in 

controls is age dependent with higher concentrations at younger age. 

Age dependent experimental data were best fitted to a simple growth-related model assuming an exponential decrease 

with age until adulthood. Among number of growth-related model tested, the best fit was obtained using model, 

x b y a. 

e c 

where y is creatinine corrected concentration of galactitol or/and galactose, x is age in months, and a, b, c are model fit 

parameters. 

Table 2 shows the galactose and galactitol concentrations for the samples of healthy subjects and treated galactosemic 

patients. 

Figure 7 shows a chromatogram of urine from galactosaemic patient demonstrating the presence of the two metabolites. 

The peaks were identified by their fragmentation pattern and corresponding position of standards added to the urine sample. 

Although the compounds are present in urine of healthy persons, the peak abundances in the chromatograms are high in 

samples of galactosaemia, which fact can serve as a new way of diagnosing and monitoring of affected patients. 




- 120 - 


11. - 14. 10. 2010

Galactitol [mmol/mol creatinine] 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

0 

24 

48 

72 

96 

120 

144 

168 

192 

Age at month 

Fig. 6. Age-dependence of urinary excretion of galactitol in healthy subjects. Metabolite concentrations were calculated as 

concentrations corrected to creatinine content. 

Sample 

Table 2: Galactose and galactitol concentrations of the samples. 

Galactitol 

[mg.l -1 ] 

Galactose 

Creatinine 

Galactitol 

216 

240 

Galactose 

[mmol.mol -1 

creatinine] 

1 8.6 136.2 1.1 43.6 688.0 

2 17.7 190.4 1.7 57.8 622.4 

3 14.1 26.2 1.2 65.5 121.4 

4 8.2 12.9 1.0 45.5 71.6 

5 5.8 12.4 1.0 32.0 68.7 

6 19.4 35.6 2.3 46.9 85.9 

7 11.2 1.0 1.2 51.8 4.5 

8 10.3 16.4 1.4 40.9 65.0 

9 33.0 28.7 4.6 39.8 34.7 

10 11.6 10.2 1.5 43.1 37.8 

11 19.8 28.5 7.1 15.5 22.3 

12 5.8 2.6 1.9 17.0 7.6 

13 32.2 36.3 7.5 23.8 26.9 

14 14.2 27.2 5.3 14.9 28.5 

15 11.0 3.3 3.2 19.0 5.7 

28* 116.1 15.6 2.2 293.1 39.3 




- 121 - 

264 

288 

312 

Age group 

[month] 

0 - 1 

1 - 12 

12 - 24 


11. - 14. 10. 2010

Conclusion 

Sample Galactitol Galactose Creatinine Galactitol Galactose Age group 

[mg.l -1 ] 

[mmol.mol -1 

creatinine] 

16 7.2 17.1 2.3 17.5 41.3 

17 25.3 61.3 11.9 11.8 28.6 

18 19.5 31.6 7.6 14.3 23.1 

19 11.0 18.1 3.9 15.7 25.8 

20 21.8 31.7 7.1 17.0 24.8 

29* 183.2 25.9 7.7 132.2 18.7 

30*1* 142.0 3.2 2.8 282 6 

21 12.9 25.5 7.4 9.6 19.1 

22 9.2 18.7 6.3 8.1 16.5 

23 26.6 41.4 18.4 8.0 12.5 

24 36.9 45.5 21.6 9.5 11.7 

25 35.7 59.7 21.0 9.4 15.8 

28* 1* 240.5 29.8 10.2 131 16 

* galactosaemic treated patients 

Abundance 

6000000 

5000000 

4000000 

3000000 

2000000 

1000000 

Galactitol 

Galactose 

[month] 

24 - 180 

180 and more 

Galactose 

0 

12,0 12,5 13,0 13,5 14,0 14,5 15,0 15,5 16,0 

Time [min] 

Fig. 7. TIC GC – MS chromatogram of untreated galactosaemic patient (sample number 78). 

Analysis of galactitol and galactose in spontaneous urine samples using a GC-MS analytical method was demonstrated. 

The results of this study show that GC-MS has a potential to serve as a rapid, high throughput technique with low sample 

requirement for screening and monitoring of the metabolic disease galactosemia. The speed of analysis and the potential 

throughput are particularly appealing advantages of GC over the current techniques. Proposed GC-MS method requires a 

minimal volume for a reliable diagnosis (100 l of urine for a single run). The study has proven that the analysis time can be 

dramatically shortened by direct one step silylation of the aqueous carbohydrate samples with mixture of HMDS, TCMS and 

pyridine. 

These results indicate that GC-MS could serve as a more rapid and less costly alternative for carbohydrate screening 

and monitoring of urine for galactosaemia diagnosis. 

This work was created within the project ITMS 26240220007 „Výskum a vývoj nových technológií chemickej analýzy pre 





- 122 - 


11. - 14. 10. 2010

References 

[1] J.T.R. Clarke, Clinical Guide to Inherited Metabolic Diseases, Port Chester, Cambridge University Press, 2002. 

[2] S. Kavitha, S.N. Sarbadhikari, N.R. Ananth: J. of Health and Allied Sciences, 5 (3) 2006. 

[3] H.E. Sutton, Encyclopedia of molecular medicine, Copyright by John Wiley & Sons, Inc, 2002. 

[4] http://en.wikipedia.org/wiki/Inborn-error-of-metabolism 

[5] J. Schadewaldt, S. Killius, L. Kamalanathan, H.–W. Hammen, K. Straburger, U. Wendel, J. Inherit. Metab. Dis. 26 

(2003) 459–479. 

[6] C.A. Burtis, E.R. Ashwood, Tietz Textbook of Clinical Chemistry, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 1999. 

[7] C.J. Eastly et al., J. Chromatogr. A 1004 (2003) 29-37. 

[8] G.T. Berry, G.A. Anadiotis, Galactose-1-phosphate uridyltransferase deficiency (galactosemia) 

[9] J.B. Holton, J.H. Walter, L.A. Tyfield, in: C. R. Scriver, A. L. Beaudet, W. S. Sly, D. Valle (Eds.), The Metabolic and 

Molecular Bases of Inherited Diseases, McGraw-Hill, New York, 2001, 1553. 

[10] G.E. Black, A. Fox, J. Chromatogr. A 720 (1996) 51–60. 

[11] K.W. Smallow, N.H. Low, J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 1828. 

[12] I. Goodall, M.J. Dennis, I. Parker, M. Sharman, J. Chromatogr. A 706 (1995) 353. 

[13] C.H. Assoland–Vinet, G. Bardeletti, P.R. Coluet, Anal. Lett. 20 (1987) 513. 

[14] M. Martinez, D. Nurokand, A. Zlatkis, Anal. Chem. 50 (1978) 1226. 

[15] J.S. Bonvehi, F.V. Coll, J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 2053. 

[16] R. Mateo, F. Bosh, A. Pastor, J. Chromatogr. 410 (1987) 319. 

[17] I. Molnár-Perl, K. Horváth, Chromatographia 45 (1997) 321–328. 

[18] E. Rojas-Escudero et al, J. Chromatogr. A 1027 (2004) 117–120. 

[19] A.G. McInnes, D.H. Ball, F.P. Copper, C.T. Bishop, J. Chromatogr. 1 (1958) 556–560. 

[20] I. Ciucanu, R. Caprita, Anal. Chim. Acta 585 (2007) 81–85. 

[21] I. Martinez-Castro, M.I. Paez, J. Sanz, J. Garcia-Raso, F. Sauracalixto, A. Garcia-Raso, J. of Chromatogr. 389 (1987) 

9–20. 

[22] A.G.W. Bradbury, D.J. Halliday, D.G. Medcalf, J. of Chromatogr. 213 (1981) 146–150. 

[23] I. Molnár-Perl, M. Morvai, J. of Chromatogr. 520 (1990) 201–207. 

[24] I. Molnár-Perl, M. Morvai, D. Knausz, J. of Chromatogr. 552 (1991) 337–344. 

[25] I. Molnár-Perl, M. Morvai, Chromatographia, 34 (1992) 502–504. 

[26] I. Molnár-Perl, Zs. F. Katona, P. Sass, J. of Chromatogr. A 847 (1999) 91–102. 

[27] C.C. Sweeley, R. Bentley, M. Makita, W.W. Wells, J. of Am. Chem. Society, 85 (1963) 2497–2508. 




- 123 - 


11. - 14. 10. 2010

ANALYSIS OF LYSOZYME IN HUMAN SALIVA USING BY OFF-LINE COMBINATION OF PREPARATIVE 

ISOTACHOPHORESIS AND MASS SPECTROMETRY 

MONIKA KONDEKOVÁ*, ANDREA STAOVÁ, JOZEF MARÁK 

Department of Analytical Chemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University in Bratislava 

Mlynská Dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovak Republic 

e-mail: kondekova@fns.uniba.sk 

INTRODUCTION 

In the recent years, there has been visible in a literature an increased interest in the study of saliva. This body fluid 

contains a vast number of protein species, e.g., the salivary peptidome of low molecular weight, comprising approximately 

40-50% of the total secreted proteins, in addition to peptides generated by proteolysis of proteins of different sources. Due to 

the presence of other components, in particular mucins and enzymes, some distinctive requirements and precautions related 

to the sample collection, time of analysis, sample preservation and treatment are necessary to take into account for the 

successful analysis of salivary peptides. More than 2000 peptides compose the salivary peptidome, from which only 400-600 

are directly derived from salivary glands, suggesting an important qualitative peptide contribution of other sources, namely of 

epithelial cells. The interest in saliva analysis has been growing for the clinical purposes, as it is an alternative sample to 

other traditional body fluids (blood, urine) since it involves an easy and noninvasive collection [1]. For example, the study of 

lysozyme secretion rates among patients with mild and severe psoriasis was realized. Lysozyme is a low-molecular-weight 

cationic protein that is synthesized in and continuously released from monocytes or macrophages, and widely distributed in 

human tissues and secretion glands [2]. 

The analysis of high molecular weight compounds present in complex biological samples is a very complicated 

analytical task. There is the large number of separated analytes present in complex matrices and, therefore, also the 

possibility of the occurrence of two or more substances with close retention or migration characteristics. Even using the most 

efficient analytical separation systems, there is a peak overlap, which prevents reliable qualitative and quantitative analysis of 

the compound of interest. This fact means that the successful analytical procedure requires the using of combination of 

powerful separation technique with the sufficiently sensitive and/or selective detection technique, and very often, also using 

an efficient sample preparation. Sample pretreatment techniques play a key role in a trace analysis of analytes present in 

complex biological matrices. 

Capillary isotachophoresis (cITP) is one of the basic modes of capillary electrophoresis (CE) using discontinuous 

electrolytes system, i.e., leading electrolyte (LE) and terminating electrolyte (TE), which determine the mobility interval for 

the migration of analytes from the sample. Unlike other CE techniques, isotachophoretic separation provides the selfsharpening 

effect at the zone boundaries and the inherent concentration capability [3]. After reaching an isotachophoretic 

steady state, the zones of separated analytes are migrating according their effective mobilities with a constant speed. The 

concentration of the analyte in its zone is given by Kohlrausch regulation function and does not depend on the concentration 

of the analyte in the injected sample. Mainly due to this fact ITP is usually used as an on-line sample pretreatment technique 

before CZE or another (usually electrophoretic) separation technique [4,5]. Preparative capillary isotachophoresis (pITP) was 

proved to be a powerful sample pretreatment technique [6]. One of the possibilities of using isotachophoresis as a sample 

pretreatment technique is an off-line mode while using micro-preparative valve in single or column coupling arrangement 

[7,8]. Main advantages of this technique are rapid simplification and/or reduction of complex ionic matrices, increasing the 

concentration(s) of the analyte(s) in the collected fraction, well-defined sample pretreatment conditions in ITP separation 

mode, isolation of analyte into well-defined fraction with known composition when discrete spacer technique is used, easily 

obtainable compatibility of the whole analytical separation system when final non-CE analytical techniques is used. These 

key steps offer, for example, a very suitable analytical tool for some trace analytes present in complex biological samples. 

The potential of preparative isotachophoresis (pITP) in single column as a sample pretreatment before high performance 

liquid chromatography (HPLC) for analysis of herbicides present in soil [9] and urine matrices [10] and determination of 

flavonoids in plant extract [11] was studied. 

The above facts indicate the use of the combination of highly-efficient separation techniques with sensitive and/or 

selective detection. Liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS) or liquid chromatography with tandem mass 

spectrometry (LC-MS/MS) provides unique opportunities for pharmaceutical analysis. LC/MS and LC/MS/MS methods can 

be applied to a broad group of pharmaceutically important substances mainly due to the significant levels of analytical 

performance parameters (sensitivity, selectivity, speed and cost-effectiveness analysis) [12]. The liquid chromatographyelectrospray 

ionization source in combination with hybrid ion trap and high-resolution time-of-flight mass spectrometry 

(LC-ESI-IT-TOF-MS) appears to be an effective analytical technique for the separation and identification of biologically 

important substances (therapeutic drugs and their metabolites) present in various complex biological matrices. The main 

advantages of this system are the high separation efficiency, short analysis time, high selectivity and sensitivity of detection 

and a small amount of sample needed for analysis. LC-ESI-IT-TOF-MS is an excellent technique to obtain the chemical and 




- 124 - 


11. - 14. 10. 2010

structural information of the analytes using the power of fragmentation possibilities of the ion trap and also the gaining the 

high resolution and accurate masses measurement using time of flight analyzer. 

This work studied some potentialities of p(ITP-ITP)-HPLC/MS in the analysis of high molecular weight compounds 

(lysozyme served as model analyte) at low concentration level while present in the complex matrix (human saliva). In 

addition, selected mixture of discrete spacers was used in the p(ITP-ITP) stage of the combination, especially, to minimize 

very significantly complex character of the matrix and highly reproducible definition of the remaining compounds of the 

matrix as accompanied the analyte in the collected fractions. MS and MS/MS spectra, obtained from the reconstituted sample 

fractions, proved both the p(ITP-ITP) clean-up effect and ITP concentrating power for very low concentration levels of the 

analyte as present in complex biological matrix. 

EXPERIMENTAL 

Apparatus and HPLC-MS conditions 

Modified isotachophoretic analyzer ZKI-001 (Villa - Labeco, Spišská Nová Ves, Slovak Republic) in the columncoupling 

configuration of separation unit with the high voltage power supply capabling was used for preparative ITP 

experiments. The preseparation column of 1.8 mm I.D. (120 mm to detector) and the analytical column of 0.8 mm I.D. (160 

mm to detector) were made of fluorinated ethylene-propylene copolymer (FEP). The applied driving currents were 600 A 

and 200 A in preseparation and analytical columns, respectively. Injection valve (44 l volume) of the sample loop and/or 

microsyringe (Hamilton) was used for the sample injection. On-column conductivity detectors were used for the detection of 

isotachophoretic zones. Preparative microfractionation valve with cca. 7 l volume of the inner loop was part of the 

analytical column. Concentrator 5301 (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) was used for the lyofilization of the collected 

fractions. Electrolytes were filtered through 0.8 m membrane filter (Millipore, Molsheim, France) and stored in a fridge 

before analysis. 

HPLC-MS analyses of were performed by using Shimadzu LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japan). This MS 

analyzer is combining an electrospray ionization (ESI), a 3D quadrupol ion trap (IT) and an orthogonally accelerated time-offlight 

analyzer (TOF). HPLC experiments were performed on Reprosil-Gold 300 C18 column (100/2 mm; 5 m) (Dr.Maisch 

HPLC GmbH, Ammerbuch- Entringen, Germany) as using a gradient elution (water – acetonitrile) with a 0.2 ml/min flow 

rate: 0-1 min. - 10% ACN, 1-6 min. - 10-90%, 6.01-12 min. - 10% ACN. The column was thermostated to 40 °C. The MS 

conditions were as follows: electrospray capillary voltage +4.5 kV in positive ionization mode. Drying gas flow rate 

10 L.min , drying gas temperature 200 °C. The MS–MS3 experiments automatically acquired data within 50-1500 m/z values 

in the positive mode. Fragmentation of ions in MS2 and MS3 experiments was performed using 25% energy and 25% of 

cooling gas with fragmentation ion window ±1,5 m/z. Data acquisition and evaluation was performed using LCMS Solution 

ver.3.4.151 (Shimadzu). 

Chemicals 

The electrolytes solutions were prepared from chemicals obtained from Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich 

(Steinheim, Germany) and Fluka (Buchs, Switzerland). All chemicals used were of analytical grade or additionally purified 

by the usual methods. Standard of discrete spacers (histidine, 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol, creatinine, - 

amino-n-caproic acid, - amino-n-butyric acid, – alanine) were purchased from Sigma. To minimize the problems with 

electroosmotic flow and convection of solution, both columns were filled with 1% (w/w) solution of hydroxyethylcellulose 

(high molecular weight anti convective agent) before pITP runs. 

Formic acid, acetonitrile (LC/MS quality) and water (LC/MS quality) were obtained from Merck (Darmstadt, 

Germany). For preparation of electrolytes and solutions of standards, water cleaned in 2 stages by Pro-PS unit (Labconco, 

Kansas City, U.S.A.) and Simplicity (Millipore, Molsheim, France) was used. 

Lysozyme standard (from chicken egg white) was obtained from Sigma and served as an internal standard. 

Standard solutions and sample preparation 

Saliva samples used as a matrix in the analyses of lysozyme were obtained from forth healthy volunteers (2 male and 2 

female). Samples were filtered through 0.45 m syringe filter (Millipore) and 5 l of concentrated formic acid was added to 1 

mL of sample immediately after obtaining. 

Lysozyme standard stock solution (1 mg/mL) was prepared by dissolving of 1 mg of standard in 1 mL of water (LC/MS 

quality). Working solution (c = 0.05 mg/L) was prepared by a proper dilution of lysozyme standard stock solution with water 

(LC/MS quality). The working solution was freshly prepared on each working day. 

The stock solutions of discrete spacers at 1×10 -2 mol/L concentration were prepared by dissolving of calculated amount 

in deionized water. The mixture of discrete spacers (HIS-histidine, TRIS-2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol, 

CREAT-creatinine, EACA- - amino-n-caproic acid, GABA- - amino-n-butyric acid, BALA- – alanine) was prepared from 

the stock solutions of spacers (10 -2 mol/L) by dilution with deionized water. The final concentration of each spacer in the 

mixture was 1 mmol/L. 

All fractions obtained by pITP were lyophilized (3 hours, 30C) after obtaining and reconstituted (89 L LC-MS water 

+ 1 L 5% formic acid + 10 L 100% methanol) before the MS experiments. 




- 125 - 


11. - 14. 10. 2010

RESULTS AND DISCUSSION 

HPLC-MS analysis of 5 l of lysozyme standard (cca 35 pmol was injected) is shown in Fig.1a. Elution position of 

lysozyme under our experimental conditions is at 8.2 minute showing a negative peak in TIC trace and it is marked by a bar. 

Averaged MS spectrum corrected for the background is shown in Fig.1b where several multiply charged ions over 800 m/z 

values are visible. After deconvolution of this spectrum quite nice peak of lysozyme is obtained showing molecular mass 

14303.775 what is in very good agreement with the theoretical value 14303.8. HPLC-MS analysis of 10 ml of saliva sample 

is shown in Fig.2 where many high peaks are visible in TIC trace. Averaged MS spectrum corrected for the background is 

shown in Fig.2b from which it is clear that the main group of ions is shifted to lower m/z values (300-700). After 

deconvolution of this spectrum no peak of lysozyme is obtained what can be explained by the ion suppression as there are 

many ions present in the elution position of lysozyme. This fact is indicating that the direct HPLC-MS analysis is not 

possible to use for the analysis of lysozyme in saliva samples and some sample pretreatment technique has to be used before. 

2.25 

2.00 

1.75 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

Inten.(x1,000) 

14303.775 

0.00 

14050 14100 14150 14200 14250 14300 14350 14400 14450 14500 mass 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Inten.(x10,000) 

0.0 

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z 

C) 

1101.279 

229.154 

403.727 

894.998 

1192.943 

299.102 

340.173 

520.851 

654.277 

744.905 

847.415 

1022.715 

953.836 

1301.401 

545.736 

1154.626 

a) 

b) 

1431.349 

Fig. 1: TIC trace (a), MS spectrum (b) and deconvoluted MS spectrum (c) from HPLC/MS analysis of lysozyme standard. 

For details, see Experimental. 




- 126 - 


11. - 14. 10. 2010

(x10,000,000) 

1.5 1:TIC (1.00) 

1.4 

1.3 

1.2 

1.1 

1.0 

0.9 

0.8 

0.7 

0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

3.0 

2.0 

1.0 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 

Inten.(x10,000) 

189.956 

260.779 

301.138 

390.674 

500.759 

533.713 763.228 

617.592 683.470 

847.581 

1001.427 

250 500 750 1000 1250 m/z 

Fig.2: TIC trace (a) and MS spectrum (b) from HPLC/MS analysis of saliva sample. 

For details, see Experimental. 

Our goal was to test the possibilities of using preparative ITP before HPLC-MS analysis of lysozyme in saliva sample. 

Preparative isotachophoresis experiments were carried out using sodium cation at 10 mmol/L concentration as leading ion. 

Final pH of leading electrolyte was adjusted with acetic acid to 5.00. Beta-alanine at 20 mmol/L concentration was used as 

terminating ion. The using of discrete spacers is very useful in preparative isotachophoresis for the isolation of analyte from 

the potential interfering constituents originating from the complex ionic matrix. We have found the proper mixture of discrete 

spacers for the isolation of lysozyme from the saliva matrix consisting of 5 low molecular weight constituents: TRIS, HIS, 

CREAT, GABA, EACA. Such a mixture of discrete spacers divided the mobility span interval between leading and 

terminating ions into 6 parts. Isotachopherogram from the analysis of the final mixture of discrete spacers is shown in Fig.3. 

The scheme of fractionation procedure is shown in Fig.4. Fractions were taken out in such a way that the driving current was 

switched off when inside the micropreparative trapping valve was present the end of zone having the higher effective 

mobility and the beginning of the zone having the lower effective mobility (see Fig.4a). The valve was turn to the proper 

position and the fraction was displaced into Eppendorf microtube by air having final volume about 7 l (see Fig.4b). Then the 

channel of the sample from the loop to the microtube was washed with 25 l volume of water following with 25 l of 

methanol. Trapping valve was turned to next working position and it was filled with leading electrolyte (see Fig.4c). Finally 

the valve was turned back, the driving current was switched on and the isolation of another fraction was possible (see Fig.4d). 

All fractions obtained in pITP experiments were lyophilized and after reconstitution (89 l deionized water + 1 L 5% formic 

acid + 10 l methanol) they were analyzed by HPLC-MS. 




- 127 - 

a) 

b) 


11. - 14. 10. 2010

lysozyme 

TE 

TRIS 

CREA 

HIS 

GABA 

EACA 

TE 

Fig.3: Isotachopherogram obtained from the pITP Fig.4: Schema of fractionation procedure. 

analysis of model mixture of discrete spacers. The 

arrow indicates the migration position of lysozyme. 

The migration position of lysozyme was checked by the HPLC-MS analyses of the 6 fractions obtained during the pITP 

fractionation of lysozyme standard. It was proved that lysozyme is migrating only between TRIS and HIS spacers (2nd 

fraction) what is declared in Fig.5 where TIC traces and MS spectra of the 1st, 2nd and 3rd fractions are shown. 

The HPLC-MS analyses of the first 3 fractions obtained during the pITP fractionation of saliva sample are shown in 

Fig.6. As can be seen, there is small peak of human lysozyme visible in the deconvoluted averaged and background corrected 

MS spectrum from the 2nd fraction while no peak of lysozyme is present in the 1st and the 3rd fractions. The presence of 

lysozyme in the saliva sample was also proved by the spiking of the saliva sample with the lysozyme standard what is shown 

in Fig.7 where TIC traces and MS spectra of the 1st, 2nd and 3rd fractions obtained from such samples are shown. 




- 128 - 

CD 2 

S 3 

S 2 

S 1 

LE 

CT 

a 

C 

R 

TV 

b 

WS 

c 

LE 

d 


11. - 14. 10. 2010

1 st fraction 

1.5 

1.0 

0.5 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

2 nd fraction 

1.75 (x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

0.5 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

Inten.(x10,000) 

2.0 

279.137 

251.120 

384.201 

582.309 

1.5 

1.0 

185.128 

450.223 560.290 

727.725 

897.807 

761.004 

833.402 

3 th fraction 

1.75 (x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

4.0 

3.0 

Inten.(x10,000) 

406.187 

2.0 185.102 

1.0 

102.532 

255.935 

309.918 

487.841 

604.286 713.832 933.745 

806.587 

848.519 1006.112 1106.443 

1301.230 

0.0 

250 500 750 1000 1250 m/z 

Inten.(x10,000) 

234.987 

2.0 

185.102 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

Inten.(x1,000) 

1.0 

0.9 

0.8 

0.7 

0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

0.0 

14200 14225 14250 14275 14300 14325 14350 14375 mass 

1026.294 

1101.279 

1194.023 

1305.816 

1186.502 

250 500 750 1000 1250 m/z 

301.121 

421.924 

450.223 

560.267 

601.609 

14303.505 

782.171 

822.574 

250 500 750 1000 1250 m/z 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 

Fig.5: TIC traces (a), MS spectra (b) and deconvoluted MS spectrum (c) from HPLC/MS analysis of the fractions obtained 

during the preparative ITP isolation of lysozyme standard. For details, see Experimental. 




- 129 - 

c) 

b) 

b) 

b) 

a) 

a) 

a) 


11. - 14. 10. 2010

1 st fraction 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

Inten.(x10,000) 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

2 nd fraction 

(x10,000,000) 

1.75 1:TIC (1.00) 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

2.0 Inten.(x10,000) 

3 th fraction 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

229.139 

773.738 

727.879 

857.544 

907.489 

1029.333 

1079.652 

1125.790 

594.956 

125.975 

279.153 

466.558 1276.662 

175.068 395.221 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

Inten.(x10,000) 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

301.154 

167.011 472.267 913.409 

219.951 

125.986 661.229 

509.236 1087.108 

757.635 823.989 

250 500 750 1000 1250 m/z 

1.0 Inten.(x1,000) 

0.9 

0.8 

0.7 

0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

14756.662 

0.0 

14500 14550 14600 14650 14700 14750 14800 14850 14900 14950 mass 

1472.921 

250 500 750 1000 1250 m/z 

123.035 

185.089 

251.105 

301.138 

509.257 

428.707 

431.833 

582.286 

693.592 

250 500 750 1000 1250 m/z 

0.25 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 


during the preparative ITP isolation of saliva sample. For details, see Experimental. 




858.710 

970.388 

946.649 

- 130 - 

c) 

b) 

b) 

a) 

a) 

b) 

a) 


11. - 14. 10. 2010

1 st fraction 

1.5 

1.0 

0.5 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

2.5 Inten.(x10,000) 

185.102 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

2 nd fraction 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

Inten.(x10,000) 

3 th fraction 

1.5 

1.0 

0.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

227.107 384.182 

280.977 

450.264 

847.939 

705.777 

755.133 895.225 

655.563 

186.109 

545.736 

1004.459 

1038.537 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

Inten.(x10,000) 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

1190.750 

1301.812 

250 500 750 1000 1250 m/z 

185.115 

235.001 

384.182 

487.862 

279.168 

509.278 

613.759 

781.853 

850.840 

957.000 

Inten.(x100) 

4.5 

4.0 

3.5 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

250 500 750 1000 1250 m/z 

311.221 

406.206 

14302.595 

487.235 

558.720 895.508 

656.145 822.520 

690.052 

250 500 750 1000 1250 m/z 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 


during the preparative ITP isolation of saliva sample spiked with lysozyme standard. For details, see Experimental. 

1114.782 

0.0 

14200 14225 14250 14275 14300 14325 14350 14375 mass 




- 131 - 

c) 

1209.565 

b) 

b) 

a) 

a) 

b) 

a) 


11. - 14. 10. 2010

CONCLUSIONS 

This work studied the possibilities of preparative isotachophoresis (pITP) as a sample pretreatment technique before 

high performance liquid chromatography-mass spectrometric separation (HPLC-MS) in analysis of high molecular weight 

compounds present in complex biological matrix. The analysis of chosen analyte (human lysozyme) present in complex 

biological matrix (saliva) at different concentration levels was selected as an example of solving the analytical problem by 

using pITP-HPLC-MS combination. Without using pITP pretreatment it was impossible to detect lysozyme in saliva by 

direct HPLC-MS analysis while its using significantly simplified the saliva sample what is favourable for the minimizing of 

the matrix effects in HPLC-MS. Human lysozyme was found in the saliva samples of 4 volunteers using just deconvolution 

of data from MS mode after the background correction. Proper optimization of HPLC separation conditions as well as the 

data acquisition in MS and MS/MS modes can improve both the level of identification and the concentration limit of 

detection of lysozyme present in biological matrices. 


This work was supported by a grant from the Slovak Research and Development Agency (No.VVCE-0070-07) and the grants 

of Slovak Grant Agency, No`s.1/0882/09 and 1/0546/10. 

REFERENCES 

[1] F. Amado, M. J. Lobo, P. Domingues, J. A. Duarte, R. Vitorino, Expert. Rev. Proteomics 7 (2010) 709 

[2] D. Koh, Y. Yang, L. Khoo, S. Z Nyunt, V. Ng, C. L. Goh, Ann. Acad. Med. Singapore 33 (2004) 307 

[3] F. M. Everaerts, J. L. Beckers, T. P. E. M. Verheggen, Isotachophoresis, Theory, Instrumentation and Applications, 

Elsevier, Amsterdam, 1976 

[4] Kaniansky, D., Marák, J., J. Chromatogr. 498 (1990) 191 

[5] Kaniansky, D., Marák, J., Madajová, V., Šimuniová, E., J. Chromatogr. 638 (1993) 137 

[6] T. Hirokawa, Y. Kiso, J. Chromatogr. A 658 (1994) 343 

[7] E. Kenndler, D. Kaniansky, J. Chromatogr. 209 (1981) 306 

[8] M. Hutta, D. Kaniansky, E. Kovalíková, J. Marák, M. Chalányová, V. Madajová, E. Šimuniová, J. Chromatogr. A 

689 (1995) 123 

[9] Kaniansky, D., Madajová, V., Hutta, M., Žilková, I., J. Chromatogr. 286 (1984) 395 

[10] Schoots, A. C., Everaerts, F. M., J. Chromatogr. 227 (1983) 328 

[11] R. Sladkovský, M. Urbánek, P. Solich, Chromatografia 58 (2003) 187 

[12] Nielen M. W., Bovee T. F., van Engelen M. C., Rutgers P., Hamers A. R., van Rhijn J. H., Hoogenboom L. R., 

Anal. Chem. 78 (2006) 424 




- 132 - 


11. - 14. 10. 2010

RAPID LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF IBUPROFEN AND ITS 

METABOLITES IN HUMAN URINE 

ANDREA STAOVÁ *, JOZEF MARÁK, MONIKA RADIOVÁ, DUŠAN KANIANSKY 

Department of Analytical Chemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University in Bratislava 

Mlynská Dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovak Republic 

e-mail: stanova@fns.uniba.sk 

INTRODUCTION 

Pain is a sensory perception, which has the special status of other feelings as indicates any malfunction of the more 

complex organs. The most commonly it occurs in response to certain painful stimuli, e.g., cold, heat, chemical, pressure or 

electrical irritation. Analgesics - antipyretics are drugs that alleviate pain and also reduce the body temperature. They are 

used mainly for the treatment of mild to moderate pain caused by impairment of joints, tendons and ligaments, inflammation 

of the veins, dysmenorrhoea, headache or toothache. The combinations of active substances with the substances that increase 

their analgesic effect, e.g., caffeine, are very often used. Ibuprofen (analgesic, antipyretic and nonsteroidal anti-inflammatory 

drug) is one of the most widely used drugs in the world [1]. It is used to treat various rheumatic and musculoskeletal 

disorders, pain and fever. Ibuprofen is extensively metabolised in the body via oxidation and glucuronidation [2]. Only 15% 

of the received drug is excreted as parent compound, 26% is excreted as hydroxy- and 43% as carboxyibuprofen including 

conjugates [1]. It is a chiral drug with one chiral center. Although used as a racemic mixture, its anti-inflammatory effect is 

mainly associated with S-enantiomer [2]. Elimination of (R)-ibuprofen in plasma occurs faster than its active isomer (S)ibuprofen, 

which results in its higher concentration in plasma. Oxidative metabolism is also a way of biotransformation and 

ibuprofen has four possible oxidative metabolites. In humans, the original drug and its oxidative metabolites pass into Phase 

II, which includes their conjugation with glucuronic acid in the reaction, which is stereoselective for the S-enantiomer. Two 

major oxidative metabolites of ibuprofen, 2-hydroxyibuprofen (1 chiral center) and carboxyibuprofen (2 chiral centers), and 

their conjugates with glucuronic acid are found in urine in an amount of about 58% of the administered dose of ibuprofen, 

while two minor metabolites, 1- hydroxyibuprofen and 3-hydroxyibuprofen and their glucuronides are found only at very low 

concentrations [3]. Mainly chromatographic and electrophoretic methods with different detectors were previously used for 

the analyses of ibuprofen and its metabolites in different matrices. 

Techniques based on a combination of high performance liquid chromatography with mass spectrometry (HPLC-MS) 

provide several unique possibilities in pharmaceutical analysis. HPLC-MS techniques are applicable to a wide range of 

compounds of interest for the pharmaceutical industry and have many important analytical characteristics (sensitivity, 

selectivity, speed of analysis, cost-effectiveness) [4]. These properties are continuously improved, resulting in easier use of 

the apparatus and a higher reliability of the whole analytical procedure. The development in the HPLC-MS area has resulting 

to the state that HPLC-MS has become the preferred analytical method for the analysis of substances present at trace 

concentration levels in complex mixtures. The analysis of such compounds present in complex biological samples is a very 

complicated analytical task. In complex matrices there is the large number of separated analytes present and the probability 

of the occurrence of two or more substances with very close retention/migration characteristics is very high. Even using the 

most efficient separation systems, there are always peak overlaps present, what prevent the reliable qualitative and/or 

quantitative analysis of the analyte of interest. This fact means that successful analytical procedure requires the using of 

combination of powerful separation technique with the sufficiently sensitive and/or selective detection technique. The 

combination of chromatographic separation and identification of molecular weight and structural information of analytes 

through MS n fragmentation is currently the most powerful analytical techniques available for drug metabolism research in the 

analysis of biological samples [5]. The liquid chromatography-electrospray ionization source in combination with hybrid ion 

trap and high-resolution time-of-flight mass spectrometry (LC-ESI-IT-TOF MS) appears to be an effective analytical 

technique for the problematic tasks, such as the separation and identification of biologically important substances (therapeutic 

drugs and their metabolites) present in various complex biological mixtures. The main advantages of this system are the high 

separation efficiency, short analysis time, high selectivity and sensitivity of detection and a small amount of sample needed 

for analysis, as well as chemical and structural information using the power of fragmentation due to the ion trap and the high 

resolution and ability to gain the accurate mass of the ions using the time of flight analyzer. 

