Tilda Josipović_diplomski rad - Forenzika - Sveučilište u Splitu

SVEUČILIŠTE U SPLITU
SVEUČILIŠNI STUDIJSKI CENTAR
ZA FORENZIČNE ZNANOSTI
(Modul: Forenzična molekularna biologija i kemija)
TILDA JOSIPOVIĆ
LAŽNO POZITIVNE TOKSIKOLOŠKE ANALIZE
UZORAKA TKIVA JETRE
Split, listopad 2011.

SVEUČILIŠTE U SPLITU
SVEUČILIŠNI STUDIJSKI CENTAR
ZA FORENZIČNE ZNANOSTI
(Modul: Forenzična molekularna biologija i kemija)
TILDA JOSIPOVIĆ
LAŽNO POZITIVNE TOKSIKOLOŠKE ANALIZE
UZORAKA TKIVA JETRE
Mentor: doc. Dr. Sc. Davorka Sutlović
Split, listopad 2011.

Rad je izrađen u u kemijsko toksikološkom laboratoriju na odjelu sudske medicine Zavoda za
patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, pod nadzorom doc. dr. sc. Davorke
Sutlović, u vremenskom razdoblju od srpnja do rujna 2011. godine
žig:
Datum predaje diplomskog rada: __________
Datum prihvaćanja rada:__________________
Datum usmenog polaganja:________________
Povjerenstvo: 1. _________________________
2. _________________________
3._________________________

KAZALO
1. UVOD ................................................................................................................................... 1
1.1. Poslijesmrtna forenzična toksikologija .................................................... 1
1.2. Poslijesmrtne promjene i njihov utjecaj na analizu i interpretaciju otrova u
poslijesmrtnim forenzičnim uzorcima ............................................................... 2
1.3. Uzorci i način prikupljanja ......................................................................... 3
1.4. Toksikološka analiza .................................................................................. 6
1.5. Interpretacija rezultata ................................................................................ 9
1.6. Toksikološki značajne tvari ...................................................................... 10
1.6.1. Amfetamini.............................................................................................................. 11
2. CILJ RADA ......................................................................................................................... 13
3. MATERIJALI I METODE .................................................................................................... 14
3.1. Uzorkovanje.............................................................................................. 14
3.2. Priprema uzoraka...................................................................................... 15
3.3. Ekstrakcija ................................................................................................ 15
3.4. GC/MS analiza ......................................................................................... 16
4. REZULTATI........................................................................................................................ 17
5. RASPRAVA........................................................................................................................ 21
6. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 24
7. LITERATURA ..................................................................................................................... 25
8. Sažetak ................................................................................................................................ 27
9. Životopis.............................................................................................................................. 29

1. UVOD
Toksikologija je znanost koja se bavi proučavanjem otrova i njihova učinka na živi
organizam. Otrovi su sve one tvari prirodnog ili sintetičkog podrijetla koji uneseni u
organizam ili u dodiru s organizmom mogu ugroziti život i zdravlje ljudi ili štetno djelovati na
okoliš te tvari čijom razgradnjom ili uništavanjem nastaju otrovne tvari (1).
Toksikologija se može podijeliti u dvije velike grane: kliničku i forenzičnu
(sudskomedicinsku) toksikologiju.
Sudskim vještačenjem u pravnim postupcima u kojima je potrebno riješiti probleme vezane za
različita otrovanja bavi se forenzična ili sudska toksikologija. Forenzična toksikologija se
dijeli na dva zasebna područja:
poslijesmrtna forenzična toksikologija (smrtno otrovanih osoba),
forenzična toksikologija živih osoba.
1.1. Poslijesmrtna forenzična toksikologija
U slučajevima nasilne smrti, te iznenadne, nejasne (pod nepoznatim okolnostima) i sumnjive
smrti (pod okolnostima koje bi mogle upućivati na nasilnu smrti) potrebno je izvršiti
toksikološku analizu u svrhu određivanja/isključivanja uzroka smrti.
Poslijesmrtna forenzična toksikologija obuhvaća analizu tjelesnih tekućina i tkiva u
slučajevima koji uključuju smrtni ishod te interpretaciju rezultata analize. Utvrđuje odsutnost
ili prisutnost tvari i njihovih metabolita u tjelesnim tekućinama i tkivima te sudjeluje u
procjeni njihovog utjecaja kao uzroka smrti.
Forenzična toksikološka istraga sastoji se od četiri glavna koraka: prikupljanje podataka o
slučaju, izbor uzoraka i njegovog pravilno prikupljanje, izrada toksikološke analize te
interpretacija rezultata.
1

