Metody molekulární biologie v rostlinné ekologii a systematice
Metody molekulární biologie v rostlinné ekologii a systematice
Metody molekulární biologie v rostlinné ekologii a systematice
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Protokoly a návody pro praktikum<br />
<strong>Metody</strong> <strong>molekulární</strong> <strong>biologie</strong> v <strong>rostlinné</strong> <strong>ekologii</strong><br />
a <strong>systematice</strong><br />
Laboratoř <strong>molekulární</strong> <strong>biologie</strong> rostlin, PřF JCU, Branišovská 31,<br />
České Budějovice<br />
2008, Miroslava Herbstová, Petr Koutecký & Jiří Košnar
Základní zásady práce v molekulárně biologické laboratoři<br />
• při práci s DNA pracujeme pouze se sterilními autoklávovanými špičkami a zkumavkami<br />
(v krabičkách a kádinkách označených páskou s černými pruhy), kontaminovaný materiál<br />
odhazujeme do určených nádob<br />
• pro PCR, ředění DNA a primerů používáme výhradně sterilní vodu (autoklávovaná Milli-Q<br />
voda nebo koupená voda od f. Top-Bio)<br />
• pro omývání laboratorního nádobí používáme destilovanou vodu se savem<br />
• s roztokem Syber Greenu (nanášecí pufr, LB = loading buffer), který je potencionální<br />
mutagen, a s veškerými věcmi, které s ním přicházejí do styku (elektroforetické vany,<br />
hřebínky, pipeta na nanášení vzorků…), pracujeme v rukavicích, kontaminovanými<br />
rukavicemi se nedotýkáme ničeho jiného, gely vyhazujeme zabalené v papíru do<br />
odpadkového koše k tomu určeného<br />
• akrylamid je neurotoxin, dbáme zvýšené opatrnosti, pracujeme zásadně v rukavicích,<br />
kontaminovaný materiál a gely vyhazujeme do zvláštní nádoby, zásobní roztoky<br />
uchováváme v ledničce (2-8 °C)<br />
• dbáme zvýšené opatrnosti při práci s elektrickým proudem (elektroforéza apod.)<br />
• s těkavými chemikáliemi (chloroform, isoamylalkohol, isopropanol, kyselina octová,<br />
TEMED, kyselina chlorovodíková…) pracujeme zásadně v digestoři se zapnutým odtahem<br />
• s DNA a většinou dalších biochemikálií (enzymy, primery…) pracujeme výhradně na ledu,<br />
zvlášť citlivé jsou enzymy (polymeráza, restrikční enzymy ad.) a některé pufry<br />
• pokud odcházíme z laboratoře poslední (i jen na chvíli), vždy zamkneme
<strong>Metody</strong> analýzy DNA<br />
Obsah<br />
<strong>Metody</strong> izolace DNA.............................................................................................................1<br />
A) Izolace DNA z čerstvého nebo sušeného <strong>rostlinné</strong>ho materiálu s použitím Invisorb Spin<br />
Plant Mini Kit (INVITEK) ............................................................................................1<br />
B) Extrakce DNA ze sušeného <strong>rostlinné</strong>ho materiálu – CTAB metoda...............................3<br />
C) Extrakce DNA pomocí NaOH.......................................................................................4<br />
D) Měření koncentrace DNA a ředění DNA.......................................................................5<br />
E) Otestování kvality DNA na agarosovém gelu ................................................................5<br />
Polymerázová řetězová reakce ........................................................................................... 6<br />
Sekvenování DNA.................................................................................................................9<br />
ISSR, Inter simple sequence repeat ...................................................................................12<br />
Analýza mikrosatelitů ........................................................................................................14<br />
PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism).............................................16<br />
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)........................................................17<br />
A) Protokol s využitím AFLP kitů od firmy Invitrogen ....................................................18<br />
B) Protokol bez využití AFLP kitů...................................................................................20<br />
C) Přesrážení octanem sodným ........................................................................................23<br />
Elektroforéza DNA<br />
Elektroforéza ......................................................................................................................24<br />
Horizontální agarosová elektroforéza...............................................................................24<br />
Vertikální polyakrylamidová elektroforéza na 6,2% kontinuálním gelu............................25<br />
Práce s dokumentačním systémem Gel Imager a softwarem Scion VisiCapture................26<br />
Isozymy<br />
Princip metody.................................................................................................................27<br />
Histochemické barvení.....................................................................................................28<br />
Základy interpretace isozymových patterns .....................................................................29<br />
Extrakce vzorků...............................................................................................................30<br />
Elektroforéza a barvení ....................................................................................................31<br />
Vysušení gelu ..................................................................................................................36<br />
Jednotlivé enzymové systémy ..........................................................................................37<br />
Obsluha přístrojů<br />
Měření koncentrace DNA pomocí spektrofotometru Biowave II ......................................44<br />
Zacházení s gradientovým termocyclerem TC-XP Bioerg ................................................45<br />
Zacházení s termocyclerem Biometra T3000 se třemi bloky.............................................46<br />
Měření na pH-metru Hanna pH 211 .................................................................................47
Návody na roztoky a pufry<br />
1) Elektroforéza a příprava gelů....................................................................................48<br />
2) Izolace, ředění a srážení DNA ..................................................................................49<br />
3) AFLP........................................................................................................................50<br />
4) Isozymy – izolace.....................................................................................................51<br />
5) Isozymy – barvení ....................................................................................................52<br />
6) Isozymy – fixace ......................................................................................................53<br />
7) Ostatní......................................................................................................................53
<strong>Metody</strong> izolace DNA<br />
Izolace DNA<br />
A) Izolace DNA z čerstvého nebo sušeného <strong>rostlinné</strong>ho materiálu s<br />
použitím Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK)<br />
Princip<br />
Metoda využívá unikátní patentované technologie Invisorb ® . Umožňuje rychlou a účinnou<br />
izolaci kvalitní genomické DNA z čerstvého, mraženého nebo suchého <strong>rostlinné</strong>ho materiálu<br />
(např. z listů, kořenů, plodů nebo semen), také z řas a sinic.<br />
Podstatou je interakce mezi negativně nabitými fosfátovými skupinami DNA<br />
a pozitivně nabitými skupinami na povrchu membrány v kolonce, kde se DNA váže<br />
a po přečištění se uvolní vhodným elučním pufrem. Vazba nebo naopak uvolnění DNA<br />
z kolonky závisí na koncentraci solí a pH použitých pufrů.<br />
Postup<br />
Obecné<br />
• Před použitím promývacích pufrů (Wash Buffer I a II) zkontrolujeme přidání ethanolu<br />
(zaškrnutí příslušného políčka na láhvi).<br />
• K času pro centrifugaci přičítáme čas nutný k dosažení požadovaných otáček.<br />
• Odpadní filtráty vzniklé během izolace vyléváme do připravené kádinky.<br />
• Proteinasa K je součástí kitu. Dodává se se v lyofilizovaném stavu. Před prvním použitím<br />
přidáme 1 ml sterilní vody a rozpustíme převracením zkumavky v ruce, krátce stočíme.<br />
• Před vlastní prací odpipetujeme do 1,5 ml eppendorfky potřebné množství elučního pufru<br />
(Ellution buffer D) a předehřejeme v termobloku na 65°C.<br />
Homogenizace<br />
• V tekutém dusíku vymrazíme 1,5 ml eppendorfku s vloženým rostlinným materiálem<br />
(cca 60 mg <strong>rostlinné</strong> tkáně v čerstvém stavu nebo odpovídající množství sušeného<br />
materiálu). Vymrazíme homogenizátorek a krouživými pohyby drtíme vzorek<br />
ve vymražené eppendorfce.<br />
• Jinou možností je drtit vzorek ve vymražené třecí misce. Rozdrcený materiál vymraženým<br />
skalpelem převedeme do připravené eppendorfky.<br />
• K drcení vzorku je možné použít také mořský písek.<br />
• V některých případech je možné drtit přímo čerstvý nebo suchý materiál za pokojové<br />
teploty přímo v lyzačním pufru (Lysis buffer P) bez použití kapalného dusíku.<br />
Lýza<br />
• K rozdrcenému materiálu přidáme 400 µl lyzačního pufru (Lysis buffer P) a 20 µl<br />
proteinázy K (rozštěpení proteinů, inaktivace DNas). Lyzační pufr a proteinasu přidáváme<br />
dříve než vzorek zcela rozmrzne.<br />
• Vortexujeme a necháme 30 min nebo déle inkubovat při 65°C. Během inkubace 2–3×<br />
promícháme.<br />
• Připravíme si kolonky (Spin Filter) do 2,0 ml sběrných zkumavek (Receiver Tube).<br />
1
Filtrace<br />
Izolace DNA<br />
• Lyzační směs přeneseme na kolonku (nejen roztok, ale i rozdrcenou tkáň). Centrifugujeme<br />
1 min při 12 000 rpm (dle potřeby déle). Kolonky vyhodíme.<br />
Odstranění RNA<br />
• Pokud je potřeba pro další analýzy odstranit RNA, přidáme 5–40 µl RNAasy A (firma<br />
Promega; 10mg/ml; není součástí kitu). Množství závisí na typu a výchozí navážce<br />
materiálu.<br />
• Vortexujeme a necháme 5 min inkubovat při pokojové teplotě.<br />
Navázání DNA<br />
• Přidáme 200 µl Binding Buffer P a vortexujeme.<br />
• Umístíme nové kolonky do 2,0 ml sběrných zkumavek. Suspenzi přeneseme na kolonku<br />
a inkubujeme 1 min.<br />
• Centrifugujeme 1 min při 12 000 rpm.<br />
Promytí I<br />
• Odstraníme filtrát a kolonky umístíme zpět do 2,0 ml sběrných zkumavek.<br />
• Přidáme 550 µl promývacího pufru I (Wash Buffer I) a centrifugujeme 1 min při 12 000 rpm.<br />
• Odstraníme filtrát a kolonku umístíme zpět do 2,0 ml sběrné zkumavky.<br />
Promytí II<br />
• Přidáme 550 µl promývacího pufru II (Wash Buffer II) a centrifugujeme 1 min při<br />
12 000 rpm.<br />
• Odstraníme filtrát a kolonku umístíme zpět do 2,0 ml sběrné zkumavky.<br />
• Tento krok opakujeme ještě jednou.<br />
Vysušení<br />
• Pro odstranění zbytků ethanolu z promývacího pufru centrifugujeme 2 min při 12 000 rpm.<br />
Eluce<br />
• Kolonky umístíme do sterilních 1,5 ml eppendorfek (nejsou součástí kitu). Pokud<br />
předpokládáme delší skladování DNA, použijeme tzv. safe-lock eppendorfky.<br />
• Přidáme 50–100 µl elučního pufru (Elution Buffer D) předehřátého na 65°C. Inkubujeme<br />
10–25 min při pokojové teplotě v uzavřené digestoři bez odtahu.<br />
• Centrifugujeme 1 min při 10 000 rpm.<br />
Pozn.: Při centrifugaci nelze zavřít víčka. Při vkládání eppendorfek do centrifugy směrujeme otevřená víčka<br />
ve směru otáčení rotoru, abychom zabránili ulámání víček během centrifugace.<br />
• Pro získání maximálního výtěžku DNA je možné eluovat nejprve 50 µl elučního pufru a<br />
v druhém kroku dalšími 50 µl elučního pufru. Pokud nám nejde o celkový výtěžek DNA,<br />
ale o co nejvyšší koncentraci DNA, pak k eluci v druhém kroku použijeme první eluát<br />
(tj. roztok DNA pipetujeme znovu na kolonku). Inkubujeme 5 - 10 min a centrifugujeme.<br />
2
Izolace DNA<br />