In this work, LC-ESI-IT-TOF MS analyzer was employed for in-vivo analysis of ibuprofen and its metabolites in the 

urine samples obtained within the 6 hours after the administration of 1 tablet of Nurofen StopGrip (200 mg of ibuprofen) 

from 5 healthy volunteers. LC separations were performed on Ascentis C18 column (100/2.1 mm; 5 m particles) at 

0.2 ml/min. flow-rate using water:acetonitrile gradient. Data acquisition during the MS detection was performed in both 

positive (+4.5 kV) and negative (-3.5 kV) ionization modes. MS-MS 3 spectra were acquired in automatic data acqusition 

mode within the 50-1000 m/z range. Raw data files were submitted to MetID Solution software (Shimadzu) for data mining 

analysis. Suggested possible metabolites from MetID Solution for each volunteer were carefully checked in MS-MS 3 files to 

avoid the false-positive results. Finally, 5 metabolites were positively identified in the urine samples of all volunteers, i.e., 

hydroxyibuprofen and carboxyibuprofen in Phase I metabolic pathway, ibuprofen glucuronide, hydroxyibuprofen 




- 133 - 


11. - 14. 10. 2010

glucuronide, carboxyibuprofen glucuronide and conjugate of ibuprofen with taurine in Phase II metabolic pathway. The use 

of ibuprofen as a model analyte provides a further example of the potential utility of LC-ESI-IT-TOF MS to generate highquality 

metabolic data with the detection of both Phase I and II metabolites in human urine. The use of collision induced 

dissociation in ion trap part of the analyzer MS n data allowed the detection and confirmation of ibuprofen metabolites in 

human urine. The use of the high-resolution time-of-flight mass spectrometer allowed the generation of accurate mass data 

for both the precursor and product ions and the information enabling the confirmation of metabolic reactions pathways such 

as hydroxylation, oxidation, glucuronidation and conjugation of ibuprofen with taurine. 

EXPERIMENTAL 

Apparatus and HPLC-MS conditions 

HPLC-MS analyses of were performed by using Shimadzu LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japan). This MS 

analyzer is combining an electrospray ionization (ESI), a 3D quadrupol ion trap (IT) and an orthogonally accelerated time-offlight 

analyzer (TOF). HPLC experiments were performed on Ascentis C18 column (100/2.1 mm; 5 m) (Sigma-Aldrich, 

Steinheim, Germany) as using a gradient elution (water – acetonitrile) with a 0.2 ml/min flow rate: 0-1 min. - 10% ACN, 1-6 

min. - 10-90%, 6.01-12 min. - 10% ACN. The column was thermostated to 40 °C. The MS conditions were as follows: 

electrospray capillary voltage +4.5 and -3.5 kV in positive and negative ionization mode, respectively. Drying gas flow rate 

10 L.min -1 , drying gas temperature 200 °C. The MS–MS 3 experiments automatically acquired data within 50-1000 m/z 

values in the positive and negative modes. Fragmentation of ions in MS 2 and MS 3 experiments was performed using 25% 

energy and 25% of cooling gas with the fragmentation ion selection window ±1.5 m/z. Data acquisition and evaluation was 

performed using LCMS Solution ver.3.4.151 (Shimadzu). Measured results were evaluated and statistically processed using 

Microsoft Excel 2003 (Microsoft) and QCExpert ver.2, 5 (Trilobyte, Pardubice, Czech Republic). To identify the potential 

metabolites of ibuprofen in human urine samples MetID program (Shimadzu) was used. 

Chemicals 

All chemicals used in this work were obtained from Merck (Merck, Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (Steinheim, 

Germany) and Fluka (Busch, Switzerland). Formic acid, acetonitrile (LC-MS quality) and water (LC-MS quality) were 

purchased from Merck. Standard of ibuprofen was obtained from Sigma-Aldrich. Samples of Nurofen StopGrip® (Reckitt 

Benckiser Healthcare Ltd., Slough, United Kingdom) were obtained from the local pharmacy. 

Standard solutions and sample preparation 

Ibuprofen standard stock solution (1 mg/mL) was prepared by dissolving of 1 mg of standard in 1 mL of water (LC/MS 

quality). Working solution (c = 0.1 mg/L) was prepared by dilution of ibuprofen standard stock solution with water (LC/MS 

quality). The working solution was freshly prepared on each working day. 

Samples of the drug StopGrip Nurofen ® (Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.., Slough, UK) were obtained from the 

local pharmacy. Urine samples were collected from five healthy volunteers in 0, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 hours after oral use of 

1 tablet StopGrip Nurofen ® (declared content of ibuprofen was 200 mg). All urine samples were diluted immediately after 

the collection with acetonitrile in a 1:1 (v/v) ratio, centrifuged 5 minutes at 5000 rpm and filtered through a 0.45 m filter 

(Millipore, Molheim, France). Subsequently, 10 l of each sample was injected directly into the LC-ESI-IT-TOF MS 

analyzer. 

RESULTS AND DISCUSSION 

First and very important part of this work was to develop the optimal HPLC-MS n conditions for the separation of 

ibuprofen and its metabolites in urine samples. Optimum HPLC separation conditions (column, stationary phase, mobile 

phase, gradient, etc.) and final MS detection conditions (ESI conditions, polarity, etc.) are shown in the part “Experimental”, 

in the paragraph “Apparatus and HPLC-MS condition”. The total time of an HPLC-MS n experiment was 12 minutes. HPLC- 

MS n analyses were carried out in both ionization modes. HPLC-MS n analyses of blank urine sample and urine spiked with 

the standard of ibuprofen (cibuprofen = 18.1 μmol/L) are shown in Fig.1. In Figure 1b the totally ion chromatograms (TIC) in 

positive (pink record) and negative mode (blue record) are shown as well as extracted ion chromatogram (XIC) of ibuprofen 

obtained in negative ionization mode in a urine sample before taking Nurofen Tablets ® StopGrip. Figure 1a shows the 

elution position of ibuprofen. The MS and MS/MS spectra (Fig. 1c and 1d) can confirm that the substance eluting at the time 

of 7.98 min is ibuprofen. Since ESI is a soft ionization technique, in particular, provides an information on the analyte 

molecular weight and therefore to confirm the structure of the analyte it is necessary to perform its additional fragmentation. 

The dominant peak m/z 205.1216 corresponding to [M-H] - ion of ibuprofen can be seen in the MS spectrum (Fig. 1c). In 

MS/MS spectrum (Figure 1d), which was obtained using of the ion m/z 205.1216 as a precursor, a single peak m/z 160.9485 

can be seen, which corresponds to the lost of CO2 neutral molecule from [M-H] - ion of ibuprofen. 

After the oral administrations of Nurofen StopGrip, urine samples of 5 healthy volunteers were collected in 0-6 hour’s 

time interval. Each of the volunteers took one table (declared content 200 mg of ibuprofen). A particular urine sample was 

diluted with acetonitrile (1:1) and, subsequently, centrifuged at 5000 RPM (5 minutes) and a 10 l volume was injected into 




- 134 - 


11. - 14. 10. 2010

the LC-ESI-IT-TOF MS analyzer. HPLC-MS analyses of urine samples collected from the volunteer No.5 0-6 hours after 

oral administration of Nurofen StopGrip are shown in Figure 2. From the chromatograms it is clear that the profiles of the 

urine’s compounds concentrations and hence the representation of individual substances in the urine vary with time. These 

results also indicate that urine is not only very complex matrix, but its composition strongly depends on many individual 

factors, including the time from drug ingestion. To identify the potential metabolites MetID Solution program (Shimadzu) 

was used, for which summary formula of metabolising substance, MS-MS n records obtained from the samples taken in the 

different times of the metabolic process and blank record served as input data. After some computation time (usually 

10-30 seconds) program provides a list of potential metabolites expected (metabolites, which may arise on the basis of known 

metabolic reactions in Phase I and II of metabolic degradation pathways of xenobiotic substances) and the list of unexpected 

metabolites. MetID Solution program processed all HPLC-MS data obtained by analyzing the urine samples from each 

volunteer and the list of the potential metabolites was obtained. The lists of the potential metabolites obtained from all 

volunteers were carefully inspected as there is a high risk of false-positive results in such studies. Therefore, only the 

metabolites which were present at least in 3 samples of at least 3 volunteers were taken into account. After final 

summarization of all potential metabolites, we can found the following metabolites of ibuprofen present in the human urine, 

i.e., hydroxyibuprofen, carboxyibuprofen, hydroxyibuprofen glucuronide, carboxyibuprofen glucuronide, ibuprofen 

glucuronide and conjugate of ibuprofen with taurine. 




- 135 - 


11. - 14. 10. 2010

3.00 

2.75 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

4:205.1234 (5.00) 

2.50 

2.25 

2.00 

1.75 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

TIC + 

TIC - ibuprofen 

0.00 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

3.00 

2.75 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

4:205.1234 (5.00) 

2.50 

2.25 

2.00 

1.75 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

0.00 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

TIC + 

TIC - 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

Inten.(x1,000,000) 

161.1322 

205.1216 

301.1067(1) 

0.00 

112.9844 

277.1395 

394.9716 

364.8836 

487.3010(1) 

589.7253640.7217 

695.7434 802.6879 883.6771 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 

4.5 

4.0 

3.5 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Inten.(x10,000) 

160.9485 

[M-H] - 

[M-CO2-H] - 

0.0 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 

Fig 1: TIC and XIC chromatograms obtained from LC-MS analysis of urine (b) and urine with the addition of ibuprofen (a). 

An asterisk indicates the elution position of ibuprofen. MS spectrum obtained from urine samples with the addition of 

ibuprofen (a) from the peak eluting at the time of 7.98 min. (c) and MS / MS spectrum obtained from the fragmentation ion 

m/z 205.1216 (d). MS and MS / MS spectra were acquired in negative ionization mode. 




- 136 - 

* 

a 

b 

c 

d 


11. - 14. 10. 2010

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

1.5 

1.0 

0.5 

TIC+ 

TIC- 

6 hour 

0.0 

0.0 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

2.0 4:TIC (1.00) 

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

2.5 (x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

4.0 

3.0 

2.0 

1.0 

0.0 

4.0 

3.0 

2.0 

1.0 

0.0 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

(x10,000,000) 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

(x10,000,000) 

3.5 1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

TIC+ 

TIC- 

TIC+ 

TIC- 

TIC+ 

TIC- 

TIC+ 

TIC- 

TIC+ 

TIC- 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

(x10,000,000) 

2.5 1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

TIC+ 

TIC- 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

5 hour 

4 hour 

3 hour 

2 hour 

1 hour 

0 hour 

Fig. 2: TIC chromatograms obtained from LC-MS analysis of urine sample from volunteer No. 5 after oral administration of 

1 tablet of Nurofen® StopGrip. 




- 137 - 


11. - 14. 10. 2010

XIC of the potential metabolites of ibuprofen in urine sample of volunteer No. 5 three hours after taking the tablet 

Nurofen ® StopGrip are shown in Figure 3a. For metabolite M1 only MS spectrum was obtained (Fig. 4), because the mass 

spectrometer worked in the automatic data acquisition mode and the signal this metabolite was evaluated not to be high 

enough to perform MS/MS analysis. In the MS spectrum of metabolite M1 a dominant peak m/z 221.1187 can be seen, which 

corresponds to the mass of hydroxyibuprofen [M-H] - ion (theoretical value m/z 221.1183). The difference between the 

measured and theoretical m/z values is 0.4 mDa (1.8 ppm) what is a typical value for calibrated TOF analyzer. In the MS 

spectrum also high peak at m/z 177.1297 can be seen, what represents the difference of 43.9890 Da compared to 

m/z 221.1187 ion. This loss corresponds to the releasing of neutral CO2 molecule (theoretical loss 43.9898 Da) from [M-H] - 

ion. Based on these facts, we can say that the metabolite M1 is hydroxyibuprofen. 

(x10,000,000) 

8.0 

1:TIC (1.00) 

4:TIC (1.00) 

4:205.1234 (2.00) 

4:381.1555 (2.00) 

7.5 4:411.1297 (2.00) 

4:397.1504 (2.00) 

4:235.0976 (2.00) 

4:221.1183 (2.00) 

7.0 

4:312.1275 (2.00) 

6.5 

6.0 

5.5 

5.0 

4.5 

4.0 

3.5 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 

a 

TIC+ 

TIC- 

ibuprofen 

Fig. 3: TICs a XICs of urine samples of volunteer No.5.taken 3 hours after oral administration of Nurofen® StopGrip tablet. 

7.0 

6.0 

5.0 

4.0 

3.0 

2.0 

Inten.(x100,000) 

177.1297 

[M-H] - hydroxyibuprofen 

221.1187 

338.0700 

310.6562 

1.0 

398.1259 539.2468 

0.0 

112.9895 

277.0225 

381.1376 

599.9713 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

C 

H 3 

Fig. 4: MS spectrum of peak in the position of M1 metabolite in negative ionization mode. 




- 138 - 

OH 

CH 3 

CH 3 

O 

M3 

M5 

M4 

M2 

M1 

M6 

b 

OH 


11. - 14. 10. 2010

Figure 5 is showing MS and MS/MS spectra of metabolite M2. In the MS spectrum the ion at m/z 235.0981can be seen, 

which corresponds to the mass [M-H] - ion carboxyibuprofen (theoretical value m/z 235.0976). The difference between the 

measured and theoretical m/z values is 0.5 mDa (2.1 ppm) what is a typical value for calibrated TOF analyzer. Dominant ions 

present in MS spectrum include peak m/z 191.1093, what represents the difference of 43.9888 Da compared to m/z 235.0981 

ion. This loss corresponds to the releasing of neutral CO2 molecule (theoretical loss of 43.9898 Da) from [M-H] - ion. This 

assumption can also be confirmed by the presence of ion m/z 191.1089 in the MS/MS spectrum (loss of 43.9892 Da), where 

m/z 235.0981 ion was selected as the precursor. Based on these facts, we can say that the metabolite M2 is carboxyibuprofen. 

Inten.(x1,000,000) 

3.00 

2.75 

2.50 

2.25 

2.00 

1.75 

1.50 

1.25 

[M-CO2-H] - 

191.1093 

235.0981(1) 

329.1068 

1.00 

0.75 

397.1482 

0.50 

0.25 

0.00 

112.9867 

143.1105 

295.1289 

271.0767 

385.1607 

471.2009 

541.2641 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

Inten.(x100,000) 

[M-H] - 

[M-CO2-H] - 

191.1089 

carboxyibuprofen 

0.00 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

MS 

MS/MS 

Fig 5: MS (upper) and MS/MS (lower) spectrum of metabolite M2 in negative ionization mode. Ion m/z 235.0981 was taken 

for MS/MS analysis. 




- 139 - 


11. - 14. 10. 2010

MS and MS/MS spectra of potential metabolite M3 are shown in Figure 6. The dominant peak m/z 381.1554 can be 

seen in the MS spectrum, which corresponds to the mass of ibuprofen glucuronide [M-H] - ion (theoretical value m/z 

381.1555). The difference between the measured and theoretical m/z values is 0.1 mDa (0.26 ppm) what is a very good value 

for calibrated TOF analyzer. In the MS spectrum also ions m/z 205.1261 and m/z 175.0252 can be seen but their intensities 

are very low. The presence of these ions likely indicates the collapse of metabolite ion m/z 381.1554 to ibuprofen ion 

m/z 205.1261 (theoretical value m/z 205.1234) and the rest of the molecule of glucuronic acid and the ion m/z 175.0252 

could potentially be glucuronide ion (theoretical value m/z 175.0248). The evidence of this hypothesis is also supported by 

MS/MS spectrum obtained from m/z 381.1554 ion where, although peak m/z 193.0362 is dominating, the ions m/z 205.1235 

and m/z 175.0249 are present (the difference between the measured and theoretical values are 0.1 mDa). The presence of 

m/z 193.0362 ion in the MS/MS spectrum can be explained by assuming that the ion m/z 381.1554 is ibuprofen glucuronide 

as m/z 193.0362 ion can be formed by cleavage of the molecule of ibuprofen glucuronide at carboxyl group as is shown in 

Figure 6 (theoretical value m/z 193.0354). Based on these facts, we can say that the M3 metabolite is ibuprofen glucuronide. 

Inten.(x10,000,000) 

2.50 

2.25 

2.00 

1.75 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

381.1554(1) 

[M-H] - 

ibuprofen glucuronide 

0.50 

0.25 

193.0359 

312.1270(1) 

0.00 

113.0265 

205.1261 273.1516 352.0849 543.2106 

694.2966 

763.3135(1) 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

4.5 

4.0 

3.5 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

Inten.(x1,000,000) 

glucuronide 

193.0362(1) 



0.5 

0.0 

205.1235 

161.1361 299.1512(1) 383.1984 

193.035 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

MS 

MS/MS 

glucuronide 






- 140 - 


11. - 14. 10. 2010

Figure 7 present MS and MS/MS spectrum of potential metabolite M4. The dominant peak m/z 397.1500 can be seen in 

the MS spectrum, which corresponds to the mass of hydroxyibuprofen glucuronide [M-H] - ion (theoretical value 

m/z 397.1504). The difference between the measured and theoretical m/z values is 0.4 mDa (1.0 ppm) what is very good 

value for calibrated TOF analyzer. The ion m/z 397.1500 was selected as a precursor for obtaining MS/MS spectrum where 

m/z 193.0365 ion is dominating. The presence of this ion in the MS/MS spectrum suggests that the ion m/z 397.1500 must 

have glucuronic acid implemented in its structure and the fragmentation of M4 metabolite is occuring with higher probability 

at the carboxyl group. The peaks corresponding to the ions m/z 221.1175 (hydroxyibuprofen) and m/z 175.0253 

(glucuronide) can also be seen in MS/MS spectrum. Based on these facts, we can say that the metabolite M4 is 

hydroxyibuprofen glucuronide. 

8.0 

7.0 

6.0 

5.0 

4.0 

3.0 

2.0 

Inten.(x1,000,000) 

343.0862(1) 

[M-H] - 

397.1500(1) 

1.0 

0.0 

112.9881 

201.1143 

243.1225 

304.1204 

387.1676 

495.1250 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

1.2 

1.1 

1.0 

0.9 

0.8 

0.7 

0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

Inten.(x1,000,000) 

glucuronide 

193.0365 

M1 

C 

H 3 

OH 

CH 3 

MS 

hydroxyibuprofen glucuronide 

MS/MS 

0.2 

0.1 

0.0 

157.0142 221.1175 

193.035 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 






- 141 - 

M1 

CH 3 

O 

O 

HO 

O 

OH 

O 

OH 

OH 

glucuronide 


11. - 14. 10. 2010

Figure 8 is showing the MS and MS/MS spectra of the potential metabolite M5. The dominant peak m / z 411.1297 can 

be seen in the MS spectrum, which corresponds to the mass of carboxyibuprofen glucuronide [M-H] - ion (theoretical value 

m/z 411.1297). The difference between the measured and theoretical m/z values is 0.0 mDa (0 ppm) what represents an 

excellent value for TOF analyzer. The ion m/z 411.1297 was selected as a precursor for MS/MS spectrum, where 

m/z 175.0261 ion is dominating. The presence of this ion in the MS/MS spectrum suggests that the ion m/z 411.1297 must 

have glucuronic acid implemented in its structure (theoretical value m/z 175.0248). The peak corresponding to 

m/z 191.1076 ion can also be seen in the MS/MS spectrum what is suggesting the cleavage of CO2 molecule from the 

carboxyibuprofen ion (m/z 235.0976) and what represents the loss of 43.9900 Da. Based on these facts, we can say that the 

metabolite M5 is carboxyibuprofen glucuronide. 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

Inten.(x10,000,000) 

411.1297(1) 

0.25 

187.0080 

372.1112(1) 

0.00 

113.0278 328.1183 433.1097(1) 

511.1493 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

2.00 Inten.(x1,000,000) 

1.75 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

175.0261 

[M-H] - MS 

carboxyibuprofen glucuronide 

glucuronide MS/MS 

M2-CO2 

157.0142 

0.00 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

M2 

glucuronide 






- 142 - 


11. - 14. 10. 2010

MS and MS/MS spectra of potential metabolite M6 are shown in Fig.9. There is dominant peak m/z 381.1556, 

corresponding to the metabolite M3, visible in the MS spectrum but it is possible to see also the ion m/z 312.1270 what 

corresponds to the mass of [M-H]- ion obtained from the ibuprofen conjugate with taurine (theoretical value m/z 312.1275). 

The difference between the measured and theoretical m/z values is 0.5 mDa (1.6 ppm) what is a typical value for calibrated 

TOF analyzer. Metabolites M3 and M6 have practically identical retention times. MS/MS spectrum was measured to confirm 

the structure of metabolite M6 where m/z 312.1270 ion was selected as the precursor. The dominating ion m/z 124.0070 is 

present in the MS/MS spectrum what with high probability corresponds to taurine (theoretical value m/z 124.0068). The 

difference between the measured and theoretical m/z values is 0.2 mDa (1.6 ppm) what is a typical value for calibrated TOF 

analyzer. The peak corresponding to m/z 106.9799 ion can also be seen in MS/MS spectrum, which probably arises from ion 

m/z 124.0070 (loss of 17.0271 Da). This loss corresponds to the releasing of neutral NH 3 molecules from the taurine ion 

(theoretical loss of 17.0265 Da). Based on these facts, we can say that the metabolite M6 is ibuprofen conjugate with taurine. 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

Inten.(x10,000,000) 

[M-H] - 

193.0363 312.1270(1) 

381.1556(1) 

MS 

conjugate of ibuprofen with taurine 

0.00 

113.0256 

205.1238 266.6594328.1584(1) 495.1479(1) 607.3405 694.2962 

763.3164(1) 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

9.0 

8.0 

7.0 

6.0 

5.0 

4.0 

3.0 

2.0 

1.0 

Inten.(x100,000) 

124.0070 

taurine 

C 

H 3 

MS/MS 

0.0 

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z 

CH 3 

CH 3 

O 

NH 

O 

S 

124.0068 



On the basis of the detailed analyses of mass spectra shown in the figures 4-9, we can say that the metabolites estimated 

based on the results of the MetID Solution program were really found in urine samples of all volunteers. These results are 

consistent with works [6-8] with the exception of the conjugate of ibuprofen with taurine because the presence of such 

metabolite has been described in the literature only once. 




- 143 - 

OH 

O 


11. - 14. 10. 2010

CONCLUSIONS 

In this work, LC-ESI-IT-TOF MS analyzer was employed for in vivo analysis of ibuprofen and its metabolites in the 

urine samples obtained within the 6 hours after the administration of 1 dose of Nurofen StopGrip (200 mg of ibuprofen) from 

5 healthy volunteers. HPLC separations were performed on Ascentis C18 column (100/2.1 mm; 5 m particles) at 

0.2 ml/min. flow-rate using water:acetonitrile gradient. Data acquisition during the MS detection was performed in both 

positive (+4.5 kV) and negative (-3.5 kV) ionization modes. MS-MS 3 spectra were acquired in automatic data acquisition 

mode. Raw data files were submitted to MetID Solution software for data mining analysis. Suggested potential metabolites 

from MetID Solution for each volunteer were carefully checked by the detailed inspection of the MS-MS 3 files to avoid the 

false-positive results. Finally, 6 metabolites were positively identified in urine samples of all volunteers, i.e., 

hydroxyibuprofen and carboxyibuprofen in Phase I metabolic pathway, ibuprofen glucuronide, hydroxyibuprofen 

glucuronide, carboxyibuprofen glucuronide and conjugate of ibuprofen with taurine in Phase II metabolic pathway. The use 

of ibuprofen as a model compound provides a further example of the potential utility of LC-ESI-IT-TOF MS to generate 

high-quality metabolic data with the detection of both Phase I and II metabolites in human urine. The use of collision induced 

dissociation in ion trap part of the analyzer MS n data allowed for the detection and confirmation of the presence of ibuprofen 

metabolites. The use of the high-resolution time-of-flight mass spectrometer allowed the generation of accurate mass data of 

both the precursor and product ions providing information enabling the confirmation of metabolic reactions such as 

hydroxylation, oxidation and glucuronidation. 


This work was supported by a grant from the Slovak Research and Development Agency (No.VVCE-0070-07) and the grants 

of Slovak Grant Agency, No`s.1/0882/09 and 1/0546/10. 

REFERENCES 

[1] S. Weigel, U. Berger, E. Jensen, R. Kallenborn, H. Thoresen, H. Hühnerfuss, Chemosphere 56 (2004) 583 

[2] P. S. Bonato, M. P. F.M. Del Lama, R, de Carvalho, J. Chromatogr. B 796 (2003) 413 

[3] A. R. M. de Oliveira, F. J. M. de Santana, P. S. Bonato, Anal. Chim. Acta 538 (2005) 25 

[4] Nielen M. W., Bovee T. F., van Engelen M. C., Rutgers P., Hamers A. R., van Rhijn J. H., Hoogenboom L. R., 

Anal. Chem. 78 (2006) 4241 

[5] R. Ramanathan (Ed.), Mass spectrometry in drug metabolism and pharmakokinetics, John Wiley & Sons, Inc., New 

Jersey, 2009, chap.1 

[6] D. R. Kepp, U. G. Sidelmann, J. Tjørnelund, S. H. Hansen, J. Chromatogr. B 696 (1997) 235 

[7] M. Maeda, Y. Kogure,Y. Ishii, Determination of Ibuprofen Drug Metabolites in Urine by the Use of Multivariant 

Analysis, poster TPX 584 at ASMS 2009 

[8] D. Djukovic, E. Appiah-Amponsah, N. Shanaiah, G.A. N. Gowda, I. Henry, M. Everly, B. Tobias, D. Raftery, J. Pharm. 

Biomed. Anal. 47 (2008) 328 




- 144 - 


11. - 14. 10. 2010

DVOUROZMĚRNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE - PERSPEKTIVNÍ TECHNIKA PRO ANALÝZU 

SLOŽITÝCH VZORKÚ PŘÍRODNÍCH LÁTEK 

PAVEL JANDERA 

Katedra Analytické Chemie, Univerzita Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice 

 

ěč 

ř 

ě 

čě 

ůů 

ůřřě 

ě 

čůčě 

ů 

řěů 

ě 

řě 

ř 

řěěřřě 

řřřčř 

řůě 

ěččč 

ěřůěř 

řěů 

ěěěř 

 

řě 

ěřřěřě 

čěřůřřč 

čň 

ěč 

iěěěěi 

 

řřě 

řěůě 

 

řěřůěů 

čřůč 

ěřůě 

 




- 145 - 


11. - 14. 10. 2010

AUXILIARY 

PUMP 

LOOP 1 

FROM COLUMN (1 ST DIMENSION) 

WASTE 

LOOP 2 

TO COLUMN (2 ND 

DIMENSION) 

AUXILIARY 

PUMP 

LOOP 1 

FROM COLUMN (1 ST DIMENSION) 

WASTE 

Obr. 1. Zapojení "comprehensive" LCxLC ve dvou následujících cyklech 

Obr. 2 Výřez záznamu detektoru za kolonou v druhé dimenzi: 5 píků v 7 frakcích. 

LOOP 2 

TO COLUMN (2 ND 

DIMENSION) 

Obr. 3. prezentace 2D dat: vrstevnicový graf, graf ploch, 3D chromatogram Separace fenolických antioxidantů na 

koloně PEGvD1aC18vD2[1]. 




- 146 - 


11. - 14. 10. 2010

řřů 

ěř 

Pnčč 

ěě 

: 

ččěP2Důě 

ě 

řč 

 

1. 

R 

P- 

L 1. 

C 

in 

mi1. 

 

 

R 

et 

en 

ti 

o 

n 

ti 

m 

e 

in 

2n 

d 

di 

m 

1. 

0. 

0. 

 

A a 

c 

1 3 

5 

24 

6 

Retention time in 1st dimension 

7 

9 

8 

P D 

11 

12 

10 

13 

15 

14 

17 

16 

P D = PP 

= PP 

− 

R 

+ 

18 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

NP-LC in 

 

 

 

 

P 

 

 

 

 

+ P R 

R 

P- 0. 

L 

C 

(C 

0. 

18 

) 0. 

in 

0. 

Obr. 4 Orthogonální (NP DIOL xRP C18) a neorthogonální (RP CN x RP C18) [2]. 

P čůěřčěř 

ř 

 

 

0. 

0. 

0. 

⎡ 

⎤ 

⎢ = + ( 

n + )⎥ 

⎣ ⎦ 

k 

N 

P 




- 147 - 

R 

et 

en 

ti 

o 

n 

ti 

m 

e 

in 

2n 

d 

di 

m 

Bb 

d 

1 

Retention time in 1st dimension 

6 

10 

7 9 

8 

5 

3 4 

2 

12 

0 2 4 6 8 1 1 1 1 1 

RP-LC (Cyano) in min 

11 

13 

14 

18 19 

16 17 

15 


11. - 14. 10. 2010

Nč 

Vm, tG , VG 

Fůčř 

čř 

ěřř 

ěčěě 

čůů 

 

Obr. 5. Gradientová a izokratická píková kapacita v oblasti, vymezené elučními objemy první (VR,1)aposlední (VR,Z) 

složky vzorku. 

 

 

P = + 

PC 

240 

220 

200 

180 

160 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

N 

 

V 

m 

t 

G 

F 

( + 

k ) 

e 

0 2 4 6 8 10 

VR,Z /VR,1 

Grad 

Iso 

řůůě 

ěř 

řř 

ř 

ř 

ůřůř 

ě 

ů 

řěřěřčě 

ěěř 




- 148 - 


11. - 14. 10. 2010

řěůčťě 

čě 

č 

ěě 

 

 

Obr. 6. NPxRP separace karotenů vpomerančové šťávě do strukturních skupin 

Obr. 7. 2D RPxHILIC separace EO-PO kooligomerů. podle distribuce EO a PO jednotek. 

řůů 

 

μ 

řůμº 

μřůμº 

ěř 

ěμ 

řůů 

ůůčěěě 




- 149 - 


11. - 14. 10. 2010

ěůěč 

čňř 

ř 

 

 

Obr. 8. LCxLC separace fenolických kyselin a flavonů v červeném vínu. 

ěřčč 

řřčě 

ř 

řěřřěě 

ůřě 

ěřů 

ččč 

ůčů 

ůě 

μřůμěě 

čůěμřřůě 

ččřř 

ěμčů 

řěěμřů 

μčřů 

ůřů 

 




- 150 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 9. Separaci metabolitů indolových kyselin v extraktu z kukuřice na HS-F5 koloně vD1anaZr-Ckoloně, 3μm, 

50x2.1 mm, ultrarychlým gradientem ACN v D2. 

ěřů 

ůřč 

Obr. 10. Separace fenolických antioxidantů ve vzorku piva se současnou UV a coulometrickou detekcí. 

 

Ě 

čěě 

čňř 

čč 

ěě 

ěčě 

ň 




- 151 - 


11. - 14. 10. 2010

ěč 

 

 

Poděkování za podporu patří Grantové agentuře ČR, projekt GA 203/07/0641 a MŠMT ČR, projekt MSM 0021627502. 

 

ČňJ. Chromatogr. A 

J. Chtomatogr. A 

 

ČřJ. Chromatogr. A 

ČJ.Separation. Sci 

J. Chromatogr. A 

řČňJ. Separation Sci., 

 




- 152 - 


11. - 14. 10. 2010

STANOVENIE OXIDANÝCH PRODUKTOV OXIDU DUSNATÉHO V TELOVÝCH TEKUTINÁCH NA 

ELEKTROFORETICKOM IPE 

PETER TROŠKA 1* , MARIÁN MASÁR 1 , MICHAL HORIIAK 1 , RICHARD CHUDOBA 2 , DUŠAN 

KANIANSKY 1 

(1) Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra Analytickej chémie, Mlynská Dolina CH-2, 84215 

Bratislava, Slovenská republika, 

troska@fns.uniba.sk, michalhorciciak@gmail.com 

(2) Univerzita Karlova v Praze, Pírodovedcká fakulta, Katedra fyzikální a makromolekulové chemie, Hlavova 8, 128 40 

Praha 2, eská republika 

Úvod 

udský organizmus produkuje NO z aminokyseliny L-arginínu pomocou enzýmu NO-syntázy. NO-syntáza sa 

nachádza v mnohých bunkách tela a jej lokalizácia odráža množstvo funkcií, ktoré NO vykonáva. Napríklad NO 

syntetizovaný v nervových bunkách zabezpeuje prenos informácie a NO pochádzajúci z bielych krviniek uplatuje svoj 

toxický efekt v boji proti mikroorganizmom a nádorovým bunkám. Najdôležitejšou funkciou tejto molekuly je však jej 

schopnos rozširova priesvit ciev relaxovaním hladkých svalov v cievnej stene, a tým zabezpeova orgánom potrebné 

prekrvenie a tiež znižova systémový tlak krvi. 

Enzým NO-syntáza existuje vo viacerých izoformách. Dve z nich sú nízkoproduktívne, t.j. produkujú NO 

kontinuálne a vo vemi malých množstvách (napríklad v nervových bunkách a vo vnútornej výstelke ciev). Nízke hladiny 

NO majú signálny charakter, t.j. sprostredkovávajú prenos signálu medzi bunkami, keže malá molekula NO ahko 

prestupuje cez bunkovú membránu. Naproti tomu, vysokoproduktívna tzv. induktívna NO-syntáza je schopná v krátkom ase 

po špecifickom signáli syntetizova až tisíckrát viac NO, než jej konštitutívne izoformy. Pri relatívne vysokých množstvách 

NO sa môže zaa uplatova jeho toxický úinok. Molekula NO má radikálovú povahu a voné radikály sú vemi reaktívne 

látky schopné znii životne dôležité molekuly ako sú lipidy, bielkoviny a nukleové kyseliny. Práve na tomto princípe je 

založená likvidaná schopnos bielych krviniek, ktoré obsahujú induktívnu NO-syntázu. 

Dusinany a dusitany sú vo vekej miere používané ako indikátory vzniku NO. Oxidané produkty NO sú vo 

zvýšenej miere obsiahnuté v mozgovomiechovom moku (celebrospinal fluid; CSF) pacientov so sklerózou multiplex [1]. 

Zvýšená hladina dusinanov a dusitanov v CSF bola nameraná pri zápale mozgových blán. Pacienti trpiaci Parkinsonovou 

chorobou majú koncentrácie dusinanov a dusitanov v CSF nižšie. 

