spektrofotometria absorpcyjna uv-vis - Wydział Fizyki i Informatyki ...

SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNA UV-VIS
Pomiar i analiza widm absorpcji wybranych barwników fotosyntetycznych.
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
Natura promieniowania elektromagnetycznego: charakter falowy i korpuskularny; oddziaływanie materii
z promieniowaniem elektromagnetycznym (światłem widzialnym); pasma spektralne (widma absorpcji);
zasada Francka-Condona; diagram Jabłońskiego; chromofory; prawa absorpcji (Bouguera-Lamberta,
Lamberta-Beera, addytywności absorbancji); wykorzystanie metod spektrofotometrycznych;
APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY
Spektrofotometr Cary50 Bio (Varian), kuwety szklane i kwarcowe;
Arkusz bibuły chromatograficznej (Whatman), suszarka, komora chromatograficzna;
sączki, szkło laboratoryjne (m.in. moździerz, lejek szklany, probówki, szklane pipety Pasteura);
ODCZYNNIKI
aceton (cz.d.a.), benzyna ekstrakcyjna, metanol (cz.d.a.), kwas solny (35-38%), CaCO3, askorbinian
sodu, piasek;
WYKONANIE ĆWICZENIA:
1. Ekstrakcja barwników.
Świeże liście pietruszki pociąć na drobne fragmenty i dokładnie utrzeć w moździerzu z niewielką ilością
piasku, CaCO3 i askorbinianu sodu. W trakcie ucierania porcjami dodawać aceton. Poczekać, aż
fragmenty tkanki opadną na dno. Przygotować szklany lejek z sączkiem. Sączek zwilżyć acetonem,
ekstrakt przesączyć do probówki.
2. Rozdział barwników na bibule chromatograficznej.
Na bibule chromatograficznej narysować ołówkiem linię startu w odległości ok. 1-1.5 cm od krawędzi
bibuły. Na linię startu nanieść szklaną pipetą Pasteura ekstrakt barwnikowy. Przed nałożeniem kolejnych
porcji ekstraktu należy chwilę poczekać, aż miejsce nakładania podeschnie. Przygotować komorę
chromatograficzną. Bibułę ostrożnie umieścić w komorze chromatograficznej wypełnionej eluentem.
Rozdział chromatograficzny prowadzić aż do momentu dokładnego rozdzielenia się pasm (do osiągnięcia
przez czoło rozpuszczalnika odległości ok. 2 cm od górnej krawędzi bibuły). Chromatogram wyjąć z
komory, pozostawić do wysuszenia.
3. Wykreślenie widm absorpcyjnych.
a) Rozcieńczyć acetonem przygotowany w pkt. 1 wyjściowy ekstrakt barwników. Wykreślić widmo
absorpcji ekstraktu w zakresie od 350-750 nm.
b) Wykreślić widma absorpcyjne poszczególnych barwników w zakresie od 350-750 nm.
c) Wykreślić widmo absorpcyjne chlorofilu a w zakresie 350-750 nm. Następnie dodać do kuwety kroplę
stężonego kwasu solnego, wymieszać i ponownie zmierzyć widmo absorpcji.
d) Wykreślić widmo absorpcyjne chlorofilu a w metanolu w zakresie 350-750 nm.
Uwaga!
Wszystkie czynności z kwasem i rozpuszczalnikami organicznymi należy wykonywać pod dygestorium.
Zakład Biofizyki Molekularnej i Bioenergetyki,
1
Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki, Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej, AGH

Opracowanie i dyskusja wyników:
1. Zidentyfikować poszczególne pasma na chromatogramie, wytłumaczyć kolejność wędrówki
barwników na podstawie ich budowy.
2. Opisać zarejestrowane widma absorpcji. Wyznaczyć maksima absorpcji wszystkich barwników, oraz
w przypadku barwników chlorofilowych, stosunki absorbancji według wzoru podanego w tabeli 1.
Otrzymane wyniki zebrać w tabeli i porównać z dostępnymi danymi literaturowymi. Ocenić czystość
otrzymanych preparatów, przedyskutować przyczyny ewentualnych rozbieżności.
Tabela 1
Maksima absorpcji (aceton) oraz molowe współczynniki absorpcji () głównych barwników
fotosyntetycznych.
Barwnik
Maksima absorpcji [nm]
1
2
A1/A2
[M -1 cm -1 ]
chlorofil a 430 662 1.22 82.6 10 3 ( = 662 nm)
chlorofil b 456 645 2.81 46.9 10 3 ( = 645 nm)
feofityna a 418 653 4.25 55.4 10 3 ( = 653 nm)
-karoten 450 477 134.4 10 3 ( = 452 nm)
luteina 447 475 127.2 10 3 ( = 447 nm)
wiolaksantyna 442 473
3. Opisać i przedyskutować zmiany w widmach absorpcji chlorofilu a pojawiające się w wyniku zmiany
środowiska.
4. Oznaczyć i porównać stężenie barwników (g/ml) w ekstrakcie wyjściowym:
cChla = 11,75 A662 - 2,35 A645
cChlb = 18,61 A645 - 3,96 A662
ckar = [1000 A470 - 2,27 cChla - 81,4 cChlb]/227
5. Korzystając z prawa Lamberta-Beera obliczyć stężenie poszczególnych barwników w kuwecie (z
uwzględnieniem rozcieńczeń):
A = l Cm gdzie: l [cm], Cm [M], [M -1 cm -1 ]
LITERATURA:
1. W. Szczepaniak „Metody instrumentalne w analizie chemicznej” Wyd. Naukowe PWN, 2011 (lub wydanie
wcześniejsze);
2. D. Wróbel "Spektroskopia układów molekularnych" w "Biofizyka dla biologów" praca zbiorowa pod redakcją
M. Bryszewskiej i W. Leyko, Wyd. Naukowe PWN, 1997;
3. A. Kozik, M. Rąpała-Kozik, I. Guevara-Lora "Analiza instrumentalna w biochemii. Wybrane problemy i metody
instrumentalnej biochemii analitycznej" seria wydawnicza IBM UJ, 2001;
Zakład Biofizyki Molekularnej i Bioenergetyki,
2
Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki, Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej, AGH

Struktury głównych barwników fotosyntetycznych: (A) chlorofilu i jego pochodnych, (B) karotenoidów.
B
HO
HO
A
O
H
COOR2
R2 =
H
N N
N N
Zakład Biofizyki Molekularnej i Bioenergetyki,
3
Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki, Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej, AGH
H
M
R1
COOCH3
O
Barwnik M R1
chlorofil a Mg CH3
chlorofil b Mg CHO
feofityna 2H CH3
O
OH
OH
-karoten
luteina
wiolaksantyna