B) Extrakce DNA ze sušeného <strong>rostlinné</strong>ho materiálu – CTAB<br />
metoda<br />
Princip<br />
Metoda je založena na schopnosti CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) vytvářet komplex s<br />
nukleovými kyselinami, který je při vysoké koncentraci solí rozpustný (0,7M NaCl), ale při<br />
snížené koncentraci solí (0,45M NaCl) vytváří sraženinu. CTAB zároveň působí jako<br />
detergent, který uvolňuje DNA z membrán a proteinů. Na základě rozdílné rozpustnosti<br />
CTAB v porovnání s DNA je lze oddělit a získat dostatečně čistou rostlinnou DNA.<br />
Tuto metodu lze použít k izolaci většího množství DNA.<br />
Postup<br />
Homogenizace<br />
• Viz extrakce DNA kitem Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK).<br />
Vlastní extrakce DNA<br />
• K rozdrcenému materiálu přidáme 700 µl roztoku CTAB a 10 µl 2-merkaptoethanolu.<br />
Pracujeme v digestoři.<br />
• Zkumavky uzavřeme, krátce promícháme na vortexu a inkubujeme 30 min v termobloku<br />
při 60 °C.<br />
• Během prvních minut inkubace přidáme ke každému vzorku „na špičku špachtle“<br />
polyvinylpyrolidonu (PVP).<br />
• Po inkubaci přidáme 500 µl směsi chloroform: isoamylalkohol (24:1). Pracujeme v<br />
digestoři<br />
• Dobře uzavřené zkumavky 2–3× převrátíme a necháme cca 5 min stát.<br />
• Centrifugujeme 10 min při 13 800 rpm.<br />
• Supernatant (cca 500 µl) opatrně přepipetujeme do nových označených 1,5 ml<br />
eppendorfek. Je třeba dát pozor, abychom pipetovali jen průhledný supernatant. Pracujeme<br />
stále v digestoři a použité špičky a eppendorfky vyhazujeme do zvláštní nádoby na<br />
nebezpečný odpad.<br />
• Přidáme 500 µl vychlazeného isopropanolu (z mrazáku).<br />
• 1–2 × převrátíme (netřepeme) a necháme cca 30 min stát v –20 °C.<br />
• Centrifugujeme 5 min při 13 800 rpm.<br />
• Supernatant opatrně slijeme do kádinky (v digestoři), na dně eppendorfky lze vidět drobný<br />
matně bílý pelet DNA. Otevřené eppendorfky převrátíme dnem nahoru na filtrační papír<br />
(buničinu) pro odstranění zbytku kapaliny.<br />
• Přidáme 400 µl vychlazeného 96% ethanolu (z mrazáku).<br />
• Inkubujeme 15 min v termobloku při 37 °C.<br />
• Centrifugujeme 5 min při 13 800 rpm.<br />
• Supernatant opět opatrně slijeme do kádinky (už není nutné v digestoři).<br />
• Přidáme 200 µl vychlazeného 70% ethanolu (z mrazáku) a necháme cca 5 min stát.<br />
• Centrifugujeme 5 min při 13 800 rpm.<br />
• Supernatant opět opatrně slijeme do kádinky a eppendorfky necháme cca 10 - 15 min stát a<br />
vyschnout.<br />
3
Izolace DNA<br />
• Přibližně 1–2 min vysušíme pelet v otevřených eppendorfkách na termobloku při 37 °C.<br />
Sušení ukončíme ve chvíli, kdy lze pelet poklepem (cvrnknutím) v uzavřené eppendorfce<br />
oddělit od stěny.<br />
• Vysušený pelet rozpustíme ve 200 µl TE pufru nebo sterilní vody.<br />
• Uzavřené eppendorfky inkubujeme 30 min na termobloku při 37 °C pro úplné rozpuštění.<br />
• Krátce promícháme na vortexu a krátce stočíme na stolní centrifuze.<br />
• DNA uchováváme v ledničce nebo dlouhodobě při –20°C (–80°C).<br />
C) Extrakce DNA pomocí NaOH<br />
Extrakce DNA pomocí NaOH je velmi levnou a rychlou metodou přípravy DNA. Hojně se<br />
používaná pro extrakci DNA z mechů.<br />
Princip<br />
Hydroxid sodný naruší buněčné stěny, DNA se uvolní do roztoku a stává se denaturovanou,<br />
řetězce jsou separované.<br />
Postup<br />
Obecné<br />
• Takto získanou DNA obvykle není možné dlouhodobě skladovat (degraduje). Lze ji použít<br />
pro běžné metody založené na PCR. Pro některé aplikace náročné na kvalitu DNA (např.<br />
AFLP) ji použít nelze.<br />
Izolace<br />
• Část nebo celou rostlinku mechu vložíme do eppendorfky, uzavřeme a vymrazíme v<br />
tekutém dusíku. Vymrazíme homogenizátorek a krouživými pohyby drtíme vzorek na<br />
jemný prášek.<br />
• K rozdrcenému materiálu přidáme 5 µl 0,5M NaOH a drtíme vzorek v roztoku.<br />
• Přidáme dalších 15 µl 0,5M NaOH a pokračujeme v drcení další 1−2 min.<br />
• Centrifugujeme 2 min 13 800 rpm.<br />
• Supernatant přepipetujeme do nové eppendorfky a ředíme 1:10 roztokem 100mM Tris-<br />
HCl, pH 8,3. Podle potřeby dál ředíme roztokem 100mM Tris-HCl pufru.<br />
• Skladujeme v mrazáku při –20°C max. 1 měsíc.<br />
4
D) Měření koncentrace DNA a ředění DNA<br />
Měření koncentrace DNA<br />
• koncentraci DNA měříme pomocí spektrofotometru Biowave II (Biochrom)<br />
• ředění vypočteme např. podle vzorečku:<br />
C puv Vpož<br />
= zř =<br />
C V<br />
pož<br />
pip<br />
Izolace DNA<br />
• zaznamenáme:<br />
- koncentraci DNA v ng/µl<br />
- poměr A260/A280 – udává znečištění proteiny, u čisté DNA je 1,8 až 2,0<br />
- poměr A260/A230 – pokud je méně než 1,8, značí to přítomnost organických<br />
kontaminant – (poly)fenoly, thiokyanáty, sacharidy, močovina apod.; u čisté DNA se<br />
Ředění DNA<br />
pohybuje v rozmezí 1,8−2,0(–2,2)<br />
Cpův ............... koncentrace původní (originálního vzorku)<br />
Cpož ............... koncentrace požadovaná (na kterou chci ředit)<br />
Vpož ............... objem požadovaný<br />
Vpip ............... objem pipetovaný (vzorku)<br />
zř .................. zředění<br />
• Např. chceme 100 µl DNA o koncentraci 30 ng a máme k dispozici DNA o koncentraci<br />
215 ng/µl.<br />
215 100<br />
= 7,<br />
17 = ⇒ V pip<br />
30 V<br />
pip<br />
Smícháme tedy 13,95 µl koncentrované DNA (našeho původního originálního vzorku) a<br />
86.05 µl sterilní Milli-Q vody, tj. Vpož – Vpip (100 µl – 13,95 µl).<br />
E) Otestování kvality DNA na agarosovém gelu<br />
• připravíme 0,8 % agarosový gel<br />
100<br />
7,<br />
17<br />
= 13,<br />
95<br />
• cca 5 µl nenaředěné DNA smícháme se 2 µl nanášecího pufru LB (loading buffer) a<br />
naneseme na gel<br />
• jako žebříček naneseme 6 µl Lambda/HindIII firmy NEB<br />
=<br />
5
Polymerázová řetězová reakce<br />
PCR (Polymerase Chain Reaction)<br />
PCR<br />
Princip<br />
Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1983 Kary Mullisem (Nobelova cena<br />
za chemii). Jde o jednoduchou metodu zmnožení (amplifikace) určité části DNA in vitro.<br />
Základní uspořádání PCR vyžaduje vytvoření směsi reagencií a následné cyklické střídání<br />
teplot této směsi.<br />
Složky PCR (PCR mix)<br />
• templátová DNA – naše studovaná DNA nebo její část, kterou chceme namnožit (gen,<br />
část genu nebo nekódující sekvence)<br />
• DNA polymeráza – enzym, který buduje nový řetězec DNA podle vzoru templátu<br />
• PCR pufr – udržuje stabilní pH a obsahuje chemikálie pro optimální aktivitu a stabilitu<br />
DNA polymerázy<br />
• MgCl2 – Mg 2+ ionty slouží jako kofaktor DNA polymerázy<br />
• nukleotidy (dNTP) – směs deoxynukleosid trifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),<br />
základních stavebních jednotek DNA<br />
• primery – oligonukleotidy (krátké úseky jednořetězcové DNA), zpravidla o délce 10–25<br />
bazí párující se s komplementární sekvencí v templátové DNA a sloužící jako počáteční<br />
místo replikace DNA, bez kterého by DNA polymeráza nemohla začít syntézu nového<br />
řetězce; k extenzi primeru dochází ve směru 5'→3' nově vznikajícího vlákna.<br />
PCR teplotní program<br />
Cyklické střídání teplot umožňuje přístroj zvaný termocykler.<br />
• Na počátek cyklu se zařazuje počáteční denaturace (94–98°C, 1−10 min); následuje<br />
• vlastní cyklus:<br />
- denaturace (94−98 °C, 20 s–1 min): dvoušroubovice DNA se rozplétá na dva řetězce<br />
Pozn.: Pro GC bohaté DNA templáty může být denaturace prodloužena na 3-4 min.<br />
- nasednutí primerů (annealing) (45−60°C, cca 20−45 s): primery se specificky párují<br />
s komplementární oblastí na templátové DNA<br />
Teplota nasedání primerů by měla být o 5°C nižší než teplota tání (denaturace),<br />
tzv. melting temperature (Tm) primerů. Pro primery kratší než 25 bp se Tm vypočítá<br />
podle rovnice: Tm = 4(G+C) + 2(A+T)<br />
- syntéza DNA (elongace, extenze) (většinou 72 °C, 1 min) – optimální teplota<br />
pro činnost DNA polymerázy; na tvorbu 1 000 bazí je potřeba 1 min<br />
• Finálním krokem je :<br />
- konečná elongace (72°C, 5−15 min): dokončení syntézy částečných produktů<br />
- zchlazení PCR reakce (4−15°C)<br />
Střídáním tří teplot dochází k exponenciálnímu množení požadovaného úseku DNA<br />
vymezeného dvojicí použitých primerů. Počet cyklů u běžné PCR se pohybuje od 25 do 40.<br />
Výsledkem PCR je pak 2 25 -2 40 kopií příslušného úseku DNA z každé molekuly templátové<br />
DNA. DNA lze vizualizovat po inkorporaci UV fluorescenčního barviva (např. Syber Green,<br />
ethidiumbromid ) do dvoušroubovice DNA pod UV světlem.<br />
6
Optimalizace PCR<br />
PCR<br />
Cílem optimalizace je specifický průběh PCR reakce, tj. aby vznikal pouze jediný produkt<br />
odpovídající amplifikovanému úseku. Výsledek PCR reakce proto ověřujeme na gelu. V<br />
případě, že produkt PCR reakce není zřetelný nebo je výsledkem více produktů odlišné délky<br />
(nespecifické produkty), reakce neproběhla optimálně. Je nutné změnit reakční podmínky tak,<br />
aby PCR proběhla úspěšně. Je několik možností:<br />
• změna koncentrace DNA – snížením koncentrace DNA snížíme i koncentraci případných<br />
inhibitorů PCR, které mohou být přítomny ve vzorku, PCR může úspěšně proběhnout i<br />
s množstvím DNA menším než 1 ng; někdy naopak pomůže zvýšit koncentraci DNA<br />
až na 50 ng<br />
• změna teploty nasednutí primeru (annealingu) – snížením umožníme lepší vazbu primerů<br />
na templátovou DNA, přílišné snížení však může vést k tvorbě nespecifických produktů.<br />
Ideální je provést gradientový pokus a následně vybrat nejvhodnější teplotu.<br />
• zvýšení koncentrace MgCl2 – hořčík stabilizuje komplex DNA–polymeráza, zvýšení<br />
koncentrace na 2.5 – 6.0 mM (standardní koncentrace je 1.5-2.0 mM) může přinést úspěch.<br />
• přidání aditiv – některé látky (DMSO, formamid, betaine, glycerol, BSA, (NH4)2SO4)<br />
mohou zvyšovat stabilitu polymerázy, specifičnost vazby primerů.<br />
• modifikace cyklu – prodloužení (zkrácení) doby elongace, zvýšení počtu cyklů, apod.<br />
• touch-down protokol – do teplotního programu se na počátek amplifikace zařadí 3–5 cyklů<br />
s vyšší teplotou nasedání primerů. V prvních cyklech vzniká určité minimum jen<br />
specifických produktů, tím se redukuje nespecifické nasedání primeru a snižuje se tvorba<br />
nespecifických produktů. V dalších cyklech se použije nižší teplota, která zajistí dostatečný<br />
výtěžek.<br />
• úprava tzv. ramping time (rychlosti přechodu z jedné teploty na druhou) – např. AFLP<br />
vyžaduje pomalé ohřívání vzorku (při rychlém zahřívání část primerů odpadne), pro<br />
dostatečný výtěžek je nutné snížit ramping time na 1°C/s (standardně bývá 3°C/s).<br />
PCR protokol s využitím Plain PP Master Mixu (Top-Bio)<br />
Plain PP Master Mix již obsahuje PCR pufr, hořčík, nukleotidy a DNA polymerázu. Jeho<br />
použitím se výrazně snižuje čas nutný pro přípravu PCR reakce. Snížením počtu pipetovacích<br />
kroků je eliminována chybovost při přípravě.<br />
Postup<br />
• Po celou dobu pracujeme na ledu. Všechny potřebné reagencie necháme rozmrznout.<br />
Mezitím si označíme PCR zkumavky nebo stripy.<br />
• Do 1.5 ml eppendorfky připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků + 1 vzorek<br />
(rezerva pro pipetovací chybu). Např. máme 10 vzorků, PCR směs připravíme pro 11<br />
vzorků.<br />
• Jednotlivé složky pipetujeme v pořadí: voda, primery a Plain PP Master Mix. Promícháme<br />
na vortexu a krátce stočíme na stolní centrifuze.<br />
7
• Příprava PCR směsi pro jeden vzorek:<br />
reagencie objem (µl) výsledná koncentrace<br />
sterilní Milli-Q voda 9,5 -<br />
2 × Plain PP Master Mix 12,5 1 ×<br />
5' primer 1 0,1-1µM<br />
3' primer 1 0,1-1µM<br />
PCR<br />
Plain PP Master Mix ve finální koncentraci obsahuje 75mM Tris/HCl, pH 8,8; 20mM (NH4)2SO4;<br />
0,01% Tween20; 2,5mM MgCl2; 200µM dATP, 200µM dCTP, 200µM dTTP, 200µM dGTP; 1,25 U<br />
Taq DNA polymerázy.<br />
• Příslušný objem PCR směsi (v tomto případě 24 µl) rozpipetujeme do jednotlivých 0,2 ml<br />