Jednotlivé metódy stanovenia dusinanov a dusitanov v telových tekutinách možno všeobecne rozdeli na 

separané a neseparané analytické metódy vyžadujúce rôzny stupe predúpravy vzoriek. Neseparané metódy, napríklad 

kolorimetria, spektrofotometria, fluorimetria a elektrochemické metódy sú založené na redukcii dusinanov na dusitany, 

ktoré sú následne stanovované a poskytujú informácie o NOx (celkovom stanovení dusinanov a dusitanov). Separané 

analytické metódy stanovenia dusinanov a dusitanov, ako napríklad plynová chromatografia (GC), metódy vysokoúinnej 

kvapalinovej chromatografie (HPLC) a kapilárna elektroforéza (CE) poskytujú komplexnejšie analytické informácie, 

vyžadujú však implementáciu predúpravných a prekoncentraných techník vzhadom na nízke koncentrané úrovne 

dusinanov a najmä dusitanov v komplexných matriciach [2]. 


Na ITP-CZE separácie bol použitý CE ip so spájanými kanálikmi (CC) a integrovanými vodivostnými senzormi 

od firmy Merck (Darmstadt, Nemecko). Schéma ipu a rozmery jednotlivých kanálikov sú znázornené na obr. 1. 

LE 

BF 

C-S 

C-BE 

D1 

W 

Obr. 1 Schéma PMMA ipu so spájaným separanými kanálikmi 

C-LE - prvý (ITP) separaný kanálik naplnený vodiacim elektrolytom (4,5 l objem; 59 × 0,2-0,5 × 0,14-0,2 mm) s Pt 

vodivostným senzorom D1; C-TE - kanálik naplnený zakonujúcim elektrolytom (0,8 l objem; 11 × 0,2-0,5 × 0,2-0,38 mm); 

C-S - dávkovací kanálik (9,9 μl objem; 61 × 0,2-0,5 × 0,2-0,38 mm); C-BE - druhý (CZE) separaný kanálik naplnený 

nosným elektrolytom (4,3 l objem; 56 × 0,2-0,5 × 0,14-0,2 mm) s Pt vodivostným senzorom D2; BF - bifurkaná oblas; 

LE, TE, BE, S - vstupy pre roztoky vodiaceho, zakonujúceho a nosného elektrolytu a vzorky do jednotlivých kanálikov; W - 

výstup z kanálikov do odpadovej nádobky. 




- 153 - 

C-LE 

S 

D2 

C-TE 

BE 

TE 


11. - 14. 10. 2010

Roztoky elektrolytov a modelových vzoriek boli pripravené z chemikálií od firiem Merck, Sigma-Aldrich 

(Steinheim, Nemecko), Fluka Chemika-BioChemika (Buchs, Švajiarsko), Serva (Heidelberg, Nemecko) a Lachema (Brno, 

R). Kyselina chlorovodíková bola istená izotermickou destiláciou, 3-(N,N-dodecyldimetylamónio)propán-1-sulfonát 

(DDAPS) bol istený na kolóne so sorbentom C8 a metylhydroxyetylcelulóza (MHEC) bola deionizovaná na zmesných 

ionexoch (Amberlite MB-3, Merck). 

Na prípravu roztokov elektrolytov a vzoriek bola použitá deionizovaná voda istená deionizanými zariadeniami 

Pro-PS (Labconco, Kansas City, USA) a Simplicity (Millipore, Molsheim, Francúzsko) spojenými do sekvencie. Na 

premývanie kanálikov na ipe bol použitý 2 % vodný roztok detergentu Extran MA 02 a deionizovaná voda. 

Tab. 1 Zloženie ITP a CZE elektrolytových systémov 

Parameter ITP CZE 

Vodiaci / nosný ión chlorid octan 

Protiión -alanín -alanín 

EOF supresor MHEC MHEC 

Aditívum - DDAPS 

pH 

3,6 3,8 

Zakonujúci ión mravan 

Protiión -alanín 

EOF supresor MHEC 

pH 3,9 

MHEC = metylhydroxyetylcelulóza; DDAPS = 3-(N,N-dodecyldimetylamónio)propán-1-sulfonát 

Vzorky CSF boli odobraté v laboratóriu 1. neurologickej kliniky Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v 

Bratislave a uskladované pri -40 °C v mikroskúmavkách. Pre vysoký obsah interferujúcich chloridov boli vzorky 

predupravené na SPE kolónkach s Ag + sorbentom (Alltech, Grace Davidson Discovery Sciences, Deerfield, USA). 

Tab. 2 Analyzované vzorky CSF 

Vzorka . Pohlavie pacienta Rok narodenia pacienta Predpokladaná diagnóza 

1 Ž 1954 - 

2 Ž 1979 G35 

3 Ž 1951 H81 

4 Ž 1982 G35 


Optimalizácia ITP separaných podmienok pre ITP-CZE analýzu dusinanov a dusitanov bola uskutonená 

s cieom rieši nasledovné problémy: (i) odstránenie potenciálnych komigrantov nachádzajúcich sa v reálnych vzorkách CSF 

(najmä slabé organické kyseliny), ktoré by po prenose z ITP do CZE stupa mohli ruši analýzu dusinanov a dusitanov, 

(ii) dosiahnutie dostatonej istoty elektrolytových roztokov v ITP, pretože ITP ako taká má silnú koncentranú schopnos a 

(iii) zakoncentrovanie analytov do úzkeho pulzu medzi vodiacim a zakonujúcim iónom. 

Výber vodiaceho a zakonujúceho elektrolytu sme uskutonili na základe simulácie ITP separácie vybraných 

analytov. Z dôvodu zabránenia migrácie slabších organických kyselín, resp. zníženia ich efektívnych pohyblivostí sme na 

ITP simuláciu použili octanový vodiaci elektrolyt o nízkom pH (3,6). Zárove, pri tomto pH sú dusinany a dusitany 

dostatone disociované. Ako zakonujúci ión sme použili relatívne pomalý octan. 

CZE separácie dusinanov a dusitanov boli uskutonené v octanovom nosnom elektrolyte pri pH = 3,8. Za daných 

separaných podmienok majú dusinany a chloridy (prítomné vo vzorkách CSF o cca. 5 000-krát vyšších koncentraných 

úrovniach ako dusinany) vemi blízke efektívne pohyblivosti, a preto bol do octanového nosného elektrolytu pridaný 

zwitterionický detergent DDAPS (tab. 1). DDAPS umožnil rozlíšenie dusinanov od chloridov a dusinanov a dusitanov. 

Koncentrácia tohto zwitterionického detergentu významne ovplyvuje migrané správanie sa analytov [3]. 

Elektroforeogramy na obr. 2 ukazujú vplyv rôznej koncentrácie DDAPS v nosnom elektrolyte (0-200 mmol/l) na rozlíšenie 

dusinanov a dusitanov a taktiež dusinanov od chloridov. Obr. 2a ukazuje situáciu, ke do nosného elektrolytu nebol 

pridaný DDAPS a dusinany a aj dusitany migrujú v chloridoch prenesených z ITP do CZE stupa. So vzrastajúcou 

koncentráciou DDAPS v octanovom nosnom elektrolyte dochádza k lepšiemu rozlíšeniu dusinanov a dusitanov od chloridov 

a pri 100 mmol/l koncentrácii DDAPS dusinany a dusitany migrujú spolu. Z elektroforeogramov na obr. 2 je zrejmé, že 

optimálnou koncentráciou DDAPS v nosnom elektrolyte z hadiska rozlíšenia dusinanov, dusitanov a chloridov je 200 

mmol/l. V tomto kontexte je potrebné zdôrazni, že kritická micelárna koncentrácia (CMC) DDAPS je 2-4 mmol/l, t.j. za 

daných separaných podmienok pracujeme v micelárnom CZE prostredí. Pri koncentrácii 200 mmol/l DDAPS v nosnom 

elektrolyte dochádza ku zmene migraného poradia dusinanov a dusitanov [3]. 




- 154 - 


11. - 14. 10. 2010

e 

d 

c 

b 

a 

G 

NO - 

3 

NO - 

2 

NO - 

2 

NO - 

2 

NO - 

3 

NO - 

3 

NO - 

+ NO- 

2 3 

NO - 

2 

450 480 510 

Time [s] 

100 mV 

Obr. 2 Elektroforeogramy z ITP-CZE separácií dusitanov a dusinanov s rôznou koncentráciou DDAPS v nosnom elektrolyte 

Koncentrácia DDAPS v nosnom elektrolyte bola (a) 0, (b) 50, (c) 100, (d) 150 a (e) 200 mmol/l (tab. 1.). Koncentrácie 

dusitanov a dusinanov v modelových vzorkách boli 10 μg/l. ITP-CZE separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme 

v tab. 1. Hnací prúd bol stabilizovaný na 20 μA v oboch separaných kanálikoch. G - vodivos. 

Za optimalizovaných pracovných a separaných podmienok bola uskutonená séria ITP-CZE opakovaných meraní 

a vyhodnotené základné kvalitatívne a kvantitatívne parametre pre analyty. Hodnoty opakovateností kvalitatívnych 

a kvantitatívnych parametrov ITP-CZE separácií modelových vzoriek dusitanov a dusinanov sú prezentované v tab. 3. 

Tab. 3 Opakovatenosti migraných asov a plôch píkov dusinanov a dusitanov v modelových vzorkách na CC ipe 

Analyty 

as v ITP Migraný as Plocha píku 

c n 

Priemer RSD Priemer RSD Priemer RSD 

(s) 

(%) 

(s) 

(%) (mVs) (%) (μg/l) 

Dusitany 

Dusinany 

380 0,8 

70 

76 

2,0 

1,9 

7,3 

17,6 

9,9 

3,1 

2,5 

2,5 

3 

3 

Dusitany 73 3,6 74,8 1,5 20 3 

386 0,7 

Dusinany 

78 2,0 136,2 2,9 20 3 

n - poet meraní; RSD - relatívna smerodajná odchýlka. ITP-CZE separácie boli uskutonené v danom elektrolytovom 

systéme pri hnacom prúde 20 μA v obidvoch separaných kanálikoch. 

Kalibrané iary pre dusitany a dusinany, z ktorých boli vypoítané ich aktuálne koncentrácie vo vzorkách CSF, 

boli zostrojené v koncentranom rozsahu 2,5-50 μg/l. Im prislúchajúce parametre regresných rovníc a odhady cLOD sa 

nachádzajú v tab. 4. 

Tab. 4 Parametre regresných rovníc (Y = aX + b) pre dusinany a dusitany v modelových vzorkách a odhad ich detekných 

limitov 

Analyty a 

b 

r n c 

cLOD 

(mVs.l/μg) (mVs) 

(μg/l) 

(g/l) (nmol/l) 

Dusitany 3,963 0,317 0,9972 16 2,5-50 0,16 3,5 

Dusinany 6,224 2,848 0,9963 19 2,5-50 0,19 3,1 

a - smernica; b - úsek kalibraného grafu; r - korelaný koeficient; c - koncentraný interval analytov; n - poet meraní; 

cLOD - koncentraný detekný limit. ITP-CZE separácie boli uskutonené v danom elektrolytovom systéme pri hnacom 

prúde 20 μA v obidvoch separaných kanálikoch. 




- 155 - 


11. - 14. 10. 2010

Pri dávkovaní 9,9 μl vzorky na CC ip boli odhadnuté cLOD hodnoty pre dusitany a dusinany na úrovni 0,2 μg/l. 

Elektroforeogram na obr. 3b ukazuje možnosti prezentovanej ITP-CZE metódy pre stanovenie dusitanov a dusinanov 

prítomných v modelovej zmesi o koncentráciách blízkych ich limitom kvantifikácie (LOQ). 

b 

a 

G 

20 mV 

NO - 

2 

NO - 

3 

420 450 480 

Time [s] 

Obr. 3 Elektorforeogramy z ITP-CZE separácie dusitanov a dusinanov prítomných v modelovej vzorke na koncentraných 

úrovniach zodpovedajúcich ich limitu kvantifikácie 

Modelová vzorka obsahovala: (a) zakonujúci elektrolyt (slepý pokus); (b) dusitany, dusinany o koncentrácii 1 μg/l v 

zakonujúcom elektrolyte. ITP-CZE separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme v tab. 1. Hnací prúd bol 

stabilizovaný na 20 μA v oboch separaných kanálikoch. G - vodivos. 

Za preferovaných pracovných a ITP-CZE separaných podmienok sme uskutonili analýzy reálnych vzoriek CSF 

(tab. 2). Najskôr bola preferovaná priama analýza, ke vzorka CSF bola iba vhodne zriedená (cca. 50-krát) v zakonujúcom 

elektrolyte, následne centrifugovaná a supernatant bol dávkovaný na CC ip. Ako je zrejmé z elektroforeogramu na obr. 4c, 

veké množstvo chloridov, ktoré sú typickou makrozložkou v CSF, malo za následok prekroenie separanej kapacity CC 

ipu, a tým aj stratu rozlíšenia a neumožnilo stanovi dusinany a dusitany. Keže ITP predúprava na CC ipe nebola 

postaujúca na efektívne odstránenie chloridov prítomných v reálnej vzorke CSF o 5 000-, resp. 100 000-krát vyššej 

koncentrácii (v μg/l) ako dusinany, resp. dusitany, bolo potrebné navrhnú inú predúpravnú techniku pred vlastnou ITP- 

CZE analýzou. Ako najvhodnejšia bola vybraná off-line SPE predúprava na báze Ag + sorbentu, ktorý špecificky zachytáva 

iba chloridy. 

c 

b 

a 

G 

Cl - 

NO - 

2 

NO - 

3 

480 540 

Time [s] 

Cl - 

250 mV 

Obr. 4 Elektroforeogramy z priamej ITP-CZE analýzy reálnej vzorky CSF . 1 a po jej extraknej predúprave 

Na CC ip bolo dávkované: (a) zakonujúci elektrolyt (slepý pokus), (b) 50-krát zriedená vzorka . 1 po extraknej 

predúprave na Ag + sorbente a (c) rovnako ako v (b) bez extraknej predúpravy. ITP-CZE separácie boli uskutonené 

v elektrolytovom systéme v tab. 1. Hnací prúd bol stabilizovaný na 20 μA v oboch separaných kanálikoch. G - vodivos. 




- 156 - 


11. - 14. 10. 2010

Na obr. 4b je elektroforeogram z ITP-CZE analýzy identickej vzorky CSF . 1 po SPE predúprave. Z porovnania 

obr. 4b a 4c je zrejmé, že SPE je vemi efektívnym prostriedkom predúpravy biologických vzoriek s vysokým obsahom 

chloridov. Keže vzorky CSF sú biologické charakteru, vyznaujú sa znanou heterogenitou, a preto aj koncentrané úrovne 

dusinanov a dusitanov môžu by rozdielne. Zárove, obsahy dusitanov v telových tekutinách sú cca. 5 % v porovnaní 

s obsahmi dusinanov. Z vyššie uvedených skutoností vyplýva, že ITP-CZE stanovenie uvedených analytov vyžaduje 

optimalizáciu riedenia vzoriek CSF (v rozmedzí 10-50-krát). Na obr. 5 sú elektroforeogramy z ITP-CZE analýz vzoriek CSF 

po ich SPE predúprave. Ako slepý pokus bol dávkovaný na CC ip zakonujúci elektrolyt po SPE predúprave. 

c 

b 

a 

G 

NO - 

2 

NO - 

2 

450 480 510 

Time [s] 

Obr. 5 Elektroforeogramy z ITP-CZE analýzy vzoriek CSF po ich extraknej predúprave 

Na CC ip bolo dávkované: (a) zakonujúci elektrolyt (slepý pokus), (b) 30-krát zriedená vzorka . 3 a (c) 50-krát zriedená 

vzorka . 4 po ich extraknej predúprave na Ag + sorbente. ITP-CZE separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme 


Vo vzorkách CSF boli vyhodnocované opakovatenosti kvalitatívnych a kvantitatívnych parametrov dusitanov 

a dusinanov z troch opakovaných ITP-CZE meraní uskutonených poas jedného da s erstvo pripravenými roztokmi 

elektrolytov (tab. 5). Hodnoty RSD migraných asov (0,2-4,5 %) dusitanov a dusinanov v reálnych vzorkách CSF boli 

približne na rovnakej úrovni ako im prislúchajúce RSD hodnoty v modelových vzorkách. Opakovatenosti plôch píkov však 

boli významne vyššie najmä u dusitanov, o súvisí s ich nižšími koncentranými úrovami v reálnych vzorkách. 

Tab. 5 Opakovatenosti migraných asov a plôch píkov dusinanov a dusitanov vo vzorkách CSF po ich SPE extrakcii na 

CC ipe 

Vzorka . Analyty 

as v ITP Migraný as Plocha píku Df n 

Priemer RSD Priemer RSD Priemer RSD 

(s) (%) (s) (%) (mVs) (%) 

1 

Dusitany 

Dusinany 

407 1,0 

75 

95 

2,3 

1,5 

12,3 

1194,6 

8,8 

2,5 

10 3 

2 

Dusitany 

Dusinany 

399 0,2 

71 

85 

1,0 

4,5 

13,5 

442,6 

7,4 

5,5 

15 3 

3 

Dusitany 

Dusinany 

408 0,8 

76 

87 

2,4 

1,8 

8,8 

362,1 

11,3 

2,2 

30 3 

4 

Dusitany 

Dusinany 

399 0,3 

74 

86 

0,3 

0,2 

9,5 

406,6 

9,5 

2,1 

50 3 

n - poet meraní; RSD - relatívna smerodajná odchýlka; Df - zrieovací faktor; c - koncentrácia analytu vo vzorke. ITP-CZE 

separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme v tab. 1 pri hnacom prúde 20 μA v obidvoch separaných kanálikoch. 

Na obr. 6 je elektroforeogram z SPE-ITP-CZE analýzy 30-krát zriedenej vzorky CSF . 2 na CC ipe s vodivostnou 

detekciou s prídavkom 10 μg/l dusitanov a 20 μg/l dusinanov. Aktuálne koncentrácie dusitanov a dusinanov v testovaných 

vzorkách CSF a analyzovaných ITP-CZE na CC ipe s off-line SPE predúpravou boli vyhodnocované metódou kalibranej 

iary (tab. 6). 




- 157 - 

NO - 

3 

20 mV 


11. - 14. 10. 2010

a 

G 

NO - 

2 

450 480 510 

Time [s] 

Obr. 6 Elektroforeogramy z ITP-CZE analýzy vzorky CSF . 2 po extraknej predúprave a po prídavku štandardu 

Na CC ip bolo dávkované: (a) 30-krát zriedená vzorka . 2 po extraknej predúprave na Ag + sorbente a (b) rovnako ako v 

(a) iba s prídavkom 10 μg/l dusitanov a 20 μg/l dusinanov. ITP-CZE separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme 


Tab. 6 Aktuálne koncentrácie dusinanov a dusitanov vo vzorkách CSF po ich SPE extrakcii na CC ipe 

Vzorka . 

Dusitany Dusinany 

Df n 

c ± SD (μg/l) c ± SD (μmol/l) c ± SD (mg/l) c ± SD (μmol/l) 

1 18,2 ± 2,7 0,4 ± 0,1 3,09 ± 0,08 50 ± 1,3 10 3 

2 32,1 ± 3,8 0,7 ± 0,1 0,89 ± 0,06 14 ± 1,0 15 3 

3 28,0 ± 7,5 0,6 ± 0,2 1,39 ± 0,04 22 ± 0,7 30 3 

4 55,4 ± 11,3 1,2 ± 0,3 2,68 ± 0,07 43 ± 1,1 50 3 

n - poet meraní; SD - smerodajná odchýlka; Df - zrieovací faktor; c - priemerná hodnota koncentrácie analytu vo vzorke. 

ITP-CZE separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme v tab. 1 pri hnacom prúde 20 μA v obidvoch separaných 

kanálikoch. 

Záver 

Dusitany a dusinany sú pridávané ako konzervané látky do rôznych potravín, ale taktiež sú aj prirodzenou 

súasou potravy. Tieto anióny sú vo vekej miere používané ako indikátory vzniku oxidu dusnatého (NO) a sú vo zvýšenej 

miere obsiahnuté vo vzorkách CSF. Stanovenie dusitanov a dusinanov je nevyhnutné z hadiska prevencie niektorých 

závažných neurologických ochorení, medzi ktoré patria skleróza multiplex, zápal mozgových blán, Parkinsonova choroba 

a iné. 

CE separácie boli uskutoované na CC CE ipe s integrovanými vodivostnými senzormi. Preferované pracovné 

podmienky (uzatvorený hydrodynamický separaný systém na CC ipe a potlaený elektroosmotický tok) boli realizované 

uzatvorením vstupov do jednotlivých kanálikov na CC ipe valekmi peristaltických púmp, ktoré transportovali roztoky 

elektrolytov a vzoriek do CC ipu. Elektroosmotický tok bol eliminovaný prídavkom vysokomolekulárneho vodorozpustného 

polyméru (metylhydroxyetylcelulóza) do roztokov elektrolytov. Externé hnacie elektródy eliminovali produkciu bublín 

v separanom systéme na CC ipe. 

Na CC ipe bolo realizované on-line spojenie izotachoforézy (ITP) s kapilárnou zónovou elektroforézou (CZE), 

priom ITP s vysokou koncentranou schopnosou bola použitá ako dávkovacia technika pre CZE. CZE umožnila rýchle 

a citlivé stanovenia dusitanov a dusinanov. ITP a CZE elektrolytové systémy boli optimalizované tak, aby pri prenose 

analytov z ITP do CZE stupa boli tieto prenesené iba s minimálnym potom doprevádzajúcich zložiek matrice. 

CC ip pracujúci v režime zvýšenej dávkovacej kapacity, ke objem vzorky dávkovanej na ip bol 9,9 μl a objem 

oboch separaných kanálikov bol 9,3 μl, umožnil dosiahnu adekvátne koncentrané limity detekcie: 0,16 μg/l (3,5 nmol/l) 

pre dusitany a 0,19 μg/l (3,1 nmol/l) pre dusinany. Za preferovaných pracovných podmienok boli dosiahnuté vemi dobré 

opakovatenosti migraných asov dusitanov a dusinanov (RSD = 1,9-3,6 %) a ich plôch píkov (RSD = 1,5-9,9 %) 

nachádzajúcich sa v modelových vzorkách na nízkych koncentraných úrovniach (2,5 a 20 μg/l). 

Vzhadom na vysoké koncentrané úrovne chloridov v CSF bolo potrebné ich odstránenie z reálnych vzoriek pred 

vlastnou ITP-CZE analýzou. Vemi efektívnou predúpravnou technikou je SPE na báze použitia Ag + sorbentu, ktorý 

zadržiaval chloridy prítomné v CSF o 4 až 5 dekadických poriadkov vyšších koncentráciách ako dusinany a dusitany. 




- 158 - 

NO - 

3 

30 mV 


11. - 14. 10. 2010

Vhodnos navrhnutého analytického postupu bola ukázaná na analýze 4 vzoriek CSF poskytnutých laboratóriom 1. 

neurologickej kliniky Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. RSD hodnoty migraných asov a plôch píkov 

dusinanov a dusitanov v 10-50-krát zriedených vzorkách CSF sa výrazne nelíšili od RSD hodnôt pre modelové vzorky. 

Obsahy dusitanov a dusinanov boli v CSF vzorkách vyhodnotené metódou kalibranej iary po SPE-ITP-CZE 

analýze. Koncentrácie dusitanov sa v testovaných vzorkách pohybovali v intervale 18-55 μg/l (0,4-1,2 μmol/l) a koncentrácie 

dusinanov boli v rozsahu 0,9-3,1 mg/l (14-50 μmol/l). Tieto hodnoty boli v dobrej zhode s koncentráciami dusitanov a 

dusinanov publikovaných v literatúre [4]. 

Vypracovaná ITP-CZE metóda realizovaná na CC ipe so zvýšenou dávkovacou kapacitou a integrovanou 

vodivostnou detekciou spojená off-line s extraknou predúpravou na báze Ag + sorbentu umožnila rýchle (celkový as 

analýzy cca. 20 min.), reprodukovatené a spoahlivé stanovenie stopových koncentrácií dusinanov a dusitanov v 10-50-krát 

zriedených vzorkách CSF. SPE-ITP-CZE spojenie je vhodnou alternatívou k doposia používaným chromatografickým 

metódam stanovenia dusitanov a dusinanov v telových tekutinách. 

Literatúra 

[1] A.I. Danilov, M. Andersson, N. Bavand, N.P. Wiklund, T. Olsson, L. Brudin, J. Neuroimmunol., 136 (2003) 112. 

[2] G. Ellis, I. Adatia, M. Yazdanpanah, S.K. Makela, Clin. Biochem., 31 (1998) 195. 

[3] M.A. Woodland, C. A. Lucy, Analyst, 126 (2001) 28. 

[4] G. Žuni, S. Spasi, Z. Jeli-Ivanovi. J. Chromatogr. B, 727 (199) 73. 

Táto práca bola finanne podporená projektmi VEGA 1/0672/09 a VVCE-0070-07. 




- 159 - 


11. - 14. 10. 2010

VYUŽITIE KAPILÁRNEJ ZÓNOVEJ ELEKTROFORÉZY PRI MONITORINGU ROZKLADNÝCH 

PRODUKTOV NIEKTORÝCH LIEIV 

PAVOL KRUK 1* , HENRIETA STANKOVIOVÁ 2 , MARIÁN MASÁR 1 , DUŠAN KANIANSKY 1 , ANTON 

GÁPLOVSKÝ 2 

(1) Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra Analytickej chémie, Mlynská Dolina CH-2, SK- 

84215 Bratislava, Slovenská republika, 

e-mail: pavol.kruk@gmail.com 

(2) Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Chemický ústav, Mlynská Dolina CH-2, SK-84215 

Bratislava, Slovenská republika, 

Úvod 

Farmaceutické produkty zohrávajú významnú úlohu v každodennom živote udí. udia prostredníctvom svojich 

každodenných aktivít vnášajú tieto látky do environmentu. Mnohé z týchto zlúenín obsahujú vo svojej molekule indolový 

skelet. Degradácia a transformácia indolových zlúenín v environmente je v literatúre pomerne málo popísaná v porovnaní s 

údajmi dostupnými napr. pre chlórované aromatické a polykondenzované aromatické zlúeniny. 

Bázická hydrolýza je multikrokový proces (obr. 1). Prvým krokom je vytvorenie medziproduktu s otvoreným 

indolovým kruhom S, ktorý sa následne rozkladá na 2-aminofenylglyoxalát I. Medziprodukt S (E-Z izoméry na C=N väzbe) 

sa môže meni na medziprodukt O, ktorý sa taktiež rozkladá na 2-aminofenylglyoxalát I. Zámena O namiesto S na C=S 

väzbe je podmienená koncentráciou NaOH v reaknej zmesi. Kyselina antranilová A môže by finálnym produktom bázickej 

hydrolýzy isatín-3-tiosemikarbazónu. 

S1+S2 

isomers 

H 2N 

N 

NH 2 

NH 

COONa 

S 

1 

O 

N 

N 

H 

H 2N 

OH - 

H 2N 

N 

NH 2 

NH 

O 

NH 

COONa 

Obr. 1. Schéma priebehu reakcie 

UV-VIS spektroskopia nie je vemi vhodná metóda na monitorovanie aktuálnej koncentrácie medziproduktov z dôvodu 

prekryvu ich absorpných spektier. Zo schémy na obr. 1 je zrejmé, že medziprodukty ako aj produkty bázickej hydrolýzy 

isatín-3-tiosemikarbazónu sa vyznaujú iónogénnymi vlastnosami, preto ako vhodná metóda na ich stanovenie bola zvolená 

vysoko úinná separaná CZE metóda. Práca sa zaoberala nájdením vhodných separaných podmienok a stanovením 

produktov bázickej hydrolýzy isatín 3-tiosemikarbazónu kapilárnou zónovou elektroforézou (CZE) s UV detekciou. 




- 160 - 

S 

O 

A 

I 

COONa 

NH 2 

O 

NH 2 

COONa 


11. - 14. 10. 2010


CZE separácie boli uskutoované v hydrodynamicky uzatvorenom separanom systéme s potlaeným 

elektroosmotickým tokom (EOF) na elektroforetickom analyzátore v jednokolónovom usporiadaní separanej jednotky. 

Separaná jednotka sa skladala z dávkovaa o objeme 200 nl a kremennej kapiláry. Vnútorný priemer kremennej kapiláry bol 

300 μm. Celková džka kapiláry bola 260 mm (200 mm po detektor). CZE separácie boli monitorované UV detektorom, 

ktorý pracoval pri vlnovej džke 240 nm. CZE separácie boli uskutonené v nosnom elektrolyte s pH = 9,2. Zloženie nosného 

elektrolytu je uvedené v tab. 1. Vo vode rozpustný vysoko molekulový polymér MHEC (M.h.: 30 000) bol použitý na 

potlaenie EOF v separanom systéme v kapiláre. Hnací prúd bol stabilizovaný na 70 μA. 

Tab. 1: Zloženie nosného elektrolytu 

Nosný ión Glycín 

Protiión Bis-tris propán 

EOF supresor Metylhydroxyetylcelulóza 

Aditívum -cyklodextrín 

pH 9,2 


Cieom práce bola separácia a stanovenie rozkladných produktov isatín-3-tiosemikarbazónu (otvorené formy 

(tio)semikarbazónu, isatinát a antranilát). Separácie boli uskutoované v hydrodynamicky uzatvorenom separanom 

systéme s potlaeným EOF. Prídavkom metylhydroxyetylcelulózy do nosného elektrolytu, v ktorom sa uskutonili separácie, 

bolo dosiahnuté potlaenie EOF. Tieto pracovné podmienky všeobecne minimalizujú fluktuácie migraných rýchlostí 

analytov, o umožuje dosiahnu vysoké reprodukovatenosti kvalitatívnych a kvantitatívnych CZE parametrov. 

CZE separácie boli uskutonené pri vysokom pH vodiaceho elektrolytu (9,2) s ohadom na nízke pK hodnoty 

analytov. Rozlíšenie zložiek A a I (obr. 2) bolo dosiahnuté pomocou komplexaného inidla, -cyklodextrínu, ktorý rozdielne 

interagoval s uvedenými zložkami. Zárove toto komplexané inidlo umožnilo rozlíšenie izomérov isatín-3tiosemikarbazónu 

S1 a S2. UV detektor pracoval pri vlnovej džke 240 nm vzhadom na najvyššiu absorbanciu uvedených 

zložiek vo vyšetrovanej UV oblasti od 200 do 260 nm. 

Elektroforeogramy na obr. 3 boli získané z CZE separácií produktov a medziproduktov bázickej hydrolýzy isatín-3tiosemikarbazónu 

v rôznych asových intervaloch. Aktuálne koncentrácie medziproduktov bázickej hydrolýzy isatín-3tiosemikarbazónu 

(0,1 mmol/l) v reaknej zmesi s 10 mmol/l NaOH sú schematicky znázornené na obr. 4. 

UV 240 

5 mUA 

A 

I 

O 

S1 

imp 

S2 

300 600 

Migration time (s) 

900 

Obr. 2. CZE separácia modelovej vzorky (medzi)produktov bázickej hydrolýzy isatín-3-tiosemikarbazónu. 

A –antranilát (20 μmol/l), I – isatinát (10 μmol/l), O – semikarbazón (150 μmol/l) a S1, S2 – izoméry tiosemikarbazónu 

(71 μmol/l a 29 μmol/l). Pracovné a separané podmienky sú uvedené v Experimentálnej asti. 




- 161 - 


11. - 14. 10. 2010

UV 240 

2239 h I 

872 h 

171 h I O 

0 h 

25 mUA 

I 

S1 

300 600 900 

O 

Migration time (s) 

O S1 

S1 

imp 

Obr. 3. Elektroforeogram získaný z CZE analýzy reaknej zmesi v rozdielnom reaknom ase. 

2-(2-aminofenyl)-2-tiosemikarbazidoacetát migroval v dvoch dobre rozlíšených píkoch izomérov S1 + S2. 

Pracovné a separané podmienky sú uvedené v Experimentálnej asti. 

Tab. 2: Reprodukovatenos migraných asov a plôch píkov analytov v modelovej a reaknej zmesi 

Analyt Koncentrácia 

Migraný as Plocha píku n 

(μmol/l) Average RSD Average RSD 

Modelová vzorka 

(s) 

(%) (mVs) (%) 

Antranilát (A) 10 480 0.3 1882 0.4 4 

Isatinnát (I) 5 515 0.2 2362 0.6 4 

Semikarbazón (O) 75 603 0.2 475 2.1 4 

Tiosemikarbazón(S1) 35.5 711 0.2 3021 2.2 4 

Tiosemicarbazón (S2) 14.5 805 0.1 1758 3.4 4 

Antranilát (A) 

Reakná zmes po 2718.5 h 

- - - - - - 

Isatinát (I) - - - - - - 

Semikarbazón (O) 446 623 0.4 2706 2.1 7 

Tiosemikarbazón (S1) 3 703 0.4 907 2.8 7 

Tiosemikarbazón (S2) 105 801 0.4 12189 2.3 7 

n = poet opakovaných meraní; RSD = relatívna štandardná odchýlka. 

Na odhad koncentraných limitov detekcie (cLOD) analytov bol použitý postup známy z eluných 

chromatografických techník. Koncentrané limity detekcie boli v rozmedzí 0,1-1,5 μmol/l, okrem zložky O, ktorú bolo 

možné detekova na cca. 10-krát vyššej koncentranej úrovni.Na základe tohto postupu boli vypoítané nasledujúce cLOD 

hodnoty pre jednotlivé analyty: 0,3 μmol/l pre kyselinu antranilovú, 0,1 μmol/l pre isatinát a 1,0 μmol/l pre otvorený 

tiosemikarbazón (tab. 3). 




- 162 - 

S1 

imp 

imp 

S2 

S2 

S2 


11. - 14. 10. 2010

Séria kalibraných meraní modelových vzoriek analytov v koncentranom rozmedzí 5-200 mol/l pre otvorený 

tiosemikarbazón (S) a 1-50 mol/l pre antranilát (A) a isatinát (I) bola uskutonená za úelom výpotu regresných 

parametrov kalibraných grafov z plôch píkov analytov (tab. 2). Z vysokých hodnôt korelaných koeficientov vyplýva, že 

uvedené analyty je možné spoahlivo kvantifikova v koncentraných intervaloch, v ktorých boli kalibrané iary zostrojené. 