1.2. Poslijesmrtne promjene i njihov utjecaj na analizu i interpretaciju otrova u
poslijesmrtnim forenzičnim uzorcima
Dekompozicija trupla obuhvaća procese autolize i truljenja, koji utječu na sastav i
integritet tkiva i tjelesnih tekućina, te posljedično na sastav i koncentraciju droga i drugih
otova u tjelesnim tekućinama i tkivima.
Navedene tvari mogu biti oslobođene od svojih vezujućih mjesta u tkivima, a neapsorbirana
droga može difundirati iz krvnih žila ili lumena tjelesnih šupljina u okolna tkiva.
Dostupni podatci pokazuju da za većinu lijekova i otrova, uključujući alkohol, postoje
značajne razlike u koncentraciji u krvi ovisno o vremenu prikupljanja uzoraka nakon smrti,
anatomskoj lokaciji uzorka, načinu izuzimanja uzoraka i volumenu prikupljene krvi (2).
Također su uočene razlike u koncentraciji određenih lijekova i otrova, dobivenih iz različitih
mjesta uzorkovanja tkiva jetre i pluća (3).
Mehanizmi i procesi koji uključuju promjene u koncentraciji droga i drugih otrova mogu se
općenito svesti pod pojam poslijesmrtne redistribucije (4).
Faktori koji utječu na poslijesmrtnu redistribuciju uključuju fizikalno - kemijska i
farmakokinetička svojstva droga, vrijeme proteklo od smrti do izuzimanja uzoraka, vanjske
fizikalne uvjete - temperaturu i vlažnost, položaj tijela, koagulaciju krvi i hipostazu,
smanjenje pH vrijednost te invaziju bakterija (4, 5).
Hipoksija smanjuje unutarstanični pH te tako potiče akumulaciju bazičnih droga unutar
stanice, dok na neutralne ili kisele droge ima manji utjecaj. Nakon smrti dolazi do
zakiseljavanja pH do vrijednosti od 5,5 uzrokovajući oštećenja na membrani lizosoma, a
potom i enzimska razgradnju komponenti stanične membrane dovodeći do povećanja
propusnosti membrane te redistribuciju droga u dodatni stanični prostor (4).
Uz hemolizu i smanjenje pH vrijednosti, poslije smrti krv se zgrušava, nakon čega ponovno
postaje tekuća. Hipostaza, odnosno sedimentacija komponenti krvi u niže djelove tijela pod
utjecajem gravitacije vidljiva je manifestacija poslijesmrtnih promjena.
Droge koje podliježu procesu poslijesmrtne redistribucije su lipofilni, blago lužnati spojevi sa
relativno velikim volumenom distribucije (5,6,7).
2

Brzina redistrbucije općenito je nepoznata. Eksperimentalni modeli praćenja promjene
koncentracije barbiturata i morfina u poslijesmrtnim uzorcima ukazuju da se redistribucija
navedenih spojeva može odviti jako brzo nakon smrti (5).
Uz poslijesmrtnu redistribuciju, na promjenu, koncentraciju i sastav droga nakon smrti, utječe
i degradacija i formiranje droga ili novih entiteta u razdoblju poslijesmrtnog intervala.
Najistaknutiji primjer poslijesmrtne metaboličke formacije je etanol.
Poslijesmrtni nastanak etanola ovisan je o djelovanju mikroorganizama, a njegova
koncentracija ovisi o vrsti prisutnih mikroorganizama, dostupnosti supstrata, uvjetima prije
smrti i uvjetima skladištenja tijela prije izuzimanje uzoraka za analizu (4).
Posebnu pažnju na navedene poslijesmrtne promjene treba obratiti prilikom odabira te način i
prikupljanja uzoraka, kao i interpretaciju rezultata poslijesmrtne forenzične toksikološke
analize.
1.3. Uzorci i način prikupljanja
U mnogim smrtnim slučajevima samo vanjskim pregledom i obdukcijom tijela nije moguće
utvrditi uzrok smrti, stoga je potrebno obaviti toksikološku analizu. Preduvjet za obavljanje
dobre toksikološke analize je odgovarajući uzorak, na vrijeme izuzet te pravilno pohranjen
(1).
Uzorci koji se mogu koristiti u poslijesmrtnim toksikološkim analizama obuhvaćaju uzorke
tjelesnih tekućina, tkiva (mozak, jetra, pluća, bubrezi), te sadržaja probavnog sustava (Slika 1
i 2). Također mogu poslužiti mišićno i masno tkivo, koštana srž, kosa, pa čak i ličinke na
raspadajućim tijelima. (7)
Procedura uzorkovanja započinje odabirom prikladnog uzorka a završava točnom pohranom
materijala.
Uzorci se prikupljaju u kemijski čiste staklene ili plastične posude i odgovarajuće označavaju.
Oznake trebaju sadržavati podatke o kojoj vrsti uzorka se radi, identifikacijski broj institucije,
ime i prezime osobe od koje su uzorci prikupljeni, te vrijeme i datum prikupljanja (8).
Uzorcima se ne dodaju konzervansi osim u slučaju prikupljanja uzorka krvi za određivanje
koncentracije alkohola, te pri sumnji na otrovanje cijnidima (9).
3

Slika 1. Uzorci za toksikološku analizu izuzeti tijekom obdukcije
(Arhiv odjela za sudsku medicinu KBC Split)
Slika 2. Pripremljeni uzorak tkiva
(Arhiv odjela za sudsku medicinu KBC Split)
4

Smjernice za prikupljanje uzoraka prikazane su u Tablici 1 (1,3,4).
Tablica 1. Smjernice za prikupljanje uzoraka
Krv
Uzorak Volumen/količina
Iz femoralne ili
subklavijalne vene
10-20 ml
Iz srca 50 mL ili sva raspoloživa
Urin 50 mL ili sav raspoloživ
Želučani sadržaj 50 mL ili ukupan sadržaj
Tkiva (mozak, jetra, pluća,
bubrezi, mišići)
50 g
Žučna tekućina Sva raspoloživa
Očna vodica Sva raspoloživa
Mjesto uboda injekcijske igle 2x2x1 cm 3
Masno tkivo Najmanje 250 g
Uzorak kose Najmanje 500 mg
Uzorak noktiju Najmanje 0.2 g
Za povećanje pouzdanosti rezultata toksikološke analize, prilikom izuzimanja uzoraka
preporučuje se:
- smanjivanje vremenskog razdoblja protekloga od smrti do prikupljanja uzoraka
- odabir primjerenog uzorka (vodeći računa o okolnostima događaja i karakteristikama
tvari za koje postoji sumnja da su dovele do smrtnog ishoda, kao i metodama analize)
- uzimanje dovoljne količine ili volumena uzorka
- minimaliziranje mogućnosti kontaminacije
- svi uzorci se trebaju pohraniti u kemijski čiste i odvojene kontejnere, obilježiti i
prikladno pohraniti do analize
5