PCR zkumavek a přidáme 1 µl DNA. Promícháme, krátce stočíme v centrifuze.<br />
• Zkumavky vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem.<br />
• Po proběhnuté reakci smísíme cca 5 µl DNA s 2 µl LB pufru a otestujeme amplifikovaný<br />
produkt nanesením směsi na 1,5% agarosový gel v TBE pufru. Jako standard naneseme<br />
6 µl 100bp ladderu firmy NEB.<br />
8
Sekvenování DNA<br />
Sekvenování<br />
Princip<br />
Sekvenováním zjistíme pořadí bazí (A,C,T,G) v konkrétním úseku DNA. Postup můžeme<br />
rozdělit do několika kroků:<br />
1. PCR. Pomocí dvojice primerů amplifikujeme vybraný úsek DNA. Primery jsou specifické<br />
pro jedno konkrétní místo v jaderné nebo chloroplastové DNA. V jaderné (nukleární DNA,<br />
nDNA) se nejjednodušeji a nejčastěji sekvenují oblasti tzv. internal transcribed spaceru (ITS),<br />
které jsou přítomny až v desítkách tisíc kopií. Úseky chloroplastového genomu se také velmi<br />
jednoduše amplifikují, protože kruhových molekul cpDNA je v izolátu zpravidla velké<br />
množství. Často se sekvenují nekódující úseky (introny nebo spacery) jako např. trnL-trnF,<br />
psbA-trnH atd.<br />
2. Přečištění (purifikace) PCR produktu. Zbylé primery a neinkorporované nukleotidy<br />
(dNTP) odstraníme pomocí komerčního kitu. To je velmi důležité, protože při následné<br />
sekvenační reakci je použit pouze jeden primer a také koncentrace dNTP musí být<br />
vybalancována vzhledem k ostatním složkám, především fluorescenčně značeným<br />
nukleotidům (ddNTP).<br />
3. Cyklické sekvenování (cycle sequencing). Modifikovaná PCR reakce, při které použijeme<br />
pouze jeden sekvenační primer a PCR produkt jako templát. Nedochází tedy k exponenciální,<br />
ale pouze k lineární amplifikaci templátu. Kromě klasických dNTP jsou v sekvenační směsi<br />
přítomny i ddNTP (2´,3´-dideoxynukleotidtrisfosfáty). Ty jsou fluorescenčně značeny (každá<br />
baze jinou barvou) a při inkorporaci do vznikajícího řetězce DNA zamezí jeho dalšímu<br />
prodlužování. Výsledkem sekvenační reakce je tak směs různě dlouhých řetězců DNA<br />
a každý je fluorescenčně označen barvou podle toho, kterou bazí končí. Tyto produkty jsou<br />
pak elektroforeticky rozděleny na automatickém sekvenátoru a je možno přečíst posloupnost<br />
jednotlivých bazí. Sekvenuje se vždy jen s jedním primerem. Sekvenátor umožní číst cca 700<br />
bazí, záleží na kvalitě PCR produktu a na sekvenci bazí. Pokud chceme sekvenovat delší úsek<br />
než cca 700 bazí, je třeba provést dvě sekvenační reakce s různými primery, s tzv. forward<br />
a reverse primerem. PCR produkt bude osekvenován z obou stran. Získané sekvence se potom<br />
spojí dohromady pomocí speciálního programu.<br />
4. Purifikace produktů sekvenační reakce. Před analýzou na automatickém sekvenátoru je<br />
třeba produkty cyklického sekvenování přečistit, např. na Sephadexu.<br />
5. Sekvenační analýza na automatickém sekvenátoru. V kapilárním sekvenátoru ABI<br />
PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems jsou produkty cyklického sekvenování<br />
elektroforeticky rozděleny podle délky.<br />
9
Protokol na PCR amplifikaci<br />
Viz obecný protokol k PCR.<br />
Sekvenování<br />
Přečištění PCR produktu pomocí JETquick kitu (GENOMED)<br />
PCR produkt přečistíme pomocí kitu GENOMED Jetquick PCR Purification Spin Kit, který<br />
využívá tzv. „spin column technique“, tj. kolonky s membránou, na kterou se váže DNA.<br />
Alternativou je QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit, případně můžeme přečistit<br />
fragment vyřízlý z gelu pomocí QIAquick Gel Extraction Kit.<br />
Obecné<br />
• Před započetím práce zkontrolujeme přidání ethanolu do pufru H2 (zaškrtnutí políčka<br />
na lahvičce).<br />
• Do 1,5 ml eppendorfky odpipetujeme potřebný objem elučního pufru a předehřejeme<br />
na 60–70°C. v termobloku. Předehřátí pufru je důležité v případě eluce PCR produktu<br />
delšího než 5 kb.<br />
Postup<br />
• Ke zbylým 20 µl PCR produktu přidáme 80 µl roztoku H1 a důkladně promícháme<br />
na vortexu.<br />
Pozn.:V případě jiného objemu PCR reakce přepočteme množství H1 roztoku, aby zůstal poměr zachován.<br />
• Vložíme kolonku do označené 2 ml eppendorfky bez víčka (z kitu), přepipetujeme do ní<br />
směs z předchozího bodu.<br />
• Centrifugujeme 1 minutu při 13 000 rpm.<br />
• Odstraníme filtrát (to, co proteklo kolonkou), DNA zůstala vázána na membráně.<br />
• Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a přidáme 500 µl roztoku H2.<br />
• Centrifugujeme 1 minutu při 13 000 rpm.<br />
• Opět odstraníme filtrát (DNA vázaná na membráně je promyta).<br />
• Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a centrifugujeme 1 minutu při maximálních<br />
otáčkách (13 800 rpm), abychom důkladně odstranili roztok H2 z kolonky.<br />
• Vložíme kolonku do nové (a označené!) 1,5 ml eppendorfky (není součástí kitu) a přímo<br />
těsně nad střed membrány pipetujeme 30–75 µl TE pufru (příp. sterilní vody) předehřátého<br />
na 60–70°C.<br />
• 5 min inkubujeme na stole.<br />
• Centrifugujeme 2 min při 13 000 rpm (DNA je eluována).<br />
• DNA dále skladujeme při –20 °C .<br />
Příprava vzorků pro sekvenování DNA<br />
• Pro optimální průběh sekvenační reakce je potřeba zvolit správný poměr koncentrace<br />
primeru ku PCR produktu.<br />
• Změříme koncentraci DNA pomocí spektrofotometru Biowave II.<br />
• Pracujeme na ledu a v Biohazard boxu.<br />
• Do 0,2 ml eppendorfek určených pro sekvenaci pipetujeme přečištěnou DNA v množství<br />
dle délky PCR produktu (viz tabulka), 3–5 pmol primeru a sterilní vodu do celkového<br />
objemu 15 µl.<br />
10
Templát<br />
Množství<br />
Kit 3.1 Kit 1.1<br />
PCR produkty<br />
100–200 bp 1–3 ng 1–3 ng<br />
200–500 bp 3–10 ng 3–10 ng<br />
500–1000 bp 5–20 ng 5–20 ng<br />
1000–2000 bp 10–40 ng 10–40 ng<br />
>2000 bp 20–50 ng 40–100 ng<br />
ssDNA 25–50 ng 50–100 ng<br />
dsDNA 150–300 ng 200–500 ng<br />
Sekvenování<br />
• Množství templátové DNA závisí na naměřené koncentraci (pro každý vzorek podle<br />
koncentrace PCR produktu spočítáme kolik µl je potřeba, aby v reakci bylo přítomno<br />
např. 20 ng DNA a podle toho upravíme množství vody pro příslušný vzorek).<br />
• Poklepem na eppendorfku prsty promícháme a krátce stočíme na stolní centrifuze a<br />
odneseme do sekvenčního centra v přízemí UMBR AV ČR, kde provedou cyklické<br />
sekvenování, přečištění sekvenční reakce a také sekvenční analýzu v 16 –ti kapilárním<br />
sekvenátoru.<br />
• Sekvenční centrum používá 2 sekvenační kity. Standardně používáme k sekvenaci 3.1<br />
Cycle Sequencing Kit. 1.1 Cycle Sequencing Kit je lepší použít pokud je pro nás důležitý<br />
počátek sekvence studovaného úseku.<br />
11
ISSR, Inter simple sequence repeat<br />
ISSR<br />
Princip<br />
Jedná se o metodu založenou na PCR, která využívá mikrosatelitové sekvence jako primery<br />
(16-25 bp). Mikrosatelity (SSR) jsou jednoduché krátké opakující se sekvence několika<br />
nukleotidů (1−4 báze), tzv. repetice. Tyto repetitivní jednotky se vyskytují často, náhodně,<br />
v celém genomu u všech eukaryot a liší se počtem opakování. Během PCR dochází<br />
k amplifikaci úseků DNA mezi dvěmi stejnými mikrosatelitovými repetitivními sekvencemi,<br />
které jsou umístěny v řetězci DNA v opačném směru. Výsledkem jsou různě dlouhé úseky<br />
DNA mezi mikrosatelity.<br />
Technické provedení této metody je podobné jako u RAPD analýzy (RAPD – random<br />
amplified polymorphic DNA; metody sledující délku fragmentů DNA amplifikovaných<br />
pomocí určitého krátkého náhodně zvoleného primeru), kdy jsou využity tzv. arbitrární<br />
primery. Jde tedy o metodu univerzální, nevyžadující žádné znalosti o genomu zkoumaného<br />
organismu. ISSR nachází využití při studiu genetické diverzity, fylogeneze, mapování<br />
genomu a v evoluční biologii.<br />
ISSR primery nesou sekvenční motiv komplementární k sekvenci mikrosatelitů.<br />
Na jejich konci bývá často připojena „kotva“, tzv. anchor motiv. Nejčastěji 1−3 báze odlišné<br />
od repetitivní mikrosatelitní sekvence, které při PCR amplifikaci zajistí specifické nasednutí<br />
na konec komplementárního templátového mikrosatelitního motivu.<br />
Vlastní postup zahrnuje běžnou PCR za využití obvykle jednoho primeru. Méně často<br />
se používá kombinace dvou ISSR primerů. Produkty PCR amplifikace jsou vizualizovány<br />
na běžném agarózovém gelu. Výsledná sada vzniklých fragmentů odráží variabilitu<br />
v distribuci a délce mikrosatelitů v genomu. Analýzu každého vzorku je nutné provést ve<br />
dvou nezávislých PCR a do statistického hodnocení zahrnout pouze „proužky“, které se<br />
objeví v obou těchto nezávislých opakováních.<br />
12
Postup<br />
PCR amplifikace<br />
ISSR<br />
• Připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků + 1 rezerva jako negativní kontrola.<br />
Pracujeme stále na ledu. Pro 1 reakci o objemu 20 µl je složení následující:<br />
PCR voda ................................... 3,8 µl<br />
primer (koncentrace 2,5 pM) ....... 4,8 µl<br />
PCR enhancer ............................. 0,4 µl<br />
Plain PP Master Mix.................... 10 µl<br />
• Promícháme, krátce centrifugujeme a pipetujeme po 19 µl do PCR stripů. Přidáme po 1 µl<br />
DNA vzorku. Promícháme poklepnutím prstem na strip a krátce centrifugujeme na stolní<br />
centrifuze.<br />
• Vložíme do termocykleru a spustíme odpovídající teplotní program s použitím<br />
tzv. touchdown protokolu.<br />
Vizualizace na agarosovém gelu<br />
• Připravíme 1,8 % agarózový gel.<br />
• Po skončení programu stripy vyndáme z cykleru a krátce centrifugujeme.<br />
• Smícháme 1 µl LB s 3 µl PCR produktu, promícháme a naneseme na gel.<br />
• Jako žebříček použijeme 4 µl 100 bp Ladderu (před a za vzorky).<br />
• Napětí nastavíme na 40 V, po vyjetí vzorků z jamek zvýšíme na 80 V, elektroforézu<br />
necháme běžet cca 4 h.<br />
• Pořizujeme dvě fotky gelu, první na obvyklou expozici a druhou přeexponovanou<br />
(vyniknou i slabší, tj. méně amplifikované produkty).<br />
13
Analýza mikrosatelitů<br />
Mikrosatelity<br />
Princip<br />
Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats – krátká<br />
tandemová opakování) nebo SSR (simple sequence repeats), jsou krátké segmenty DNA, ve<br />
kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí. Nejčastěji jsou<br />
tvořeny opakováním mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidů, např. (A)n, (AT)n, (ATA)n apod.<br />
Počet opakování jednotky (repetice) v konkrétním místě DNA (lokusu) definuje alelu. Každý<br />
jedinec má v jaderné DNA dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce, druhý<br />
po otci. U diploidních jedinců tak můžeme odhalit dvě alely, u tetraploidních až čtyři atd.<br />
Délku alel(y) zjistíme PCR amplifikací daného lokusu pomocí primerů přiléhajících k<br />
mikrosatelitní sekvenci. Pro analýzu mikrosatelitů tedy potřebujeme znát okolní sekvence.<br />
PCR fragmenty pak rozdělíme podle délky v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační<br />
analýzou. Ke každému vzorku se přidá fluorescenčně značený standard (500-LIZ), obsahující<br />
fragmenty DNA o známé délce, aby bylo později možné identifikovat délku každého<br />
fragmentu (alely) a jednoznačně ji srovnávat s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu.<br />
Mikrosatelity jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů díky<br />
jejich hojnému výskytu v celém genomu, extrémní variabilitě (polymorfismu) a kodominantní<br />
dědičnosti (umožňuje rozlišit heterozygoty). V populační biologii nacházejí využití při<br />
identifikaci příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů.<br />
Jaderné mikrosatelity jsou často velmi druhově specifické, musíme tedy pracovat s<br />
druhem, pro nějž jsou primery již publikované. Používají se na vnitrodruhové úrovni.<br />
Chloroplastové mikrosatelity se naopak vyskytují v místech mezi konzervovanými<br />
sekvencemi. Na základě tzv. konsenzuálních primerů můžeme určité lokusy amplifikovat pro<br />