Tab. 3: Parametre regresných rovníc kalibraných iar (Y = aX + b) pre študované analyty a ich detekné limity 

Analyt cLOD 

a 

b 

r n X 

(mol/l) (mVs.l/μmol) (mVs) 

(μmol/l) 

Antranilát (A) 0.3 195.2 -200.9 0.9976 16 5-80 

Isatinát (I) 0.1 502.2 -98.2 0.9985 16 3-40 

Semikarbazón (O) 10.8 7.0 -87.8 0.9975 16 38-600 

Tiosemikarbazón (S1) 1.2 82.7 664.4 0.9958 16 18-284 

Tiosemikarbazón (S2) 0.8 132.1 -245.9 0.9993 16 7-116 

cLOD = koncentraný limit detekcie; a = smernica, b = úsek kalibranej iary, r = korelaný koeficient, n = poet meraní, X 

= koncentraný interval analytov, Y = plocha píku (mVs). 

Záver 

Concentration / mol/l 

400 

300 

200 

100 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

I 

O 

S1+S2 

0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 

Reaction time / h 

Obr. 4. Aktuálne koncentrácie medziproduktov v reaknej zmesi pozostávajúcej z 0,1 mmol/l isatín-tiosemikarbazónu 

v 10 mmol/l NaOH poas 3 mesiacov 

CZE s UV detekciou je vhodná na rýchly monitoring rozkladných produktov isatín-3-tiosemikarbazónu a môže by 

použitá na sledovanie kinetiky rozkladných procesov alších environmentálnych polutantov, resp. biologicky zaujímavých 

látok. 

Túto prácu finanne podporili grantové agentúry VEGA (VEGA 1/0639/08 a VEGA 1/0672/09) a APVV (VVCE-0070-07) a 

Grant Univerzity Komenského . UK/463/2010. 




- 163 - 


11. - 14. 10. 2010

VYUŽITIE ELEKTROFORETICKÉHO IPU PRE STANOVENIE RÔZNYCH BIOMARKEROV V 

NEUROLOGICKEJ DIAGNOSTIKE 

LADISLAV DAN*, MARIÁN MASÁR, DUŠAN KANIANSKY 

Katedra Analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského v Bratislave, Mlynská dolina CH-2, 84215 

Bratislava 

danc@fns.uniba.sk 

Úvod 

Mozgovomiechový mok (celebrospinálny likvor; anglicky: celebrospinal fluid, skratka: CSF) je íra kvapalina, ktorá 

obklopuje centrálnu nervovú sústavu. U dospelého jedinca sa celkový obsah CSF pohybuje v rozmedzí 125-150 ml. Analýza 

zloženia CSF sa využíva pri diagnózach rôznych neurologických ochorení, ako sú skleróza multiplex, bakteriálna 

meningitída, vírusové neuroinfekcie alebo choroby imunitného systému. Zárove, s vývojom sofistikovanejších analytických 

prístupov, sa v CSF proteóme našli nové biomarkery neurologických ochorení. Uvedená práca sa zameriava na zónovo 

elektroforetické (ZE) stanovenie kyseliny oxálovej, citrónovej, glykolovej, mlienej a 2- a 3- hydroxymaslovej v CSF na 

elektroforetickom ipe so systémom spájania separaných kanálikov (“column coupling” chip) a vodivostnou detekciou. 

Uvedené kyseliny sú potenciálnymi biomarkermi pre diagnostiku niektorých neurologických ochorení a metabolických 

porúch. Napríklad relatívne vysoká koncentrácia kyseliny mlienej v CSF bola nameraná u pacientov s bakteriálnou a 

fungicídnou meningitídou, nedostatkom pyruvát dehydrogenázy a poruchami v dýchacom reazci. Znížená úrove kyseliny 

citrónovej a mlienej v likvori, bola zistená u pacientov s Huntingtonovou choreou (degeneratívne poruchy centrálneho 

nervového systému). Zvýšená koncentrácia kyseliny 2- a 3-hydroxymalovej a kyseliny glykolovej bola nameraná u pacientov 

s diagnózou L-2-hydroxyglutárová acidúria [1]. 


ZE a ZE-ZE separácie boli realizované na polymetylmetakrylátovom (PMMA) CE ipe, so spájanými separanými 

kanálikmi (CC) a integrovanými vodivostnými detektormi. CC ip bol vyrobený firmou Merck (Darmstadt, Nemecko). Na 

obr. 1. je znázornené schematické usporiadanie kanálikov. 

BE 

S 

S 

BF 

C2 

D1 

C1b 

W 

Obr. 1. Schéma PMMA ipu so spájanými separanými kanálikmi 

C1a = predná (separaná) as prvého separaného kanálika (4,5 l objem; 59 × 0,2-0,5 × 0,14-0,2 mm [džka × šírka × 

hrúbka]) s platinovým vodivostným senzorom D1; C1b = zadná as prvého separaného kanálika (9,8 l objem; 60 × 0,2- 

0,5 × 0,2-0,38 mm); S = dávkovací kanálik (900 nl objem; 12 × 0,2-0,5 × 0,2 mm); C2 = druhý separaný kanálik (4,3 l 

objem; 56 × 0,2-0,5 × 0,14-0,2 mm) s platinovým vodivostným senzorom D2; BF = bifurkaná oblas; BE, S = vstupy pre 

roztoky nosného elektrolytu a vzorky do kanálikov. W = výstup z kanálikov do odpadovej nádobky. 

ZE a ZE-ZE separácie boli uskutoované pri pH ~ 5,5 za použitia bis-tris-propánu, ako protiiónu, ktorý umožnil 

rozlíšenie šaveanu od chloridu (typická makrozložka v likvori). Vzorky likvoru boli odoberané na 1. Neurologickej klinike 

Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. Vzorky boli cca. 100-krát zriedené deionizovanou vodou a priamo 

analyzované bez alších predúpravných krokov. 




- 164 - 

C1a 

D2 

BE 

BE 


11. - 14. 10. 2010


Na obr. 2 sú znázornené jednotlivé pracovné kroky ZE (schéma A) a ZE-ZE (schéma B) separácií. V oboch prípadoch 

boli oba kanáliky naplnené identickým nosným elektrolytom. Schéma A na obr. 2 ukazuje využitie CC ipu 

v jednokolónovom usporiadaní, kde na separáciu jednotlivých zložiek vzorky sa využíva separaná dráha oboch separaných 

kanálikov. V prípade, ak je potrebné uskutoni „on-column“ istenie vzorky (sample clean-up), je možné použi CC ip 

v dvojkolónovom usporiadaní (schéma B na obr. 2). Použitím správneho asovo riadeného programu analýzy a prepínania 

smeru hnacieho prúdu je možné odvies interferujúce zložky matrice v prvom separanom kanáliku a uskutoni prenos len 

analyticky dôležitých zložiek do druhého kanálika na ipe pred ich separáciou a detekciou (kroky 3B-5B na obr. 2). 

2A 

3A 

BE S 

A+M 

1 

i 

i 

C1b 

S 

BE 

C1a 

ZE 

A A A x 2 1 

M 

BE 

C2 

D1 D2 

2B 

3B 

4B 

5B 

ZE-ZE 

BE S 

A+M 

i 

A A A M 

x 2 1 

i 

A x A2 A 1 

Obr. 2. Sekvencia pracovných krokov v ZE a ZE-ZE separáciách na CC ipe 

1 = poiatoné usporiadanie roztokov v kanálikoch. ZE separácia: 2a = poiatoná fáza separácie so zakoncentrovaním 

vzorky (S) elektrickým poom; 3a = ZE separácia a detekcia jednotlivých zložiek vzorky vodivostným detektorom D2. ZE- 

ZE separácia: 2b = rovnako ako v 2a; 3b = ZE separácia v prvom kanáliku s odstránením matricových zložiek migrujúcich 

pred analytmi (A1-A x); 4b = prenos analytov (A 1-A x) do druhého separaného kanálika (zmena smeru hnacieho prúdu); 5b = 

ZE separácia a detekcia prenesených zložiek v druhom separanom kanáliku. C1a, C1b = predná a zadná as prvého 

separaného kanálik; C2 = druhý separaný kanálik; D1, D2 = detekné senzory v C1 a C2; BE S = nosný elektrolyt 

prispôsobený zloženiu vzorky (S); A1-Ax = analyty; M = matricové zložky nachádzajúce sa vo vzorke; i = smer hnacieho 

prúdu. 

Pri návrhu a optimalizácii ZE separaného systému pre stanovenie študovaných organických kyselín v likvori na CC 

ipe sme vychádzali z práce Ramautara a kol. [1]. Na obr. 3 je znázornený elektroforeogram zo ZE separácie organických 

kyselín v prítomnosti 55 mg/l chloridu v takto optimálnom nosnom elektrolyte. 




- 165 - 

i 

i 

A A x 2 

A 1 M 


11. - 14. 10. 2010

a 

G 

b 

O 

imp 

imp 

100 200 300 400 

C 

G 

10 mV 

t m (s) 

Obr. 3. ZE separácie organických kyselín v optimálnom nosnom elektrolyte pri pH = 5,5 

Separácie boli uskutonené v nosnom elektrolyte pri pH =5,5. Dávkovaná vzorka: (a) 55 mg/l chlorid (slepý pokus); (b) 55 

mg/l chlorid, 0,5 mg/l oxalát, 2,5 mg/l citrát, 1,5 mg/l glykolát, laktát, 2- a 3-hydroxybutyrát. 2. Imp = neidentifikovaná 

neistota. 

Za preferovaných separaných a pracovných podmienok bola v optimalizovanom nosnom elektrolyte pri pH = 5,5 

uskutonená séria ZE opakovaných meraní s analytmi nachádzajúcimi sa v modelových vzorkách na nasledujúcich 

koncentraných úrovniach: 0,2 mg/l oxalát, 0,7 mg/l citrát, 0,6 mg/l glykolát, 1,0 mg/l laktát, 3,0 mg/l 2-hydroxybutyrát a 3,5 

mg/l 3-hydroxybutyrát spolu s 55 mg/l chloridu reprezentujúceho makrozložku v CSF. Koncentrácie analytov v modelových 

vzorkách boli zvolené na nižších úrovniach vzhadom na ich koncentrané úrovne v reálnych vzorkách pri ich cca. 50- až 

100-násobnom zriedení. V tab. 1 sú uvedené dlhodobé opakovatenosti kvalitatívnych a kvantitatívnych parametrov ZE 

separácií v týchto modelových vzorkách. Parametre dlhodobej opakovatenosti boli vypoítané z 20 ZE opakovaných meraní 

uskutonených v priebehu piatich dní, priom pred každou sériou meraní boli pripravené nové roztoky elektrolytov a 

modelových vzoriek. 

Výsledky v tab. 1 ukazujú vysokú opakovatenos migraných asov analytov, ke ich RSD hodnoty sa pohybovali 

v rozmedzí 0,4-0,8 %.RSD hodnoty plôch píkov analytov sa pohybovali v priemere cca. 7 %. Vyššia RSD hodnota plochy 

píku pre citrát (18,8 %) súvisí s relatívne nízkou koncentráciou tohto analytu v modelovej vzorke a tým aj malej priemernej 

hodnoty plochy píku. 

Na odhad LOD boli uskutonené ZE separácie s modelovými vzorkami obsahujúcimi analyty na nasledujúcich 

koncentraných úrovniach: 50-400 g/l oxalát, 200-1400 g/l citrát, 200-1300 g/l glykolát, 200-2000 g/l laktát, 700-6100 

g/l 2-hydroxybutyrát a 900-7100 g/l 3-hydroxybutyrát a chlorid o koncentrácii 55 mg/l reprezentujúci makrozložku v CSF. 

V tab. 2 sú uvedené hodnoty LOD pre jednotlivé analyty. 

Tab. 1: Opakovatenosti migraných asov a plôch píkov organických kyselín v modelových vzorkách 

Analyt 

Migraný as Plocha píku 

c n 

Priemer RSD 

Priemer RSD 

(s) 

(%) 

(mVs) 

(%) (mg/l) 

oxalát 190,2 0,4 17,1 6,1 0,2 20 

citrát 248,9 0,6 2,0 18,8 0,7 20 

glykolát 262,7 0,6 19,5 5,3 0,6 20 

laktát 299,6 0,8 27,0 10,6 1,0 20 

2-hydroxybutyrát 331,0 0,7 31,8 7,1 3,0 20 

3-hydroxybutyrát 367,5 0,6 22,2 6,7 3,5 20 

n = poet meraní; RSD = relatívna smerodajná odchýlka. 




- 166 - 

L 

2H 

3H 


11. - 14. 10. 2010

Tab. 2: Parametre regresných rovníc (Y = aX + b) pre organické kyseliny v modelových vzorkách a odhad ich detekných 

limitov 

Analyt a 

b 

r n X 

LOD 

(mVs.l/mg) (mVs) 

(mg/l) 

(g/l) (mol/l) 

Oxalát 93,16 -1,09 0,9995 29 0,05-1,5 8 0,1 

Citrát 18,44 -12,32 0,9971 24 0,7-4,0 72 0,4 

Glykolát 43,67 -6,35 0,9993 29 0,6-4,6 35 0,5 

Laktát 30,39 -1,31 0,9977 29 1,0-7,5 53 0,6 

2-hydroxybutyrát 15,89 -20,65 0,9985 29 3,0-22,5 155 1,5 

3-hydroxybutyrát 12,50 -25,31 0,9986 29 3,5-26,3 220 2,1 

a = smernica; b = úsek kalibraného grafu; r = korelaný koeficient; X = koncentraný interval analytov; n = poet meraní; 

LOD = detekný limit. 

Aplikané možnosti navrhnutej ZE metódy sme testovali na 9 vzorkách CSF. Vzorky CSF boli odobraté v laboratóriu 1. 

neurologickej kliniky Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. Na obr. 4 sú elektroforeogramy zo ZE 

separácií identickej vzorky CSF (vzorka . 14), ktorá bola zriedená 25-, 50- a 100-krát. Tieto elektroforeogramy ilustrujú 

vplyv rýchlosti destackingu (rýchlos rozpadu izotachoforetickej migranej konfigurácie) na rozlíšenie oxalátu od chloridu. 

G 

a 

b 

c 

O 

O 

imp 

imp 

O* 

imp 

C G 

G* 

C 

100 200 300 400 

t m (s) 

Obr. 4. ZE separácie organických kyselín prítomných vo vzorke CSF . 14 o rozdielnom riedení 

Separácie boli uskutonené v nosnom elektrolyte pri pH =5,5. Dávkovaná vzorka .14: (a) 25-krát riedená; (b) 50-krát 

riedená; (c) 100-krát riedená. Imp = neidentifikovaná neistota. 




C 

- 167 - 

G 

L 

L 

5 mV 

L 


11. - 14. 10. 2010

Elektroforeogramy na obr. 5 ukazujú typické ZE profily vzoriek CSF (vzorky . 1, 4, 7, 12, 14, 20 a 25) pri ich 100násobnom 

zriedení. Zo ZE profilov vzoriek je zrejmé, že navrhnutá metóda sa vyznauje dobrou selektivitou . 

G 

a 

b 

c 

d 

e 

f 

g 

O 

O* 

O 

O 

O 

O 

O 

10 mV 

imp 

imp 

imp 

imp 

imp 

imp 

imp 

C 

C 

C 

C 

C 

C 

C 

100 200 300 400 

Obr. 5. ZE profily analyzovaných vzoriek CSF 

Separácie boli uskutonené v nosnom elektrolyte pri pH =5,5. Všetky vzorky boli 100-krát riedené. Vzorka .: (a) 1, (b) 4, (c) 

7, (d) 12, (e) 14, (f) 20, (g) 25. Imp = neidentifikovaná neistota. 

Vo vzorke CSF . 7 boli vyhodnocované dlhodobé opakovatenosti migraných asov a plôch píkov analytov. 

Výsledky sú uvedené v tab. 3. ). RSD hodnoty migraných asov analytov boli 0,4 % a ich korešpondujúce plochy píkov sa 

reprodukovali s RSD hodnotami v rozmedzí 1,9-9,4 %. 




t m (s) 

- 168 - 

L 

L 

L 

L 

L 

L 

L 


11. - 14. 10. 2010

Tab. 3: Opakovatenosti migraných asov a plôch píkov organických kyselín v CSF 

Analyt 

Migraný as Plocha píku 

c n 

Priemer RSD 

Priemer 

RSD 

(s) 

(%) 

(mVs) 

(%) (mg/l) 

Oxalát 179,3 0,4 3,1 9,4 0,05 10 

Citrát 243,1 0,4 16,3 4,4 1,6 10 

Glykolát - - - - - 10 

Laktát 294,5 0,4 44,8 1,9 1,5 10 

2-hydroxybutyrát - - - - - 10 

3-hydroxybutyrát - - - - - 10 

n = poet meraní; RSD = relatívna smerodajná odchýlka. Vzorka CSF . 7 bola 100-krát zriedená. 

Koncentrácie organických kyselín prítomných v analyzovaných vzorkách CSF boli stanovované metódou kalibranej 

krivky. Výsledky sú uvedené v tab. 4. Priemerné koncentrácie organických kyselín stanovených ZE metódou na CC ipe sú 

v dobrej zhode s údajmi publikovanými v práci [1]. V súasnosti nie sú publikované referenné hodnoty pre obsah 

organických kyselín v CSF, preto je vemi problematické akýmkovek spôsobom interpretova namerané údaje. Hodnoty 

výažností pre organické kyseliny zosumarizované v tab. 4 (96-117 %) indikujú správnos analytických výsledkov. 

Tab. 4: ZE stanovenie organických kyselín vo vzorkách CSF 

Analyt Parameter Vzorka .: 

1 7 14 20 24 25 

DF 100 100 100 100 100 100 

Oxalát 

c±SD (mg/l) 4,5±0,3 4,5±0,3 5,1±0,2 7,3±0,4 9,0±0,5 8,7±0,7 

R (%) 99 - - - 96 107 

Citrát 

c±SD (mg/l) 134,7±5,2 155,4±3,9 103,7±3,1 116,7±4,1 139,8±3,3 105,9±3,1 

R (%) 99 - - - 106 103 

Glykolát 

c±SD (mg/l) - - - - - - 

R (%) 117 - - - 96 93 

Laktát 

c±SD (mg/l) 212±4,4 151,6±2,7 113,1±7,0 141,8±2,8 100,7±1,5 106,1±2,6 

R (%) 102 - - - 108 92 

2-hydroxybutyrát c±SD (mg/l) - - - - - - 

R (%) 112 - - - 108 112 

3-hydroxybutyrát 

c±SD (mg/l) - - - - - - 

R (%) 99 - - - 104 97 

c = priemerná hodnota koncentrácie analytu stanovenej vo vzorke; R = výažnos. 

V prípade, ak sa analyty nachádzajú vo vzorke na nízkych koncentraných úrovniach spolu s vekým nadbytkom 

makrozložiek, len zriedenie vzorky (zníženie koncentrácie makrozložiek a s tým spojené zníženie koncentrácie analytu na 

úrove, ke už nie je kvantifikovatený, resp. detekovatený) neposkytne adekvátny analytický výsledok. Toto je prípad 

separácie oxalátu od chloridu vo vzorkách CSF. Ako už bolo spomenuté vyššie, jednou z možností riešenia tohto problému je 

použitie CC ipu v režime „column-switching“. Schéma B na obr. 2 názorne ukazuje jednotlivé pracovné kroky v ZE-ZE 

separáciách na takomto ipe. Využitie ZE-ZE prístupu v analýze organických kyselín v CSF je ukázané na obr. 5. 

Z elektroforeogramu na obr. 5a je zrejmé, že ak sa CC ip použije v jednokolónovom usporiadaní separaných kanálikov, t.j. 

celá dávkovaná vzorka sa prenesie do druhého separaného kanálika, separaná dráha na CC ipe nie je postaujúca na úplný 

destacking oxalátu od chloridu (vi vyššie). Odvedenie cca. 97-99 % chloridu v prvom separanom kanáliku umožnilo 

rozlíšenie oxalátu od chloridu bez jeho straty v druhom separanom kanáliku na CC ipe pracujúcom v režime „columnswitching“ 

(obr. 5b a 5c). Elektroforeogram na obr. 5d ukazuje situáciu, ke pri odvedení väšieho množstva chloridu 

v prvom separanom kanáliku, došlo k úplnej strate oxalátu v druhom separanom kanáliku. Kvantitatívne údaje zo ZE a ZE- 

ZE stanovenia organických kyselín vo vzorkách CSF . 1 a 17 sú uvedené v tab. 5. 




- 169 - 


11. - 14. 10. 2010

G 10 mV 

a 

b 

c 

d 

O 

O 

imp 

imp 

imp 

O 

C 

G 

G 

C 

G 

C 

imp 

L 

L 

L 

C G 

100 200 300 400 

t m (s) 

Obr. 5. ZE a ZE-ZE separácie organických kyselín prítomných vo vzorke CSF . 17 

Separácie boli uskutonené v nosnom elektrolyte pri pH =5,5. Vzorka .17 bola 50-krát riedená. V prvom separanom 

kanáliku bolo odvedených (a) 0 %, (b), 97 % (c) 99 % a (d) 99,5 % chloridov (hlavná makrozložka). 

Tab. 5: Porovnanie ZE a ZE-ZE stanovenia organických kyselín vo vzorkách CSF 

Analyt Parameter Vzorka . 

1 a 1 b 17 a 17 b 

DF 100 25 50 50 

Oxalát c±SD (mg/l) 4,5±0,3 4,2±0,2 4,5±0,5 5,4±0,4 

Citrát c±SD (mg/l) 134,7±5,2 126,5±9,2 66,2±2,3 62,9±1,6 

Glykolát c±SD (mg/l) - - 10,8±0,9 11,3±0,6 

Laktát c±SD (mg/l) 212±4,4 215,0±1,9 90,8±12,1 106,5±0,6 

2-hydroxybutyrát c±SD (mg/l) - - - - 

3-hydroxybutyrát c±SD (mg/l) - - - - 

a b 

ZE a. ZE-ZE separácie boli uskutonené v elektrolytovom systéme pri pH = 5,5. c = priemerná hodnota koncentrácie 

analytu stanovenej vo vzorke. 

Záver 

Práca sa zaoberala stanovením vybraných organických kyselín (kyselina oxálová, glykolová, citrónová, mliena, 2- a 3hydroxymaslová) 

vo vzorkách CSF na PMMA CC ipe s vodivostnou detekciou (obr. 1). ZE a ZE-ZE separácie organických 

kyselín boli uskutonené na identickom CC ipe. ZE separácie boli uskutoované pri pH = 5,5. Na rozlíšenie oxalátu od 




- 170 - 

L 


11. - 14. 10. 2010

chloridu, typickej makrozložky v CSF, bol použitý dvojmocný BTP, ktorý plnil zárove funkciu protiiónu v nosnom 

elektrolyte. ZE separácie boli uskutoované v hydrodynamicky uzatvorenom separanom systéme na CC ipe s potlaeným 

EOF [2]. Preferované pracovné podmienky umožnili dosiahnu dlhodobo vysokú reprodukovatenos migraných asov pre 

modelové analyty (do 0,8 % RSD). Dlhodobé reprodukovatenosti ich plôch píkov boli cca. 7 % RSD. Analytické využitie 

navrhnutej ZE metódy bolo ukázané na 9 vzorkách normálneho CSF. Vzorky boli zriedené cca. 100-krát a priamo 

analyzované bez alšej predúpravy. Dlhodobé opakovatenosti migraných asov organických kyselín v CSF nepresiahli 0,4 

% RSD, zatia o RSD hodnoty plôch ich píkov sa pohybovali v rozsahu 1,9-9,4 % (tab. 3). Vyššie RSD hodnoty boli 

typické pre analyty nachádzajúce sa v CSF na nízkych koncentraných úrovniach. Problém stanovenia mikrozložky (oxalát) 

veda vekého nadbytku makrozložky (chlorid) v CSF len sasti riešilo vhodné zriedenie vzorky. Efektívnym nástrojom 

zníženia koncentrácie makrozložky bolo použitie CC ipu v režime „column-switching“, ktoré umožnilo odvies cca. 97-99 

% chloridu v prvom separanom kanáliku a prepnutím smeru hnacieho prúdu boli do druhého separaného kanálika 

prenesené iba analyticky významné zložky bez ich straty (obr. 5). Hodnoty výažností (96-117 %) pre organické kyseliny 

(tab. 4) však poukazujú na správnos analytických výsledkov ZE stanovenia organických kyselín v CSF. 

Literatúra 

[1] R. Ramautar, G.W. Somsen, G.J. De Jong, Anal. Bioanal. Chem. 387 (2007) 293. 

[2] D. Kaniansky, M. Masár, R. Bodor, M. Žúborová, E. Ölvecká, M. Jöhnck, B. Stanislawski, Electrophoresis 24 (2003) 

2208. 

Táto práca bola finanne podporená projektmi VEGA 1/0672/09, GUK445/2010 a VVCE-0070-07. 




- 171 - 


11. - 14. 10. 2010

RÝCHLY MONITORING ANIÓNOV A KATIÓNOV V PITNÝCH VODÁCH ZÓNOVOU ELEKTROFORÉZOU 

NA IPE S VODIVOSTNOU DETEKCIOU 

MILAN LUC * , MARIÁN MASÁR, DUŠAN KANIANSKY 


Bratislava 

e-mail luc@fns.uniba.sk 

Úvod 

Kontrola kvality pitnej vody je už cca. 30 rokov úzko spätá s vývojom nových analytických metód stanovenia rôznych 

zložiek (prirodzene zastúpené látky a kontaminanty) v pitných vodách a exaktného urenia ich maximálnych koncentraných 

limitov (MCL). Výsledkom tohto spojenia je zlepšenie ochrany zdravia udí pred rôznymi ochoreniami pochádzajúcimi 

z konzumácie vody [1]. 

V USA zabezpeuje kontrolu a validáciu nových metód stanovenia rôznych zložiek v pitných vodách Agentúra pre 

ochranu životného prostredia (United States Environmental Protection Agency, US EPA). V Európskej únii sa týmto 

problémom venuje „Smernica Európskej únie o pitnej vode“ (Drinking water directive, DWD). Výsledkom ich inností je 

súbor smerníc, ktoré riešia problematiku spojenú s pitnou vodou, ako napr. klasifikácia jednotlivých chemických látok 

prítomných vo vodách, ich efekt na udské zdravie, maximálne prípustné hodnoty (MCL) ako aj výber vhodných 

analytických metód na kontrolu, monitoring a reguláciu látok v pitných vodách [1]. 

Medzi hlavné indikátory kvality pitných vôd možno zaradi majoritne zastúpené katióny (sodný, vápenatý a horenatý) 

spolu s amónnym a draselným katiónom, ako aj majoritne zastúpené anióny (chlorid, dusinan a síran). Dominantnou 

analytickou metódou na ich stanovenie v rutinnej analytickej kontrole je iónová chromatografia (IC), ktorú Medzinárodná 

organizácia pre štandardizáciu (International Organization for Standardization, ISO) urila ako referennú metódu ich 

stanovenia v pitných vodách [2,3]. Napriek tomu metódy kapilárnej elektroforézy (CE) poskytujú vhodnú alternatívu k IC 

vzhadom na ionogénny charakter vyššie uvedených látok [4], a to aj napriek uritým obmedzeniam z hadiska nízkej 

separanej kapacity konvennej CE s otvorenými separanými systémami [5]. V uzatvorených CE separaných systémoch 

bolo prezentovaných niekoko analytických metód na stanovenie majoritne zastúpených katiónov alebo aniónov vo vodách 

[6-9]. S rozvojom miniaturizovaných analytických systémov (MAS), kde CE zaujíma dominantnú pozíciu vzhadom na jej 

najvyššiu kompatibilitu s tzv. totálnymi miniaturizovanými analytickými systémami, boli prezentované práce venujúce sa CE 

stanoveniam katiónov alebo aniónov v pitných vodách na ipoch [9-11]. So zdokonaujúcou sa ipovou technológiu bol 

predstavený CE ip s duálnym protismerným dávkovaním vzorky, ktorý umožuje súasné stanovenie katiónov aj aniónov 

[12]. 

Naša práca sa venovala vývoju nových CE metód na báze ipov s „column-coupling“ (CC) technikou pracujúcich 

v uzatvorenom separanom systéme [9]. Hlavným cieom bol vývoj vhodných analytických metód, ktoré umožujú 

sekvenné stanovenie anionických (chlorid, dusinan, síran) a kationických (amoniak, draslík, horík, sodík, vápnik) 

makrozložiek v pitných vodách vzhadom na rozdielne koncentrané zastúpenie študovaných katiónov a aniónov. 


Pre separácie bol použitý polymetylmetakrylátový (PMMA) CC ip s uzatvoreným separaným priestorom 

a integrovanou vodivostnou detekciou [3]. CC ip bol spojený s CE platformou, ktorej súasou boli aj peristaltické 

mikropumpy, ktoré zabezpeovali naplnenie ipu príslušnými elektrolytmi a vzorkou a po skonení plniaceho kroku 

uzatvárali separaný priestor [3]. Externé Pt membránové elektródy zabraovali prieniku bublín vznikajúcich pri 

elektródových reakciách do separaného priestoru na CC ipe. Vodivostné senzory boli umiestnené na koncoch oboch 

separaných kanálikov. 

Koncentrácie študovaných kationických makrozložiek (draslík, horík, sodík, vápnik spolu s amoniakom, ktorý bol 

zastúpený na nižších koncentraných úrovniach) sú v pitných vodách ovea vyššie v porovnaní s koncentráciami 

študovaných anionických makrozložkiek (dusinan, chlorid, síran), pretože uhliitan, ktorý nebol predmetom nášho záujmu, 

je v tomto type matrice najviac „zastúpeným“ aniónom. Preto pre stanovenie uvedených kationicky a anionicky migrujúcich 

iónov v pitných vodách sú zrieovacie faktory pre anióny a katióny znane rozdielne a ich sekvenné stanovenie je ovea 

výhodnejšie v porovnaní so simultánnym stanovením v jednom experimente. 


Zónovo-elektroforetické (ZE) separácie na CC ipe s vodivostnou detekciou boli realizované sekvenne s dvoma 

rozdielnymi nosnými elektrolytmi (jeden pre katióny, druhý pre anióny), ktoré implementovali rozdielne separané 

mechanizmy pre katióny a anióny. V ZE separáciách bol CC ip použitý v jednokolónovej („single-column“) konfigurácii 

separaných kanálikov, priom separácie boli monitorované vodivostným detektorom umiestneným v druhom separanom 

kanáliku. ZE separácie boli uskutonené za nasledujúcich preferovaných pracovných podmienkach: (i) potlaený 

hydrodynamický tok (HDF) a (ii) potlaený elektroosmotický tok (EOF). Hnací prúd pri separáciách bol urený na 40 A. 

ZE separácie aniónov boli realizované v nosnom elektrolyte o pH 4,2 s prídavkom zwitterionického additíva (DDAPS), 

ktoré zabezpeovalo dostatoné rozlíšenie anionických analytov. ZE separácie katiónov boli realizované v nosnom 

elektrolyte o pH 3,2 a úplné rozlíšenie kationických analytov zabezpeoval prídavok 18-crown-6-éteru. Súasne, do 




- 172 - 


11. - 14. 10. 2010

kationického roztoku elektrolytu bol pridaný trietyléntetraamín (TETA), ktorý vemi efektívne potlail adsorpciu 

študovaných katiónov na povrch vnútorných stien separaných kanálikov PMMA ipu. Na potlaenie elektroosmotického 

toku bol pridaný do roztokov oboch elektrolytov vysokomolekulový polymér: metylhydroxyetylcelulóza (MHEC). 

Elektroforeogramy zo ZE separácií študovaných aniónov a katiónov prítomných v modelových vzorkách na sub-ppm 

koncentraných úrovniach sú zobrazené na Obr. 1. Zloženie a vodivos jednotlivých nosných elektrolytov bolo 

optimalizované aj na základe oakávaných koncentraných úrovní študovaných katiónov a aniónov vo vzorkách pitných vôd. 

ANIÓNY KATIÓNY 

- D1 D2 D1 D2 

+ + 

- 

Cl 

Cl 

NO 

2 

NO 

SO 

3 

2 

NO 

4 

 

2 

NO 

SO 

3 

2 

4 

NE 

VÝMENA 

60 s 

NH + 

NH 

4 

+ 

4 

Ca 2+ 

Ca 2+ 

Mg 2+ 

Mg 2+ 

Na + 

Na + 

200 500 800 t (s) 

Obr. 1 ZE separácie modelových vzoriek aniónov a katiónov na CC ipe 

ZE separácie boli realizované v anionickom a kationickom nosnom elektrolyte pri hnacom prúde 40 A. Koncentrané 

zastúpenie jednotlivých analytov v modelových vzorkách bolo 0,5 mg/l. 

S ohadom na objem dávkovanej vzorky (900 nl), použitý typ detekcie (kontaktná vodivostná detekcia) a spôsob 

zakoncentrovania vzorky (zakoncentrovanie elektrickým poom, ke bola vzorka dávkovaná do zriedeného nosného 

elektrolytu) bol odhadnutý koncentraný detekný limit pre jednotlivé študované anióny na úrovni cca. 100 g/l. Za 

identických pracovných podmienok bol koncentraný detekný limit pre jednotlivé katióny odhadnutý na cca. 10 g/l. 

Opakovatenosti kvalitatívnych a kvantitatívnych parametrov analytov za preferovaných pracovných a separaných 

podmienok (potlaený HDF a EOF v uzatvorenom separanom priestore CC ipu) boli vyhodnocované zo série opakovaných 

ZE separácií aniónov a katiónov na rôznych koncentraných úrovniach (Tab 1). 

Tab. 1: Opakovatenosti migraných asov a plôch píkov analytov zo ZE separácií modelových vzoriek 

Analyt 

Migraný as 

Priemer (s) RSD (%) 

Plocha píku 

Priemer (mVs) RSD (%) 

Koncentrácia 

(mg/l) 

Poet meraní 

Chlorid 

275 

322 

0,1 

0,1 

226,0 

2658,4 

0,8 

1,3 

5,2 

60,3 

3 

3 

Síran 

343 

385 

0,3 

0,3 

139,9 

1725,3 

0,7 

1,6 

5,2 

60,2 

3 

3 

Dusinan 

399 

412 

0,1 

0,2 

11,9 

431,7 

2,7 

0,7 

0,6 

20,7 

3 

3 

Amoniak 

177 

165 

0,5 

0,2 

9,2 

156,3 

3,8 

0,8 

0,05 

1,0 

4 

4 

Vápnik 

195 

183 

0,5 

0,5 

12,9 

171,5 

1,5 

2,0 

0,05 

1,0 

4 

4 

Horík 

210 

195 

0,4 

0,5 

19,5 

347,2 

2,8 

1,2 

0,05 

1,0 

4 

4 

Draslík 

314 

298 

0,8 

0,6 

10,1 

183,9 

3,8 

1,2 

0,05 

1,0 

4 

4 

Sodík 

234 

221 

0,6 

0,6 

8,7 

206,9 

2,8 

1,7 

0,05 

1,0 

4 

4 

RSD = relatívna štandardná odchýlka, ZE separácie boli realizované v anionickom a kationickom nosnom elektrolyte pri 

hnacom prúde 40 A. 