U većini slučajeva za poslijesmrtno dokazivanje otrovanja osobe dovoljno je uzeti uzorke
krvi, mokraće i očne vodice. Od svih materijala dostupnih obdukcijom, krv je ključna za
procjenu je li pokojnik bio pod utjecajem droge ili drugih sredstava ovisnosti u vrijeme smrti.
Urin je uzorak izbora za toksikološko probiranje jer sadrži oko 99% vode i mali udio
endogenih proteina, lipida i drugih srodnih velikih molekula, što pojednostavljuje pripremu
uzorka za analizu (3).
Akumulacije droga i njihovih metabolita u mokraći rezultirati će relativno visokim
koncentracijama navedenih tvari, te tako olakšati otkrivanje izloženosti potencijalnom otrovu.
Međutim, u slučajevima kada je od konzumacije otrova do smrti proteklo manje od sat
vremena, konzumirana tvar se najvjerojatnije neće izlučiti u mokraću (3).
Tkivo jetre, bubrega i sl. tkiva, u situacijama kada biološke tekućine nisu raspoložive, postaju
važan uzorak, a često puta za toksikološku analizu i jedini. To je najznačajnije kod tijela
umrlih osoba koja se nalaze u fazi raspadanja jer je proteklo duže vrijeme od smrti do
pronalaska tih osoba. U takvim situacijama, naročito za ljetnih mjeseci, dolazi do degradacije
tkiva i pojave novih kemijskih produkata.
Jetra
Jetra ima vrlo važnu ulogu u nizu metaboličkih, kako kataboličkih tako i anaboličkih procesa,
pa se stoga naziva „centralnim laboratorijem“ organizma.
Predstavlja uzorak od značajne važnosti za forenzičnu toksikologiju. Naime, u njoj se odvija
veliki dio metabolizma droga i drugih tvari od značaja za forenzičnu toksikologiju, te vrlo je
vjerojatno da će tvari koje se metaboliziraju tim putem biti prisutne u velikoj koncentraciji.
Zbog navedenog ona mogu omogućiti utvrđivanje onih tvari koje su uzrokovale smrt čak i
kada te tvari ne mogu biti detektirane u krvi (1).
1.4. Toksikološka analiza
Nalaženje otrova u tjelesnim tekućinama, tkivima i u raznom sumnjivom materijalu obavlja se
primjenom kemijskih i fizikalno kemijskih metoda.
Rad na utvrđivanju prisutnosti otrova u ispitivanom uzorku olakšan je ako se na osnovi
dobivenih podataka sumnja na određenu toksičnu tvar. Rezutati toksikološke analize
pronađenih predmeta na mjestu događaja dati će vrijedne inforacije o vrsti upotrebljenog
6

sredstva. U slučajevima kada nije poznato sredstvo koje je uzrokovalo otrovanje, a
obdukcijom nije dobivena karakteristična slika za pojedini otrov, primjenjuje se sve
obuhvatna toksikološka analiza. Određenim analitičkim postupcima nastoji se obuhvatiti
većina raznih otrova, te utvrditi ili isključiti njihova prisutnost u ispitivanom uzorku (9).
U slučaju nalaza otrova u tjelesnim tekućinama i tkivima, potrebno je odrediti ima li ga u
dovoljnoj količini koja može prouzročiti kliničke simptome otrovanja, odnosno smrti. Za
većinu lijekova i ostalih tvari danas su poznate koncentracije u krvi i pojedinim organima,
koje se nalaze nakon uzimanja terapijskih, toksičnih i smrtonosnih doza (9).
Priprema biološkog materijala za analizu
Prije toksikološke analize potrebno je izolirati otrovne spojeve iz uzoraka tjelesnih tekućina i
tkiva, te drugog nebiološkog materijala. Biološki materijal sadrži brojne komponente koje
mogu interferirati s analitom te ih je potrebno ukloniti prije analize. Budući da se otrovne
tvari često nalaze u malim koncentracijama u uzorcima bioloških materijala potrebno ih je
koncentrirati.
Za pripremu bioloških uzoraka najčeće se koriste:
ekstrakcija na čvrstim nosačima (eng. solid phase extraction, SPE),
ekstrakcija tekuće-tekuće (liquid –liquid extraction, LLE) (1).
Ekstrakcija na čvrstim nosačima je fizikalni proces koji se odvija između tekuće i čvrste faze,
a podrazumijeva odjeljivanje organskih spojeva iz biološkog materijala na temelju njihovih
različitih afiniteta za nosače u kolonama.
Kod ekstrakcije tekuće – tekuće dolazi do raspodjele tvari između dvije tekuće faze koje se ne
miješaju. Takvo stanje predstavlja ravnotežu jer je nakon razdvajanja otapala na dva sloja
omjer koncentracija u otapalima stalan bez obzira na volumene otapala i količinu otopljene
tvari.
Kromatografske metode analize
Kromatografska analiza služi za odjeljivanje, identifikaciju i kvantifikaciju kemijskih
sastojaka prisutnih u složenim smjesama. Kromatografijom se omogućava odjeljivanje i
djelomičan opis spojeva čije je prisutstvo nepoznato ili neočekivano u smjesi (10).
7