druhy z mnoha různých čeledí. Jsou tedy využitelné pro hodnocení variability mezi druhy.<br />
Postup<br />
1) PCR<br />
Pro amplifikaci konkrétního úseku DNA, který obsahuje repetitivní mikrosatelitovou sekvenci<br />
použijeme dva specifické primery, jeden z primerů je fluorescenčně značený (používáme<br />
barvy 6-FAM, VIC, NED a PET).<br />
Pokud je třeba analyzovat více mikrosatelitových lokusů (často se analyzuje 8−10), je<br />
výhodné pokusit se sestavit tzv. multiplex PCR. Je to v podstatě běžná PCR reakce, do které<br />
přidáme více primerových páru najednou a amplifikujeme tak více lokusů (až třeba pět) v<br />
jedné PCR reakci. Můžeme tak výrazně snížit finanční i časové náklady na analýzu. Pro<br />
úspěšnou a dostatečnou amplifikaci všech lokusů musíme zaručit, aby (1) primery měly<br />
přibližně stejnou teplotu annealingu, (2) primery v jedné PCR reakci nevytvářely dimery, (3)<br />
lokusy s překrývajícím se rozsahem předpokládaných délek fragmentů byly označeny jinou<br />
fluorescenční barvou.<br />
14
Mikrosatelity<br />
• Do 1.5 ml eppendorfky napipetujeme směs pro příslušný počet vzorků + 1. Pracujeme stále<br />
na ledu.<br />
sterilní Milli-Q voda ........................ 5,7 µl<br />
2 × Plain PP Master Mix (Top-Bio).. 7,5 µl<br />
• forward primer (10 pmol/µl) .......... 0,4 µl<br />
• reverse primer (10 pmol/µl) ........... 0,4 µl<br />
• Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a po 14 µl pipetujeme do PCR<br />
zkumavek (případně stripů).<br />
• Přidáme 1 µl naředěné DNA (5 ng/µl), promícháme na vortexu a vložíme do termocykleru<br />
s příslušným teplotním programem.<br />
• Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost amplifikace na 1% agarosovém gelu v TBE<br />
pufru.<br />
Příprava pro fragmentační analýzu<br />
• Připravíme směs osahující 0,25 µl velikostního standardu (Size standard, 500-LIZ), 0,5 µl<br />
od každého PCR produktu a doplníme deionizovaným formamidem (tzv. Hi-Di formamid<br />
= high deionized) na výsledný objem 10 µl.<br />
• Postupujeme tak, že si nejprve připravíme směs formamidu a velikostního standardu pro<br />
příslušný počet vzorků +1.<br />
• Promícháme, krátce stočíme, a rozpipetujeme do označených 0,5 ml eppendorfek.<br />
• Přidáme PCR produkt(y).<br />
• Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a odneseme do sekvenačního centra.<br />
15
PCR-RFLP<br />
PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)<br />
Princip<br />
Metoda využívá tzv. restrikčních endonukleas, které specificky štěpí řetězec DNA. Např.<br />
enzym EcoRI rozštěpí DNA vždy, pokud nalezne sekvenci 3´-GAATTC-5´. Vlastní postup se<br />
skládá z PCR amplifikace určitého úseku DNA a jeho štěpení vybranou restriktasou.<br />
Restrikční fragmenty dělíme elektroforeticky podle velikosti. Pokud PCR produkt obsahuje<br />
právě jedno štěpné místo, získáme dva kratší fragmenty nebo více fragmentů, pokud je<br />
štěpných míst více. Restrikční místa mohou mutacemi zanikat i vznikat. Hledáme<br />
polymorfismus ve štěpných místech a ten pak interpretujeme jako genetickou podobnost<br />
studovaných organismů.<br />
Postup<br />
1) PCR amplifikace<br />
• Viz obecný protokol pro PCR.<br />
• Výsledek PCR ověřujeme standardním způsobem. Pro PCR-RFLP je důležité, aby byl na<br />
gelu pouze jeden specifický pruh.<br />
2) Restrikce<br />
Každá restriktáza má svůj specifický restrikční pufr, ve kterém vykazuje maximální aktivitu.<br />
Restrikční pufry jsou dodávány s příslušným enzymem, např. od firmy Fermentas, Takara<br />
nebo NEB (plakát na zdi vedle mrazáku) a zajišťují stálé optimální pH během restrikce.<br />
Stálou optimální teplotu pro restrikční reakci pak zajistíme v termostatu nebo termocykleru.<br />
• Pracujeme stále na ledu.<br />
• Do sterilní 1,5 ml eppendorfky připravíme restrikční směs pro příslušný počet vzorků + 1.<br />
sterilní Mili-Q voda.................................. 9,4 µl<br />
restrikční pufr (koncentrace 10×).............. 2 µl (1,22×)<br />
restrikční enzym (10 U/µl)........................ 1 µl<br />
• Promícháme, krátce stočíme na stolní centrifuze a rozpipetujeme do jednotlivých 0,2ml<br />
PCR zkumavek po 12,4 µl. Přidáme 4 µl amplifikačního produktu, promísíme, stočíme a<br />
zkumavky vložíme na 4−5 h nebo přes noc do termocykleru nastaveného na teplotu 37 °C.<br />
• Po skončení restrikce přidáme 3 µl nanášecího pufru LB (barvička zastaví restrikční<br />
reakci) a naneseme na 1,7% agarosový gel v TBE pufru spolu se 6 µl 100 bp žebříčku. Pro<br />
větší rozlišení lze použít vertikální polyakrylamidový gel.<br />
16
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)<br />
AFLP<br />
Princip<br />
Jde o restrikční metodu, která umožňuje analýzu polymorfismu v celkové genomové DNA<br />
a nevyžaduje znalosti o struktuře geonomu (specifické primery apod.). DNA je štěpena dvěma<br />
různými restrikčními enzymy a z velkého množství vzniklých fragmentů je pomocí dvou<br />
následných PCR selektována část fragmentů. (desítky až stovky). Sleduje se přítomnost nebo<br />
nepřítomnost fragmentu určité délky.<br />
Prvním krokem AFLP metody je restrikce. Pro štěpení DNA se používají restriktasy MseI a<br />
EcoRI, které štěpí DNA řetězec tzv. s přesahem, tj. na koncích fragmentů vznikají<br />
jenovláknové přesahy několika bazí. Na tyto volné konce se komplementárně vážou<br />
tzv. adaptory, krátké syntetické úseky dvouřetězcové DNA o známé sekvenci. Spojení<br />
adaptorů s konci restrikčních fragmentů zajišťuje enzym T4 DNA ligasa. Následuje<br />
tzv. preselektivní amplifikace, kdy PCR reakce probíhá s dvojicí primerů, které mají sekvenci<br />
komplementární k sekvenci adaptorů a obsahují jednu tzv. selektivní bázi navíc (obecně se<br />
používá C pro MseI primer a A pro EcoRI primer). Výsledkem PCR jsou fragmenty s MseI<br />
adaptorem na jednom konci a EcoRI adaptorem na druhém konci. Díky prodloužení o jednu<br />
selektivní bázi vzniká pouze 1/16 restrikčních fragmentů. Preselektované fragmenty vstupují<br />
do druhé, tzv. selektivní PCR, ve které jsou použity primery komplementární k adaptorům<br />
prodloužené o tři selektivní báze (C + dvě náhodně zvolené báze pro MseI a A + dvě náhodně<br />
zvolené báze pro EcoRI). Tím je počet fragmentů znovu redukován. EcoRI primery jsou<br />
fluorescenčně značené, což umožňuje separaci fragmentů v automatickém sekvenátoru tzv.<br />
fragmentační analýzou. Fragmenty jsou rozděleny podle délky, jejíž přesné určení umožní<br />
přidání fluorescenčně značeného standardu obsahujícího fragmenty DNA o známé délce ke<br />
každému vzorku.<br />
Obvykle se hledá několik primerových kombinací, které pak budou odlišeny různou<br />
fluorescenční barvou EcoRI primeru a mohou být na sekvenátoru analyzovány zároveň<br />
ve směsných vzorcích. Automatický sekvenátor ABI PRISM 3130xl firmy Applied<br />
Biosystems umožňuje současně analýzu čtyř různých primerových kombinací.<br />
Díky možnosti detekovat variabilitu na nízkých úrovních lze AFLP použít pro studium<br />
procesů v populacích, odlišení blízkých taxonů, při fylogeografických studiích apod. Existují<br />
ale i práce využívající AFLP pro studium fylogeneze i na rodové úrovni. Nevýhodou metody<br />
je poměrně vysoká cena, časová náročnost metody i požadavky na kvalitu DNA a přesné<br />
reakční podmínky při restrikci i PCR.<br />
V současnosti je možné v naší laboratoři použít dva protokoly:<br />
17
A) Protokol s využitím AFLP kitů od firmy Invitrogen<br />
Obecné poznámky:<br />
AFLP<br />
• Sekvenační centrum vyžaduje pro fragmentační analýzu, aby byl výsledný počet vzorků<br />
v násobcích 16.<br />
• Během celého postupu pracujeme stále na ledu. Enzymy vyndáváme z mrazáku až těsně<br />
před jejich použitím a ihned poté vracíme zpět.<br />
• Fluorescenčně značené primery chráníme před světlem (zkumavky obalujeme alobalem<br />
a necháváme rozmrzat např.v tmavé skříni). Pro práci používáme alikvoty.<br />
1) Restrikce<br />
• Využijeme AFLP ® Core Reagent Kit I.<br />
• Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je<br />
2,5 µl na vzorek.<br />
sterilní H2O ................................. 1,1 µl<br />
5× Reaction buffer....................... 1,0 µl<br />
EcoRI/MseI enzyme mixture ....... 0,4 µl<br />
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 2,5 µl do PCR stripů nebo<br />
0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 2,5 µl DNA (koncentrace 50–100 ng/µl); výsledný objem 5 µl. Promícháme,<br />
krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.<br />
• Vložíme do termocykleru a inkubujeme 3 hodiny při teplotě 37°.<br />
2) Ligace<br />
• Využijeme AFLP ® Core Reagent Kit I.<br />
• Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl<br />
na vzorek.<br />
Adaptor/Ligation Solution .......... 4,8 µl<br />
T4 DNA ligase ........................... 0,2 µl<br />
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a přidáme po 5 µl ke vzorkům po restrikci;<br />
celkový objem 10 µl.<br />
• Vložíme do termocykleru a spustíme restrikci: 12 hodin při teplotě 37°.<br />
Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat<br />
preselektivní amplifikací.<br />
• Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu<br />
v TBE pufru. Nanášíme 3–5 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu.<br />
Na gelu by měl být vidět „smír“ restrikčních fragmentů (zejména v oblasti 50–1000 bp).<br />
3) Preselektivní amplifikace<br />
• Využijeme AFLP ® Pre-amp Primer Mix I .<br />
• Připravíme si preamplifikační směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi<br />
je 5 µl.<br />
PA mix ........................................ 4 µl<br />
PCR buffer (10×)......................... 0,5 µl<br />
DNA polymerasa (1 U/µl) ........... 0,1 µl<br />
18
AFLP<br />
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme, a rozpipetujeme po 4,6 µl do PCR stripů nebo<br />
0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 0,4 µl DNA po ligaci; výsledný objem 5 µl.<br />
• Vložíme do termocykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci:<br />
1× 72°C 2 min<br />
20× 94°C 1 s<br />
56°C 30 s<br />
72°C 2 min ramping 2°C/s<br />
1× 60°C 30 min<br />
1× 10°C hold<br />
• Směs po preselektivní amplifikaci naředíme 10× naředíme (2 µl preamplifikační směsi +<br />
18 µl sterilní H2O). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v –20°C pro případné<br />
opakování.<br />
• Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru.<br />
Nanášíme 3 µl (neředěné) preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu.<br />
Na gelu by měl být vidět „smír“ preamplifikačních fragmentů, na několika místech<br />
intenzivnější.<br />
4) Selektivní amplifikace<br />
• Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek<br />
4 varianty, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený<br />
EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné variantě.<br />
Sterilní H2O ................................ 5,1 µl<br />
PCR buffer (10x).......................... 1 µl<br />
dNTP (10 mM) ........................... 0,2 µl<br />
EcoRI primer (1 pmol/µl) ............ 0,5 µl<br />
MseI primer (5 pmol/µl) ............. 0,5 µl<br />
DNA polymerasa (1 U/µl) ........... 0,2 µl<br />
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů<br />
nebo 0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi 10 µl.<br />
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.<br />
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci:<br />
1× 94°C 2 min<br />
65°C 30 s<br />
72°C 2 min s ramping 2°C/s<br />
8× 94°C 1 s<br />
64-56°C 30 s touch-down by 1°C<br />
72°C 2 min ramping 2°C/s<br />
23× 72°C 1 s<br />
56°C 30 s<br />
72°C 2 min ramping 2°C/s<br />
1× 60°C 30 min<br />
1× 10°C hold<br />
19
5) Příprava pro fragmentační analýzu<br />
AFLP<br />
• Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního<br />
vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší se fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl<br />
(nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev.<br />
• Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme<br />
selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C).<br />
• Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici<br />
v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek.<br />
Hi-Di formamid.................................... 10,25 µl<br />
GeneScan 500LIZ Size standrad.............0,25 µl<br />
• Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené<br />
vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu.<br />
B) Protokol bez využití AFLP kitů<br />
• Obecné poznámky viz protokol A.<br />
• ATP je skladováno při –80°C, proto potřebné množství necháme rozmrznout v předstihu.<br />
1) Restrikce<br />
• DNA naředíme TE pufrem tak, abychom měli 50 ng DNA v celkovém objemu 40 µl.<br />
• Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je<br />
10 µl na vzorek.<br />
R/L buffer (koncentrace 10x).................... 5 µl<br />
sterilní H2O ........................................... 4,25 µl<br />
EcoRI (koncetrace 20U/µl) ................... 0,25 µl (= 5 U)<br />
MseI (10U/µl) .........................................0,5 µl (= 5 U)<br />
• Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 40 µl DNA, výsledný objem 50 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní<br />
centrifuze.<br />
• Vložíme do cykleru a inkubujeme 16 hodin při teplotě 37°C<br />
Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat ligací.<br />
2) Ligace<br />
• Připravíme si ligační směs pro odpovídající počet vzorků + 1.<br />
• Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek.<br />
sterilní H2O ............................................ 6,2 µl<br />
R/L buffer (koncentrace 10x).................... 1 µl<br />
EcoRI 3’ adaptor (50 pmol/µl) ............... 0,1 µl (= 5 pmol)<br />
EcoRI 5’ adaptor (50 pmol/µl) ............... 0,1 µl (= 5 pmol)<br />
MseI 3’ adaptor (250 pmol/µl) ............... 0,2 µl (= 50 pmol)<br />
MseI 5’ adaptor (250 pmol/µl) ............... 0,2 µl (= 50 pmol)<br />
ATP (10 mM)......................................... 1,2 µl (= 1,2 pmol)<br />
T4 ligasa (1 U/µl) ..................................... 1 µl = 1 U<br />
20
• Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 50 µl DNA po restrikci. Výsledný objem ligační směsi je 60 µl.<br />
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.<br />
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro ligaci: 3 hodiny při 37°C.<br />
AFLP<br />
• Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu<br />
v TBE pufru. Nanášíme 10 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu.<br />
Na gelu by měl být vidět „smír“ restrikčních fragmentů (zejména v oblasti 50–1000 bp).<br />
• Směs po ligaci 10x naředíme (5 µl ligační směsi + 45 µl T0.1E pufru).<br />
• Zbytek nenaředěného vzorku po ligaci uschováme v –20°C pro případné opakování<br />
(naředěných 50 µl stačí pro 10 preamplifikačních reakcí).<br />
3) Preselektivní amplifikace<br />
• Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 45 µl na vzorek.<br />
Sterilní H2O .......................................... 30,5 µl<br />
PCR buffer (10x)...................................... 5 µl<br />
MgCl2 (25 mM)........................................ 8 µl (= 4 mM)<br />
dNTP (10 mM) ........................................ 1 µl (= 0.2 mM)<br />
EcoRI+A primer (500 ng/µl) ................. 0,15 µl (= 75 ng)<br />
MseI+C primer (500 ng/µl) ................... 0,15 µl (= 75 ng)<br />
DNA polymerasa (5 U/µl) ...................... 0,2 µl (= 1 U)<br />
• Směs promícháme a rozpipetujeme po 45 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 5 µl naředěné DNA po ligaci. Výsledný objem směsi je 50 µl.<br />
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.<br />
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci:<br />
1× 94°C 1 min<br />
30× 94°C 30 s<br />
60°C 30 s<br />
72°C 60 s ramping 1°C/s<br />
1× 72°C 9 min<br />
1× 10°C hold<br />
• Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,2 % agarosovém gelu v TBE pufru.<br />
Nanášíme 10 µl preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by<br />
měl být vidět „smír“ preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější.<br />
• Směs po preselektivní amplifikaci 20× ředíme (5 µl preamplifikační směsi + 95 µl TE<br />
pufru). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v –20°C pro případné opakování.<br />
21
4) Selektivní amplifikace<br />
AFLP<br />
• Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek<br />
4 sady vzorků, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený<br />
EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné sadě.<br />
Sterilní H2O ........................................... 4,5 µl<br />
PCR buffer (10x)...................................... 1 µl<br />
MgCl2 (25 mM)...................................... 0,6 µl (= 1,5 mM)<br />
dNTP (10 mM) ...................................... 0,2 µl (= 0.2 mM)<br />
MseI+CNN primer (300 ng/µl) .............. 0,1 µl (= 30 ng)<br />
EcoRI+ANN primer (5 ng/µl) .................. 1 µl (= 5 ng)<br />
DNA polymerasa (5 U/µl) ...................... 0,1 µl (= 0,5 U)<br />
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů<br />
nebo 0,2 ml PCR zkumavek.<br />
• Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi je 10 µl.<br />
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.<br />
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci:<br />
1× 94°C 2 min<br />
10× 94°C 30 s<br />
65-56°C 30 s touch-down by 1°C<br />
72°C 60 s ramping 1°C/s<br />
25× 72°C 9 min<br />
56°C 30 s<br />
72°C 60 s ramping 1°C/s<br />
1× 72°C 15 min<br />
1× 10°C hold<br />
5) Příprava pro fragmentační analýzu<br />
• Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního<br />
vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl<br />
(nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev.<br />
• Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme<br />
selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C).<br />
• Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici<br />
v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek.<br />
Hi-Di formamid.................................... 10,25 µl<br />
GeneScan 500LIZ Size standrad.............0,25 µl<br />
• Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené<br />
vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu.<br />
22
C) Přesrážení octanem sodným<br />
Všechny centrifugační kroky probíhají při 4°C v předem vychlazené centrifuze.<br />
• Na stěnu 1,5 ml eppendorfky pipetujeme 1 µl 3M octanu sodného.<br />
• Do kapky octanu sodného přidáme 3 µl směsi DNA po selektivní amplifikaci.<br />
• Přidáme 25 µl čistého 96% ethanolu.<br />
• Promícháme na vortexu, krátce stočíme na stolní centrifuze.<br />
• Necháme stát 20 min v mrazáku při –20°C.<br />
AFLP<br />
• Centrifigujeme 30 min při 14 000 rpm. Eppendorfky v centrifuze orientujeme do stejné<br />
pozice, abychom měli DNA usazenou vždy na stejném místě.<br />
• Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává usazená na stěně eppendorfky.<br />
• Přidáme 100 µl 70% ethanolu.<br />
• Centrifigujeme 5 min při 14 000 rpm.<br />
• Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává na stěně eppendorfky.<br />
• Otevřené eppendofky necháme stát ve stojánku 5 min při laboratorní teplotě a následně<br />
dosušíme 10 min v termobloku při 65°C.<br />
• Skladujeme v lednici (4°C).<br />
• Před přípravou pro fragmentační analýzu rozpustíme ve 3 µl sterilní destilované vody<br />
(nebo TE pufru).<br />
23
Elektroforéza DNA<br />
Horizontální agarosová elektroforéza<br />
Elektroforéza DNA<br />
• pracujeme v rukavicích, protože všechny věci mohou být kontaminovány SyberGreenem<br />
(potencionální mutagen!)<br />
• do Erlenmeyerovy baňky na předvážkách navážíme příslušné množství agarosy (nejčastější<br />
navážky viz tabulka)<br />
% gel agarosa [g]<br />
0.7 0,21 0,35 0,42 0,84 1,4<br />
0,8 0,24 0,4 0,48 0,96 1,6<br />
1,0 0,3 0,5 0,6 1,2 2<br />
1,5 0,45 0,75 0,9 1,8 3<br />
1,8 0,54 0,9 1,08 2,16 3,6<br />
3,0 0,9 1,5 1,8 3,6 6<br />
1× TBE [ml] 30 50 60 120 200<br />
• přidáme příslušné množství 1×TBE pufru (odměříme odměrným válcem), lehce kroužením<br />
promícháme<br />
• vložíme na několik minut do mikrovlnky na 550-700W; v uvařeném gelu nesmí být<br />
viditelné krystalky („nitky“) agarosy<br />
• mezitím si připravíme vaničku na nalití gelu – položíme ji na nalévací stolek (vodováhy v<br />
rozích)<br />
• podle počtu nanášených vzorků vybereme hřeben s dostatečným počtem zubů a umístíme<br />
ho do zářezů ve vaně<br />
• uvařený gel ochladíme kroužením „Erlenkou“ pod tekoucí vodou (používáme rukavici,<br />
abychom se nespálili) na teplotu cca 50°C (odhadneme tak, že udržíme ruku na dně baňky)<br />
• gel pomalu naléváme do vaničky s hřebínky, špičkou odstraníme případné bublinky v gelu<br />
a necháme tuhnout cca 30 minut<br />
• po ztuhnutí opatrně vyjmeme hřebínky, vaničku s gelem vložíme do elektroforetické vany<br />
a zalijeme pufrem (1×TBE) tak, aby celý gel byl těsně pod hladinou a všechny jamky byly<br />
zality<br />
• krajní jamky necháváme prázdné, do druhé jamky pipetujeme cca 6 µl 100bp Ladderu<br />
(žebříčku) a do dalších jamek pak směs DNA s nanášecím pufrem LB (Loading Buffer)<br />
• po nanesení všech vzorků na gel přiklopíme víko s přívodními kabely, připojíme<br />
elektroforézu ke zdroji; napětí nastavíme v modu „SET“ na 50 - 100 V (dle velikosti gelu)<br />
otáčením knoflíku<br />
• pro spuštění elektroforézy vypneme mod „SET“; po vyjetí vzorků z jamek napětí zvýšíme<br />
• ve chvíli, kdy čelo (nejrychlejší barvička) dojíždí ke konci gelu, vypneme proud, sejmeme<br />
víko elektroforetické aparatury, vyndáme gel a umístíme do komory UV transiluminátoru<br />
dokumentačního systému Gel Imager<br />
24
Elektroforéza DNA<br />
Vertikální polyakrylamidová elektroforéza na 6,2% kontinuálním<br />
gelu<br />
• Pozor, akrylamid je toxický!<br />
Obecné<br />
• Viz protokol na isozymy.<br />
Postup<br />
• Do 1,5 ml eppendorfky připravíme 10% roztok APS (ammonium persulfate).<br />
APS ................................................ 0,022 g .............. 0,033 g ........... 0,056 g<br />
destilovaná voda .............................. 200 µl ................. 300 µl .............. 500 µl<br />
• Do vysoké 250 ml kádinky připravíme následující směs:<br />
1 gel 2 gely 4 gely<br />
Mili-Q voda ................................... 19,85 ml ............. 39,7 ml .......... 59,55 ml<br />
akrylamid (40%) + BIS (1 %) .......... 3,9 ml ................ 7,8 ml ............ 11,7 ml<br />
20× TBE pufr ................................. 1,25 ml ............... 2,5 ml ............ 3,75 ml<br />
• Opatrně, ale důkladně promícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí<br />
polymeraci). V digestoři přidáme iniciátor (APS) a katalyzátor (TEMED) polymerace.<br />
1 gel 2 gely 4 gely<br />
10% APS ......................................... 120 µl ................ 240 µl ............. 480 µl<br />
TEMED ............................................ 20 µl .................. 40 µl ............... 80 µl<br />
• Opatrně promícháme a ihned naléváme gel, zastrčíme hřebeny mezi skla.<br />
• Necháme gel 2–3 hodiny polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek roztoku v<br />
kádince, nevyléváme ho do odpadu!<br />
• Po ztuhnutí gelu vypláchneme jamky 1× TBE pufrem, naneseme vzorky a 100bp ladder.<br />
• Do horní i spodní elektroforetické vany nalijeme 1× TBE pufr.<br />
• Aparaturu není nutné chladit.<br />
• Elektroforézu spustíme na konstantní napětí 50 V, po vyjetí vzorků z jamek (cca 20 min.)<br />
zvýšíme napětí na 150 V. Elektroforéza trvá cca 3 hodiny.<br />
• Po skončení elektroforézy od sebe oddělíme skla. Gel ze skla nezvedáme prsty, ale opatrně<br />
nadzvedneme špachtlí nebo nožem jeden roh a střičkou stříkáme pod gel destilovanou<br />
vodu, dokud se gel od skla zcela neodlepí (sklo držíme rovně, aby gel po odlepení<br />
nesklouznul). Pracujeme nad miskou, do které odtéká přebytečná voda. Odlepený gel<br />