- 173 - 

K + 

K + 


11. - 14. 10. 2010

V ZE stanoveniach aniónov pri 3 opakovaných meraniach sa RSD hodnoty ich migraných asov pohybovali 

v rozmedzí 0,1-0,3 % pre obe koncentrané úrovne anionických analytov. Opakovatenosti plôch píkov aniónov boli 

v rozmedzí 0,7-2,7 % RSD pre nižšie koncentrácie a 0,7-1,6 % RSD pre vyššie koncentrácie. V ZE stanoveniach katiónov sa 

RSD hodnoty ich migraných asov pohybovali do 0.8 % pre obe koncentrané úrovne. RSD hodnoty plôch píkov katiónov 

prítomné v modelových vzorkách o 0,05 mg/l koncentráciách sa pohybovali v rozmedzí 1,5-3,8 %. RSD hodnoty plôch píkov 

katiónov pre ich 1 mg/l koncentrácie neprekroili 2,0 %. 

Analytické možnosti prezentovaných metód boli demonštrované v analýzach troch vzoriek pitných vôd (vodovodná 

voda a minerálne vody „Mitická“ a „Bonaqua“). Predúprava vzoriek pitných vôd bola asovo a technicky nenároná a 

spoívala iba v ich odplynení pomocou ultrazvuku a vhodného zriedenia. 

Pitná voda 

Miticka 

Bonaqua 

ANIÓNY KATIÓNY 

Cl SO 2 

Cl 4 

SO 2 

4 

NE 

VÝMENA 

NO 

NO 

3 

 

3 

60 s 

Ca 2+ 

Ca 2+ 

Mg 2+ 

Mg 2+ 

Na + 

Na + 

200 400 600 50 800 250 t (s) 450 800 

Obr. 2: ZE separácie aniónov a katiónov vo vzorkách pitnej vody 

ZE separácie boli realizované v anionickom a kationickom nosnom elektrolyte pri hnacom prúde 40 A. 

Vzhadom na rozdielne koncentrané zastúpenie kationických analytov v minerálnych vodách boli ZE separácie katiónov 

uskutonené pri dvoch rozdielnych zriedeniach vzorky. Vypoítané obsahy aniónov a katiónov v pitných vodách získané zo 

ZE stanovení na CC ipe vemi dobre korešpondovali s ich hodnotami deklarovanými výrobcami (Tab. 2). Výažnosti 

katiónov v ich ZE stanoveniach sa pohybovali v rozmedzí 96-104 %. Elektroforeogramy zo ZE separácií vzoriek pitných vôd 

sú znázornené na Obr. 2. Dosiahnuté výsledky poukazujú na praktickú aplikovatenos tohto analytického prístupu do 

rutinných resp. monitorovacích analýz. 




- 174 - 

K + 

K + 


11. - 14. 10. 2010

Tab. 2: Stanovenie aniónov a katiónov vo vzorkách pitnej vody 

Vzorka Analyt Stanovené ± SD Deklarované Výažnos Zrieovací 

(mg/l) 

(mg/l) 

faktor 

Chlorid 21,0 ± 0,2 - - neriedené 

Síran 36,3 ± 0,2 - - neriedené 

Dusinan 11,7 ± 0,3 - - neriedené 

Pitná voda 

Amoniak 

Vápnik 

- 

62,7 ± 1,2 

- 

- 

106 

104 

20 

200 

Horík 11,2 ± 0,4 - 99 200 

Draslík 2,5 ± 0,1 - 96 20 

Sodík 12,7 ± 0,4 - 102 200 

Chlorid 18,0 ± 0,1 18,6 - 3 

Síran 19,5 ± 0,2 17,7 - 3 

Dusinan 3,0 ± 0,1 4,1 - 3 

Miticka 

Amoniak 

Vápnik 

- 

264,3 ± 1,7 

- 

262,9 

104 

98 

75 

200 

Horík 70,1 ± 0,7 88,5 101 200 

Draslík 3,1 ± 0,1 2,2 101 75 

Sodík 29,6 ± 0,3 29,6 100 75 

Chlorid 2,5 ± 0,0 3,2 - neriedené 

Síran 14,8 ± 0,3 17,8 - neriedené 

Dusinan 9,3 ± 0,2 8,2 - neriedené 

Bonaqua 

Amoniak 

Vápnik 

- 

68,3 ± 0,7 

- 

62,1 

101 

94 

25 

75 

Horík 38,9 ± 0,6 41,0 93 75 

Draslík 1,1 ± 0,1 0,6 95 25 

Sodík 1,6 ± 0,1 2,5 101 25 

SD = štandardná odchýlka. ZE separácie boli realizované v anionickom a kationickom nosnom elektrolyte pri hnacom prúde 

40 A. 

Záver 

Táto práca sa zaoberala ZE separáciami aniónov (dusinan, chlorid, síran) a katiónov (amoniak, draslík, horík, sodík 

a vápnik) na CC ipe s integrovanou vodivostnou detekciou. V dôsledku rozdielneho koncentraného zastúpenia jednotlivých 

skupín analytov je potrebné uskutoni ich ZE stanovenie v sekvencii s rôznymi riedeniami identickej vzorky. ZE separácie 

boli realizované v dvoch rozdielnych kationických a anionických elektrolytoch, v ktorých boli aplikované rozdielne 

separané mechanizmy pre úplné rozlíšenie jednotlivých skupín analytov. Za preferovaných pracovných podmienok 

(potlaený HDF a EOF) boli dosiahnuté vemi dobré reprodukovatenosti ich stanovenia (RSD plôch píkov 0,7-2,7 % pre 

anióny a 0,8-3,8 % pre katióny) bez použitia asovo náronej predúpravy vzoriek (odplynenie a vhodné zriedenie). 

Prezentované ZE metódy stanovenia majoritne zastúpených kationicky a anionicky migrujúcich iónov v pitných vodách na 

CC ipe s vodivostnou detekciou môžu by vemi vhodným analytický nástrojom pre ich monitoring v pitných vodách. 

Literatúra 

[1] P. Hecq, A. Hulsmann, F.S. Hauchman, J.L. McLain, F. Schmitz, Drinking Water Regulations, in P. Quevauviller and 

K.C. Thompson (Editors), Analytical Methods for Drinking Water. Advances in Sampling and Analysis, Wiley, Chichester, 

2006, Ch. 1, p. 1-37. 

[2] ISO Method 14911-1, Water quality - Determination of dissolved Li + , Na + , NH 4 + , K + , Mn 2+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ and Ba 2+ 

using ion chromatography - Method for water and wastewater, ISO, Geneva, 1998 

[3] ISO Method 10304-1, Water quality—determination of dissolved fluoride, chloride, nitrite, orthophosphate, bromide, 

nitrate, and sulfate ions using liquid chromatography of ions. Part 1: Method for water with low contamination, ISO, Geneva, 

1992 

[4] V. Pacáková, K. Štulík, J. Chromatogr. A 789 (1997) 169 

[5] J.W. Jorgenson, K.D. Lukacs, Anal. Chem., 53 (1981) 1298. 

[6] I. Zelenský; A. Hyberová a D. Kaniansky, Chem. Papers, 51 (1997) 221 

[7] E. Šimuniová, D. Kaniansky, K. Lokšíková, J. Chromatogr. A, 665 (1994) 203 

[8] D. Kaniansky ,V. Zelenská, D. Baluchová, ELECTROPHORESIS, 17 (1996) 1890 

[9] D. Kaniansky, M. Masár, R. Bodor, M. Žúborová, E. Ölvecká, M. Jöhnck, B. Stanislawski, Electrophoresis, 24 (2003) 

2208. 




- 175 - 


11. - 14. 10. 2010

[10] E. X. Vrouwe, R. Luttge, W. Olthuis, A. van den Berg, J. Chromatogr. A, 1102(2006) 287 

[11] P. Kubá, P.C. Hauser, Electrophoresis 26 (2005) 3169 

[12] J. Wang, G. Chen, A. Muck jr., G. E. Collins, Electrophoresis 24(2003) 3728 

Táto práca bola podporená Vedeckou grantovou agentúrou MŠ SR (VEGA 1/0672/09), Agentúrou na podporu výskumu a 

vývoja (VVCE-0070-07) a Univerzitou Komenského v Bratislave (UK/307/2009). 




- 176 - 


11. - 14. 10. 2010

CHARAKTERIZÁCIA RP-HPLC FRAKCIONOVANÝCH HUMÍNOVÝCH KYSELÍN VYUŽITÍM 

KOMBINÁCIE RP-HPLC METÓDY S ELÚCIOU SO SKOKOVÝM A LINEÁRNYM GRADIENTOM 

ROHÁRIK PAVOL, GÓRA RÓBERT, HUTTA MILAN 

Katedra Analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina, 84215, 

Bratislava, Slovensko, 

roharik@fns.uniba.sk 

1. Úvod 

Humínové látky (HL) sú všadeprítomná prírodná hmota, ktorá sa vyskytuje vo väších množstvách v pôdach, 

sedimentoch a prírodných vodách ako produkt chemickej a biologickej premeny živoíšnych a rastlinných zvyškov [1]. Sú to 

amorfné, hydrofilné, polydisperzné, polyelektrolytové makromolekuly, z ktorých pravdepodobne žiadne dve nie sú identické. 

Reverzno-fázová vysokoúinná kvapalinová chromatografia (RP-HPLC) je jednou z najpoužívanejších 

chromatografickýhc metód, ale v oblasti analýzy a charakterizácie HL, dosiahla iba obmedzené využitie. Vo väšine 

prípadov ako mobilnú fázu (MF) vedci používali zmesi klasických rozpúšadiel, používaných v RP-HPLC (metanol, 

acetonitril) s deionizovanou vodou alebo vybraným tlmivým roztokom, vhodné na RP-HPLC analýzu diskrétnych molekúl, 

o ale v prípade vzoriek typu HL neprinieslo preukázatený, výrazný výsledok [2-4]. 

V tejto práci bola aplikovaná kombinácia RP-HPLC metód s využitím skokovej a lineárnej gradientovej elúcie na 

charakterizáciu vzoriek RP-HPLC frakcionovaných humínových kyselín [5,6]. Ako organický modifikátor mobilnej fázy bol 

použitý N,N-dimetylformamid (DMF) a stacionárnou fázou kolóna s oktadecylsilikagélovou náplou s rozmermi pórov 

(30nm). 

2. Materiál a metódy 

Na frakcionáciu HL bol použitý HPLC systém LaChrom (Merck-Hitachi, Darmstadt, Germany), pozostávajúci 

zo štvorkanálovej pumpy L-7100 on-line spojená s vákuovým odplyovaom L-7612, automatického dávkovaa L-7200, 

kolónového termostatu L-7300, v ktorom bola umiestnená chromatografická kolóna LiChrospher ODS WP 300 RP-18 (250 x 

4) mm, (30nm) s predkolónou, spektrofotometrického detektora s poom diód (DAD) L-7450A, flourimetrického detektora 

(FLD) L-7480. Komunikáciu medzi zariadením a riadiacím softvérom HSM verzia 4 bola zabezpeená fázovým rozhraním 

D-7000. 

Priebeh skokovej gradientovej elúcie bol nastavený miešaním roztokov A (1% DMF / 99% fosforenanový tlmivý 

roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) a B (99% DMF / 1% fosforenanový tlmivý roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) 

nasledovne: od 0.0 po 3.6 minút izokratický úsek 0% (v/v) B v A, následne od 3.7 minút, bol nastavený každú 4 minútu skok 

pozostávajúci z 10% (v/v) zvýšenia množstva B v A až po posledný skok pozostávajúci zo zvýšenia o 9% (v/v) a koniaci na 

99%, (v/v) B v A a do 55 minút sa izokraticky udržiavalo 99% (v/v) množstvo B v A a od 55.1 minút do 60 minút pokraoval 

lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A do 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami bol 10 minútový asový úsek na re-ekvilibráciu [5,6]. 

Priebeh lineárnej gradientovej elúcie bol nastavený nasledovne: od 0.0 po 5.0 minút izokratický úsek 0% (v/v) B 

v A, následne od 5.1 do 35.0 minút lineárny nárast z 0% (v/v) B v A do 99% (v/v) B v A, od 35.1 do 40.0 min izokratické 

udržiavanie 99% (v/v) B v A, od 40.1 do 45.0 min lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A po 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami 

bol 10 minútový asový úsek na re-ekvilibráciu [5]. 

V práci boli použité 3 typy vzoriek humínových látok, komerne pripravený štandard humínových kyselín (HK) od 

firmy Sigma – Aldrich (Aldrich) a humínové kyseliny izolované z pôdy (okolie Dunajskej Stredy (DS J)) použitím 

modifikovanej IHSS fakcionanej schémy [7,8] a vzorka Ecohum. Všetky vzorky mali koncentráciu 3 mg/ml. 




- 177 - 


11. - 14. 10. 2010


V prvom kroku bola použitá RP-HPLC metóda [5,6] so skokovou gradientovou elúciou na frakcionáciu (11 frakcií 

poda potu dosiahnutých píkov) a na charakterizáciu skúmaných vzoriek humínových kyselín na základe dosiahnutých 

eluných profilov (Obr. 1, 2 a 3). Zo záznamov je zrejmé, že v dôsledku skokovej gradientovej elúcie sa vzorky rozdelili do 

11 dobre definovatených zón (frakcii). Jednotlivé frakcie boli zozbierané v oblasti maxima píku a ich objem predstavoval 

1,2 ml. Pri porovnaní získaných chromatogramov vzoriek HK DS J, HK Aldrich HK Ecohum si môžeme všimnú niekoko 

odlišností, o poukazuje na kvalitatívne rozdiely v štruktúre skúmaných humínových kyselín. Najvýraznejšie je táto zmena 

viditená pri píkoch v oblasti mtveho objemu. Kde pri vzorke HK DS J je tento pík najvýraznejší o môže poukazova na 

vylúenie istého množstva vzorky, ktorá za daných podmienok poskytuje fluorescenný signál s výraznou intenzitou. 

V prípade vzorkiek HK Aldrich a HK Ecohum môžeme pozorova výrazne menšie píky v danej oblasti, o vypovedá 

o vylúení menšieho množstva vzorky alebo vylúené asti vzoriek poskytuje fluorescenný signál výrazne nižšej intenzity. 

Taktiež sú badatené rozdiely v rozložení jednotlivých frakcií oboch vzoriek. Na chromatografickom zázname HK DS J 

môžeme pozorova, že HL eluujúce v predných frakciách (3,4,5) poskytujú fluorescený signál s vyššou intenzitou ako HL 

prítomné vo frakciách eluujúcich pri vyšších retenných asoch. Oproti tomu v prípade vzorky HK Aldrich poskytujú 

fluorescenný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakcii 7, nakoniec v prípade vzorky HK Ecohum poskytujú 

fluorescenný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakciách 6 a 7. 

V druhom kroku bola RP-HPLC metóda so skokovou gradientovou elúciou použitá na charakterizáciu takto 

zozbieraných frakcií (Obr. 4, 5 a 6). Zo získaných chromatografických záznamov vyplýva, že reinjektované frakcie všetkých 

vzoriek si zachovali svoj charakter aj po opätovnom nástreku do chromatografického systému. Výnimku tvorili prvé frakcie 

vzoriek, ktoré aj po opätovnom nástreku do separaného systému poskytli chromatografický záznam kopírujúci priebeh 

separácie pôvodných vzoriek HL analyzovaných v prvom kroku (Obr. 1, 2 a 3). Preto môžeme predpoklada, že táto frakcia 

pravdepodobne obsahuje HL prítomných vo všetkých frakciách. Avšak aj pri reinjekcií frakcii sa v oblasti mtveho objemu 

objavil pík, ktorého plocha sa zvyšovala so zvyšujúcim sa íslom poradia frakcie. 

Obr. 1. RP-HPLC profil vzorky HK DS J (3.02 mg/ml) získaný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex. 

470 nm, em. 530nm), bez odítania pozadia, davkovaný objem 100 μL. Arabské íslice 1-11 reprezentujú poradie a poet 

zozbieraných frakcií. 




- 178 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 2. RP-HPLC profil vzorky HK Aldrich (3 mg/ml) získaný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex. 

470 nm, em. 530nm), bez odítania pozadia, davkovaný objem 100 μL. 

Obr. 3. RP-HPLC profil vzorky HK Ecohum (3 mg/ml) získaný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex. 

470 nm, em. 530nm), bez odítania pozadia, davkovaný objem 50 μL. 

alej bola vypracovaná RP-HPLC metóda s lineárnou gradientovou elúciou, ktorá bola použitá na charakterizáciu 

získaných frakcií vzoriek skúmaných HK (Obr. 7, 8 a 9). Použitím tejto metódy sme získali chromatografické záznamy 

typické pre HK pri použití techniky lineárnej gradientovej elúcie s charakteristickými širokými zónami. Zo získaných 

chromatografických záznamov vyplýva, že maximá píkov jednotlivých RP-HPLC frakcií sa posúvajú k vyšším retenným 

asom v poradí frakcií od 2 do 11. Tento fakt nám umožuje predpoklada, že skúmané frakcie HK aj po opätovnom 

dávkovaní nemenia svoj charakter a ich retenné charakteristiky zostávajú rovnaké bez ohadu na spôsobe použitej elunej 

techniky. Aj v týchto chromatografických záznamoch sa nám objavili píky v oblasti mtveho objemu systému aj ke nie 

s rovnakou tendenciou zväšovania plochy ako v prípade použitia skokovej gradientovej elúcie. V prípade vzorky HK 




- 179 - 


11. - 14. 10. 2010

Ecohum si ešte môžeme všimnú jeden dvojitý pík asi v 15 minúte, ktorý sme prisúdili neistote, nakoko sa nám objavil aj 

vo vzorke vody (blanku). 

Výsledky naznaujú, že použitá 10 skoková gradientová elúcia môže indukova zretené rty na 

chromatografickom zázname humínových kyselín a koncentruje ich do presne vymedzených zón, im umožuje zvyšovanie 

citlivosti detekcie. Kombinácia vhodných solvataných vlastností DMF pre HL a použitie širokopórovej (wide-pore) RP 

stacionárnej fázy zlepšuje povrchové interakcie analytov a potláa vplyv efektu rozmerovej diskriminácie. Taktiež poskytuje 

dobrú reprodukovatenos získaných chromatografických profilov a dáva predpoklad pre dosiahnutie robustnej analytickej 

metódy na charakterizáciu HL. 

Obr. 4. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK DS J, získané elúciou skokovým gradientom, bez odítania pozadia, použitím 

FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 400 μL. 

Obr. 5. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK Aldrich, získané elúciou skokovým gradientom, bez odítania pozadia, 

použitím FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 400 μL. 




- 180 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 6. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK Ecohum, získané elúciou skokovým gradientom, bez odítania pozadia, 

použitím FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 400 μL. 

Použitá gradientová RP-HPLC metóda má potenciál v kombinácii s inými hlavne separanými metódami, na 

úinnú charakterizáciu vzoriek HL. Individuálne frakcie, získané RP-HPLC metódou, môžu by alej analyzované 

separanými metódami, založenými na rozdielnych separaných princípoch a mechanizmoch, napr. rozmerovo-vyluovacia 

chromatografia (SEC) a iné, ím umožujú dosiahnú ortogonálne separané systémy, ktoré poskytujú rozšírený súbor dát 

s vyššou dimenzionalitou o skúmaných vzorkách HL. 

Obr. 7. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK DS J získané elúciou lineárnym gradientom po odítaní pozadia, použitím FLD 

detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 300 μL. 




- 181 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 8. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK Aldrich získané elúciou lineárnym gradientom bez odítania pozadia, použitím 


Obr. 9. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK Ecohum získané elúciou lineárnym gradientom bez odítania pozadia, použitím 


4. Záver 

Získané údaje naznaujú, že takýto model aplikácie nami navrhnutého RP-HPLC systému môže by vhodný ako 

separaný systém pre detailnejšiu charakterizáciu komplikovaných prírodných makromolekúl, medzi ktoré patria aj 

analyzované humínové kyseliny. Dosiahnuté výsledky poukazujú na fakt, že získané frakcie skúmaných vzoriek humínových 

kyselín zachovavajú svoj charakter aj po opätovnom vstupe do separaného systému. 

Poakovanie 

Táto práca vznikla za finannej podpory projektov VEGA 1/0870/09, APVV-0595-07 a VVCE-0070-07. 




- 182 - 


11. - 14. 10. 2010

Zoznam použitej literatúry 

[1] Hayes M.H.B., MacCarthy P., Malcolm R.L., Swift R.S. (Eds.), Search of Structure, Humic Substances, Vol. II, Wiley, 

New York, 1989. 

[2] Lombardi A.T., Morelli E., Balesteri E., Seritti A., Environ. Technol, 13 (1992) 1013. 

[3] Woelki G., Friedrich S., Hanschmann G., Salzer G., Fresenius J. Anal. Chem., 357 (1997) 548. 

[4] Namjesnik-Dejanovic K., Cabaniss S.E., Environ. Sci. Technol., 38 (2004) 1108. 

[5] Hutta M., Góra R., J. Chromatogr. A, 1012 (2003) 67. 

[6] Góra R., Hutta M., J. Chromatogr. A, 1084 (2005) 39. 

[7] Kandrá J., Hutta M., Foltin M., J. Radioanal. Nucl. Chem., Articles, 208 (1996) 577. 

[8] Prochácková T., Góra R., Kandrá J., Hutta M., J. Radioanal. Nucl. Chem., 229 (1998) 61. 




- 183 - 


11. - 14. 10. 2010

VPLYV ZWITERIONICKÝCH DETERGENTOV NA SEPARÁCIU HUMÍNOVÝCH KYSELÍN ZÓNOVOU 

ELEKTROFORÉZOU S IZOTACHOFORETICKOU ÚPRAVOU V SPÁJANÝCH KOLÓNACH 

ANDREA PASTIEROVÁ*, RÓBERT BODOR, DUŠAN KANIANSKY 

Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina, 842 15 

Bratislava 

email: pastierova@fns.uniba.sk 

Úvod 

Humínové látky (HL) sú komplexné, polydisperzné a heterogénne zmesi nestechiometrického zloženia [1]. HL sú 

komplexné makromolekulárne látky obsahujúce rôzne stavebné bloky a rôzne funkné skupiny, štruktúru a správanie, ktoré v 

životnom prostredí zostávajú nevyjasnené. Sú amorfné, hnedé alebo ierne, acidické a polydisperzné látky, majú mólovú 

hmotnos v rozmedzí od niekokých stoviek do desiatok tisíc daltonov [2]. Úinky humínových látok sa zaínajú oraz viac 

využíva v humánnej aj veterinárnej medicíne, v agrochémii, v aplikovanej ekológii a v stavebníctve. Z biomedicínskeho 

hadiska humínové látky sú schopné pracova ako protizápalové lieky a lieky proti bolesti, pôsobia proti rakovine, sú 

schopné detoxikova, poskytujú preventívny úinok proti kardiovaskulárnym chorobám, stimulujú látkovú výmenu a 

priaznivo pôsobia na pohybové ústrojenstvo. Humínové látky nepatria k látkam, ktoré sú zdraviu škodlivé. 

Na základe rozpustnosti sa humínové látky delia do troch skupín: [3] 

(1) humínové kyseliny, (HAs), 

(2) fulvo kyseliny, (FAs), 

(3) humín. 

V závislosti od pH a iónovej sily majú HAs tendenciu vytvára agregáty vo vodných roztokoch [4]. Separácie v tejto práci 

boli uskutoované pri vysokom pH (približne 10) v ITP aj v CZE, o viedlo k eliminácii tvorby týchto agregátov. V tomto 

kontexte, acidické skupiny HAs a FAs sú ionizované úplne (karboxylové) alebo vo vysokom stupni (fenolové) a preto 

agregácie týchto zložiek, pri takýchto acidobázických podmienkach, by nemali ma vplyv na separáciu. Z hadiska 

dosiahnutia adekvátneho rozlíšenia látok on-line kombináciou ITP-CZE je výhodné použi také elektrolytové systémy, v 

ktorých efektívne pohyblivosti separovaných látok sú ovplyvnené prostredníctvom nasledovných mechanizmov, napríklad 

prídavkom komplexotvorných inidiel, polymérov a povrchovo aktívnych látok a podobne. alšou možnosou je 

ovplyvnenie pohyblivosti látok využitím miciel. Po prvý krát v práci [5] boli využité zwiterionické povrchovo aktívne látky 

pri CZE separácii tricyklických antidepresív. alšiou prácou bola [6] v ktorej boli využité zwiterionické detergenty na CZE 

separáciu blízko príbuzných druhov peptidov. Zwiterionické detergenty neslúžia len k separácii látok, ale sa môžu využíva 

aj na zabránenie adsorbcie kationických proteínov na stenu kapiláry, o om svedí práca [7]. V mnohých lánkoch 

zwiterionické detergenty zlepšili separáciu analyzovaných látok a keže ešte neboli aplikované na separáciu humínových 

látok rozhodli sme sa ich využi v našej práci. 

Cieom tejto práce bolo: 

1) preskúma možnosti on-line kombinácie ITP a CZE pri separácii sodnej soli humínovej kyseliny (NaHA), kde ITP 

zakoncentruje anionické zložky, pochádzajúce zo vzorky a v CZE dôjde k ich rozlíšeniu. 

2) zisti vplyv zwiterionických detergentov pridávaných do nosného elektrolytu, ktoré by mohli by schopné zlepši 

CZE rozlíšenie anionických zložiek HAs prostredníctvom modifikácie elektroforetických pohyblivostí 

3) využi mikrofiltráciu k získaniu prehadu o distribúcie mólovej hmotnosti zložiek pochádzajúcich z použitej 

vzorky sodnej soli humínovej kyseliny. Použitím mikrofiltrov 10 000 a 30 000 odhadnú pomer nízko a vysoko 

molekulového obsahu vzorky. 


Separácia humínových kyselín bola uskutonená v elektroforetickom analyzátore EA-102 (Obr.1), ktorý sa skladal zo 

separanej jednotky so spájanými kolónami, z elektronickej a kontrolnej jednotky. Elektronická as pozostávala z prúdovostabilizovaného 

zdroja vysokého napätia, vysokonapäového relé, riadiacej jednotky a deteknej inštrumentácie. Kontrolná 

jednotka, zabezpeujúca riadenie analýzy (vekos a smer prúdov) a zber dát z detektorov, bola prepojená s PC pomocou 

programu ACES. Tento program bol použitý aj na vyhodnotenie dát z detektorov. Separaná jednotka analyzátora 

predstavuje hydrodynamicky uzavretý systém, v ktorom pohyb roztoku elektrolytu je zamedzený polopriepustnou 

membránou, bez obmedzenia elektromigraného transportu iónov. Prvá kolóna bola vybavená kontaktným vodivostným 




- 184 - 


11. - 14. 10. 2010

a druhá kolóna kontaktným vodivostným a tiež UV-fotometrickým detektorom. Pracovalo sa v anionickom režime separácie 

s využitím štandardu sodnej soli humínovej kyseliny (NaHA) s koncentráciou 100mg/l (Sigma, Steinheim, Nemecko), ako 

vzorky. 

Tab.1: Použité elektrolytové systémy 

ITP 

CZE 

LE 10 mmol/l HCl; 39 mmol/l etanolamín; 0,2 % HEC; pH=10 

TE elektrolyzovaná voda (OH - ) 

NE 30 mmol/l etanolamín; 20 mmol/l BALA; 0-100 mmol/l DAPS, 0,05 % HEC; pH=10 

NE 30 mmol/l etanolamín; 20 mmol/l BALA; 0-50 mmol/l DDAPS, 0,05 % HEC; pH=10 

NE 30 mmol/l etanolamín; 20 mmol/l BALA; 0-5 mmol/l TDAPS, 0,05 % HEC; pH=10 

BALA= -alanín, DAPS=N-decyl-N,N-dimetyl-3-amino-1-propán sulfónová kyselina 

DDAPS= N-Dodecyl-N,N-dimetyl-3-amino-1-propán sulfónová kyselina, 

TDAPS= N-tetradecyl-N,N-dimetyl-3-amino-1-propán sulfónová kyselina 

Obr. 1: Dvojkolónový elektroforetický analyzátor EA 102 použitý v ITP-ITP, ITP(DS)ITP, ITP-CZE, ITP(DS)CZE, 2D 

ITP(DS)-CZE 

Separaná jednotka: E1, E2, E3 – hnacie elektródy, BF – bifurkaná oblas, N-V – ihlové ventily, TE, LE, BE – zakonujúci, 

vodiaci a nosný elektrolyt, M – membrána, V – injektovaný objem, S-I – dávkovanie pomocou mikrostriekaky cez septum, 

S-L – dávkovanie pomocou dávkovacej sluky, S-V – dávkovanie dávkovaom, W – odpad 


On-line kombinácia izotachoforézy a zónovej elektroforézy predstavuje spojenie dvoch elektromigraných techník, 

ktoré sa odlišujú okrem iných aj priestorovým usporiadaním separovaných zložiek pozdž separanej osi. Pri ITP-CZE 

separácii sodnej soli humínovej kyseliny sme využili rôzne modifikátory pridávané do nosného elektrolytu (NE), sledovali 

sme ako budú ovplyvované efektívne pohyblivosti látok zo sodnej soli humínovej kyseliny a aký budú ma dopad na 

separáciu NaHA. Ako modifikátory boli použité zwiterionické detergenty N-decyl-N,N-dimetyl-3-amino-1-propán sulfónová 

kyselina (DAPS), N-Dodecyl-N,N- dimetyl-3-amino-1-propán sulfónová kyselina (DDAPS), N-Tetradecyl-N,N-dimetyl-3amino-1-propán 

sulfónová kyselina (TDAPS). Tieto detergenty majú aj pozitívne aj negatívne nabité funkné skupiny, 




- 185 - 


11. - 14. 10. 2010

navonok vykazujú nulový náboj a vo vode môžu tvori elektroneutrálne micely. Na separáciu sodnej soli humínovej kyseliny 

sme v našej práci využili tvorbu miciel. K tvorbe miciel dochádza vtedy, ak koncentrácia surfaktantu je vyššia ako kritická 

micelárna koncentrácia (CMC), a teplota systému je vyššia ako kritická micelárna teplota, teda tvorba miciel je ovplyvovaná 

potom premenných vrátane pH, iónovej sily a teploty. Kritické micelárne koncentrácie (CMC) sú pre DAPS (25-40 mmol/l), 

pre DDAPS (2-4 mmol/l) a pre TDAPS (0,1-0,4 mmol/l). 

Najvyšší poet rozlíšených píkov (spomedzi všetkých použitých zwiterionických detergentov) bol dosiahnutý s 

použitím DDAPS v NE pri koncentranej úrovni vyššej ako CMC. Ak koncentrácia DDAPS bola nižšia ako CMC (1 mmol/l) 

(Obr. 2b), tvar elektroforeogramu v CZE nebol ovplyvnený. Zvýšením koncentrácie DDAPS v NE nad CMC (5, 10, 50 

mmol/l) (Obr. 2c, d, e) sa výrazne zvýšil poet píkov na CZE profiloch v porovnaní so separáciou s nosným elektrolytom bez 

prídavku DDAPS (Obr. 2a). Táto dôležitá skutonos naznauje, že interakcia medzi DDAPS micelami a látkami zo sodnej 

soli humínovej kyseliny mení ich efektívne pohyblivosti. Vzdialenos medzi píkmi bola predlžovaná rastúcou koncentráciou 

miciel. Micely DDAPS poas CZE separácie pôsobia ako pseudostacionárna fáza s nulovou pohyblivosou. Látky poas 

migrácie v takomto prostredí sú distribuované medzi pseudostacionárnu fázu a istý roztok nosného elektrolytu, o priamo 

zabezpeí diferenciáciu ich efektívnych pohyblivostí. Vekos zmeny pohyblivosti závisí najmä od koncentrácie miciel 

a vlastností jednotlivých látok. 

Použitie DAPS (Obr. 3) a TDAPS (Obr.4) pridávaných do NE samostatne pri koncentráciách pod a nad CMC mali podobný 

vplyv na separáciu sodnej soli humínovej kyseliny ako DDAPS, ale ani zaleka nebol získaný taký poet píkov s takým 

rozlíšením. 

Mikrofiltrácia (Obr. 5) bola použitá na získanie disribúcie mólovej hmotnosti zložiek pochádzajúcich zo vzorky sodnej soli 

humínovej kyseliny a ku kvantifikácií nízko a vysoko molekulového obsahu. Pripravený roztok vzorky bol mikrofiltrovaný 

cez odlišné mikrofiltre (10 000 a 30 000) a získané frakcie boli injektované do ITP-CZE systému. Z elektroforeogramov, na 

základe celkových plôch píku jednotlivých frakcií bolo zistené, že podstatná as zo vzorky NaHA obsahuje zložky s 

mólovou hmotnosou >30 000. 

e 

d 

c 

b 

a 

1000 1500 tm [s] 

2000 

Obr. 2: Úloha DDAPS v CZE stupni ITP-CZE separácie NaHA 

10 l NaHA dávkovanej cez S-I, (Fig. 1), ITP kolóna bola naplnená LE (10 mmol/l HCl, 39 mmol/l etanolamín, 0.2 % [w/v] 

HEC, pH=10) a elektrolyzovaná deionizovaná voda bola použitá ako TE. CZE kolóna bola naplnená NE (20 mmol/l BALA, 

30 mmol/l etanolamín, 0.05 % [w/v] HEC, pH=10). DDAPS bol pridávaný do NE v nasledujúcich koncentráciách: 

(a) 0 mmol/l, (b) 1 mmol/l, (c) 5 mmol/l, (d) 10 mmol/l, (e) 50 mmol/ 




- 186 - 

1V 


11. - 14. 10. 2010

c 

b 

a 

1000 1500 tm [s] 2000 

Obr. 3: Úloha DAPS v CZE stupni ITP-CZE separácie NaHA 



30 mmol/l etanolamín, 0.05 % [w/v] HEC, pH=10). DAPS bol pridávaný do NE v nasledujúcich koncentráciách: (a) 0 

mmol/l, (b) 80 mmol/l, (c) 100 mmol/l 

e 

d 

c 

b 

a 

1000 1500 tm [s] 2000 

Obr. 4: Úloha TDAPS v CZE stupni ITP-CZE separácie NaHA 



30 mmol/l etanolamín, 0.05 % [w/v] HEC, pH=10). TDAPS bol pridávaný do NE v nasledujúcich koncentráciách: (a) 0 

mmol/l, (b) 0,1 mmol/l, (c) 2 mmol/l, (d) 3 mmol/l (e) 5 mmol/l. 