Najčešće kromatografske tehnike su:
Tankoslojna kromatografija
Kromatografija na stupcu
Plinska kromatografija
Kromatografija na papiru
Plinska kromatografija
Plinska kromatografija je kromatografska metoda koja se koristi za odjeljivanje smjesa
hlapljivih spojeva. Mobilna faza je inertni plin, a stacionarna faza tekućina koja je vezana za
stijenke kolone ili nanesena na neki sorbens.
Uređaj za plinsku kromatografiju - kromatograf sastoji se od injekcijskog bloka,
kromatografske kolone, termostatirani prostor u kojem je smještena kolona (pećnice),
detektora i računala. Uzorci se unose u injekcijski blok pomoću injekcijskih šprica. Detektor
može biti bilo koji uređaj koji na osnovu neke kemijske ili fizikalne promjene registrira
prisutnost odijeljene komponente. Detekcija se može izvesti mjerenjima koja se zasnivaju i
između ostalog i na spektrometriji masa, (GC-MS metoda).
Spektrometrija masa
Spektrometrija masa (MS) je analitička tehnika kojom se ispituju kemijske vrste, tako
što se uzorci prevode u plinovito stanje, ioniziraju, fragmentiraju i razdvajaju prema njihovoj
masi, odnosno omjeru masa i naboja te se registriraju pojedine ionske vrste. Spektrometrijom
masa se određuju relativne molekulske mase, preko kojih se dolazi do molekulskih formula.
Spektrometrija masa obuhvaća procese ionizacije molekula uzorka, razdvajanja i
određivanja iona. Spektar mase se obično prikazuje kao linijski dijagram ovisnosti intenziteta
i omjera mase i naboja.
Vezani sustav plinska kromatografija- spektrometrija masa ( GC-MS )
Vezana tehnika plinska kromatografija-spektrometrija masa (GC/MS) jedna je od
najraširenijih metoda koja se koristi za istraživanje i identifikaciju nepoznatih uzoraka. Ta
8

tehnika kombinira metode plinske kromatografije i spektrometrije masa za identifikaciju
različitih ispitivanih uzoraka, te za kvalitativno i kvantitativno određivanje elemenata ili
spojeva. Plinska kromatografija omogućuje ispitivanje spojeva koji se mogu prevesti u
plinovito stanje, a da se pri većim temperaturama ne raspadnu, i njihovu detekciju, dok se
masenom spektrometrijom analiziraju molekule na temelju njihove mase i naboja.
Karakteristični podatci dobiveni korištenjem vezane tehnike GC-MS su vrijeme
zadržavanja ili retencijsko vrijeme (RT) i površina pika koja je proporcionalna količini
sastojka. Dobiveni maseni spektar pojedinog sastojka se uspoređuje sa masenim spektrima iz
banke masenih spektara.
Analizom injektiranog uzorka na GC/MS instrumentu (Slika 3) dobiva se
kromatogram, koji se najčešće snima na dva načina, kao kromatogram ukupne ionske struje
(TIC) ili kao selektivno praćanje iona (SIM). TIC načinom se u određenom vremenu snima
ukupna analiza uzorka, dok se SIM načinom prate samo odabrani ioni.
1.5. Interpretacija rezultata
Slika 3. Plinski kromatograf s detektorom masa
Interpretacija analitičkih rezultata najčešće je najteži aspekt forenzične toksikologije (5).
Temelji se na iskustvu forenzičnih toksikologa te o prijašnjim saznanjima o toksičnosti droga,
alkohola i drugih čestih otrova (7).
9

1.6. Toksikološki značajne tvari
U forenzičnoj toksikologiji susrećemo se s mnogim otrovima ( Tablica 2) koji su doprinijeli
smrtnom ishodu ili prouzrokovali smrt, međutim najčešće su predmet forenzičnih
toksikoloških analiza razne droge, pa tako i amfetamini.
Tablica 2. Toksikološki značajne tvari (1)
SREDSTVA OVISNOSTI
(prirodne ili sintetičke
tvari sa psihoaktivnim
djelovanjem koje se
zloupotrebljavaju zbog
trenutnog i prolaznog
osjećaja ugode što vodi ka
ponovnom uzimanju )
OSTALE
TOKSIKOLOŠKI
ZNAČAJNE TVARI
Narkotici i opijati:
- prirodni (opijum i njegovi derivati morfin i heroin)
- polusintetički i sintetički (metadon, propoksifen, tramadol,...)
Halucinogeni :
- prirodni (kanabinoidi, psilocibin, meskalin, atropin,
skolpolamin, beladon)
- polusintetički (LSD)
- sintetički (fenciklidin-PCP)
Stimulansi SŽS:
- amfetamini/metamfetamini
- kokain
- efedrin
Hipnotici SŽS
- barbiturati
- benzodijazepini
Druga sredstva ovisnosti
(alkohol, kofein, nikotin, inhalanti)
- plinoviti i lako hlapljivi anorganski otrovi ( CO, CO2, H2S...)
- korozivni otrovi (jake anorganske kiseline, organske kiseline,
lužine te različiti korozivni spojevi)
- metali i metaloidi (arsen, živa, olovo, talij...)
- pesticidi
- industrijske organske kemikalije
10

1.6.1. Amfetamini
Amfetamini obuhvaćaju skupinu stimulansa središnjeg živčanog sustava niske molekularne
težine baznih droga, u koju spadaju:
amfetamini (1-fenilpropan-2-amin),
metamfetamini (N-metil-1-fenil-propan-2-amin),
metilendioksiamfetamin MDA (1-(benzo(1,3)dioksol-5-il)propan-2-amin,
metilendioksimetamfetamin MDMA (1-benzo(d)(1,3)dioksol-5-il)N-metilpropan-2-
amin) (1).
Često ih nalazimo na nelegalnom tržištu kao sredstva ovisnosti.
Amfetamini i metamfetamini pojavljuju se u D i L izomernim oblicima. Strukturna formula
izomernih oblika navedenih spojeva prikazana je na Slici 4.
Slika 4. Strukturna formula D i L izomernih oblika amfetamina i metamfrtamina
11

Metabolizam amfetamina
Glavni metabolički put amfetamina uključuje deaminaciju pod utjecajem citokroma P450
dajući hidroksiamfetamin i fenilaceton, koji naknadno oksidacijom prelaze u benzojevu
kiselinu,a potom se izlučuju u urinu kao hipurna kiselina i konjugati glukuronske kiseline.
Manje količine amfetamina mogu oksidacijom prijeći u u norefedrin. Mehanizmom
hidroksilacije proizvode se farmakološki aktivni metaboliti, O-hidroksinorepinefrin, koji
djeluje kao lažni neurotrasmiter, te mogu imati za posljedicu promjene u ponašanju, poebno
kod kroničnih konzumenata (11).
Eliminacija i ekskrecija
Normalno 5 do 30% terapeutske doze amfetamina izlučuje se nepromjenjeno u urinu unutar
24 sata, ali stvarana količina izlučivanja urinom ovisna je o pH urina (11).
12