necháme opatrně sklouznout na navlhčenou plochu UV transluminátoru a vyfotíme.<br />
25
Elektroforéza DNA<br />
Práce s dokumentačním systémem Gel Imager a softwarem Scion<br />
VisiCapture<br />
• Při manipulaci s gelem, nalévací vaničkou a elektroforetickou vanou pracujeme<br />
v rukavicích!<br />
• Po skončení elektroforézy vypneme zdroj a odpojíme od něj kabely.<br />
• Vyjmeme vaničku s gelem z elektroforetické vany.<br />
• Do komory fotodokumentačního zařízení umístíme již samotný gel a otočíme ho o 90°<br />
(horní jamky jsou blíž levé straně komory transluminátoru), opatrným posouváním po<br />
ploše se zbavíme případných vzduchových bublin pod gelem, gel srovnáme.<br />
• Bez rukavic (!) spustíme program Scion VisiCapture.<br />
• Klikneme na „Image“ a vybereme „Start Live Capturing“.<br />
• Při otevřených dvířkách komory si gel připravíme k focení, přímo na objektivu kamery<br />
můžeme vyladit zoom (velikost gelu nebo jeho části) a clonu (jas).<br />
• Zavřeme dvířka a zapneme UV světlo, popřípadě ještě doladíme obraz (expozici lze<br />
vyladit kliknutím na „Image“ a „Properties“ – nastavením délky expozice nebo<br />
elektronického zesílení signálu, tj. gain).<br />
• Klikneme na „Image“ a gel vyfotíme tlačítkem „Snap“.<br />
• Obrázek uložíme vybráním „File“ a „Save As“ do příslušné složky .<br />
• Vypneme zdroj UV světla, otevřeme dvířka, gel v rukavicích (!) zabalíme do papírového<br />
ručníku a vyhodíme do odpadkového koše k tomu určeného a očistíme plochu UV<br />
transiluminátoru ethanolem.<br />
DNA žebříčky (ladders) používané v laboratoři (NEB)<br />
100 bp DNA Ladder (NEB)<br />
0.5µg 100 bp DNA žebříčku/jamku,<br />
1,3% agarosový gel v 1X TAE<br />
Lambda DNA-Hind III Digest (NEB)<br />
0.5 µg Lambda DNA-Hind III Digest/jamku,<br />
1,0% agarosový gel<br />
26
Princip metody<br />
Isozymy (allozymy)<br />
Isozymy<br />
Analýza isozymů sleduje variabilitu na úrovni proteinů, konkrétně určitých enzymů, které<br />
jsme schopni specificky detekovat. Ačkoliv se v molekule proteinu díky degeneraci<br />
genetického kódu neprojeví všechny změny ve struktuře DNA, lze obvykle najít enzymy,<br />
které: (a) jsou u studovaných organismů v různých jedincích/populacích/taxonech zastoupeny<br />
různými formami, které se liší pohyblivostí při elektroforéze a (b) a tyto rozdíly jsou dědičné.<br />
Při kombinaci dat z několika enzymů dohromady můžeme získat dostatečnou variabilitu pro<br />
odhad obvyklých populačně-genetických parametrů, studium rozdílů mezi taxony a nebo<br />
dokonce identifikaci jedinců (isozymová analýza se u rostlin často využívá k identifikaci<br />
jednotlivých klonů).<br />
Proteiny vyizolované z <strong>rostlinné</strong> tkáně naneseme na gel (škrobový nebo polyakrylamidový),<br />
rozdělíme elektroforézou a následně ze směsi detekujeme vybraný enzym (resp. skupinu<br />
enzymů, enzymový systém). Využíváme tzv. histochemické barvení, při kterém detekujeme<br />
projevy reakce katalyzované zkoumaným enzymem – na gelu dostáváme v místě aktivity<br />
enzymu barevnou zónu. Detekce je u různých enzymů různě specifická – někdy dostáváme na<br />
gelu jednu zónu, označovanou jako lokus, která odpovídá jednomu enzymu pravděpodobně<br />
kódovanému jedním genem, častěji ale získáváme více lokusů. Přítomnost více lokusů může<br />
být způsobena dvěma faktory – buď je daný enzym v genomu kódován několika geny<br />
nezávisle (např. jednou v jádře a jednou v plastidech) nebo není naše detekce zcela specifická<br />
a jedním barvením detekujeme více různých enzymů najednou. Právě v počtu lokusů je rozdíl<br />
mezi pojmy isozymy a allozymy. Jako isozymy (isoenzymy) se označují všechny různé formy<br />
enzymu (ve smyslu různé pohyblivosti při elektroforéze), které detekujeme jednou barvící<br />
reakcí. Jako allozymy se označují pouze různé formy v rámci jednoho lokusu – tedy různé<br />
alely jednoho genu. Pojem isozymy je obecnější, allozymy jsou podmnožinou isozymů.<br />
V současnosti je známo více než 100 specifických barvení (i když asi v žádné<br />
laboratoři není možné dělat všechny; u nás máme v současnosti materiál pro 21 enzymových<br />
systémů, rutinně používáme 10–12 z nich). Většina používaných enzymů patří mezi enzymy<br />
základního metabolismu (např. glykolýza, pentosafosfátový cyklus, Krebsův cyklus,<br />
metabolismus aminokyselin). To znamená, že tytéž enzymy zastoupeny u široké škály<br />
organismů a isozymová analýza je v tomto ohledu dosti univerzální metodou. Za druhé jsou<br />
enzymy (resp. geny je kódující) pod velkým selekčním tlakem – enzymy pro základní<br />
metabolismus musí v organismu fungovat. Proto lze předpokládat, že případné různé formy<br />
enzymů (tedy isozymy/allozymy) budou fungovat přibližně stejně, rozdíly budou ± selekčně<br />
neutrální. To je ideální stav pro výpočet populačně-genetických parametrů. (V současnosti ale<br />
víme, že tento předpoklad určitě neplatí stoprocentně).<br />
Hlavními výhodami analýzy isozymů ve srovnání s DNA metodami je nižší cena,<br />
kodominantní charakter, takže je možné přímo rozlišit heterozygoty (z DNA metod má tuto<br />
vlastnost pouze analýza mikrosatelitů) a značná univerzálnost metody. Určitou výhodou je i<br />
menší náročnost na některé aspekty práce v laboratoři (menší riziko kontaminací, netřeba<br />
pracovat sterilně, pracuje se s většími objemy roztoků). Značnou nevýhodou je naopak<br />
27
Isozymy<br />
nutnost izolovat isozymy z čerstvého živého materiálu. Určitou nevýhodou je i vyšší množství<br />
materiálu pro izolaci (problém u malých organismů, např. u mechorostů) a značná citlivost<br />
enzymů na teplotu a z toho vyplývající nároky na skladování a dostatečné chlazení při vlastní<br />
laboratorní práci. Pro interpretaci výsledků je také potřeba brát v úvahu, že ne všechny změny<br />
v kódující sekvenci DNA se projeví ve struktuře enzymu a ne všechny formy enzymu jsme<br />
schopni oddělit elektroforézou, takže analýza isozymů dává nižší odhady variability než je<br />
variabilita na úrovni sekvence DNA (odhady se pohybují mezi 20–60%).<br />
Histochemické barvení<br />
Nedetekujeme přímo molekulu enzymu jako takovou (tj. nebarvíme přímo proteiny), ale<br />
detekujeme projevy reakce enzymem katalyzované. Barvicí roztoky mají tři hlavní součásti:<br />
(a) pufr udržující optimální podmínky pro daný enzym (určitá hodnota pH, u některých<br />
enzymů se přidává MgCl2, apod.), (b) substrát, který je specifický pro studovaný enzymový<br />
systém a je jeho činností metabolizován a (c) látky, které vytvářejí barevnou reakci.<br />
Jsou tři hlavními způsoby detekce:<br />
a) Přímá detekce. Dochází ke změně bezbarvého rozpustného substrátu na barevnou<br />
sraženinu, které se v gelu hromadí v místě aktivity enzymu a vytváří barevnou zónu.<br />
b) Nepřímá detekce. Dochází ke změně barevného substrátu na bezbarvý produkt – gel je<br />
zbarvený, pouze v místě aktivity enzymu vznikají bezbarvé pruhy.<br />
c) Spřažené reakce (využívané u naprosté většiny enzymových systémů). Produkt reakce není<br />
barevný, ale reakci je možné zviditelnit pomocí dalších souběžně probíhajících reakcí.<br />
Typickým příkladem je tzv. tetrazoliový systém používaný pro<br />
detekci většiny dehydrogenáz – ty oxidují substrát a za účasti<br />
několika přenašečů se redukuje látka světle žlutá rozpustná<br />
tetrazoliová sůl MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide;<br />
thiazolylová modř) na modrofialový nerozpustný formazan, viz<br />
schéma. U některých systémů není ale možná ani podobná<br />
detekce pomocí spontánně probíhajících spřažených reakcí. V<br />
takovém případě se do barvícího roztoku přidává další enzym<br />
(někdy i více), který metabolizuje produkt námi zkoumaného<br />
enzymu, přičemž reakci tohoto druhého enzymu už obarvit<br />
schopni jsme – a protože substrát tohoto druhého enzymu v<br />
kaskádě je pouze tam, kde jej vyrábí první enzym, barevná<br />
reakce označuje polohu prvního enzymu v kaskádě, viz schéma.<br />
Histochemické barvení isozymů je poměrně citlivé na<br />
přesné dodržení reakčních podmínek (teplota, pH a koncentrace<br />
roztoků, někdy je nutné postupně doplňovat substrát). Používaná<br />
barviva většinou citlivá na světlo, takže příprava barvících<br />
roztoků a vlastní barvení musí probíhat ve tmě. Velmi důležitá je<br />
i správná délka barvení, kterou je třeba pro každý organismus a<br />
enzymový systém empiricky vyzkoušet – nesmí být ani příliš<br />
krátká (proužky slabé) ani příliš dlouhá (tzv. „přebarvení“,<br />
proužky jsou pak široké a neostré, může se zvýšit zabarvení<br />
pozadí gelu a proužky jsou pak málo zřetelné).<br />
Schéma tetrazoliového barvení<br />
alkoholdehydrogenasy<br />
(ADH)<br />
Schéma barvení glukosafosfátisomerasy<br />
(PGI) spřaženou<br />
reakcí glukosafosfátdehydrogenasy<br />
(G6PDH)<br />
28
Základy interpretace isozymových patterns<br />
Isozymy<br />
Výsledkem analýzy isozymů je soustava proužků na gelu. Nejjednodušším vyhodnocením je<br />
pouhé porovnání pattern jednotlivých vzorků – shodují-li se genotypy (dané pozicí všech<br />
proužků) nebo ne. Takové jednoduché vyhodnocení je možné v některých případech použít,<br />
např. pro identifikaci klonů, ale obvykle nestačí. Pokud je to možné, snažíme se o tzv. alelické<br />
hodnocení – pokoušíme se najít, kolika alelami je daný lokus v studovaném souboru jedinců<br />
zastoupen, kteří jedinci jsou homozygotní a kteří heterozygotní, apod.<br />
Pro alelické hodnocení je důležité znát kvartérní strukturu studovaného enzymu a<br />
ploidní úroveň zkoumaného organismu – haploid má vždy v jednom lokusu jedinou alelu (u<br />
rostlin se s tím lze setkat u mechorostů), diploid má u heterozygotů v jednom lokusu dvě<br />
alely, tetraploid dvě, tři nebo i čtyři, atd. Druhou podstatnou informací je kvartérní struktura<br />
studovaného enzymu.<br />
Nejjednodušší situace je u monomerních enzymů, tj. enzymů, jejichž molekula je<br />
tvořena jediným proteinovým řetězcem, jedinou podjednotkou. V tomto případě odpovídá<br />
jeden proužek jedné alele – u homozygota bude vždy jeden, u heterozygota dva (u diploidů).<br />
U dimerních enzymů složených ze dvou podjednotek tvoří u diploidů pattern buď<br />
jeden proužek u homozygotů nebo tři proužky u heterozygotů (u diploidů). Tři proužky u<br />
heterozygota vznikají tak, že krajní proužky odpovídají molekulám složeným ze dvou<br />
stejných podjednotek (jednoho nebo druhého typu) a prostřední proužek odpovídá molekulám<br />
složeným ze dvou různých podjednotek. Intenzita proužků je v ideálním případě 1:2:1 –<br />
nejčastěji se kombinují různé podjednotky, lze odvodit z jednoduché kombinatoriky. Podobně<br />
lze odvodit i stav pro složitější systémy (tetramery, hexamery, …).<br />
U polyploidů počet proužků roste. I v nejjednodušším případě monomerního enzymu<br />
může mít heterozygot u tetraploida až čtyři proužky, v případě dimerů je to u tetraploida až<br />
deset proužků (při čtyřech různých alelách), u složitějších systémů ještě více. Takto složitá<br />
pattern už není obvykle možné alelicky přečíst („rozšifrovat“) a většinou se ani nedaří je<br />
obarvit – jsou zde velké rozdíly v intenzitě jednotlivých proužků, takže při dostatečném<br />
obarvení nejintenzivnějších jsou ty nejslabší nezřetelné a naopak dostatečné obarvení slabých<br />
proužků vede k přebarvení těch intenzivních.<br />
Příklady ideálních isozymových patterns, které se mohou vyskytnout u jednoho jedince určité ploidie a<br />
kvartérní struktury enzymu. U tetraploidů je zobrazen jen výběr ilustrující možné počty a intenzity proužků,<br />
ale ne všechny genotypy (analogicky budou vypadat např. bbbb, bbbc, aadd, atd.), vzájemné polohy<br />
jednotlivých alel mohou být samozřejmě jiné a u složitějších pattern se některé proužky mohou překrývat.<br />
29
Isozymy<br />
Interpretaci isozymových pattern mohou komplikovat i další faktory:<br />
(a) Různá intenzita u různých jedinců. Rozdíly v celkové intenzitě barvení mezi jedinci<br />