- 187 - 

1V 

1V 


11. - 14. 10. 2010

c 

b 

1V 

1000 1500 tm [s] 2000 

a 

1000 1500 2000 

tm [s] 

1V 

1V 

e 

d 

1000 1500 2000 

tm [s] 

Obr. 5: Elektroforeogramy frakcií získaných mikrofiltráciou roztoku NaHA (100 mg/l) cez mikrofiltre 10 000 a 30 000. 

Vysokomolekulové frakcie (M>10 000, M>30 000) boli zriedené deionizovanou vodou. NaHA vzorka, injekný mód, 

elektrolyty pre ITP a CZE stupe boli rovnaké ako v Obr. 2e (a) bez mikrofiltrácie, (b) M10 000, (d) M30 000.´ 




- 188 - 

1V 

1V 


11. - 14. 10. 2010

Záver 

ITP-CZE uskutonená použitím techniky so spájanými kolónami s hydrodynamicky uzavretým systémom v anionickom 

móde bola po prvý krát študovaná v súvislosti so separáciou humínových kyselín (HA). V tomto kontexte bolo zavedené 

použitie zwiterionických detergentov pridávaných do nosného elektrolytu o viedlo k optimalizácií CZE separácie zložiek 

humínových kyselín. DDAPS, pri vyšších koncentráciách ako CMC pôsobil v CZE stupni ako pseudostacionárna fáza 

a výrazne zvýšil rozlíšenie HA. DAPS a TDAPS nepreukázali výrazné zlepšenie v separácii sodnej soli humínovej kyseliny. 

Aplikácia mikrofiltrácie potvrdila, že okolo 70% zo všetkých UV absorbujúcich zložiek z použitej vzorky je prítomná vo 

frakcií s mólovou hmotnosou >30 000. Tento odhad bol vypoítaný na základe celkových plôch píku. Iba o 10% vyššia 

plocha bola pri nižšej mólovej hmotnosti (M>10 000) v porovnaní s frakciou s M>30 000. 

Poakovanie: práca bola financovaná z projektov: VEGA 1/0882/09, VVCE 0070/07 

LITERATÚRA: 

[1] P. Schmitt-Kopplin, J. Junkers, Journal of Chromatography A, 998 (2003) 1 

[2] P. Janoš, Journal of Chromatography A, 983 (2003) 1–18 

[3] G.G. Choudry, Humic substances, Structural ASPects and photophysical, photochemical and free radical characteristics, 

in Hutzinger O. Ed., The Handb. Environ. Chem. Vol.1. The natural environment and the biochemical cycles, Springer 

Verlag, Heidelberg, (1989) 1 

[4] M. Schnitzer, Soil Sci. 151 (1991) 41 

[5] A. Sally, A. Swedberg, Journal of Chromatography, 503 (1990) 449. 

[6] Kimberly F. Greve, Wassim Nashabeh, Barry L. Karger, Journal of Chromatography A, 680 (1994) 15-24. 

[7] K.K.C. Yeung, C.A. Lucy, Anal. Chem. 69 (1997) 3435. 




- 189 - 


11. - 14. 10. 2010

OVPLYVNENIE SEPARANEJ KAPACITY ZNÍŽENÍM SATURANÉHO FAKTORA A PREKRYV PÍKOV 

V HYDRODYNAMICKY OTVORENOM A ZATVORENOM SEPARANOM SYSTÉME PRI STANOVENÍ 

MNOHOZLOŽKOVEJ MODELOVEJ VZORKY 

MIROSLAVA HALAŠIOVÁ*, RÓBERT BODOR, DUŠAN KANIANSKY 

Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra analytickej chémie, Mlynská dolina, 

842 15 Bratislava, Slovensko, miroslava.halasiova@fns.uniba.sk 

Abstrakt 

Práca pojednáva o porovnaní automatizovaného režimu separácie on-line spojenia kapilánej izotachoforézy so zónovou 

elektroforézou (ITP–CZE) s využitím diskrétnych spacerov (DS) v hydrodynamicky zatvorenom separanom sytéme 

a automatizovanej jednokolónovej zónovej elektroforézy (CZE) v hydrodynamicky otvorenom separanom sytéme. 

Porovnanie oboch prístupov bolo uskutonené na základe rozlíšenia píkov pri použití zmesi 50 organických UV 

absorbujúcich aniónov. Pre CZE separáciu v oboch hydrodynamických prístupoch bol použitý rovnaký nosný elektrolyt 

(CE), 100×10 -3 mol L -1 morpholínetánsulfónová kyselina (MES), 10×10 -3 mol L -1 histidín (HIS) a 8×10 -3 mol L -1 

-cyklodextrín s pH 5,1. V ITP stupni ITP–CZE kombinácie bol použitý vodiaci elektrolyt (LE), 10×10 -3 mol L -1 kyselina 

chlorovodíková a 14,5×10 -3 mol L -1 -alanín s pH 3,2 a zakonujúci elektrolyt (TE), 15×10 -3 mol L -1 kyselina kaprónová 

s rídavkom 60×10 -3 mol L -1 -alanínu s pH 4,6. Všetky elektrolyty obsahovali prídavok hydroxyetylcelulózy (0,05%; 0,1% 

alebo 0,2% (m/V)) na potlaenie elektroosmotického toku. V hydrodynamicky zatvorenom separanom systéme, kde je 

potlaený laminárny a elektroosmotický tok, boli separácie uskutonené v anionickom móde s vodivostnou a UV 

fotometrickou detekciou pri vlnovej džke 254nm. V hydrodynamicky otvorenom separanom systéme boli separácie 

uskutonené s pozitívnou polaritou napätia pri vlnovej džke 208 a 254nm. Táto práca prezentuje výhody ako aj nevýhody 

plne automatizovaného režimu kapilárnej elektroforézy v column-coupling spojení s izotachoforézou, poukazuje na zvýšenie 

potu rozlíšených píkov a separanej kapacity vplyvom zníženia saturaného faktora v porovnaní s hydrodynamicky 

otvoreným prístupom. 

1. Úvod 

Základný rozdiel medzi hydrodynamicky otvoreným a zatvoreným separaným sytémom je v umiestnení mechanickej 

prekážky (semipermeabilnej membrány [1] alebo vrstvy gelu [2]) na konci kapiláry, ktorá zamedzuje pohybu roztoku 

elektrolytu v kapiláre bez obmedzenia elektroforetického transportu iónov oproti otvoreným systémom, kedy je pohyb 

roztoku elektrolytu kapilárou mechanicky neobmedzený. 

V súasnosti sú CZE separácie uskutoované v hydrodynamicky otvorených separaných systémoch najmä 

z nasledujúcich dôvodov: nízka tepelná disperzia, vysoký hydrodynamický odpor kapilár, možnos súasného stanovenia 

kationicky a anionicky migrujúcich látok v jednom pokuse pomocou elektroosmotického transportu roztoku elektrolytu 

a jednoduchá automatizovatenos. Tieto separané systémy dovoujú použitie kapilár väších vnútorných priemerov, avšak 

problémom je hydrodynamická disperzia súvisiaca s tokom roztoku elektrolytu [3,4], ktorá môže by spôsobená rozdielnym 

elektroosmotickým tokom v rôznych astiach kapiláry (vytvára sa lokálny hydrodynamický tok) alebo tlakovým rozdielom 

na koncoch kapilár (rozdielne výšky hladín kapilár ponorené do roztoku) [3]. alšie obmedzenia vyplývajú zo separanej 

kapacity a koncentraných detekných limitov dosiahnutených v CZE [5-8]. 

Hydrodynamicky zatvorený systém ponúka riešenie aj ke za cenu istých obmedzení, je možné dosiahnu nižšie 

koncentrané detekné limity, potlaením elektroosmotického toku nedochádza k elektroosmotickej disperzii (je 

zanedbatená) [5]. Zatvorený hydronynamický systém umožnuje on-line kombinácie s inými CE technikami, najmä 

izotachoforézou [9-15]. V práci [16] sú uvedené možnosti ako eliminova elektroosmotický tok do vysokého stupa 

a reprodukovatene pomocou vysokomolekulárnych vodorozpustných polymérov. 

Jedným z obmedzení je použitie membrány, ktorá za uritých okolností môže by zdrojom významných zmien 

migraných rýchlostí analytov [17], konkrétne heterogénne zloženie roztokov na oboch stranách membrány (osmóza 

vyvoláva hydrodynamický tok rozpúšadla membránou), riziko deformácie membrány poas plnenia, ktorá sa po uzavretí 

separaného systému vplyvom pružnosti vracia do pôvodného stavu, o môže spôsobi deformáciu zóny analytu a zmenu 

migranej rýchlosti (riešením je necha dostatone dlhý as na relaxáciu membrány alebo ju mechanicky spevni) [18], 

potreba používa mechanicky vysoko stabilné porézne membrány s takou vekosou otvorov, aby nedochádzalo k výtoku 

roztoku elektrolytu z kapiláry. 

Keže väšina analytických postupov vyžaduje mnohonásobné prevedenie jednotlivých rutinných analytických 

operácií, automatizácia by mohla odstráni ich nevýhody, ako je znaná prácnos, nízka produktivita a veká spotreba 

chemikálií. Tieto asovo nároné analytické operácie sú asto tiež zdrojom hrubých experimentálnych chýb. Preto súasné 

vysoké požiadavky na analytickú kontrolu je možné racionálne splni zavádzaním výpotových metód a technických 

prostriedkov pre automatické prevádzanie analýz, i už v otvorenom alebo zatvorenom systéme. Rozvoj automatizácie 

analytických metód sa stáva nevyhnutnou súasou rozvoja analytickej chémie a teda aj elektromigraných separaných 

techník, z dôvodov zvyšujúcich sa nárokov na kvalitu a kvantitu poskytovaných analytických informácií. 

Na Katedre analytickej chémie Prírodovedeckej fakulty UK v Bratislave bol vyvinutý automatický elektroforetický 

analyzátor so separanou jednotkou s architektúrou spájania kolón pracujúci v zatvorenom separanom režime. 




- 190 - 


11. - 14. 10. 2010

Automatizácia je založená na poítaovom riadení analytického postupu a na elektronickom zbere a spracovaní nameraných 

údajov. Takýto systém rieši najmä problém analýz vekých sérií vzoriek a môže priaznivo ovplyvni kvalitu získaných dát. 

Jednou z výhod automatizovaného systému je, že umožuje nepretržité meranie, ím sa skracuje as potrebný na celkovú 

analýzu vzorky, z hadiska nepretržitej personálnej obsluhy. 

Najväší prínos nahradenia manuálneho postupu plne automatizovaným postupom sme oakávali v znížení vplyvu 

udského faktora na správnos a presnos výsledkov analýzy a najmä v zvýšení produktivity, s možnosou mera 24 hodín 

denne. Predpokladali sme, že konštrukné rozdiely medzi manuálnym a automatizovaným analyzátorom budú ma skôr 

pozitívny ako negatívny dopad na separáciu. 

Cieom bolo poukáza na analytické možnosti automatizácie dvojdimenzionálneho (2D) režimu ITP-CZE separaného 

systému s využitím diskrétnych spacerov pri separácii mnohozložkových zmesí látok (eliminovanie rizika prekryvu píkov 

znížením saturaného faktora) v porovnaní s automatizovaným prevedením analýz na elektroforetickom analyzátore 

pracujúcom v otvorenom separanom priestore. 

2. Experimentálna as 

2.1. Chemikálie 

Chemikálie použité na prípravu roztokov elektrolytov, vzorky a diskrétnych spacerov boli zakúpené v Sigma 

(Steinheim, Nemecko), Serva (Heidelberg, Nemecko), Lachema (Brno, eská republika), Loba-chemie (Viede, Rakúsko) a 

Merck (Darmstadt, Nemecko). Kyselina chlorovodíková (HCl) a kaprónová boli istené izotermickou destiláciou. Na 

prípravu všetkých roztokov bola použitá deionizovaná voda, istená v systéme Pro-PS (Labconco, Kansas City, USA) 

a následne v zariadení Simplicity (Milipore, Molsheim, Francúzsko). Hydroxyetylcelulóza (HEC), istená na zmesnom 

ionexe (Amberlite MB-1), bola použitá na dynamické pokrytie povrchu kapilár ako supresor elektroosmotického toku. 

Roztoky elektrolytov boli pred použitím filtrované cez membránové filtre s priemerom pórov 0,8 m (Millipore). Na meranie 

pH roztokov bol použitý pH-meter inoLab-pH 720 (WTW GmbH, Weilheim, Nemecko) s kombinovanou elektródou. 

Modelovú vzorku analytov tvorilo 50 UV absorbujúcich organických aniónov. Na zabránenie adsorbcie analytov na 

steny, s ktorými prichádzali do kontaktu, bol do modelovej vzorky pridávaný síran sodný. Zmes diskrétnych spacerov 

pozostávala z dichlóracetátu (DCA), monometylmalonátu (MMM), N-acetylglycínu (Ac-Gly) a glutarátu (GLR). 

Tab. 1: Zloženie použitých elektrolytových systémov 

Vodiaci elektrolyt Zakonujúci elektrolyt Nosný elektrolyt 

Anión Chlorid Kaprónan Morpholínetánsulfónan 

Koncentrácia (10 -3 mol L -1 ) 10 15 100 

Protiión -alanín -alanín Histidín 

Koncentrácia (10 -3 mol L -1 ) 14,5 60 10 

pH 3,2 4,6 5,1 

EOF supresor HEC HEC HEC 

Koncentrácia (%, m/v) 0,2 % 0,05 % 0,1 % 

Modifikátor pohyblivosti -cyklodextrín 

Koncentrácia (10 -3 mol L -1 ) 8 

2.2. Zariadenie 

Na separácie v hydrodynamicky zatvorenom separanom režime bol použitý automatizovaný elektroforetický 

analyzátor so spájanými kolónami navrhnutý D. Kanianskym a spol. [19]. V súasnosti je zariadenie EA 202A komerne 

vyrábané firmou Villa Labeco (Spišská Nová Ves, Slovensko). ITP kolóna s priemerom 800m a džkou 90mm, vyrobená 

z FEP (tetrafluoroetylén a hexafluoropropylén, 3M, St. Paul, MN, USA) a vodivostným detektorom je on-line spojená s CZE 

kolónou s priemerom 320m a džkou 180mm, vyrobenej z FEP s vodivostným a fotometrickým detektorom. Zber dát bol 

realizovaný pri vlnovej džke 254nm. 

Separaná jednotka analyzátora predstavuje hydrodynamicky uzavretý systém, v ktorom je pohyb roztoku elektrolytu 

zamedzený polopriepustnou membránou, bez obmedzenia elektromigraného transportu iónov. Pri všetkých experimentoch 

bol v ITP kolóne aplikovaný separaný prúd 150 μA a v CZE kolóne 50 μA, priom sa pracovalo v anionickom režime. 

Aparatúra bola vždy na zaiatku a na konci merania vymytá deionizovanou vodou. 

Na separácie v hydrodynamicky otvorenom separanom režime bol použitý plne automatizovaný elektroforetický 

analyzátor 3D-CE system (Agilent Technologies, CA, USA) s fotometrickou detekciou pri 208 a 254nm. Separácie boli 

uskutonené v kremennej kapiláre s efektívnou džkou 24cm a vnútorným priemerom 45m (Microquartz, Mníchov, 

Nemecko). Vzorky boli dávkované hydrodynamicky tlakom 50mbar po dobu 20s. Napätie poas analýzy bolo 20kV. Pred 

a po použití bola kapilára premytá 0,1 mol L -1 NaOH, vodou a nakoniec nosným elektrolytom. 




- 191 - 


11. - 14. 10. 2010


V tejto práci bolo cieom získa informácie o možnosti rozlíšenia 50 organických UV absorbujúcich aniónov 

v hydrodynamicky otvorenom aj zatvorenom separanom systéme, a poukáza na prednosti a obmedzenia daných 

separaných prístupov. Ako prvým sme sa zaoberali separáciami uskutonenými v otvorenom separanom prístupe. Aby sme 

získali predstavu, v akom ase budú jednotlivé analyty migrova a aký budú ma profil píku (dôležité pre identifikáciu 

v prítomnosti iných analytov), boli všetky analyty samostatne dávkované v koncentráciách 1x10 -3 mol L -1 . 50 analytov sme 

rozdelili na 5 skupín s menším potom analytov (spôsob delenia analytov bol identický ako pri separáciách v zatvorenom 

systéme a bude vysvetlený nižšie) a uskutonili separácie s analytmi prítomnými v danej skupine. 

V prvej skupine bolo prítomných 6 analytov s koncentráciou 0,1×10 -3 mol L -1 ; 2-naftol-3,6-disulfónová kyselina; 

1-naftylamín-3,6-disulfónová kyselina; 2-naftylamín-4,8-disulfónová kyselina; sulfosalicylan sodný (0,3×10 -3 mol L -1 ); 

maleínová kyselina (0,3×10 -3 mol L -1 ); 1-naftylamín-3,6,8-trisulfónová kyselina. Niektoré analyty boli dávkované vo vyšších 

koncentráciách (uvedené v zátvorke), pretože pri nižšej koncentrácii sme nedosahovali odozvu. Rozseparovali sme 3 analyty, 

bolo ažké uri presne o ktoré analyty sa jedná, pretože aj pri samostatnom dávkovaní sme nedosahovali odozvu pre 

maleínovú kyselinu, pri predžení dávkovacieho pulzu (60s) sulfosalicylan sodný a 1-naftylamín-3,6,8-trisulfónová kyselina 

boli zaznamenané. V tomto prípade migruje ako prvá 2-naftol-3,6-disulfónová kyselina, potom 1-naftylamín-3,6-disulfónová 

kyselina a nakoniec 2-naftylamín-4,8-disulfónová kyselina (Obr 1.a a Obr 2.a). 

V druhej skupine bolo prítomných 21 analytov s koncentráciou 0,023×10 -3 mol L -1 ; 2-naftol-6-sulfónová kyselina; 

2-naftalénsulfónová kyselina; salicylan sodný (0,115×10 -3 mol L -1 ); 1-naftalénsulfónová kyselina (0,046×10 -3 mol L -1 ); 

p-toluénsulfónová kyselina (0,115×10 -3 mol L -1 ); sulfanilan sodný; 3-nitrobenzén sulfónová kyselina; 

2,5-dimetylbenzénsulfónová kyselina (0,115×10 -3 mol L -1 ); nitrobarbitúrová kyselina (0,046×10 -3 mol L -1 ); fumarová 

kyselina; 3,5-dinitrobenzoová kyselina; 2-chlórbenzoová kyselina (0,115×10 -3 mol L -1 ); mandlová kyselina (0,115×10 -3 mol 

L -1 ); ftalová kyselina; antrachinón-2-sulfónan sodný; 2,3-dihydroxybenzoová kyselina; trans-akonitová kyselina; 

p-nitroanilínsulfónová kyselina; 2,6-dihydroxybenzoová kyselina; 3-nitroftalová kyselina; 4-nitroftalová kyselina. V tomto 

prípade sme rozseparovali iba 15 analytov, už pri samostatnom dávkovaní sme nedosiahli odozvu pre mnohé z nich (8) ani 

pri predžení pulzu. V tomto prípade bola identifikácia sažená znaným potom analytov v skupine a ich vzájomným 

prekryvom (Obr 1.b a Obr 2.b). Identifikácia pri prvých dvoch skupinách bola obtiažnejšia, avšak pri ostatných skupinách 

bola identifikácia jednoznaná. 

V tretej skupine migrovali 4 analyty s koncentráciou 0,1×10 -3 mol L -1 ; 2,4-dihydroxybenzoová kyselina; 

p-nitrobenzoová kyselina; m-nitrobenzoová kyselina a 2,6-dinitrofenol migrujúce v tomto poradí. Podarilo sa nám 

rozseparova a identifikova všetky analyty (Obr 1.c a Obr 2.c). 

Vo štvrtej skupine migrovalo 9 analytov s koncentráciou 0,082×10 -3 mol L -1 ; 7-amino-2-naftylsulfónová kyselina; 

2,4-dinitrofenol; 3-chlórbenzoová kyselina (0,247×10 -3 mol L -1 ); N-acetyltryptofán; 3,5-dihydroxybenzoová kyselina; 

benzoan sodný (0,165×10 -3 mol L -1 ); p-aminosalicynát sodný; 8-hydroxychinolín-5-sulfónová kyselina; 8-chinolínsulfónová 

kyselina; migrujúce v tomto poradí. Aj v tomto prípade sa nám podarilo rozseparova a identifikova všetky analyty (Obr 1.d 

a Obr 2.d). 

V poslednej piatej skupine bolo 10 analytov s koncentráciou 0,07×10 -3 mol L -1 ; fenylantranilová kyselina; 

p-hydroxybenzoová kyselina; asulam; škoricová kyselina; 3,4-dihydroxybenzoová kyselina; B-indolyloctová kyselina; galová 

kyselina; sorbová kyselina; fenyloctová kyselina (0,35×10 -3 mol L -1 ) a nikotínová kyselina migrujúce v tomto poradí (Obr 1.e 

a Obr 2.e). 

Všetky separácie boli uskutonené pri vlnovej džke 208 a 254 nm (Obr 1. a Obr 2.), a to z toho dôvodu, že niektoré 

analyty mali slabú (žiadnu) odozvu pri 254 nm ale pri 208 nm mali vysokú odozvu a naopak. Takýmto spôsobom boli 

analyty stanovené v jednotlivých skupinách v piatich pokusoch. Poet rozlíšených píkov v jednotlivých skupinách bolo 3 zo 

6 látok; 15 z 21 látok; 4 zo 4; 9 z 9 a 10 z 10, teda 45 z celkového potu 50 látok. 

alším krokom bolo pripravi zmes obsahujúcu všetkých 50 analytov a rozseparova ju v jednom pokuse (Obr 3.). 

Podarilo sa nám rozseparova 33 analytov s koncentráciou väšiny z nich 0,012x10 -3 mol L -1 . Treba poznamena, že sme 

nepredpokladali úplné rozseparovanie daných analytov. Otvorené systémy sú preferované na separácie menšieho potu 

analytov (vybraných analytov) a na dostatonej koncentranej úrovni, nenašli sme publikáciu, v ktorej by sa autori zamerali 

na separáciu mnohozložkovej vzorky. V tomto prípade bol trošku problém so štandardami, pretože už pri koncentrácii 

1×10 -3 mol L -1 sa niektoré analyty ažko rozpúšali, nebolo možné zarobi koncentrovanejšie zmesi vo vodnom roztoku, 

preto sme mali v niektorých prípadoch nízku odozvu. 




- 192 - 


11. - 14. 10. 2010

e 

d 

c 

b 

a 

20mAu 

t CZE (min) 

2 4 6 8 10 

Obr 1. Elektroforeogram z UV detektora z CZE separácie organických aniónov v otvorenom separanom systéme pri 

vlnovej džke 208nm; (a) 0,1×10 -3 mol L -1 1. skupina analytov; (b) 0,023×10 -3 mol L -1 2.skupina analytov; 

(c) 0,1×10 -3 mol L -1 3.skupina analytov; (d) 0,082×10 -3 mol L -1 4.skupina analytov; (e) 0,07×10 -3 mol L -1 5.skupina analytov. 

Separácie boli uskutonené v kremennej kapiláre s priemerom 45m s efektívnou džkou 24cm; vzorka bola dávkovaná 

hydrodynamicky po dobu 20s tlakom 50mbar; pozitívna polarita napätia 20kV. 

e 

d 

c 

b 

a 

10mAu 

t CZE (min) 

2 4 6 8 10 

Obr 2. Elektroforeogram z UV detektora z CZE separácie 50 organických aniónov v otvorenom separanom systéme pri 

vlnovej džke 254nm; (a) 0,1×10 -3 mol L -1 1. skupina analytov; (b) 0,023×10 -3 mol L -1 2.skupina analytov; 

(c) 0,1×10 -3 mol L -1 3.skupina analytov; (d) 0,082×10 -3 mol L -1 4.skupina analytov; (e) 0,07×10 -3 mol L -1 5.skupina analytov. 

Separácie boli uskutonené v kremennej kapiláre s priemerom 45m s efektívnou džkou 24cm; vzorka bola dávkovaná 

hydrodynamicky po dobu 20s tlakom 50mbar; pozitívna polarita napätia 20kV. 




- 193 - 


11. - 14. 10. 2010

a 

5mAu 

t CZE (min) 

4 8 

12 

Obr 3. Elektroforeogram z UV detektora z CZE separácie zmesi 50 organických aniónov s koncentráciou 0,012×10 -3 mol L -1 

v otvorenom separanom systéme pri vlnovej džke (a) 254nm; (b) 208nm. Separácie boli uskutonené v kremennej kapiláre 

s priemerom 45m s efektívnou džkou 24cm; vzorka bola dávkovaná hydrodynamicky po dobu 20s tlakom 50mbar; 

pozitívna polarita napätia 20kV. 

V úvode sme uviedli, že je možné dosiahnu nižšie koncentrané detekné limity v zatvorených separaných 

systémoch. Pracovali sme s rovnakou zmesou 50 organických UV absorbujúcich analytov s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 . 

Treba poznamena, že je to skoro 20x menšia koncentrácia ako v otvorenom systéme. Je to možné okrem dlhšej dráhy 

žiarenia v deteknej cele fotometrického detektora aj vaka ITP predúprave vzorky, kde dochádza k zakoncentrovaniu 

vzorky. 

Pri klasickom prístupe on-line spojenia ITP-CZE, kedy je vzorka dávkovaná medzi zónu vodiaceho a zakonujúceho 

elektrolytu, sa nám podarilo rozseparova 33 analytov (Obr 4.). Pre dosiahnutie lepšej separácie bolo potrebné zníži poet 

analytov v CZE stupni. Dalo sa to dosiahnu pomocou 4 spacerov, ktoré boli do ITP dávkované spolu so vzorkou 50 

analytov. Tieto spacery, tvoriace vlastné ITP zóny v pohyblivostnom intervale medzi vodiacim a zakonujúcim elektrolytom 

vytvorili celkom 5 hraníc ITP zón (Obr 5.). Do týchto zónových rozhraní boli priestorovo rozdelené analyty poda ich 

efektívnych pohyblivostí. Látky z jedného rozhrania definované dvojicou ITP zón (spredu a zozadu) tvorili jednu skupinu. 

Toto rozdelenie analytov bolo využité aj pri príprave roztokov modelových vzoriek s menším potom analytov pri 

separáciách v otvorenom systéme. 

Vaka systému prepínania separaného prúdu do kolón v zatvorenom systéme so spájanými kolónami bolo možné 

prenies do CZE stupa len jednu zo skupín a tak on-line zníži poet látok pre CZE separáciu. Ostatné rozhrania s alšími 

skupinami analytov boli odstránené mimo separaný priestor pomocou vhodného prepínania dráhy prúdu a asovania. Na 

zaiatku merania prúd prechádza ITP kolónou medzi hornou a bonou ITP elektródou po dobu, kým sa nedostane 

požadované zónové rozhranie pred bifurkanú oblas (spojenie ITP a CZE kapiláry). Potom sa prepne dráha prúdu do CZE 

kolóny k CZE elektróde (prúd prechádza od hornej ITP elektródy k CZE elektróde), požadované rozhranie migruje do CZE 

kolóny, potom sa prepne dráha prúdu naspä k bonej ITP elektróde a nežiaduce rozhrania sa odvedú mimo separaný 

priestor. Chceme zdôrazni, že v jednom pokuse sa do ITP kolóny dávkuje 50 analytov a spacery, do CZE kolóny sa pustí iba 

požadované rozhranie, ím sa znižuje saturaný faktor a zvyšuje sa pravdepodobnos rozlíšenia analytov do singletov. 

Takýmto spôsobom sa nám podarilo rozseparova 50 analytov pomocou 4 spacerov s koncentráciou 0,25×10 -3 mol L -1 

(dichlóracetát- DCA, monometylmalonát- MMM, N-acetylglycín- Ac-Gly, glutarát- GLR) do hraniných zón (Obr 5.), kedy 

sa v prvom rozhraní LE/DCA rozseparovalo 6 analytov s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 zo 6 (migrujúce v poradí 

1-naftylamín-3,6,8-trisulfónová kyselina; sulfosalicylan sodný (2,25×10 -6 mol L -1 ); 2-naftylamín-4,8-disulfónová kyselina; 

maleínová kyselina (2,25×10 -6 mol L -1 ); 1-naftylamín-3,6-disulfónová kyselina; 2-naftol-3,6-disulfónová kyselina); (Obr 5.a). 

V druhom rozhraní DCA/MMM sa rozseparovalo 19 analytov s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 z 21 prítomných 

(migrujúce v poradí fumarová kyselina; trans-akonitová kyselina; 3-nitroftalová kyselina; 4-nitroftalová kyselina; ftalová 

kyselina; nitrobarbitúrová kyselina (1,5×10 -6 mol L -1 ); 3-nitrobenzén sulfónová kyselina; sulfanilan sodný; 2-chlórbenzoová 

kyselina (3,75×10 -6 mol L -1 ); 3,5-dinitrobenzoová kyselina; p-nitroanilínsulfónová kyselina; 2,3-dihydroxybenzoová 




- 194 - 


11. - 14. 10. 2010

kyselina; mandlová kyselina (3,75×10 -6 mol L -1 ); salicylan sodný (3,75×10 -6 mol L -1 ); 2,6-dihydroxybenzoová kyselina; 

2,5-dimetylbenzénsulfónová kyselina (3,75×10 -6 mol L -1 ); p-toluénsulfónová kyselina (3,75×10 -6 mol L -1 ); 

1-naftalénsulfónová kyselina (1,5×10 -6 mol L -1 ); 2-naftalénsulfónová kyselina; 2-naftol-6-sulfónová kyselina; antrachinón-2sulfónan 

sodný); (Obr 5.b). 

V treom rozhraní MMM/Ac-Gly sa rozseparovali 4 analyty s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 zo 4 (migrujúce 

v poradí 2,6-dinitrofenol; m-nitrobenzoová kyselina; p-nitrobenzoová kyselina; 2,4-dihydroxybenzoová kyselina); (Obr 5.c). 

Vo štvrtom rozhraní Ac-Gly/GLR sa rozseparovalo 9 analytov s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 z 9 (migrujúce 

v poradí 8-hydroxychinolín-5-sulfónová kyselina; 8-chinolínsulfónová kyselina; p-aminosalicynát sodný; benzoan sodný 

(1,5×10 -6 mol L -1 ); 3,5-dihydroxybenzoová kyselina; N-acetyltryptofán; 3-chlórbenzoová kyselina (2,25×10 -6 mol L -1 ); 

2,4-dinitrofenol; 7-amino-2-naftylsulfónová kyselina); (Obr 5.d). 

V poslednom piatom rozhraní GLR/TE sa rozseparovalo 10 analytov s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 z 10 (migrujúce 

v poradí nikotínová kyselina; fenyloctová kyselina (3,75×10 -6 mol L -1 ); galová kyselina; sorbová kyselina; B-indolyloctová 

kyselina; 3,4-dihydroxybenzoová kyselina; škoricová kyselina; asulam; p-hydroxybenzoová kyselina; fenylantranilová 

kyselina); (Obr 5.e). 

Poet rozlíšených píkov z potu analytov v jednotlivých skupinách bolo 6 zo 6; 19 z 21; 4 zo 4; 9 z 9 a 10 z 10. 

Pomocou 5 následných separácii tej istej vzorky bolo celkom rozlíšených 48 píkov z 50 prítomných analytov s vemi dobrou 

reprodukovatenosou. Nevýhodou tejto metódy je dlhý as potrebný na uskutonenie potrebných analýz, lebo poet 

separácii pre jednu vzorku je daný potom skupín vytvorených poas izotachoforézy. Z tohto dôvodu efektivita nevyhnutne 

vyžaduje prácu v automatizovanom režime. 

1V 

700 t (s) 750 

ITP 

500 1000 1500 

12,5mAu 

t CZE (s) 

blank 

Obr 4. Izotachoforeogram z CD detektora a elektroforeogram z UV detektora pre CZE separáciu zmesi 50 organických 

aniónov v zatvorenom separanom systéme s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 . Blank je síran s koncentráciou 10 -4 mol L -1 . 

Poet rozlíšených píkov je 33 z celkového potu 50. V ITP kolóne bol aplikovaný prúd 150A a v CZE kolóne 50A. 




- 195 - 


11. - 14. 10. 2010

1V 

700 750 800 t ITP (s) 

e 

d 

c 

b 

a 

25mAu 

500 1000 1500 t CZE (s) 

Obr 5. Izotachoforeogram z CD detektora a elektroforeogram z UV detektora pre CZE separáciu 50 organických aniónov 

v zatvorenom separanom systéme so 4 spacermi (DCA, MMM, Ac-Gly, GLR) s koncentráciou 0,25×10 -3 mol L -1 pri 

vlnovej džke 254nm; (a) analyty v rozhraní LE/DCA s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 ; (b) analyty v rozhraní DCA/MMM 

s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 ; (c) analyty v rozhraní MMM/Ac-Gly s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 ; (d) analyty v 

rozhraní Ac-Gly/GLR s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 ; (e) analyty v rozhraní GLR/TE s koncentráciou 0,75×10 -6 mol L -1 . 

V ITP kolóne bol aplikovaný prúd 150A a v CZE kolóne 50A. 

4. Záver 

Dvojdimenzionálny ITP-CZE prístup s využitím diskrétnych spacerov je kúovým na zníženie rizika prekryvu látok 

prostredníctvom zníženia saturaného faktora a na dosiahnutie úinného nástroja na separáciu mnohozložkových 

(biologických) vzoriek. Celkový súbor sekvenne vykonaných ITP(DS)-CZE separácií, kedy sa do CZE kolóny prenáša vždy 

iné rozhranie, poskytuje údaje dvojdimenzionálneho (2D) charakteru pre danú multikomponentnú vzorku ako aj celkový 

prehad o všetkých resp. väšiny látok, ktoré migrujú za daných separaných podmienok. Z vyššie uvedených skutoností 

vyplýva, že na komplexnú separáciu jednej vzorky je potrebné uskutoni taký poet pokusov, aký je poet rozhraní 

vytvorených v ITP stupni. Automatizácia uvedeného prístupu v porovnaní s manuálnym prístrojom prináša niekoko výhod, 

z hadiska nepretržitej prevádzky možnos mera 24 hodín denne, zníženie vplyvu udského faktora na správnos a presnos 

výsledkov analýzy a znížená spotreba chemikálií. Jednou z nevýhod je dlhší as potrebný na prevedenie potrebných analýz (1 

analýza trvá okolo 40 minút) v porovnaní s otvoreným prístupom, kedy jedna analýza trvala do 15 minút. Avšak keby sme 

chceli pracova s biologickou vzorku, nebolo by možné v otvorenom prístupe rozdeli vzorku na skupiny s menším potom 

analytov pred meraním. Separácie v otvorenom separanom systéme boli menej reprodukovatené, ako separácie 

v zatvorenom systéme. 