2. CILJ RADA
Cilj ovoga rada bio je:
Odrediti može li analiza uzorka tkiva jetre, u kojima prethodno nije utvrđeno
prisustvo amfetamina, naknadno, pod određenim promijenjenim uvjetima dati lažno
pozitivan rezultat.
Odrediti uvjete odgovorne za nastanak lažno pozitivnih amfetamina u poslijesmrtnim
uzorcima tkiva jetre.
Odrediti minimalan broj dana koji je potreban za pojavu lažno pozitivnog rezultata na
prisustvo amfetamina
13

3. MATERIJALI I METODE
3.1. Uzorkovanje
Prilikom obdukcije prikupljeno je 100 g uzorka tkiva jetre. Uzorak je prikupljen u kemijski
čistu staklenu posudu, zapečaćen, propisno obilježen i pohranjen u hladnjak na +4 C do
kemijske analize.
Prikupljeni uzorak tkiva jetre raspoređen je u 6 staklenih epruveta, na način da je u svaku
odvagano po 5 grama prethodno isjeckanog uzorka.
Kontrolni uzorak odmah je podvrgnut pripremi za kemijsku analizu, dok je ostalih pet
podvrgnuto inkubaciji u prostoriju, te izloženo djelovanju sunčevog svjetla i sobnoj
temperaturi. Usporedno su se pratili fizikalni uvjeti - temperatura, relativna vlažnost i tlak
zraka.
Uzorci su podvrgnuti analizi prema rasporedu prikazanom u Tablici 2.
Tablica 2. Raspored analize uzoraka
Uzorci jetre Datum analize Vrijeme inkubacije (dani)
Uzorak 1 6.07.2011. 2
Uzorak 2 8.07.2011. 4
Uzorak 3 13.07.2011. 9
Uzorak 4 18.07.2011. 14
Uzorak 5 22.07.2011. 18
14

3.2. Priprema uzoraka
Prethodno pripremljenih 5 g uzoraka tkiva jetre (Slika 5), prebacilo se u Erlenmayerovu
tikvicu u koju se dodalo 100 mg L-cysteina. Potom se dodalo 5 mL destilirane vode i treslo na
tresilici 15 min.
Uzorak se zakiselio s 5 mL koncentrirane HCl i termostatirao 25 min, na 90 ˚C. Ohlađeni
uzorak se zalužio s 0,1 M otopinom NaOH do pH 8,5, nakon čega se filtrirao.
3.3. Ekstrakcija
Slika 5. Priprema uzoraka tkiva jetre
Ekstrakcija je obavljena na “Champagne” koloni za ekstrakciju.
Kolone su se kondicionirale metanolom, nakon čega se propustio prethodno obrađen uzorak i
25 mL vode. Nakon toga, preko bezvodnog Na2SO4 prethodno natopljenog smjesom etil
acetat – kloroform, propustilo se 25 mL smjese etil acetat-kloroform (3:2).
Eluati su sakupljeni u petrijevu zdjelicu i upareni do suha, a nakon toga, u tubicama za
GC/MS analizu, rekonstituirali u kloroformu do konačanog volumena od 30 µl.
15

3.4. GC/MS analiza
Analiza je obavljena na plinskom kromatografu s masenim spektrometrom Shimadzu GCMS-
QP2010.
Korištena je kromatografska kolona RESTEK (Rtx-5MS (30m, ID =0,25mm, df =0,25 um).
Početna temperature kolone od 90 ˚C zadržana je 3 minute, nakon čega je programirana na
270 C, 20 ˚C/min, i zadržana 25 minuta.
Uzorak se injektira pri temperaturi 250 ˚C I tlaku 107.2 kPa. Kao plin nosač korišten je helij,
uz protok 1,5 mL /min.
16

4. REZULTATI
Fizikalni parametri
Tablica 3. Prikaz fizikalnih parametara, temperature, relativne vlažnosti i tlaka zraka, u
razdoblju trajanja analize poslijesmrtnih uzoraka tkiva jetre, od 4.07. 2011. do 22.07.2011.
godine.
DATUM
TEMPERATURA (°C)
Max
dnevna
Min
dnevna
prosjek
RELATIVNA VLAŽNOST TLAK ZRAKA
(%)
(hPa)
Max
Min prosjek Max Min
4.07.2011.
(kontrolni
uzorak)
27.5 19.1. 23.4 69 34 48 1016.1 1012.8
5.07.2011. 25.9 18.3 21.8 83 60 72 1015.1 1011.4
6.07.2011.
(Uzoral 1)
28.3 19.7 24.1 79 47 65 1013.1 1011.1
7.07.2011. 30.7 21.2 26.3 78 35 54 1014.8 1013.1
8.07.2011.
32.6 23.3 28.4 60 35 45 1016.8 1014.1
(uzorak 2)
9.07.2011. 35.1 24.4 30.3 63 28 41 1018.5 1016.5
10.07.2011. 35.3 25.2 30.5 47 26 37 1017.2 1014.4
11.07.2011. 34.5 25.2 30.0 66 33 45 1014.8 1012.4
12.07.2011. 36.1 27.9 32.0 62 35 45 1013.8 1011.7
13.07.2011.
(uzorak 3)
35.1 27.0 30.6 62 39 48 1012.4 1010.0
14.07.2011. 36.4 27.6 31.9 62 33 42 1011.7 1009.7
15.07.2011. 33.1 28.0 30.4 65 34 51 1013.8 1011.1
16.07.2011. 32.9 24.7 29.0 49 38 43 1013.8 1010.0
17.07.2011. 30.8 24.7 27.8 50 36 42 1010.7 1007.7
18.07.2011.
(uzorak 4)
33.4 23.9 29.1 55 34 41 1008.4 1006.0
19.07.2011. 32.8 26.8 29.5 60 42 51 1007.0 1003.0
20.07.2011. 27.4 19.7 24.9 86 38 59 1007.3 1000.6
21.07.2011. 27.4 19.9 24.1 64 49 56 1007.7 1006.7
22.07.2011.
(uzorak 5)
27.6 18.5 24.3 86 49 63 1010.4 1007.0
17