většinou nelze brát v úvahu. Nemusí nesouviset s genetickými rozdíly, ale se způsobem<br />
zpracování vzorků, s rozdílným stavem, v jakém byly jednotlivé rostliny v době odběru nebo<br />
přesném množství izolovaného materiálu. Příliš rozdílná intenzita je problém při barvení, část<br />
jedinců bude nedobarvených nebo přebarvených a jejich pattern nečitelná, takové vzorky je<br />
obvykle nutné analyzovat znovu (a např. nanést na gel úměrně větší nebo menší množství<br />
extraktu). Někdy ale může mít intenzita (resp. až absence) barvení určitý význam, např. u<br />
jednoho taxonu se určitý lokus barví a u druhého ne.<br />
(b) Sekundární proužky. U některých systémů se objevuje více proužků i u homozygotů. Tyto<br />
sekundární proužky mohou být nezřetelné nebo neostré („duchy“) nebo méně intenzívní, ale<br />
někdy jsou intenzitou nebo ostrostí srovnatelné se skutečnými „hlavními“ proužky. Mohou<br />
vznikat např. degradací enzymu, která vede k odlišné pohyblivosti při elektroforéze (přičemž<br />
ale i degradovaná molekula má nějakou enzymatickou aktivitu) nebo může jít o důsledek<br />
posttranslačních úprav.<br />
(c) Nulové alely. Někdy se vyskytují formy enzymu, které nemají žádnou nebo téměř žádnou<br />
katalytickou aktivitu a v gelu se nebarví (jakoby tam nebyly). Obvykle nemohou být v<br />
homozygotním stavu (takový organismus by měl narušený základní metabolismus), ale<br />
mohou existovat u heterozygotů. U monomerních enzymů je není možné přímo odhalit<br />
(projevit se mohou ale mohou např. u analýzy kříženců, pokud pattern u potomstva<br />
„nesouhlasí“ s pattern rodičů). U dimerů se projevují tak, že (u diploidů) je pattern tvořeno<br />
dvěma proužky místo tří, přičemž heterodimerní („střední“) proužek je slabší. Analogicky to<br />
platí u složitějších systémů a nebo polyploidů.<br />
(d) Intergenické (interlokusové) proužky. U enzymů složených z více podjednotek se mohou<br />
někdy skombinovat podjednotky z různých lokusů a vzniklá molekula je přesto funkční (i<br />
když je aktivita obvykle slabá). Může jít například o dvě kopie genu pro týž enzym, jednu<br />
jadernou a jednu z organel – v živé buňce se proteiny podle nich vytvořené asi nikdy<br />
nesetkají, ale v homogenátu pro isozymovou analýzu to možné je. V tomto případě nacházíme<br />
heterodimerní proužky i mezi lokusy.<br />
Extrakce vzorků<br />
a) odběr vzorků v terénu<br />
Isozymy izolujeme vždy z čerstvého živého materiálu. Ideální materiál je u každého druhu<br />
třeba vyzkoušet, protože aktivita jednotlivých enzymů se mezi jednotlivými orgány může lišit<br />
a může se dosti měnit během ontogenetického vývoje. Nejčastěji se používají mladé listy. Pro<br />
izolaci potřebujeme v typickém případě okolo 0,75 g tkáně, což obvykle odpovídá 1 až<br />
několika málo cm 2 listu.<br />
Je třeba dávat pozor, aby odebraná tkáň byla zdravá, bez parazitů (houby, hmyz), a v<br />
dobrém fyziologickém stavu (nezvadnutá, nepřemrzlá, apod.). Ihned po odběru ukládáme<br />
vzorky do vlhkého a chladného prostředí, dbáme na to, aby nezvadly, nevyschly a<br />
nepřehřívaly se. Různé druhy jsou na stav tkáně při odběru různě citlivé, u těch nejcitlivějších<br />
je třeba sbírat v optimálních podmínkách (např. ráno, dokud je chladno a vlhko, může vadit i<br />
mírné zavadnutí přes poledne).<br />
Vzorky co nejrychleji dopravíme do laboratoře k dalšímu zpracování a celou dobu se<br />
30
je snažíme držet v chladnu. Typický postup při odběru v terénu je následující:<br />
• List ihned po utržení zabalíme do vlhkého ubrousku nebo toaletního papíru<br />
• Vzorek vložíme do igelitového pytlíku („zip-lock“) a ihned popíšeme<br />
• Vložíme do termosky s ledem (lépe větší kusy než drobná tříšť).<br />
Isozymy<br />
• Transportujeme do laboratoře. Obvykle je možné v termosce uchovat vzorky v<br />
použitelném stavu maximálně 2–3 dny. V laboratoři před zpracování uchováváme vzorky v<br />
lednici.<br />
b) izolace v laboratoři<br />
Vzorky izolujeme v pufru, který stabilizuje pH a obvykle obsahuje antioxidanty a další látky,<br />
které stabilizují proteiny a umožní uchovat enzymatickou aktivitu. Izolačních pufrů existuje<br />
celá řada, je třeba vždy vyzkoušet nejvhodnější pro zkoumaný materiál (předpisy pro 3<br />
nejčastěji používané v naší laboratoři viz Roztoky a pufry). Někdy je dobré přidat ke vzorku<br />
malé množství látky Dowex-Cl, optimální množství je třeba vyzkoušet (obvykle snižuje<br />
intenzitu pozadí na gelech, ale může snižovat i aktivitu enzymů).<br />
Celá procedura vyžaduje důkladné chlazení. Pracujeme na ledu. Před začátkem izolace<br />
dáme vychladit centrifugu na 4°C a vychladíme třecí misky a tloučky (delší dobu v lednici,<br />
při opakovaném použití během izolace alespoň krátce vychladíme v mrazáku při –20°C).<br />
Postup izolace:<br />
• Do vychlazené třecí misky v ledové tříšti vložíme 0,6–0,8 g <strong>rostlinné</strong> tkáně<br />
• Přidáme 750 µl vychlazeného izolačního pufru (uchováváme v kádince v ledové tříšti) a<br />
případně Dowex-Cl.<br />
• Tloučkem homogenizujeme rostlinný materiál. U tuhých listů může pomoct nastříhání na<br />
malé kousky nebo přidání trochy sterilního písku.<br />
• Homogenát přepipetujeme do 1,5 ml eppendorfky. Obvykle je nutné ustřihnout asi 3 mm<br />
špičky, abychom získali širší otvor, úzký by se ucpával.<br />
• Centrifugujeme v centrifuze vychlazené na 4°C 10 minut při 13800 rpm.<br />
• Supernatant rozpipetujeme do 0,5 ml eppendorfek po 160 µl (dávka pro 5 vzorků + 10 µl<br />
rezerva), obvykle vychází dvě série přesně po 160 µl a třetí série s proměnlivým<br />
objemem.<br />
• Vzorky buď hned dále zpracováváme nebo zamrazíme v –80°C (v tomto stavu lze<br />
uchovávat rok i déle; pro krátkodobé skladování lze použít i –20°C).<br />
Elektroforéza a barvení<br />
Pro isozymovou analýzu se používají buď horizontální škrobové nebo vertikální<br />
polyakrylamidové gely. V naší laboratoři používáme kvůli lepšímu rozlišování i delšímu<br />
uchovávání polyakrylamidové gely.<br />
Pozor! Akrylamid je před zpolymerováním velmi jedovatý (neurotoxin), a to jak při<br />
styku s kůží, tak při vdechnutí (např. při vážení). Při manipulaci s ním a s jakýmikoliv<br />
předměty, které s ním přišly do styku (skla, stojánek, apod.) dbáme zvýšené opatrnosti a<br />
pracujeme zásadně v rukavicích a plášti, při vážení navíc s respirační rouškou. Veškeré<br />
kontaminované předměty co nejdříve oplachujeme větším množstvím vody. Odpadní roztoky<br />
obsahující akrylamid (např. nezpolymerovaný zbytek roztoku pro přípravu gelu) musí být<br />
skladovány ve zvláštní láhvi a zlikvidovány jako nebezpečný odpad, nikdy je proto<br />
31
Isozymy<br />
nevyléváme do běžného odpadu. Polyakrylamid je již netoxický, ale protože polymerace<br />
nikdy neproběhne dokonale a na gelech i aparatuře mohou být zbytky nezpolymerovaného<br />
akrylamidu, pracujeme i s hotovými gely zásadně v plášti a v rukavicích.<br />
Pozor! Enzymy jsou velmi citlivé na teplo, proto je nutné elektroforézu důkladně<br />
chladit. Vzhledem k provizornímu chlazení v naší laboratoři (i vzhledem k délce<br />
elektroforézy) je dobré připravit gely a aparaturu (kroky a–c) odpoledne a nechat přes noc<br />
vychladit v lednici a elektroforézu a barvení provádět další den.<br />
a) Sestavení skel (do tzv. sendvičů)<br />
Pozor! Skla pro elektroforézu jsou velmi křehká a zároveň drahá, proto s nimi zacházíme<br />
velmi opatrně. Je nutné, aby nebyly poškozené hrany a rohy, aparatura by pak netěsnila.<br />
• Aparatura v laboratoři (Hoefer 600SE) umožňuje používat najednou 1, 2 nebo 4 gely.<br />
• Do nalévacího stojánku umístíme těsnící vložky (silikonovou „gumovou“ stranou nahoru),<br />
stojánek postavíme na vodorovný stůl. Stojánek umístíme do misky, která by zachytila<br />
vytékající akrylamid v případě, že by skla byla špatně sestavená a netěsnila.<br />
• Skla zkontrolujeme, pokud jsou znečištěná, omyjeme destilovanou vodou a vysušíme<br />
nebo necháme oschnout. Před sestavením vždy otřeme lihem (stačí denaturovaný),<br />
necháme uschnout. Čistá skla bereme pouze za hrany a nepokládáme je přímo na stůl (lze<br />
na podložku z buničiny nebo filtrační papír).<br />
• Spacery a hřebeny omyjeme lihem, necháme uschnout.<br />
• Na kratší strany vnějšího skla (bez výřezu)položíme pár spacerů, na ně položíme vnitřní<br />
sklo (divider plate, tenčí sklo s výřezem), na něj opět pár spacerů a na ně druhé vnější<br />
sklo. (Tento postup platí pro přípravu čtyř gelů najednou. Při dvou gelech se vynechává<br />
krok s vnitřním sklem a druhou sadou spacerů; při použití jediného gelu se druhý sendvič<br />
nahrazuje speciální skleněnou deskou.)<br />
• Z boku nasadíme na připravený sendvič upínací nástavce s povolenými šrouby a krajní<br />
šrouby lehce dotáhneme.<br />
• Zvedneme sendvič do vertikální polohy, postavíme spodní stranou na stůl, povolíme<br />
šrouby a srovnáme skla a spacery. Spacery musí být dotlačené úplně do boku na kraj skel<br />
a nesmí přesahovat nahoru nad skla. Lehce přitáhneme krajní šrouby, skla otočíme o 180°<br />
a postup opakujeme s horní hranou. Opakujeme tak dlouho, než jsou spacery zcela na<br />
kraji a spodní a horní hrany skel a spacerů zcela v rovině. Pozor! Důkladně<br />
zkontrolujeme, jakákoliv nerovnost by mohla vést k netěsnosti aparatury a vytékání<br />
akrylamidu nebo elektrodového pufru.<br />
• Přiměřeně (ne velkou silou) dotáhneme všechny boční šrouby; postupujeme po obou<br />
hranách zároveň, nikdy křížem (skla by mohla prasknout).<br />
• Spodní hranu skel namažeme vazelínou (při rutinním zvládnutí postupu lze vynechat) a<br />
skla postavíme do stojánku.<br />
• Z boku do otvorů na stojánku vložíme utahovací kolíky, delším koncem dolů.<br />
• Plynulým pohybem utáhneme kolíky (oba najednou a stejným směrem) plynulým<br />
pohybem směrem nahoru o 180°, skla se mírně „zaboří“ do podložky.<br />
32
) Příprava gelů<br />
Isozymy<br />
• Pro analýzu isozymů se používáme diskontinuální gely složené ze spodního 8,16%<br />
separačního gelu a 4% zaostřovacího (koncentračního gelu).<br />
• Připravíme si 10% roztok APS (ammonium persulfate), který nelze dlouhodobě skladovat<br />
a je třeba připravit vždy čerstvý. Do 1,5 ml eppendorfky navážíme na analytických vahách<br />
množství podle počtu gelů a rozpustíme v destilované vodě.<br />
1 gel 2 gely 4 gely<br />
APS ................................................ 0,022 g .............. 0,033 g ........... 0,067 g<br />
destilovaná voda .............................. 200 µl ................. 300 µl .............. 600 µl<br />
• Na vnější sklo uděláme fixem značku 3,5 cm od horního okraje.<br />
• Do vysoké 250 ml kádinky připravíme následující směs podle množství gelů:<br />
Pufr pro separační gel ..................... 6,25 ml .............. 12,5 ml ........... 22,5 ml<br />
Zásobní roztok Akrylamid + BIS ..... 4,4 ml ............... 8,75 ml .......... 15,75 ml<br />
destilovaná voda ............................. 10,6 ml ............. 21,25 ml ......... 38,25 ml<br />
• Opatrně mícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí polymeraci) tak<br />
dlouho, dokud roztok nebude homogenní (nebudou v něm viditelná „vlákna“ akrylamidu).<br />
• Přidáme poslední dvě látky, které spouští a katalyzují polymeraci:<br />
10% APS ......................................... 100 µl ................ 200 µl ............. 360 µl<br />
10% TEMED ................................... 100 µl ................ 200 µl ............. 360 µl<br />
• Opatrně promícháme a ihned naléváme gel<br />
• Nabereme roztok do stříkačky, přiložíme na okraj skel a spustíme jednu větší kapku po<br />
spaceru, až dosáhne dna skel, plynulým proudem naléváme roztok až po značku. Při<br />
nalévání kontrolujeme, jestli nevznikají při hladině bubliny (pokud ano, vyženeme je na<br />
hladinu a necháme prasknout).<br />
• Po nalití všech gelů ihned převrstvíme roztok akrylamidu destilovanou vodou. Nabereme<br />
vodu do 5 ml špičky a pomalu vypouštíme po jednom spaceru. Voda se nemísí s roztokem<br />
akryalmidu a vytváří klín na hladině, přestaneme přidávat, až špička klínu dosáhne asi 1<br />