Dvojdimenzionálny ITP-CZE prístup s využitím diskrétnych spacerov doteraz nebol publikovaný a bol nosným 

pilierom tejto práce. V budúcnosti by sme chceli tento prístup aplikova na separáciu vzorky biologického pôvodu 

a predpokladáme subné výsledky. 

Poakovanie 

Táto práca bola podporená Slovenskou grantovou agentúrou VEGA (1/0882/09 a 1/0546/10), Slovenskou agentúrou pre 

výskum a vývoj (VVCE-0070-07) a Grantom Univerzity Komenského íslo UK/329/2009. 




- 196 - 


11. - 14. 10. 2010

Literatúra 

[1] Th.P.E.M. Verheggen, A.C. Schoots, F.M. Everaerts, J. Chromatogr., 503 (1990) 245. 

[2] H. Yin, C. Keely-Templin, D.Mc Manigill, J. Chromatogr. A, 744 (1996) 45. 

[3] F. Foret, L. Kivánková, P. Boek, Capillary Zone electrophoresis, VCH, Weinheim, 1993. 

[4] S. Hjertén, Chromatogr. Rew., 3 (1967) 122. 

[5] R. Virtanen, Acta Polytech. Scond., 123 (1974) 1. 

[6] F.E.P. Mikkers, F.M. Everaerts, Th.P.E.M. Verheggen, J. Chromatogr., 169 (1979) 1. 

[7] J.L. Beckers, F.M. Everaerts, J.Chromatogr., 508 (1990) 3. 

[8] J.L. Beckers, F.M. Everaerts, J.Chromatogr., 508 (1990) 19. 

[9] D. Kaniansky, J. Marák, J. Chromatogr., 498 (1990) 191. 

[10] D. Kaniansky, J. Marák, V. Madajová, E. Šimuniová, J. Chromatogr., 638 (1993) 137. 

[11] D. Kaniansky, F. Iványi, F.I. Onuska, Anal. Chem., 66 (1994) 1817. 

[12] D. Kaniansky, I. Zelenský, A. Hybenová, F.I. Onuska, Anal. Chem., 66 (1994) 4258. 

[13] L. Kivánková, F. Foret, P. Boek, J. Chromatogr., 545 (1991) 307. 

[14] F. Foret, E. Szoko, B.L. Karger, J. Chromatogr. A, 608 (1992) 3. 

[15] L. Kivánková, P. Gebauer, W. Thormann, R.A. Mosher, P. Boek, J. Chromatogr., 638 (1993) 119. 

[16] D. Kaniansky, M. Masár, J. Bielíková, J. Chromatogr. A, 792 (1997) 483. 

[17] D. Kaniansky, Habilitaná práca, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava, 1995. 

[18] M. Kova, Kandidátska dizertaná práca, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava, 1981. 

[19] D. Kaniansky, J. Marák, V. Vaváková, M. Masár, Automated Capillary Electrophoresis Analyzer, Omega Info, 

Bratislava, 2004. 




- 197 - 


11. - 14. 10. 2010

CHARAKTERIZÁCIA PÔDNYCH HUMÍNOVÝCH KYSELÍN OFF-LINE KOMBINÁCIOU METÓD RP-HPLC A 

SEC 

RÓBERT GÓRA *, MILAN HUTTA, PAVOL ROHÁRIK, NATÁLIA MASARYKOVÁ 

Department of Analytical Chemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University in Bratislava, Mlynská dolina CH-2, 

842 15, Bratislava, Slovakia 

e-mail:gora@fns.uniba.sk 

Úvod 

Humínové látky (HL) sú prírodné látky makromolekulového charakteru s komplexnou 3-dimenzionálnou štruktúrou. 

Patria medzi najvýznamnejšie zložky pôdnej organickej hmoty, ktorá z hadiska globálneho životného prostredia predstavuje 

dôležitú zásobáre uhlíka pre uhlíkový cyklus. Vo všeobecnosti sú HL amorfné, polydisperzné makromolekuly kyslého 

charakteru so žltým až iernym sfarbením, ich relatívna molová hmotnos pohybuje v rozsahu od niekokých stoviek až po 

niekoko stotisíc [1]. Napriek tomu, že humínové látky sú dlhodobo predmetom štúdií a našli rôznorodé, široké využitie, ešte 

stále nie sú komplexne vo všetkých detailoch spoznané. Táto skutonos je dôsledkom ich chemickej, štruktúrnej a fyzikálnej 

polydisperzity, ktorá sa prejavuje vo vekej neuritosti analytického signálu takmer vo všetkých analytických metódach, 

ktoré sa zaoberajú výskumom a meraním HL z makromolekulového pohadu. Výrazný analytický signál je získavaný o HL 

iba pri zjednodušujúcom pohade zameranom napr. na ich elementárne chemické zloženie. Štruktúrna nejednoznanos a 

vlastnosti HL majú za následok vemi rôznorodé prejavy v správaní sa za rôznych podmienok (napr. silná schopnos 

agregova a disagregova, vytvára supramolekulové štruktúry a podobne). 

Významné uplatnenie v charakterizácii a analýze humínových látok našli separané metódy. Medzi hlavné oblasti ich 

využitia patria izolácia a frakcionácia HL pred alšími experimentami alebo získanie informácii o ich štruktúre a 

vlastnostiach [2]. Spomedzi chromatografických metód najširšie uplatnenie našla rozmerová vyluovacia chromatografia 

(SEC), používaná predovšetkým na stanovenie relatívnej molovej hmotnosti HL, alebo na frakcionáciu vzoriek na základe 

rozmerov molekúl. Metóda SEC umožuje dosiahnu relatívne správne a presné stanovenie distribúcie molovej hmotnosti aj 

vzhadom nato, že vekos molekúl je úmerná ich relatívnej molovej hmotnosti, ale závisí aj od alších iných faktorov, ktoré 

môžu výrazne ovplyvni ich eluné spávanie sa HL v chromatografickom systéme ako sú koncentrácia HL, pH, iónová sila 

prítomných solí v roztoku [3-6]. 

Reverzno - fázová vysokoúinná kvapalinová chromatografia (RP-HPLC) sa asto používa na stanovenie celkového 

obsahu HL v rôznych emvironmentálnych vzorkách, najmä v prírodných vodách. Cieom týchto prác sú obvykle stanovenie 

dôležitých parametrov z hadiska životného prostredia, ako množstvo celkového alebo rozpusteného organický uhlíka (TOC, 

DOC) [2]. Vo všeobecnosti platí, že klasické RP – systémy s použitím lineárnej gradientovej elúcie neumožujú úinnú 

frakcionáciu HL, a získané chromatogramy poskytujú iba obmedzené množstvo použitených informácií o povahe a štruktúre 

analyzovaných látok. Naopak, použitie skokovej gradientovej elúcie umožní HL separova do niekokých dobre 

definovaných frakcií v závislosti od potu vynútených krokov [7]. 

Kombináciu dvoch alebo viac chromatografických metód (on-line alebo off-line) založených na rozliných separaných 

princípoch využívali autori doposia iba v zriedkavých prípadoch na analýzu HL. Shalliker a kol. vo svojej práci [8] opísali 

využitie spojenia SEC a RP-HPLC metódy na analýzu a charakterizáciu humínových látok izolovaných z tzv. Bayerových 

roztokov (vznikajú pri procese výroby hliníka, kde vysoký obsah humínových látok je nežiaduci). HL separovali pomocou 

SEC metódy do niekokých frakcií a vybrané frakcie alej analyzovali RP-HPLC metódou v spojení s hmotnosnou 

spektrometriou (MS), ktorá umožnila aj identifikova niektoré komponenty nachádzajúce sa v SEC frakciách HL. 




- 198 - 


11. - 14. 10. 2010

Z uvedeného vyplýva, že je stále potrebné vyvíja nové separané metódy a techniky na analýzu a charakterizáciu 

týchto látok. K riešeniu podobných zložitých problémov môže napomôc aplikácia nových postupov, ktoré poukazujú na 

možnosti kombinácie spájania dvoch alebo viacerých chromatografických alebo separaných metód pracujúcich na odlišných 

princípoch (napr. spojenie SEC - HPLC, RP-HPLC - SEC, ITP - CZE - HPLC) [8,9] a taktiež využitie neobvyklých, doteraz 

menej používaných postupov v chromatografických metódach (skoková gradientová elúcia, voba netradiného organického 

modifikátora mobilnej fázy – DMF a pod.) [7,10,11]. 


Všetky chromatografické experimenty sme uskutonili použitím chromatografického systému LaChrom Merck - 

Hitachi (Merck, Darmstadt, Nemecko), ktorý sa skladal z nasledujúcich modulov: zo štvorkanálovej pumpy L-7100 on-line 

spojeným s vákuovým odplyovaom L-7612, z automatického dávkovaa L-7200, z kolónového termostatu L-7300, v 

ktorom bola umiestnená chromatografická kolóna, zo spektrofotometrického detektora s radom diód (DAD) L-7450A, z 

flourimetrického detektora (FLD) L-7480. Komunikáciu medzi zariadením a riadiacim softvérom HSM verzia 4.1 bola 

zabezpeená fázovým rozhraním D-7000. 

V prvom separanom stupni na frakcionáciu vzoriek HL do niekokých dobre definovaných frakcií sme použili metódu 

RP – HPLC. Na separáciu vzoriek sme použili analytickú kolónu LiChrospher ODS WP 300 RP-18 (250 x 4) mm s 

priemernými rozmermi pórov 30 nm (Merck, Darmstadt, Nemecko), ktorá bola spojená s predkolónou LiChrospher ODS WP 

300 RP-18 (4 x 4) mm (Merck, Darmstadt, Nemecko). Na samotnú frakcionáciu sme využívali techniku skokovej 

gradientovej elúcie, kde hlavnou organickou zložkou mobilnej fázy (MF) bol N,N- dimetylformamid (DMF), ktorý 

v minulosti bol asto používaný pri izolácii HL z pôdnych vzoriek, vzhadom na jeho výborné solvatané vlastnosti, silnú 

schopnos tvorby vodíkových mostíkov a nízku prchavos [12]. Požadované zloženie MF sme dosiahli miešaním dvoch 

základných roztokov, DMF a fosforenanového tlmivého roztoku o pH 3.00 (pripravený rozpustením NaH2PO4 . 2H2O koncentranú úrove 5 mol.dm -3 , pH sme si upravili na hodnotu 3,00 pridávaním roztoku H3PO4 o koncentrácii 5 mol.dm -3 ) v 

závislosti od asu [7]. Jednotlivé frakcie sme zbierali v asových intervaloch odvodených z odozvy FLD detektora (ex. = 470 

nm, em. = 530 nm), o predstavovalo približne 500 μl eluátu z oblasti maxima píkov. Frakcie získané týmto spôsobom sme 

použili na alšie analýzy v druhom separanom stupni. Termostat bol vyhriaty na teplotu 35,0 ± 0,1 °C, prietok MF bol 

nastavený na 1 ml/min a pre úely RP-HPLC frakcionácie HL sme dávkovali do chromatografického systému 100 μl vzorky. 

Druhý separaný stupe pozostával zo SEC analýzy frakcii HL. Použili sme kovovú kolónu s rozmermi (250 x 2,2) 

mm, plnenú sorbentom Spheron HEMA 100 s priemernými rozmermi astíc gélu < 25 μm. Pri tejto metóde sme ako mobilnú 

fázu použili zmes DMF a fosforenanového tlmivého roztoku (koncentrácia 5 mol.dm -3 , pH = 3.00) v pomere 99/1 (v/v). 

Používali sme rovnaký spôsob detekcie a nastavenie teploty termostatu ako v prípade RP - HPLC experimentov. Dávkovaný 

objem frakcií bol v rozmedzí 20 - 100 μl pri prietoku MF 0,2 ml /min. 

V práci sme použili 3 typy vzoriek humínových látok, komerne pripravený štandard humínových kyselín od firmy 

Sigma – Aldrich (HK Aldrich) (Sigma – Aldrich, St. Louis, MI, USA) a humínové kyseliny izolované z pôdy (okolie 

Dunajskej Stredy (HK DS I a HK DS J)), poda modifikovanej IHSS frakcionanej schémy [13,14]. Všetky tri vzorky boli 

pripravené na koncentranej úrovni 3 mg/ml. 




- 199 - 


11. - 14. 10. 2010


V prvom separanom stupni sme aplikovali RP - HPLC metódu na charakterizáciu HL porovnaním ich 

chromatografických profilov a tiež na separáciu vzoriek do frakcií, ktoré boli zbierané v oblasti maxím píkov. Tieto frakcie 

boli následne v alšom separanom stupni v off - line režime charakterizované metódou SEC. Zo získaných 

chromatografických záznamov vyplýva, že dôsledkom prinútených náhlych zmien koncentrácie mobilnej fázy poda 

priebehu aplikovanej gradientovej elúcie sa nám jednotlivé vzorky podarilo rozdeli do 11 - tich pomerne dobre 

definovaných frakcií (Obrázok 1.). 

Obrázok 1.: RP - HPLC záznam vzorky HA DS J (3,02 mg/ml), FLD detekcia (ex. = 470 nm, em. = 530 nm), dávkovaný 

objem 100 μl. íslicami 1 až 11 sú oznaené približné polohy odobratia jednotlivých frakcií. 

Porovnaním RP-HPLC profilov skúmaných vzoriek HL (Obrázok 1, 2a a 2b) môžeme konštatova, že jednotlivé vzorky 

poskytujú chromatogrami s rozdielnymi charakteristickými rtami, o svedí o rozdielnom zložení jednotlivých vzoriek. 

Podobné rozdiely v chromatografických profiloch dokumentujú aj chromatogramy získané spektrofotometrickou detekciou, 

i už porovnaním kontúrových máp sledovaných v rozmedzí vlnových džok 270 až 800 nm alebo pri konkrétnej vybranej 

vlnovej džke (280 nm, 420 nm). 




- 200 - 


11. - 14. 10. 2010

2a.) 2b.) 

Obrázok 2.: RP - HPLC záznam vzorky HA DS I (3,00 mg/ml) - 2a.) a HA Aldrich (3,00 mg/ml) - 2b.), FLD detekcia (ex. = 

470 nm, em. = 530 nm), dávkovaný objem 100 μl. íslicami 1 až 11 sú oznaené približné polohy odobratia jednotlivých 

frakcií. 

Pre druhý separaný stupe sme si zvolili chromatografickú metódu, ktorá pracuje na základe rozdielnych separaných 

princípov ako v prvom stupni používaná RP-HPLC metóda. Vybrali sme rozmerovo vyluovaciu chromatografiu (SEC), 

ktorá umožuje pomerne presne a správne uri distribúciu molovej hmotnosti jednotlivých vzoriek HL [2,15] a takisto ich 

frakcií získaných RP - HPLC metódou. Ako stacionárna fáza bol použitý gél Spheron HEMA 100 s vekosou astíc < 25 

μm, ktorým bola naplnená kolóna s rozmermi (250 x 2,2) mm. Gély Spheron HEMA sa vyznaujú mimoriadnou 

mechanickou odolnosou, ktorá umožuje ich použitie pri kvapalinovej chromatografii pri vysokých tlakoch, bez rizika 

deformácie i rozpadnutia astíc, upchania kolóny a roztrhnutiu stpca gélu. 

Na kalibráciu použitej kolóny sme použili rôzne štandardy makromolekulových látok o známej relatívnej molovej 

hmotnosti. Spomedzi skúmaných kalibraných štandardov najlepšie vyhoveli polystyrénové štandardy (PS) najmä preto, lebo 

svoje absorpné maximum majú pri 270 nm a svojimi vlastnosami najviac spajú požiadavky vyplývajúce zo zloženia nami 

navrhnutého separaného systému. Zo získaných retenných údajov sme zostrojili kalibranú závislos (Obrázok 3.), ktorá 

znázoruje závislos logaritmu molovej hmotnosti (log MW) jednotlivých PS štandardov od ich retenného asu (tr), ktorú 

sme potom použili na stanovenie distribúcie relatívnych molových hmotností pre jednotlivé vzorky humínových látok a ich 

RP-HPLC frakcií. 

Obrázok 3.: Kalibrácia použitej kolóny Spheron HEMA 100 použitím polystyrénových štandardov s nominálnymi hodnotami 

relatívnych molových hmotností (900, 2600, 4000, 10000, 37000, 97000, 1200000). 




- 201 - 


11. - 14. 10. 2010

Frakcie odobrané v prvom separanom stupni sme alej analyzovali SEC metódou za aplikáciou rôznych kombinácií 

experimentálnych podmienok. Pri týchto experimentoch sme sledovali predovšetkým vplyv niektorých parametrov na 

priebeh separácie, ako napr. vplyv dávkovaného objemu, vplyv obsahu organickej zložky v mobilnej fáze a tiež vplyv 

rýchlosti prietoku mobilnej fázy. Po vyhodnotení výsledkov sme dospeli k názoru, že pre finálne experimenty budeme 

používa ako mobilnú fázu (MF) zmes so zložením 99% N,N-dimetylformamidu (DMF) a 1% fosforenanového tlmivého 

roztoku o pH 3.00. Vplyv zvýšeného obsahu DMF sa prejavilo najmä po porovnaní plôch píkov a iastone aj na vzhade 

chromatogramov, keže oproti záznamom získanými za podmienok použitia MF s nižším obsahom DMF boli plochy píkov v 

niektorých prípadoch niekokonásobne väšie. V prípade vplyvu množstva dávkovaného objemu sme navrhli sériu 

experimentov, pri ktorých sme si zvolili 20 μl, 50 μl a 100 μl objemy vzoriek, ktoré boli injektovaný do chromatografického 

systému. Z nameraných výsledkov vyplýva, že objem dávkovanej vzorky do chromatografického systému má vplyv na 

vzhad chromatografických záznamov. Po vyhodnotení a porovnaní plôch píkov prislúchajúcich jednotlivým frakciám na 

SEC záznamoch môžeme konštatova, že rozdiely v pomeroch plôch píkov v prípade jednotlivých RP-HPLC frakcií pri 

dávkovaní rôznych objemov vzorky sú výraznejšie v prípade frakcií, ktoré eluovali pri nižších obsahoch DMF v RP-HPLC 

systéme a postupne sa znižujú. V prípade dávkovania 100 μl vzorky do SEC systému sa už prejavili známky preaženia 

kolóny. 

 

Obrázok 4.: SEC profily RP-HPLC frakcií vzorky HA DS J (3,02 mg/ml), FLD detekcia (ex. = 470 nm, em. = 530 nm), 

dávkovaný objem 50 μl. Jednotlivé frakcie sú zoradené od frakcie11 po 2. 

 

Obrázok 5.: SEC profily RP-HPLC frakcií vzorky HA DS I (3,00 mg/ml), FLD detekcia (ex. = 470 nm, em. = 530 nm), 

dávkovaný objem 50 μl. Jednotlivé frakcie sú zoradené od frakcie11 po 1. 




- 202 - 


11. - 14. 10. 2010

Porovnaním chromatogramov frakcií vzoriek získaných SEC separáciou HL „DS J“ a „DS I“, ktoré sú izolované z toho 

istého zdroja, prešli však inou úpravou v rozdielnych vetvách použitej frakcionanej schémy [13,14] sme zistili niekoko 

výrazných odlišností. Ako z nameraných záznamov (Obrázok 4. a 5.) vyplýva, SEC eluné profily RP-HPLC frakcií týchto 

vzoriek vykazujú v niektorých prípadoch výrazne odlišný pomer v zastúpení látok s vyššou relatívnou hmotnosou voi 

látkam majúce nižšie relatívne molové hmotnosti. Tento jav je charakteristické najmä v prípade tých frakcií, ktoré v RP- 

HPLC systéme eluovali pri vyššom obsahu fosforenanového tlmivého roztoku v MF a výraznejšie sa prejaví pri dávkovaní 

väších objemov vzoriek. 

Použitím kalibranej závislosti pre kalibráciu kolóny sme z nameraných výsledkov urili distribúciu relatívnej molovej 

hmotnosti pre jednotlivé RP-HPLC frakcie troch vybraných vzoriek HL. RP-HPLC frakcie skúmaných vzoriek v SEC 

systéme separovali spravidla na dve veké subfrakcie, z ktorých prvá eluovala v oblasti vyluovacej medze použitej 

stacionárnej fázy a „de facto“ boli vylúené zo separácie, o znamená, že ich relatívna mólová hmotnos je väšia ako 100 

000. Druhá subfrakcia pokryla prakticky celý pracovný rozsah kolóny, o znamená, že v tej zóne eluovali látky so širokou 

distribúciou relatívnej mólovej hmotnosti, priom maximum zóny padalo do oblasti, kde eluovali štandardy s relatívnou 

mólovou hmotnosou okolo 10 000. V niektorých prípadoch sa na chromatografických záznamoch objavil aj tretí pík, ktorý 

eluoval v oblasti zodpovedajúcej elúného asu štandardu s relatívnou mólovou hmotnosou približne 30 000. 

Použitú kombináciu dvoch chromatografických metód RP-HPLC a SEC sme vyhodnotili aj z hadiska dosiahnutia 

miery ortogonality separácie. Na tento úel sme použili metódu, kde sme porovnávali úrove korelácie dát získaných 

obidvomi chromatografickými metódami zostrojením grafickej závislosti, kde sme na os „x“ vyniesli hodnoty retenných 

asov získané z prvej chromatografickej dimenzie (RP-HPLC) na os „y“ hodnoty maxím píkov z druhej chromatografickej 

dimenzie (SEC) v prípade všetkýchy troch skúmaných vzoriek HL (Obrázok 6., 7. a 8.). Pomocou dostupného štatistického 

programu [16] sme vypoítali Pearsonove korelané koeficienty („Pearson Product Moment Correlation“) a alšie 

štatistické parametre, ktoré charakterizujú stupe porovnatenosti nameraných dát (Tabuka 1., 2. a 3.). 

Obrázok 6. a Tabuka 1.: 2D záznam Pearsonovho korelaného koeficientu - grafické znázornenie stupa 

porovnatenosti po aplikácii kombinácie metód SEC a RP-HPLC a získané štatistické parametre pre vzorku HA DS J 




- 203 - 


11. - 14. 10. 2010


porovnatenosti po aplikácii kombinácie metód SEC a RP-HPLC a získané štatistické parametre pre vzorku HA DS I. 


porovnatenosti po aplikácii kombinácie metód SEC a RP-HPLC a získané štatistické parametre pre vzorku HA DS Aldrich. 

Záver 

Práca sa zoberá možnosami analýzy a charakterizácie vzoriek humínových látok off-line kombináciou dvoch 

chromatografických metód, RP-HPLC a SEC. V prvej separanej stupni použitá RP-HPLC metóda s technikou skokovej 

gradientovej elúcie umožnila separáciu jednotlivých vzoriek HL do 11 dobre definovaných frakcií, ktoré boli v druhom 

chromatografickom stupni charakterizované metódu SEC, ktorá pracuje na základe odlišných separaných princípov ako RP- 

HPLC. 

Porovnaním vypoítaných hodnôt Pearsonových korelaných koeficientov pre charakterizáciu všetkých troch 

skúmaných vzoriek humínových kyselín a ich frakcií kombináciou metód RP-HPLC a SEC môžeme konštatova, že hodnoty 

poukazujú na vemi nízku úrove korelácie a použitý separaný systém sa správa ako ortogonálny 




- 204 - 


11. - 14. 10. 2010

Práca vznikla za podpory grantov VEGA 1/0870/09, APVV-0595-07, VVCE-0070-07. 

LITERATÚRA 

[1] Choudhry G.G., Humic Substances. Structural aspects, and photophysical, photochemical and free radical 

characteristics, in Hutzinger O. Ed., The Handbook of Environmental Chemistry Vol. 1., Part C., The Natural environment 

and the biogeochemical cykles, Springer Verlag, Heidelberg, 1989, pp. 1-24. 

[2] Jánoš P., J. Chromatogr. A., 983 (2003) 1. 

[3] Town R.M., Powell H.K.J., Anal. Chim. Acta, 256 (1992) 81. 

[4] Powell H.K.J., Town R.M., Anal. Chim. Acta, 267 (1992) 47. 

[5] Town R.M., Powell H.K.J., Anal. Chim. Acta, 279 (1993) 211. 

[6] Mori S., Hiraide M., Mizuike A., Anal. Chim. Acta, 193 (1987) 231. 

[7] Hutta, R. Góra, J. Chromatogr. A, 67, 1012 (2003). 

[8] Whelan T.J., Shalliker R.A., McIntyre C., Wilson M.A., Ind. Eng. Chem. Res., 44 (2005) 3229. 

[9] Róbert Góra, Milan Hutta, Havlíková Dana, Pavol Rohárik, Orthogonal off-line combination of RP-HPLC and SEC 

for analysis and characterization of soil humic acids, Proceedings of International Conference Humic Substances in 

Ecosystems 8, Šopora, 13-16 September 2009, Ed. Zaujec A., Bielek P., Gonet S.S., Debska B., Heczko J., pp. 167 – 

174, Vyd. VUPOP Bratislava, ISBN: 978-80-89128-60-0, 2009. 

[10] Góra R., Hutta M., J. Chromatogr. A., 39, 1084 (2005). 

[11] Góra R., Hutta M., Vrška M., Katušák S., Jablonský M., J. Sep. Sci., 2179, 29 (2006). 

[12] W. Ziechmann, Huminstoffe, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach- Florida, Basel 1980, pp.191. 

[13] Kandrá J., Hutta M., Foltin M., J. Radioanal. Nucl. Chem., Articles, 208 (1996) 577. 

[14] Prochácková T., Góra R., Kandrá J., Hutta M., J. Radioanal. Nucl. Chem., 229 (1998) 61. 

[15] Jánoš P., Zatepálková I., J. Chromatogr. A, 1160 (2007) 160. 

[16] Wessa P., (2009), Free Statistics Software, Office for Research Development and Education,version 1.1.23-r4, 

http://www.wessa.net/ (15.6.2010). 




- 205 - 


11. - 14. 10. 2010

VÝVOJ NOVEJ METÓDY ANEXOVEJ CHROMATOGRAFIE NA CHARAKTERIZOVANIE PÔDNYCH A 

RAŠELINOVÝCH HUMÍNOVÝCH LÁTOK 

MILAN HUTTA * , JURAJ PESSL, JANKA RÁCZOVÁ 


Bratislava 

e-mail hutta@fns.uniba.sk 

Úvod 

Štruktúra humínových látok (HL) ešte stále nie je celkom objasnená, a to napriek tomu, že sú študované už viac ako 150 

rokov a tiež napriek ich dôležitosti pre pôdohospodárstvo, prvotnú úpravu vôd, ekológiu, vedy o zdraví a neustupujúcemu 

záujmu výskumných vedcov a technológov. 

Tieto látky, s formálne neustálenými nazormi na ich nestálu štruktúru, silne ovplyvujú mechanické a fyzikálno-chemické 

vlastnosti pôdy. Medzi takéto vlastnosti patrí napríklad štruktúra a textúra pôdy a jej stálos, odolnos a sorpná kapacita. 

Humínové látky sú schopné viaza živiny pre rastliny a remobilizova ažké kovy. 

Z dostupnej literatúry vyplýva, že poet prác, ktoré prakticky využívajú kvapalinovo-chromatografické separané 

mechanizmy na analýzu, charakterizovanie a frakcionovanie humínových látok sa pohybuje na úrovniach okolo 600 

publikácií rôzneho druhu. Z uvedeného potu je najväší podiel zahajúci viac ako 90% zameraný na využívanie gélovej 

chromatografie (GPC, SEC). Podstatne menší podiel publikácií do 5 % je zameraný na využívanie možností vysoko úinnej 

kvapalinovej chromatografie s obrátenými fázami (RP-HPLC). Chromatografických metód využívajúcich na separáciu 

humínových látok prevažne nábojové interakcie, t.j. iónovo-výmennú chromatografiu (IEC) je vemi málo s relatívnym 

zastúpením publikácií menším ako 2%. Iónovo-výmenná chromatografia (IEC) nenašla veké uplatnenie pri separácii 

humínových látok pravdepodobne v dôsledku vemi vekej retencii HL na väšine iónomeniov. Iónovo- výmenné separané 

mechanizmy sa používali väšinou len na izoláciu HL a ich odstraovanie zo vzoriek životného prostredia, hlavne vodných 

a pôdnych matríc. V praxi prevládajú s viac ako 95% zastúpením kolónové chromatografické techniky a len málo prác je v 

súasnosti publikovaných so zameraním na plošné chromatografické techniky (TLC), alebo na kombinácie TLC a HPLC. 

Z popisu názorov a poznatkov o štruktúre a funkných skupinách humínových látok, najmä humínových kyselín a 

fulvokyselín je zrejmé, že iónogénne (hlavne aniónogénne) funkné skupiny hrajú v ich štruktúre významnú úlohu, ktorá sa 

prejavuje pri ich interakciách s rôznymi zložkami životného prostredia a tiež umožuje ich separáciu elektroseparanými 

metódami [1-6]. Pritom prác zameraných priamo na analýzu a frakcionovanie humínových kyselín a fulvokyselín pomocou 

IEC je vemi málo, o bol aj jeden z dôvodov, preo sme si pre podrobnejšie štúdium zvolili práve túto tému. 

Humínové látky sú definované operane na základe ich správania sa v zriedených alkalických roztokoch (extrakné roztoky 

napríklad hydroxidu sodného, pyrofosforenanu sodného a podobne) a v prostrediach kyselín (kyselina chlorovodíková) po 

neutralizovaní a okyslení extrakného alkalického prostredia [7]. 

Predpokladá sa, že humínové látky tvoria v kyslejších prostrediach takzvané agregáty, kedy sa dá zjednodušene poveda, že 

sú stoené do „klbka“ dôsledkom intramolekulovej a intermolekulovej agregácie. Pri dostatonom znížení hodnoty pH sa 

hlavne humínové kyseliny, ako to vyplýva z ich vlastností, makroskopicky vyzrážajú. V roztokoch humínových látok s 

vysokou hodnotou pH naproti tomu prebieha disociácia funkných skupín, ako sú hlavne karboxylové a fenolické 

hydroxylové skupiny. Dôvodom, preo sme si zvolili na štúdium chromatografického správania sa v IEC mobilnú fázu s 

vysokou hodnotou pH, je možnos vytvori viac negatívnych nábojov nesených ich makromolekulami a tak potlai ich 

asociovanie sa cez vzájomné odpudzovanie ich záporných nábojov. V dôsledku toho makromolekuly humínových látok 

môžeme „rozbali“ a iastone linearizova. Predpokladáme, že týmto spôsobom budeme môc dosiahnu spoahlivé a 

robustnejšie charakterizovanie humínových látok popri nehumínových látkach pôd a rašelín. 

Prakticky vždy ke sa analyzujú humínové látky z pôdy, i už fulvokyseliny, alebo humínové kyseliny, je potrebné použi 

viacstupovú úpravu tuhej vzorky. Skoro vždy ide v prvom stupni o ich extrakciu z pevnej matrice roztokom NaOH. 

Najastejšie sa na tento úel používa NaOH s koncentráciou 0,5 mol/L, alebo s koncentráciou 1,0 mol/L. Po tomto stupni 

nasledujú alšie kroky, napríklad okyslenie na pH 1 za úelom vyzrážania humínových kyselín a podobne. Analýza takto 

upravených vzoriek však už nie je analýzou humínových látok ako takých, ale ich jednotlivých operane definovaných 

frakcií. Na základe toho sme sa rozhodli pre analýzu a charakterizovanie humínových látok v alkalickom prostredí pomocou 

nových metód IEC s cieom vyvinú metódu a študova gradientovú kolónovú chromatografiu s tandemovou 

spektrofotometrickou detekciou pomocou radu fotodiód (DAD) a spektrofluorimetrickou detekciou (FLD) na 

charakterizovanie humínových látok v alkalickom prostredí. 

Teoretická as 

Humínové látky tvoria hlavnú súas organickej hmoty. Rozpustený organický uhlík (DOC) vo vodnom životnom prostredí 

reprezentuje jeden z najväších zásobníkov aktívneho organického uhlíka v biosfére [8]. S celkovým množstvom DOC v 

oceánoch môže by porovnatené množstvo uhlíka z oxidu uhliitého v atmosfére [9]. V povrchových vodách približne 

polovica celkového množstva organických zložiek a skoro všetky organické zložky s chromofórmi patria medzi humínové 

látky. 




- 206 - 


11. - 14. 10. 2010

Vznik a funkcia humínových látok 

Humínové látky vznikajú organickým rozkladom rastlinného materiálu [10, 11] a rozkladom mtvych organizmov [12]. 

Proces degradácie a mineralizácie za vzniku humínových látok sa nazýva humifikácia. Tradine sa predpokladá, že humínové 

látky v riených a jazerných vodách sú tie isté ako humínové látky v pôde, a že hlavným zdrojom HS sú priahlé brehy, z 

ktorých sa HS do vody dostávajú rozrušením (eróziou, vymletím) pôdy poas dážov [13]. Poda Stevensona [14] je 

distribúcia humínových látok – humínových kyselín (HK) a fulvokyselín (FK) v lúnych pôdach, pasienkových pôdach 

v pomere HK/FK rovnom 2 a v lesných pôdach je pomere HK/FK rovnom 0,5. 

Bežne sú pri objasovani vzniku humínových látok používané hypotézy zameriavajúce sa na štyri cesty ku vzniku 

humínových látok v pôde poas rozkladu tkanív rastlín. Tieto humifikané procesy môžu fungova vo všetkých pôdach, ale 

nemusí to by v rovnakom rozsahu a nemusia ma rovnakú dôležitos pri vzniku HL [15] . 

Cesty ku vzniku HL [14] sa oznaujú ako: 

1. Lignínová teória 

2. Polyfenolová teória I. (polyfenoly sú na rozdiel od 3. teórie syntetizované) 

3. Polyfenolová teória II. 

4. Kondenzácia cukru a amínu 

Štruktúra a vlastnosti humínových látok majúce vzah k IEC 

Názov humínové látky, definuje skupinu vemi heterogénne štrukturovaných organických makromolekúl [16]. HL vykazujú 

komplexnú chemickú štruktúru, hydrofilný charakter a kyslé vlastnosti [17]. 