Rezultati kromatografske analize
Analizom kontrolnog uzorka (označenog br. 1) koji nije podvrgnut utjecaju promjena, nije
utvrđena prisutnost amfetamina (Slika 6).
Slika 6. Prikaz kromatograma dobivenog nakon ekstrakcije kontrolnog uzorka tkiva jetre, koji
nije podvrgnut utjecaju temperaturnih promjena
18

Slika 7. Rezultati analize GC/MS analize uzorka br. 2, nakon 2 dana inkubacije: A) TIC
kromatogram i B) spektar masa amfetamina (m/z: 91-65-121)
U 4 od 5 analiziranih uzoraka uočena je prisutnost amfetamina, i to u slijedećim uzorcima:
uzorak 2 – podvrgnut analizi nakon 4 dana inkubacije (Slika 7)
uzorak 3 – podvrgnut analizi nakon 9 dana inkubacije
uzorak 4 – podvrgnut analizi nakon 14 dana inkubacije
uzorak 5 – podvrgnut analizi nakon 18 dana inkubacije.
Na slikama 8 i 9 prikazana je pojava amfetamina u svim analiziranim uzorcima.
19

Slika 8. Pojava amfetamina (usporedba svih analiziranih uzoraka)
Slika 9. Uvećani kromatogram prikaza rezultata amfetamina dobiven TIC-metodom
20

5. RASPRAVA
Uzorci jetre u kojima nije prethodno dokazano prisustvo amfetamina, mogu dati lažno
pozitivne rezultate.
Točna interpretacija rezultata analize poslijesmrtnih uzoraka kompleksna je znanstvena
disciplina koja uključuje mnogo više od detekcije i kvantifikacije spojeva u uzorku.
Prilikom interpretacije rezultata treba razmotriti nekoliko ključnih čimbenika. Svaki slučaj je
različit te treba obratiti pozornost na informacije koje se odnose na akutnu/kroničnu
izloženost otrovu, liječenje i vrijeme preživljavanja. Osim individualnih varijacija treba
obratiti pažnju na izbor uzorka za analizu, metodu primjene i analizu, nalaze prilikom
obdukcije i ako je moguće poslijesmrtne promjene. Kada god je pronađeno više spojeva, treba
uzeti u obzir mogućnost dodatnih učinaka, sinergizma ili antagonizma.
Osobito je bitno poznavanje farmakodinamike i farmakokinetike lijekova ili droga, te procesa
biotransformcije, pogotovo kad je izvorni spoj brzo metaboliziran ili ga nije lako otkriti.
Prema dostupnoj literaturi (12 - 15) pojava lažno pozitivnih amfetamina uočena je u uzorcima
tjelesnih tekućina, a odnosila se na rezultate analize metodama probira (screening testovi).
Takvi testovi nisu visoko specifični pa prisustvo farmakološki slične aktivne tvari u
ispitivanom uzorku može dati lažno pozitivne rezultate (15). Lažno pozitivni rezultati
probirnih testova na prisutnost amfetamina uočeni su kod pacijenata koji su uzimali lijekove
za prehladu koji sadrže efedrin, te lijekove koji sadržavaju amfetamine kao što su neki
anorektici i lijekovi za narkolepsiju (15). Međutim, da bi se razlučilo jeli netko konzumirao
amfetamine ili pak lijekove sličnog farmakološkog sastava potrebno je znati koji su korišteni
testovi za njihovo određivanje te ispravno interpretirati dobivene rezultate. Stoga, ako je
rezultat takvog preliminarnog testa pozitivan, potrebno ga je potvrditi testom koji služi za
potvrdu, a u to spada i test plinske kromatografije s detektorom masa (GC-MS metoda).
Jedino korištenjem takvih tehnika sa sigurnošću se može reći radi li se o amfetaminu ili
farmakološki sličnom spoju.
Dostupna istraživanja koja su se odnosila na pronalazak amfetamina u poslijesmrtnim
uzorcima (16), uključivala su uglavnom promjene u koncentraciji amfetamina u različitim
uzorcima, prethodno pozitivnih na amfetamine, uslijed utjecaja poslijesmrtnih promjena.
21

Tek novija istraživanja Sutlović i suradnika (17) spominju mogućnost pronalaska lažnih
amfetamina u uzorcima tkiva jetre. Prema navedenim istraživanjima uočena je prisutnost
lažnih amfetamina nakon nekoliko dana pri temperaturi od 32,5 ºC.
U ovom istraživanju uočena je pojava lažno pozitivnih rezultata afetamina već nakon 4 dana
od inkubacije. Ostali analizirani uzorci, ekstrahirani nakon inkubacije (u rasponu od 4 do 18
dana), pokazali su pojavu lažno pozitivnih amfetamina (slika 10).
Slika 10. Shematski prikaz tijeka analize ispitivanih uzoraka jetre
Za određivanje uvjeta koji bi mogli doprinjeti pojavi lažno pozitivnih amfetamina praćene su
varijacije u temperature, relativnoj vlažnosti i tlaku zraka. Vrijednosti navedenih fizikalnih
parametara pribavljeni su od obližnje meteorološke postaje, te ne odražavaju stvarno stanje
uvjeta u prostoriji. Međutim, u prethodnim eksperimentima koji su se provodili u prostoriji u
kojoj su ispitivani uzorci inkubirani, maksimalna dnevna temperatura u ljetnim mjesecima
iznosila je i do 36 ºC, što je odgovaralo izmjerenim vanjskim uvjetima u istom razdoblju.
Zbog navedenog izmjerene temperaturne vrijednosti uzete su u obzir prilikom interpretacije
rezultata ovoga istraživanja.
22

Usporedbom podataka pojave lažnih amfetamina i fizikalnih parametara došli smo do
zaključka da relativna vlažnost i tlak zraka najvjerojatnije nemaju nekog utjecaja na pojavu
amfetamina. Budući da temperatura ima utjecaja na raspadanje tijela (18), te je uočen utjecaj
povišenih temperature na ubrzanu degradaciju bioloških tkiva (9), kao parameter za
određivanje uvjeta koji bi mogli biti odgovorni za nastanak lažno pozitivnih amfetamina u
poslijesmrtnim uzorcima tkiva jetre, uzeta je maksimalna dnevna temperatura.
Pojava lažno pozitivnih rezultata afetamina uočena je pri maksimalnoj dnevnoj temperaturi
već od 32,6 ºC.
Poznato je da tkivo podliježe degradaciji i da je ta degradacija u pozitivnoj korelaciji s
vremenom. Stoga, važno je naglasiti da na stupanj degradacije ispitivanih tkiva jetre, važnu
ulogu je imao i broj dana protekao od početka postavljanja eksperimenta do početka
ekstrakcije i analize. To znači da je na ispitivane uzorke jetre označene br. 2-5, osim
temperature okolša i proteklo vrijeme imalo snažnog utjecaja.
Da bi donijeli zaključak o korelaciji temperature i početku pojavljivanja lažno pozitivnih
rezultata amfetamina trebali bi usporedno pratiti više istih uzoraka podvrgnutih različitim
temperaturnim vrijednostima, što nije bio predmet u ovom istraživanju. Zbog navedenog
zaključci temeljeni na temepraturi i pojavi lažnih amfetamina trebaju se uzeti s rezervom.
Mehanizmi odgovorni za pojavu lažno pozitivnih amfetamina u uzorcima raspadnutog tkiva
jetra nisu u potpunosti razjašnjeni. Unatoč nedostatku podataka u literaturi ne bismo trebali
zanemariti mogućnost pojave ovakvih rezultata u budućnosti te provesti daljnja istraživanja na
ovom području.
23

6. ZAKLJUČAK
U ovom radu nastojali smo utvrditi prisutnost amfetamina u raspadnutim uzorcima tkiva jetre
Došli smo do sljedećih zaključaka:
1. Uzorci jetre u kojima, prethodnim analizama, nije utvrđena prisutnost amfetamina,
dali su lažno pozitivne amfetamine nakon najmanje 4 dana inkubacije pri
maksimalnoj dnevnoj temperaturi od 32,6 ºC.
2. Analizom raspadnutih uzoraka tkiva jetre dokazana je prisutnost amfetamina u
uzorcima označenim 2 - 5 (nakon 4-18 dana inkubacije).
3. Pronalazak amfetamina u tkivu jetri, prije donošenja zaključaka o uzroku smrti,
trebao bi se uvijek potvrditi toksikološkom analizom drugih bioloških uzoraka.
24

7. LITERATURA
1. Sutlović D i sur. Osnove forenzične toksikologije, Redak; 2011
2. Pounders DJ, Jones GR. Post-mortem Drug Redistribution - A Toxicological
Nightmare, Forensic Sci Int (1990);45: 253-363.
3. Karch SB, Postmortem Toxicology of Abused Drugs. CRC Press; 2007.
4. Skoop G. Postmortem toxicology, Forensic Sci Med Pathol (2010); 6:314-325
5. Leikin JB, Watson WA. Apost-mortem toxicology:what the dead can and cannot tell
us. J Toxicol Clin Toxicol (2003);41(1):47-56.
6. Cook DS, Braithwaite RA, Hale KA. Estimating antemortem drug concetrations from
postmortem blood samples: the influence of postmortem redistribution, J Clin Pathol
(2000);53:282-285.
7. Koski A. Interpretation of postmortem toxicology results: pharmacogenetics and drugalcohol
interaction. Academic dissertation, University of Helsinki, Helsinki; 2005.
8. Forest ARW, Obtaining samples at post mortem examination for toxicological and
biochemical analyses, J Clin Pathol (1993); 46:292-296
9. Zečević D. i sur. Sudska medicina i deontologija. Medicinska naklada: Zagreb;2004
10. Mastelić J, Krka S. Primjena plinske kromatografije- spektrometrije u analizi složenih
uzoraka, skripta za internu upotrebu, Kemijsko- tehnološki fakultet Sveučilišta u
Splitu, 1994
11. Dollery. Therapeutic drugs. Edinburgh Churchill, Livingstone; 1991 in International
Programme on Chemical Safety (IPCS), Poison Information Monograph 934 (PIM
934); URL: http://www.inchem.org/documents/pims/pharm/pim934.htm, pristupljeno
kolovoz 2011.
12. Olsen KM, Gulliksen M, Christophersen AS. Metabolites of chlorpromazine and
brompheniramine may cause false-positive urine amphetamine results with
monoclonal EMIT d.a.u. immunoassay. Clin Chem. (1992);38(4):611-2.
13. Nixon AL, Long WH, Puopolo PR, Flood JG. Bupropion metabolites produce falsepositive
urine amphetamine results. Clin Chem. (1995); 41:955–6.
14. Smith-Kielland A, Olsen KM, Christophersen AS. False-positive results with Emit II
amphetamine/methamphetamine assay in users of common psychotropic drugs. Clin
Chem. (1995); 41:951–2.
25