Poda rozpustnosti sú humínové látky rozdelené do troch vekých skupín: 

1. Humínové kyseliny sú hlavnou extrahovatenou zložkou humínových látok. Sú nerozpustné za kyslých podmienok 

(pH < 2), ale rozpustné pri vyšších hodnotách pH. Ich farba je tmavo hnedá až ierna. Rozpätie ich relatívnych molekulových 

hmotností je od 1500 do 5000 vo vodách a od 50000 do 500000 v pôdach [7]. V ich chemickej štruktúre dominujú fenolické 

skupiny, dlhé mastné kyseliny a iné. Tieto molekuly sú viac hydrofóbne v porovnaní s fulvokyselinami. 

2. Fulvokyseliny sú rozpustné vo vode za všetkých pH podmienok. Ich farba je žltá až bledo hnedá. Rozpätie ich 

relatívnych molekulových hmotností sa pohybuje od 600 do 1000 vo vodách a od 1000 do 5000 v pôdach [14]. Priemerná 

džka ich makromolekúl je 60 nm a priemerný prierez molekulou je 2 nm. Tieto zložky sú bežne rozpustné vo vode. 

3. Humíny nie sú rozpustné vo vode za žiadných pH podmienok. Farba humínov je ierna [19]. 

HL sú prevažne zložené z prvkov C, H, O, N, S a to približne v zastúpení 50%C, 5%H, 45%O, do 4%N a do 1%S. V 

nasledujúcej tabuke je elementárne zastúpenie v humínových štandardoch International Humic Substance Society (IHSS): 

HL obsahujú aromatické a alifatické karboxylové skupiny, fenolické a alifatické OH skupiny, karbonylové skupiny, 

veký poet aromatických kruhov, alifatické reazce, chinónové a hydrochinónové štruktúry. Základné štruktúrne jednotky 

humínových látok sú aromatické kruhy fenolického typu, ktoré sú substituované skupinami ako –COOH, spojené navzájom 

skupinami –O–, –CH2–, –NH– a –S–, a obvykle obsahujú tiež dve voné hydroxylové skupiny. Humínové látky obsahujúce 

funkné skupiny –COOH, –OH, –NH2, at., majú schopnos ovplyvni viazanie katiónov stopových kovov v životnom 

prostredí. Komplexácia stopových kovov s HL môže spôsobi zníženie toxicity kovu (napr. me), alebo zvýšenie jeho 

rozpustnosti (napr. železo) a tak ich lepšie sprístupnenie pre rastlinný organizmus. 

Absorbné spektrum typických humínových látok je nevýrazné a podobá sa klesajúcej exponenciálnej krivke. Pri krátkých 

vlnových džkach () v UV oblasti spektra je absorbancia najvyššia a zväšovaním vlnových džok postupne klesá aj 

absorbancia, ako keby chvostovala do ervenej oblasti viditeného spektra. Z toho vyplýva, že na detekciu HL môže by 

použitá skoro každá vlnová džka, ale najcitlivejšie detekcie sa dosiahnu s nižšími hodnotami. 

Fluorescenné vlastnosti sú pozorované iba u špecifických látok s rigídnou molekulovou štruktúrou ako sú aromatické 

systémy, zlúeniny s konjugovanou dvojitou väzbou, karbonylovou väzbou a kondenzované heterocyklické zlúeniny. [20]. 

Humínové látky patria medzi takéto štruktúry a preto vykazujú fluorescenciu. 

Tieto látky s nestálou štruktúrou silne ovplyvujú fyzikálno-chemické vlastnosti pôdy. Medzi takéto vlastnosti patrí napríklad 

štruktúra zn a sorpná kapacita pôdy. HL sú schopné viaza živiny pre rastliny a remobilizova ažké kovy. Napriek 

dôležitosti pre ekológiu, agrikultúru, prvotnú úpravu vôd a ohromnému záujmu výskumných vedcov, zloženie a štruktúra ešte 

nie je jasná. Dôvodom je fakt, že HL boli vytvorené a tvoria sa asociáciou vysokomolekulových zložiek mikrobiálneho, 

rastlinného a živoišného pôvodu. Vekos molekúl humínových látok je bežne spojovaná s ich hmotnosou, pritom ale je 

vemi závislá aj od iných faktorov. Napríklad, množstvo funkných skupín v HL može by disociovaných, alebo 

protónovaných v závislosti od pH. Disociované funkné skupiny nesú prevažne negatívny náboj. V humínových látkach, 

vaka prítomnosti hydroxylových a karboxylových skupín, prevláda záporny náboj (anionický charakter). Rozmer 

humínových látok je ažko definovatený. V roztoku s vysokým pH a nízkou iónovou silou (IS) sa uplatuje 

intramolekulárne odpudzovanie (repulzia) v rámci jednotlivých molekúl medzi záporne nabitými skupinami a 

intermolekulárna repulzia záporne nabitých skupín medzi viacerými molekulami. Naopak, pri nízkych hodnotách pH a 

vysokej iónovej sile sú humínové látky v agregátoch stoených do kbka, podobne ako je tomu pri proteínoch. Záverom je že 

humínové látky s tou istou hmotnosou môžu ma rôzne vekosti, v závislosti od aktuálnych okolitých podmienok. Relatívne 

zastúpenie karboxylových skupín, aromatických hydroxylových (fenolických) a alifatických hydroxylových (alkoholy, 

cukry) skupín, zodpovedných za aniónový charakter, je nižšie pri humínových kyselinách ako pri fulvokyselinách. 




- 207 - 


11. - 14. 10. 2010

Obr. 1: Vplyv pH na agregané stavy humínovej kyseliny. 

Znižovanie pH vodných roztokov humínových látok má podobný efekt ako pridávanie kovových solí, aj ke s menším 

vplyvom. Zvýšenie koncentrácie H 3O + spôsobuje protonizáciou karboxylových skupín nachádzajúcich sa na humínových 

látkach, ktoré eventuálne vedie ku zníženiu ich rozpustnosti v roztokoch a vyzrážaniu. Tento jav bežne zaína u rôznych HA 

pri pH 3±2 a dosahuje koniec pri pH 2±1 a považuje sa za kontinuálny proces. Zaína sa na intramolekulovom stupni, 

prechádza cez stupe intermolekulový a na záver produkuje zrazeninu [21]. 

V literatúre je uvedených viacero možných hypotetických štruktúr humínových kyselín a fulvokyselín, ktoré vychádzajú 

z poznatkov získaných využitím degradaných techník s následnou separáciou degradaných produktov metódami 

kvapalinovej chromatografie, plynovej chromatografie a elektroseparaných metód a ich identifikáciou takými modernými 

deteknými a identifikanými technikami akými sú napríklad nukleárna magnetická rezonancia (NMR), hmotnostná 

spektrometria (MS), alebo infraervená spektrometria (IR). 

Obr. 2: Teoretický model fulvokyseliny poda [22] poukazujúci na vysoký podiel karboxylových funkných skupín v ich 

štruktúre. 

Obr. 3: Teoretický model humínovej kyseliny poda [14] poukazujúci na relatívne nižšie zastúpenie karboxylových 

funkných skupín v ich štruktúre oproti fulvokyselinám. 

Acidobázické vlastnosti humínových látok 

Na úely racionálneho optimalizovania eluných podmienok v IEC je potrebné dáva si do vhodného vzahu 

acidobázické a nábojové vlastnosti rôznych typov humínových látok s obdobnými vlastnosami iónomeniov a mobilných 

fáz obsahujúcich elektrolyty. Na Obrázku 4 prevzatom z publikácie [23] a upravenom poda sú uvedené závislosti vekosti 




- 208 - 


11. - 14. 10. 2010

celkového náboja jedného gramu pôdnych fulvokyselin a humínových kyselín od pH. Vekos týchto nábojov sa pohybuje 

v rozmedzí od 100 po 300 coulomb na gram (ekvivalentné od 1 mmol/g po 3 mmol/g) pri pH 4,5 až po 500 až 700 coulomb 

na gram (ekvivalentné od 5 mmol/g po 7 mmol/g) pri pH 10,0. Všeobecne negatívny náboj humínových kyselín 

a fulvokyselín monotónne vzrastá so vzrastom pH a nárastom disocianého stupa aniónogénnych funkných skupín (hlavne 

karboxylových a fenolických hydroxylových skupín). Celkový negatívny náboj fulvokyselín je poda meraní autorov [23] 

takmer dvojnásobne vyšší ako náboj humínových kyselín. 

Obr. 4: Závislos náboja od pH pre fulvokyseliny a humínové 

kyseliny, izolované z rôznych horizontov pôdy a merané potenciometrickými titráciami, modifikované poda [23]. 

Nezaiernené asti pri pH 10 až 12 predstavujú extrapoláciu publikovaných údajov. 

Z uvedených literárnych údajov sme vychádzali pri návrhu, štúdiu a testovaní metódy iónovo-výmennej chromatografie 

zameranej na analýzu HA a FA v alkalických pôdnych extraktoch, pretože v mnohých prípadoch je práve alkalická 

hydrolýza v spojení s vysokou rozpustnosou pôdnych humusových látok v alkalickom prostredí, základným a prvým 

krokom pre ich izoláciu z pôd. 


TESSEK Separon HEMA sorbenty sú založené na rigídnej, makroporéznej a hydrofilnej polymérnej matrici. Vykazujú 

unikátnu kombináciu stability (mechanickej, chemickej a biologickej), makropórovitej štruktúry a hydrofilných vlastností. 

TESSEK Separon HEMA plnia požiadavky na univerzálne chromatografické sorbenty. 

Základná Separon HEMA matrica je syntetizovaná kopolymerizáciou 2-hydroxyetylmetakrylátu a etyléndimetakrylátu 

(EDMA). Výsledkom polymerizácie hydrofilných HEMA jednotiek striedavo s EDMA monomérmi vzniká základná 

štruktúra, ktorá tvorí hustú, nepriestupnú, trojrozmernú sie vo forme mikroastíc. Mikroastice polymerizujú do 

aglomerátov, vytvárajúc makroporézne astice s perfektným guovým tvarom. Patentovaná technológia dovoluje aby boli 

TESSEK Separon HEMA vyrábané s kontrolovanými vekosami astíc a pórov [24]. 

Použité zariadenia a pomôcky 

Chromatografický systém LaChrom Merck-HITACHI s nízkotlakovým gradientom pozostávajúci z komponent: 

Vysokotlakové erpadlo L – 7100 

Prietokový odplyova mobilnej fázy L – 7612 




- 209 - 


11. - 14. 10. 2010

Automatický dávkova L – 7200 

Kolónový termostat L – 7300 

Spektrofotometrický detektor s diódovým poom (DAD) L – 7450 

Fuorimetrický detektor L – 7480 

Rozhranie (interface) D – 7000 

Softvér HSM vs. 4.0 

Kolóna od firmy TESSEK Ltd. Praha, eská republika - Separon HEMA – BIO 1000 DEAE 60 m (30 x 3 mm) 

V práci bol navrhnutý optimalizovaný skokový gradient, ktorého tvar je uvedený na obrázku: 

Obr. 5: Tvar a zloženie použitého skokového gradientu 

Pomocné zariadenia: 

Centrifúga eppendorf AG 22331, Hamburg, Nemecko 

Centrifúga Janetzki T30, Lipsko, Nemecko 

Ultrazvuk Ecoson, UCM9, Slovensko 

pH meter WTW inoLab pH 730, vybavený kombinovanou sklenou/AgCl elektródou, Weilheim, Nemecko 

Analytické váhy AR 0604, Ohaus, USA 

Chemikálie 

Kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA) p.a., (Lachema, Brno, eská republika) 

Voda (ultra istá voda z istiaceho systému Labconco, Waters, Pro – PS, Labconco, Cansas City, USA). 

Voda pre HPLC , (zariadenie - Simplicity UV, Millipore Corp., Billerica, MA, USA) 

Hydroxid sodný (NaOH) p.a., (Merck Darmstadt, Nemecko). 

Technické tlmivé roztoky na kalibráciu pH metra (WTW D – 82362) s pH 10,01 a pH 7,00 (Weilheim, Nemecko). 

Kyselina citrónová (CH3COOH) p.a., (Lachema Brno, eská republika) 

Humusové látky: 

Humínová kyselina, (Sigma – Aldrich, Steinheim, Nemecko) 

Ekohum, (komerne dostupný preparát) 

HK rašelina Cerová a HK rašelina Suchá hora, humínové kyseliny extrahované modifikovanou IHSS frakcionanou 

schémou na Katedre analytickej chémie Prírodovedeckej fakulty UK z rašeliny z okolia Cerová [25,26]. 




- 210 - 


11. - 14. 10. 2010

Vzorky pôd a ich charakterizácia [27], pracovný názov poda lokality odberu: 

Senec (oznaené ako SENEC) 

Lokalizácia: Najnižšie výškové pásmo Trnavskej pahorkatiny, pôdy zo spraší, 48° 14,060‘ severnej šírky, 17° 24.055‘ 

východnej zemepisnej džky, 143 m n.m. 

Klíma: Priemerný roný úhrn zrážok 550-600 mm, priemerná roná teplota 9,5 °C. 

Pôdny typ: ernozem kultizemná. 

Popis pôdneho profilu: Akp (0-30 cm): 10YR3/3, kultizemný ornicový (molický ernozemný) humusový horizont, 

karbonátový, vlhký, konzistencia drobivá, štruktúra drobnohrudkovitá, jemnozem hlinitá, bez skeletu, silne prekorenený, 

difúzny prechod. 

Šajdíkove Humence (oznaené ako SAJDIK) 

Lokalizácia: Sonda sa nachádza v severnej asti Borskej nížiny medzi obcami Šajdíkove Humence, Borský Mikuláš a 

Bílkove Humence, pôdy vznikajú z viatych pieskov, 48° 38,137’ severnej šírky, 17° 17.543‘ východnej zemepisnej džky, 

213 m n.m. 

Klíma: Priemerný roný úhrn zrážok 567 mm, priemerná roná teplota 9,4 °C. 

Pôdny typ: umbrizem modálna. 

Popis pôdneho profilu: Au (0-32 cm): umbrický humusový horizont, farba 7,5YR 2/1,5, navlhlý, nekarbonátový, štruktúra 

elementárne voná, konzistencia kyprá, piesonatá, bez skeletu, silne prekorenená, prechod difúzny, zvlnený. 

Skalka (v práci oznaené ako SKALKA) 

Lokalizácia: Pohorie Kremnických vrchov, pôdy z vulkanických hornín (pyroklastika pyroxénických andezitov), 48°44,367’ 

severnej šírky, 18°59,847’ východnej zemepisnej džky, 1200 m n.m. 


Pôdny typ: andozem modálna. 

Popis pôdneho profilu: Aa1 (0-10 cm): 10YR2/1, vlhký, kyprý, slabo plastický, drobnohrudkovitý, piesito-hlinitý, stredne 

kamenitý, výrazne prekorenený. 

Voderady (oznaené ako VODERADY) 

Lokalizácia: Znížená as Trnavskej pahorkatiny, pôdy zo spraší, 48° 17,042’ severnej šírky, 17° 33.192‘ východnej 

zemepisnej džky, 139 m n.m. 


Pôdny typ: ernozem kultizemná. 

Popis pôdneho profilu: Akp (0-30 cm): 10YR3/2, kultizemný ornicový (molický ernozemný) humusový horizont, slabo 

karbonátový, navlhlý, konzistencia drobivá, štruktúra hrudkovitá, jemnozem ílovito-hlinitá, bez skeletu, silne prekorenený, 

zretelný prechod. 

Gbely (oznaené ako GBELY) 

Lokalizácia: Stredná as Záhorskej nížiny s výstupom neogénnych sedimentov (ílov), 48° 44,732’ severnej šírky, 17° 

08.684‘ východnej zemepisnej džky, 203 m n.m. 


Pôdny typ: smonica kultizemná. 

Popis pôdneho profilu: Akp (0-30 cm): 10YR2,5/1,5, kultizemný ornicový (molický smonicový) humusový horizont, 

nekarbonátový, mokrý, konzistencia plastická, štruktúra prizmatická, jemnozem ílovitá, bez skeletu, silne prekorenený, 

zretený prechod. 

Šterusy (oznaené ako STERUSY) 

Lokalizácia: Vrcholová as Trnavskej pahorkatiny v blízkost Malých Karpát, pôdy zo spraší, 48° 35,949’ severnej šírky, 17° 

41.117‘ východnej zemepisnej džky, 225 m n.m. 


Pôdny typ: hnedozem kultizemná. 

Popis pôdneho profilu: Akp (0-30 cm): 10YR4/3,5, kultizemný ornicový (ochrický) humusový horizont, nekarbonátový, 

vlhký, konzistencia drobivá, štruktúra drobnohrudkovitá, jemnozem linitá, bez skeletu, slabo prekorenený, ostrý prechod. 

Príprava mobilných fáz: 

Na prípravu roztokov mobilných fáz (EDTA o rôznych koncentráciach) sme odvážili potrebné vypoítané množstvo. Pre 

prípravu 1 l roztoku EDTA o koncentrácii 0,5 mol/L sme odvážili 146,12 g EDTA a doplnili vodou na objem, ktorý je asi o 

50 mL menší ako koncový objem. Tento roztok sme dotitrovali roztokom NaOH na pH 12 a doplnili vodou na požadovaný 

objem 1 liter). Nižšie koncentrácie EDTA v mobilných fázach sme pripravili z vyšších riedením vodou a v prípade potreby 

dodali chromatografickému systému. Výpoet hodnôt iónovej sily pre koncentreácie roztokov EDTA je následovný: Na 

výpoet iónovej sily (IS) bol použitý vzah: 

Roztok EDTA s koncentráciou 0,005 mol/L má iónovú silu 0,05; roztok EDTA s koncentráciou 0,5 mol/L má iónovú silu 

5,0. 




- 211 - 


11. - 14. 10. 2010

Príprava extraktov HL z pôd 

Každý typ vzorky pôdy sme preosiali cez sito s 1,25 mm okami. Na zásobné roztoky sme z každej vzorky navážili 1 g a 

extrahovali 10 mL 0,5 alebo 1 mol/L NaOH po dobu 30 minút. Takto upravené vzorky sme centrifugovali 15 minút pri 3500 

otákach za minútu. Supernatant bol po odpipetovaní do vialiek pripravený na analýzu. 

Príprava pracovných zásobných a štandardných roztokov HL: 

Zásobné roztoky humínových kyselín sme pripravili rozpustením 120,0 mg jednotlivých kyselín v 10,0 mL 0,01 mol/L 

roztoku NaOH. Koncentrácia takto pripravených roztokov je teda 12,0 mg/mL. Do vialiek na analýzu, sme zásobné roztoky 

HL zriedili 4 krát na konenú koncentráciu 3,0 mg/mL. 


Po meraniach a štúdiu viacerých typov katexových a anexových sorbentov a kolón s rôznymi rozmermi sme sa rozhodli 

použi na separáciu laboratórne naplnenú kolónu s rozmermi 30 x 3 mm. Použitý sorbent bol HEMA BIO 1000 Q s 

priemerom astíc 60 m. Väšia vekos medziasticových kanálikov znamenala zmenšenie tlaku za použitia relatívne 

vysokých prietokov (0,5 – 2 mL/min). Tomuto cieu napomohla aj menšia džka kolóny. Do takejto kolóny sa zmestilo menej 

sorbentu a tým sme zmenšili aj celkové látkové množstvo dostupných dietylaminoetylových funkných skupín schopných 

interagova s funknými skupinami humusových kyselín. V tom dôsledku sme oakávali požadovanú menšiu retenciu 

humínových látok a väšiu výažnos humusových látok v chromatografickom systéme. Pre alšie optimalizovanie 

separaných podmienok, sme si zvolili nasledujúce kritéria: teplota, rýchlos analýzy a rozlíšenie jednotlivých zložiek 

humínových látok pri využití skokových gradientov. 

Vplyv pracovnej teploty 

Vplyv teploty separaného prostredia na správanie sa humínových látok bol skúmaný za použitia gradientu na 

chromatografickej kolóne Separon HEMA BIO 1000 DEAE (30 x 3 mm) pri prietoku mobilnej fázy 0,5 ml/min na vzorkách 

HA Aldrich, HA Ekohum, HA Cerová a HA Suchá Hora. Skúmali sme vplyv kolónových teplôt 40 °C; 55°C a 70 °C. Z 

nameraných záznamov vyplynulo, že pri zvyšovaní teploty sa retencia humusových látok prakticky nemení a tvar 

chromatografického záznamu je tiež ovplyvnený len málo. V pomerne vekej miere sa so zmenou teploty mení výška 

(plocha) píkov pre jednotlivé humusové látky v rôznej miere a rôznym smerom. Správanie sa humusových látok sme alej 

študovali na kolónach obsahujúcich DEAE funkné skupiny, ktorých pKa hodnota je rovná približne 11,5 o prakticky 

znamená, že pri pH 12 je efektívny náboj DEAE skupín rovný +0,27 na rozdiel napríklad od kvartérneho amínu, ktorý má za 

rovnakých podmienok náboj +1. Z uvedeného je zrejmé, že retencia HL pri pH 12 bude v prípade použitia Separon HEMA 

BIO DEAE nižšia ako v prípade napríklad Separon HEMA BIO Q. 

Charakterizovanie humusových látok v alkalických extraktoch pôd 

Optimalizovaná metóda gradientovej IEC (gradient na obrázku 5, IEC DEAE) bola študovaná z pohadu jej použitenosti na 

charakterizovanie humínových látok prítomných v extraktoch pôd pomocou roztokov hydroxidu sodného. Roztok NaOH je 

štandardným extrakným roztokom, ktorým sa zaína takmer každý prvý extrakný krok, je dokonca prvým a štandardným 

extrahovadlom doporuovaným IHSS [19]. Pri prvej extrakcii pôdy sa extrahujú popri humusových látkach aj látky 

nehumusového charakteru, preto sme si na detekciu zvolili fluorimetrickú detekciu (ex. 460nm, ex. 530nm), ktorá je relatívne 

selektívnou detekciou humusových látok. Pomocou IEC chromatografie bolo charakterizovaných 6 rôznych typov dobre 

pedologicky popísaných pôd. Výsledky týkajúce sa 4 typov pôd z lokalít Kremnica-Skalka, Šajdíkové Humence, Gbely a 

Šterusy, ktoré poskytovali v IEC dobré signály sú alej uvedené. Vzorky pôd z lokalít Senec a Voderady dávali pri IEC s 

fluorimetrickou aj DAD detekciou signály s malými intenzitami a z toho dôvodu sme ich do našich úvah nezahrnuli. 

Chromatografické záznamy týkajúce sa jednotlivých pôd extrahovaných alternatívne roztokmi 0,5 mol/L a 1,0 mol/L NaOH 

sú uvedené na Obr. 6 až Obr. 9. Najvyššie fluorescenné signály poskytovali extrakty pôd Kremnica –Skalka a Šajdíkové 

Humence, celkove menšie hodnoty signálov dávali extrakty pôd z lokalít Gbely a Šterusy (vi Obr. 6 až Obr. 9). 

Prekvapujúco nebol veký rozdiel vo výažnosti humusových látok extrahovaných roztokmi 0,5 mol/L a 1,0 mol/L NaOH. 

Zriedenejší roztok NaOH extrahoval relatívne vyšší podiel humusových látok zadržaných na anexe DEAE oproti 

nezadržaným humínovým látkam. 




- 212 - 


11. - 14. 10. 2010




- 213 - 

Obr. 6: Vplyv koncentrácie NaOH v extraknom 

roztoku na chromatografický profil humínových 

látok v extraktoch pôdy z lokality Kremnica- 

Skalka. 

Použitá kolóna HEMA BIO 1000 DEAE 

(30 x 3 mm), teplota 40°C, Skokový gradient 

.2, MF: A = 500 mmol/L EDTA, pH 12;0; 

B = 5 mmol/L EDTA, pH 12,0, 

prietok 2,0 mL/min, spektrofluorimetrická 

detekcia (ex. 480 nm; em. 530 nm) 

Obr. 7: Vplyv koncentrácie NaOH 

v extraknom roztoku na chromatografický 

profil humínových látok v extraktoch pôdy 

z lokality Šajdíkové Humence. 

Použité podmienky sú uvedené v popise Obr. 6. 

Obr. 8: Vplyv koncentrácie NaOH v extraknom 


látok v extraktoch pôdy z lokality Šterusy. 



11. - 14. 10. 2010

Obr. 9 Vplyv koncentrácie NaOH v extraknom 


látok v extraktoch pôdy z lokality Šterusy. 


Obr. 10: Vyznaenie astí chromatogramu použitých pre zhotovenie kruhových diagramov na Obr. 11 




- 214 - 


11. - 14. 10. 2010

Obrázok 11: Kruhové diagramy percentuálneho zastúpenia plôch „píkov“ pre vybrané vzorky pôd (SKALKA, SAJDIK, 

STERUSY, GBELY). Vyhodnotené z chromatogramov pre HL extrahované z pôd pomocou 1 mol/L NaOH. 

Obr. 12: Fotografie sond z pôdnych horizontov, z ktorých boli odoberané vzorky pôd na laboratórne spracovanie [27]. 

Namerané chromatografické profily boli po korekcii na fluorescenciu pozadia mobilnej fázy využité na kvantitatívne 

porovnanie zastúpenia plôch nezadržaných a zadržaných humusových látok v celkovom IEC profile humusových látok. 

Vymedzenie skupiny nezadržaných humínových látok a zadržaných humínových látok v extrakte 1,0 mol/L NaOH je 

uvedené na Obr. 10. Kruhové diagramy (Obr. 11) skonštruované z normalizovaných integrálov plôch týchto dvoch skupín 

poukazujú na prekvapujúcu zhodu normalizovaných profilov extraktov pôd z lokalít Kremnica-Skalka a Šajdíkové Humence 

vzdialených navzájom 126 km, a tiež zhodu normalizovaných profilov extraktov pôd z lokalít Gbely a Šterusy vzdialených 

navzájom 43 km. Kvôli interpretácii týchto výsledkov sú na Obr. 12 ukázané fotografie sond z genetických pôdnych 

horizontov, z ktorých boli odoberané vzorky pôd na alšie laboratórne spracovanie [27]. Výsledky pedologickej 

charakterizácie vrchných horizontov pôd profilovaných aniónovo-výmennou IEC korelované s fyzikálne-chemickými 

parametrami pôd [27] pouk8zali na to, že IEC výsledky v skupine pôd Kremnica-Skalka/Šajdíkové Humence a Gbely/Šterusy 

nápadne korelujú s parametrami pH/H2O, pH/KCl, íl%, piesok% a naopak nekorelujú prekvapujúco s chemickými 

parametrami Cox%, humus%, CaCO3% a prach%. Pri alšom hadaní súvislostí pomocou zobrazenia lokalít odberu pôd 

pomocou satelitného zobrazenia v Google Earth sa ukázala potenciálna súvislos medzi chromatografickými profilmi 

reprezentovaných koláikovými diagramami a typom vegetanej pokrývky miest odberu pôdnych vzoriek. 




- 215 - 


11. - 14. 10. 2010

Záver 

Na záver môžeme skonštatova, že navrhnutá metóda aniónovo- výmennej chromatografie využivajúca krátke kolóny 

naplnené stredne silným anexom nesúcim dietylaminoetylové funkné skupiny je v kombinácii s skokovou gradientovou 

elúciou roztokmi EDTA s pH tlmeným na hodnotu pH=12,0 vhodnou metódou umožujúcou charakterizova pôdne typy na 

základe prirodzeného pomeru humínovýc kyselín a fulvokyselín. Táto pracovná hypotéza vyplývajúca z profilovania 

štandardnej humínovej kyseliny (ALDRICH), technického produktu (EKOHUM), rašelinových humínových kyselín (Cerová, 

Suchá Hora) a alkalických extraktov 6 typov pôd si však vyžaduje potvrdenie v experimentoch s dobre operane 

definovanými fulvokyselinami a humínovými kyselinami, najlepšie izolovanými z analyzovaných pôd a chrakterizovanými 

nezávislými metódami. 

Po prechode na kolónovú techniku sme mali predstavu o tom, akú mobilnú fázu použijeme. EDTA kvôli jej nábojovým 

vlastnostiam, nám poskytla dostatoné množstvo náboja za podmienok pH 12 mobilnej fázy. Po optimalizanom procese, 

kedy sme skúmali vplyvy faktorov: teploty, prietokovej rýchlosti, tvaru a trvania gradientov a typu anexu sme dospeli k 

vhodným podmienkám pre analýzu a charakterizovanie humínových kyselín a fulvokyselín. 

Na základe získaných výsledkov sa nami navrhnutá metóda javí ako nádejný a efektívny prostriedok na charakterizovanie 

humínových látok extrahovaných jednoduchou extrakciou hydroxidom sodným z pôdy. Bolo potrebné zamera sa práve na 

charakterizovanie HL získaných z pôdy práve v tomto prvom extraknom kroku. 

Namerané chromatografické profily boli po korekcii na fluorescenciu pozadia mobilnej fázy využité na kvantitatívne 

porovnanie zastúpenia plôch nezadržaných a zadržaných humínových látok v celkovom IEC profile humínových látok. 

Kruhové diagramy skonštruované z normalizovaných integrálov plôch týchto dvoch skupín poukazujú na podobnos 

normalizovaných profilov extraktov pôd z lokalít Kremnica-Skalka a Šajdíkové Humence vzdialených navzájom 126 km, a 

tiež vzájomnú podobnos normalizovaných profilov extraktov pôd z lokalít Gbely a Šterusy vzdialených navzájom 43 km. 

Pri alšom hadaní súvislostí pomocou zobrazenia lokalít odberu pôd pomocou satelitného zobrazenia v Google Earth sa 

ukázala alšia potenciálna podobnos chromatografických profilov reprezentovaných koláikovými diagramami a typom 

vegetanej pokrývky miest odberu pôdnych vzoriek. 

Na záver môžeme skonštatova, že navrhnutá metóda aniónovo-výmennej chromatografie využivajúca krátke kolóny 

naplnené stredne silným anexom nesúcim dietylaminoetylové funkné skupiny je v kombinácii s skokovou gradientovou 

elúciou roztokmi EDTA s pH tlmeným na hodnotu pH=12,0 vhodnou metódou umožujúcou charakterizova pôdne typy na 

základe prirodzeného pomeru humínovýc kyselín a fulvokyselín. Táto pracovná hypotéza vyplývajúca z profilovania 

štandardnej humínovej kyseliny (ALDRICH), technického produktu (EKOHUM), rašelinových humínových kyselín (Cerová, 

Suchá Hora) a alkalických extraktov 6 typov pôd (spolu s uvedenými pôdami boli analyzované aj pôdy z lokalít Senec a 

Voderady) si však vyžaduje potvrdenie v experimentoch s dobre operane definovanými fulvokyselinami a humínovými 

kyselinami, najlepšie izolovanými z analyzovaných pôd a chrakterizovanými alšími nezávislými metódami. Metódy IEC 

napriek tomu, že sa v súasnosti v porovnaní s IEC analýzou glykoproteínov, proteínov a peptidov prakticky nevyužívajú na 

úely chrakterizovania humusových látok, majú veký potenciál v kombinovaných separaných metódach. 

Literatúra 

[1] M. Hutta, D. Kaniansky, E. Kovalíková, J. Marák, M. Chalányová, V. Madajová, E. Šimuniová, J. Chromatogr. A, 689 

(1995), 123. 

[2] D. Fetsch, M. Hradilova, E.M.P. Mendez, J. Havel, J. Chromatogr. A, 817 (1998) 313. 

[3] D. Fetsch, J. Havel, J. Chromatogr. A, 802 (1998) 189. 

[4] R.Dunkelog, H.H. Rüttinger, K. Peisker, J. Chromatogr. A, 777 (1997) 355. 

[5] L. Pokorná, M.L. Pacheco, J. Havel, J. Chromatogr. A, 895 (2000) 345. 

[6] I. Nagyová, D. Kaniansky, J. Chromatogr. A, 916(2001) 191. 

[7] http://karnet.up.wroc.pl/~weber/def2.htm (stav ku 12.11.2010). 

[8] R.M.W. Amon, R. Benner, Limnol. Oceanogr., 41 (1996) 41. 

[9] A. Mannino, H.R. Harvey, Limnol. Oceanogr., 54 (2000) 775. 

[10] I.D. Cuthbert, P. Giorgio, Limnol. Oceanogr., 37 (1992) 1319. 

[11] M. Skokanová, K. Dercová, Chem. Listy, 102 (2008) 262 

[12] J. Buffle, Anal. Chim. Acta, 232 (1990) 1. 

[13] R.L. Malcolm, Anal. Chim. Acta, 232 (1990) 19. 

[14] F.J. Stevenson, Humus chemistry. Genesis, composition, reactions., John Wiley and Sons, (1982). 

[15] M. Skybová, Acta Montan. Slovaca, 2 (2006) 362. 

[16] C.F. Lin, Y.J. Huang, O.J. Hao, Wat. Res., 33 (1999) 1252. 

[17] M. Pansu, J. Gautheyrou, Handbook of Soil Analysis, Mineralogical, Organic, and Inorganic Methods, Berlin, 

Heidelberg, New York: Springer (2006), 993. 

[19] http://ihss.gatech.edu/ihss2/ (stav ku 12.11.2010). 

[20] M. Petro, Diplomová práca, Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, 

(2007). 

[21] R. von Wandruszka, Geochem. Trans., 2 (2000) 10. 

[22] J.A.E. Buffle, „Les substances humiques et leurs interactions avec les ions mineraux", Conference de la Commission 

d'Hydrologie Appliquee de A.G.H.T.M., l'Universite d'Orsay, (1977) 3. 




- 216 - 


11. - 14. 10. 2010

[23] D. Gondar, R. Lopez, S. Fiol, J.M. Antelo, F. Arce, Geoderma, 126 (2005) 367 

[24] http://www.tessek.com/cat4.htm (stav ku 12.11.2010). 

[25] T. Prochácková, R. Góra, J. Kandrá, M. Hutta, J. Radioanal. Nucl. Chem., 229 (1998) 61. 

[26] J. Kandrá, M. Hutta, M. Foltin, J. Radioanal. Nucl. Chem., 208 (1996) 577. 

[27] P. Dlapa, Charakteristika vybraných pôdnych profilov pre úely štúdia pôdnej organickej hmoty v rámci projektu 

APVV-0595-07, Katedra pedológie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, november 2008. 

[28] J. Pessl, Metódy aniónovo-výmennej chromatografie na charakterizovanie pôdnych a rašelinových humínových látok v 

alkalickom prostredí, Diplomová práca študijný odbor 4.1.14 Chémia (vDP M. Hutta), PriF UK v Bratislave 2010 

Práca bola realizovaná z prostriedkov projektov APVV-0595-07 a VEGA 1-0870-09 pod 

záštitou centra excelencie VVCE-0070-07. 




- 217 - 


11. - 14. 10. 2010

Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?