15. Moeller KE, Lee KC, Kissack JC. Urine Drug Screening: Practical Guide for
Clinicians. Mayo Clin. Proc.(2008); 83(1): 66 - 76.
16. Nagata T, Kimuraa K, Harab K, Kudoa K. Methamphetamine and amphetamine
concentrations in postmortem rabbit tissues. Forensic Sci Int (1990); 48(1): 39-47
17. Sutlović D, Veršić M., Definis-Gojanović M. False Positive Amphetamine Findings,
Toxicol lett (2011); 205S: 117.
18. Vass AA. Beyond the grave-understanding human decomposition. Microbiology today
(2001);28:190-192
26

8. Sažetak
Uvod - Interpretacija rezultata poslijesmrtne toksikološke analize ključni je faktor u
određivanju uzroka smrti. Prilikom interpretacije rezultata potrebno je uzeti u obzir nekoliko
ključnih faktora kao što su odabir prikladnog uzorka, okolnosti događaja i karakteristike tvari
za koje postoji sumnja da su dovele do smrtnog ishoda, metode analize te poslijesmrtne
promjene. Tkiva i organi, a posebno jetra, u situacijama kada biološke tekućine nisu
raspoložive, postaju važan uzorak, a često puta za toksikološku analizu i jedini. To je
najznačajnije kod tijela umrlih osoba koja se nalaze u fazi raspadanja jer je proteklo duže
vrijeme od smrti do pronalaska tih osoba. U takvim situacijama, naročito za ljetnih mjeseci,
dolazi do degradacije tkiva i pojave novih kemijskih produkata.
Cilj- Odrediti može li analiza uzorka tkiva jetre, u kojima prethodno nije utvrđeno prisustvo
amfetamina, naknadno, pod određenim promijenjenim uvjetima dati lažno pozitivnan rezultat
i odrediti uvjete odgovorne za njihov nastanak. Odrediti minimalan broj dana koji je potreban
za pojavu lažno pozitivnog rezultata na prisustvo amfetamina
Metode – Poslijesmrtni uzorak tkiva jetre, u kojem prethodno nije utvrđeno prisustvo
amfetamina, podijeljen je na pet identičnih dijelova i podvrgnut djelovanju fizikalnih uvjeta –
temperature, tlaka zraka i relativne vlažnosti. Uzorci su podvrgnuti GC/MS analizi u
različitim vremenskim intervalima.
Rezultati - Uzorci jetre u kojima nije utvrđena prisutnost amfetamina, dali su lažno pozitivne
amfetamine. Prva pojava amfetamina uočena je nakon 5 dana pri maksimalnoj dnevnoj
temperaturi od 32,6 ºC.
Zaključak - Uzorci jetre u kojima nije prethodno dokazano prisustvo amfetamina, mogu dati
lažno pozitivne rezultate. Pronalazak amfetamina u jetri uvijek bi se trebao potvrditi
toksikološkom analizom drugih uzoraka prije donošenja zaključaka o uzroku smrti.
Ključne riječi: poslijesmrtna toksikologija, uzorci tkiva jetre, amfetamin, GC/MS analiza
27

Abstract
Introduction- The interpretation of post-mortem toxicology data is a crucial factor in the
determination of the cause of death. When interpreting the results it is necessary to take into
consideration several key factors such as the proper selection of the sample, case history and
characteristics of substances that are suspected to be cause of death, methods of analysis and
post-mortem changes. Tissues and organs, especially the liver, in situations where biological
fluids are not available, become an important and often times the only specimens for
toxicological analysis. This is the most important in decayed bodies, because the interval
between death and collection of specimens is longer. In such situations, especially during the
summer months, the degradation of tissue and the appearance of new chemical products may
occur.
Aim- The aim of this study is to determine can the liver sample give a positive result for
amphetamines, although it is proved that the person has not previously consumed
amphetamines, and, if it can, to determine conditions that are responsible for amphetamine
false positive findings in post-mortem liver samples. Determine the minimum number of days
required for the appearance of amphetamine false-positive findings.
Methods- Post-mortem liver samples, which should be toxicologically processed, and the
previous test gave negative amphetamine findings, are divided into five samples with identical
weight and were subjected to the influence of different temperature in different time period.
At various time intervals samples are being analyzed and determent by gas chromatography-
mass spectrometry technique (GC/MS).
Results- Liver samples with amphetamine negative findings, gave positive results after four
days at maximum daily temperature of 32,6 degree Celsius.
Conclusion- Analysis of decomposed liver tissue (without analysis of other samples) can give
false positive amphetamine findings. Amphetamine finding in liver, should never be used
alone to establish the cause of death.
Key word: post-mortem toxicology, liver samples, amphetamine, GC/MS
28

9. Životopis
Osobni podaci
Ime i prezime Tilda Josipović
Datum i mjesto rođenja 7. studenog 1982. Split
Adresa K. Ljudevita Posavskog 15, 21000 Split
Obrazovanje
listopad 2009. -
e-mail tilda.josipovic@gmail.com
Sveučilišni stručni studij za forenzične znanosti
- modul: forenzična kemija i molekularna biologija
2001- 2008. Studij Biologija i ekologija mora na Sveučilišnom studijskom centru za
studije mora Sveučilišta u Splitu.
Završni rad “Fitoplanktonski toksini u priobalnim vodama srednjeg
Jadrana”, mentor: Prof.dr.sc. Maja Pavela Vrančić.
- zvanje: dipl.ing biologije i ekologije mora
1997.- 2001. I. Gimnazija (Klasični smjer), Split
Publikacije
Koautor u CC
znanstvenom radu
Kongresi
Custovic S; Orhanovic S, Nincevic-Gladan Ž, Josipovic T, Pavela-
Vrancic M. Occurence of yessotoxin (YTX) in the costal waters of the
eastern-mid Adriatic sea(Croatia) Fresenius enviro. Bull. 18 (2009) , 8;
1452-1455
7. ISABS konferencija forenzičke, antropološke i medicinske genetike,
Bol 2011.
29