cm od druhého spaceru.<br />
• Necháme gel nejméně 1 hodinu polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek<br />
roztoku v kádince, nevyléváme ho do odpadu!<br />
• Po zpolymerování separačního odsajeme injekční stříkačkou vodu nad gelem. Protože<br />
obsahuje i zbytky nezpolymerovaného akrylamidu, zacházíme s ní jako s nebezpečným<br />
odpadem! Stejně zacházíme s nezpolymerovaným zbytkem v kádince!<br />
• Do vysoké 100 ml kádinky připravíme následující směs pro koncentrační gel:<br />
1 gel 2 gely 4 gely<br />
Pufr pro koncentrační gel ................. 4,5 ml ................. 9 ml ............... 18 ml<br />
Zásobní roztok akrylamid + BIS ...... 0,5 ml ................. 1 ml ................ 2 ml<br />
• Opatrně mícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí polymeraci) tak<br />
dlouho, dokud roztok nebude homogenní (nebudou v něm viditelná „vlákna“ akrylamidu).<br />
• Přidáme poslední dvě látky, které katalyzují polymeraci:<br />
10% APS .......................................... 30 µl .................. 60 µl .............. 120 µl<br />
10% TEMED .................................... 30 µl .................. 60 µl .............. 120 µl<br />
33
• Opatrně promícháme a ihned naléváme gel<br />
Isozymy<br />
• Nabereme roztok do stříkačky a naléváme do úrovně výřezů ve vnitřním skle (resp. asi<br />
5 mm pod okraj skel při nalévání jediného gelu v sendviči)<br />
• Mezi skla zastrčíme hřebeny. Při použití čtyř gelů je dobré srovnat hřebeny tak, aby jamky<br />
v rámci jednoho sendviče byly přesně za sebou (usnadní to nanášení vzorků).<br />
• Zkontrolujeme, jestli nezůstaly bubliny pod zuby hřebenů, pokud ano, vyženeme je<br />
pohybem nebo nadzvednutím hřebene.<br />
• Necháme gel nejméně 1 hodinu polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek<br />
roztoku v kádince, nevyléváme ho do odpadu!<br />
• Během polymerace si připravíme elektrodový pufr (viz protokoly „Roztoky a pufry“).<br />
• Po zpolymerování gelu opatrně vyjmeme hřebínky (pozor na poškození jamek!). Případné<br />
zbytky roztoku co nejrychleji odsajeme injekční stříkačkou. Roztok obsahuje zbytky<br />
nezpolymerovaného akrylamidu, zacházíme s ním jako s nebezpečným odpadem!<br />
• Jamky ihned naplníme elektrodovým pufrem (pipetou, vypouštíme prudce, jamky se<br />
proudem pufru lépe vypláchnou).<br />
• Znovu vysajeme pufr z jamek (nyní již s ním zacházíme jako s běžným odpadem) a jamky<br />
znovu naplníme elektrodovým pufrem.<br />
• Horní hranu gelů překryjeme alobalem, aby nevysychaly, a dáme chladit do lednice.<br />
c) Příprava aparatury<br />
• Spodní vanu pro elektroforézu naplníme ředěným elektrodovým tris-glycinovým pufrem<br />
(2,4 l neředěného pufru + 1,8 l destilované vody). Do vany vložíme magnetické míchadlo.<br />
• Vanu elektroforézy umístíme do větší plastové vany a vložíme do lednice pro<br />
elektroforézu. Do vany zasuneme skleněný výměník tepla. Necháme vychladit přes noc.<br />
• Do výřezů na spodní straně horní vany elektroforézy vložíme těsnící vložky. Výřezy<br />
nejprve postříkáme malým množstvím destilované vody, kapky rozetřeme do plochy a na<br />
ně těsnění „přilepíme“. Umístíme do lednice a necháme vychladit přes noc.<br />
d) Nanášení vzorků a elektroforéza<br />
• Zapneme chlazení (spínač na boku pro chlazení + zapojení pumpičky prostým zapojením<br />
druhého kabelu do elektrické sítě) a zapneme magnetické míchadlo.<br />
• Aparaturu elektroforézy v lednici obsypeme ledem.<br />
• Dáme rozmrazit vzorky (trvá asi 15–20 minut), po rozmrznutí uchováváme na ledu!<br />
• Těsně před nanášením vzorků vyndáme z lednice stojánek s gely, doplníme do jamek<br />
vychlazený elektrodový pufr až po okraj.<br />
• Pipetou nanášíme 30 µl vzorku (v případě potřeby je množství možné upravit). Pozor!<br />
Pracujeme co nejrychleji, aby se vzorky citlivé na teplo co nejméně zahřívaly.<br />
• Po nanesení vzorků povolíme šrouby držící gely ve stojánku (plynulým pohybem k sobě<br />
oba šrouby najednou o 180°; delší konec bude nakonec mířit dolů) a vyjmeme je z otvorů.<br />
• Na horní hranu skel nasadíme horní vanu elektroforézy, do otvorů vložíme šrouby delším<br />
koncem nahoru a přitáhneme plynulým pohybem o 180° k sobě (delší konce dolů).<br />
• Horní vanu s gely vložíme do spodní vany tak, aby výměník tepla zůstal mezi gely.<br />
• Nalijeme elektrodový pufr (neředěný tris-glycinový pufr) do horní vany. Pufr naléváme<br />
nejprve do středu vany a pomalu zaplavujeme štěrbiny spojující vanu s gely, nikdy<br />
34
Isozymy<br />
nenaléváme pufr přímo do štěrbin, aby se nevyplavily vzorky z jamek. Pufr naléváme do<br />
výšky asi 0,5 – 1 cm (ne více!) nad drátek (elektrodu) vprostřed vany.<br />
• Vanu přikryjeme víkem, otvory ve víku musí dosednout přesně na konce elektrod.<br />
• Připojíme elektroforézu na zdroj elektrického proudu, dbáme na správnou polaritu.<br />
• Zapneme elektroforézu na konstantní proud 80 mA, po ustálení (cca po 1 min.)<br />
zaznamenáme do protokolu hodnotu proudu, napětí a výkonu.<br />
• Pravidelně kontrolujeme průběh elektroforézy. Ve chvíli, kdy zbarvené čelo elektroforézy<br />
dosáhne asi 0,5 cm od spodního okraje (asi 4:30–5 hod.), vypneme zdroj elektřiny a<br />
odpojíme elektroforézu od zdroje.<br />
• Do protokolu zaznamenáme celkovou dobu elektroforézy a koncové hodnoty proudu,<br />
napětí a výkonu.<br />
e) Příprava barvení<br />
V průběhu elektroforézy připravíme barvicí roztoky. Pozor! Barvící roztoky jsou citlivé na<br />
světlo. Všechny látky vystavujeme světlu co nejméně, ihned po vážení je uklízíme zpět do<br />
skříně nebo lednice, navážená množství uchováváme v kádince obalené alobalem, ihned po<br />
vážení je odneseme do temné komory.<br />
• V průběhu elektroforézy připravíme barvicí roztoky.<br />
• Na analytických vahách navážíme látky do barvícího roztoku podle receptů pro jednotlivé<br />
enzymové systémy. Pracujeme vždy v rukavicích, některé z používaných látek jsou<br />
jedovaté. Navážené látky přesypeme do 100 ml kádinek obalených alobalem.<br />
• Pokud je součástí postupu přidání enzymu do barvicího roztoku, nepřidáváme jej nikdy<br />
během vážení, ale až těsně před aplikací roztoku na gel.<br />
• Navážené směsi skladujeme v temné komoře.<br />
• Odměříme si příslušné objemy pufrů. Používáme připravené zásobní roztoky dané<br />
koncentrace, kde je potřeba, upravíme pH.<br />
• Asi 10 minut před koncem elektroforézy rozpustíme navážená barviva v příslušných<br />
pufrech (někdy rozpouštění několik minut trvá, je třeba barviva důkladně rozmíchat).<br />
• Těsně před skončením elektroforézy připravíme barvicí misky, do kterých dáme<br />
vychlazenou destilovanou vodu nebo vychlazený pufr pro opláchnutí gelů (podle<br />
enzymového systému).<br />
f) Vyjmutí gelů<br />
• Vytáhneme gely z aparatury, pufr z horní vany vylijeme do spodní vany nebo do odpadu.<br />
• Gely umístíme do stojánku, povolíme šrouby a odstraníme horní vanu.<br />
• Sendvič položíme na stůl, povolíme šrouby na upínacích nástavcích a ty odděláme, skla<br />
opatrně položíme na filtrační papír na stůl.<br />
• Plastovou špachtlí (tenčím koncem) nebo nožem zatlačíme na spodní stranu spacerů a<br />
vytáhneme je. Snažíme se nepoškodit gel se vzorky.<br />
• Širší konec plastové špachtle přiložíme asi do poloviny boční strany skel do mezery po<br />
spaceru (případně přiložíme nůž po celé délce skel), druhou stranu skla přidržujeme prsty<br />
a opatrně zapáčíme, dokud se skla neodlepí od sebe. Pokud gel zůstane přilepený na<br />
horním skle, rychle sklo otočíme gelem nahoru a položíme na stůl.<br />
• Odřízneme koncentrační gel a šikmým ukrojením pravého spodního rohu označíme pozici<br />
posledního vzorku (pozor na opačnou orientaci gelu, pokud zůstal na horním skle!).<br />
35
Isozymy<br />
• Navlhčíme si rukavice, nadzvedneme jeden okraj gelu, uchopíme do prstů a plynulým<br />
pohybem zvedneme ze skla a přeneseme do připravené barvicí misky.<br />
g) Barvení<br />
• Gely v barvicích miskách necháme chvíli oplachovat.<br />
• Slijeme destilovanou vodu nebo oplachovací pufr, gely v miskách přeneseme do temné<br />
komory a (za minimálního osvětlení) nalijeme do misek barvicí roztok. Pokud je součástí<br />
postupu přidání enzymu, přidáme jej těsně před nalitím roztoku na gel.<br />
• Promícháme a vložíme do termostatu.<br />
• Průběžně promícháváme barvící roztok a kontrolujeme (za minimálního osvětlení!) stav<br />
barvení, abychom gely nepřebarvili.<br />
• Po skončení barvení slijeme barvicí roztok do k tomu určené nádoby (jde o nebezpečný<br />
odpad, nelze vylévat do běžného odpadu!). Gel opláchneme v destilované vodě.<br />
• Pokud je to potřeba (jen některé enzymové systémy), fixujeme gel ve fixačním roztoku.<br />
Po skončení fixace vylijeme fixační roztok do nádoby na nebezpečný odpad, nevyléváme<br />
jej nikdy do běžného odpadu!<br />
• Gel oplachujeme v destilované vodě, kterou průběžně měníme, dokud se z gelu nevymyjí<br />
zbytky barvícího (příp. fixačního) roztoku.<br />
Vysušení gelu<br />
Akryalmidové gely lze vysušit mezi dvěma vrstvami celofánu a ± trvale uchovávat ve<br />
vysušeném stavu:<br />
• Do fotografické misky nalijeme 1–2 cm destilované vody (podle použitých rámečků).<br />
• Na dno misky vložíme rámeček.<br />
• Vezmeme list celofánu a oplachujeme pod mírně tekoucí vodou, dokud nezměkne.<br />
• Rozprostřeme list celofánu na rámeček tak, aby pod ním ani nad ním nezbyly žádné<br />
bubliny (případné bubliny vyženeme na hladinu a necháme prasknout).<br />
• Na celofán položíme gel.<br />
• Opláchneme druhý list celofánu a opatrně přiložíme na spodní celofán a gel. Mezi oběma<br />
vrstvami celofánu ani okolo gelu nesmí zbýt žádné bubliny (potrhaly by vysýchající gel).<br />
• Přiložíme horní rámeček.<br />
• Srovnáme gel a obě vrstvy celofánu tak, aby vyčnívaly z rámečků na všechny strany<br />
stejně daleko a posuneme gel do středu rámečku.<br />
• Ohneme obě vrstvy celofánu přes jednu delší stranu rámečku, vyženeme bubliny (nesmí<br />
se dostat mezi rámečky ke gelu) a přichytíme celofán k rámečkům kolíčky na prádlo.<br />
Napneme celofán a pokračujeme s dalšími dvěma stranami.<br />
• Narovnáme gel do středu rámečků, podepřeme jej prsty (aby se nesesunul) a zvedneme<br />
rámečky tak, aby poslední volná strana zůstala dole. Vypustíme přebytečnou vodu.<br />
Vrátíme rámečky zpět do misky a přichytíme kolíčky i poslední stranu.<br />
• K rámečkům připneme popisek (enzymový systém, datum zpracování) a necháme gel<br />
vyschnout. Při použití tenkých rámečků je ještě musíme po asi 30 min. až 1 hodině<br />
přepnout na pevnou podložku, aby se vysýchající celofán nezkroutil.<br />
36
Isozymy<br />
• Po cca 2 dnech můžeme vysušený gel vyjmout z rámečků. Ostřihneme celofán tak, aby<br />
zbyl okolo gelu asi 1 cm široký pruh, na který napíšeme čísla vzorků a studovaný druh,<br />
datum a enzymový systém.<br />
• Gel necháme několik dnů lisovat. Gely dále uchováváme v suchu a zbytečně<br />
nevystavujeme světlu (pokud s gelem zrovna nepracujeme, uchováváme jej v<br />
neprůhledných deskách ve skříni nebo šuplíku, ve tmě).<br />
Jednotlivé enzymové systémy<br />
V této části jsou uvedeny detaily o jednotlivých enzymových systémech a návody na barvení.<br />
Uvádíme vždy (pokud jsou informace v literatuře dostupné):<br />
- zkratku enzymu a název (v angličtině, české názvy jsou stejné, jen s českými koncovkami)<br />
- oddělené pomlčkami: E.C. číslo, kvarterní strukturu, lokalizaci v buňce (c – cytosol, m –<br />
mitochondrie, p – plastidy) a počet lokusů<br />
- praktické poznámky, upozornění na možné komplikace, apod.<br />
- složení barvicích roztoků (názvy chemikálií z praktických důvodů anglicky); návody na<br />
pufry viz Roztoky a pufry<br />
- informace k barvení (teploty, odchylky od standardního postupu, apod.)<br />
ACP – acid phosphatase<br />
E.C. 3.1.3.2 – monomer, dimer – c, m, p – 2 až 4<br />
0,05M sodium acetate buffer, pH = 5.0 30 ml (+ asi 50 ml na oplachování)<br />
1-naphthylphosphate 50 mg<br />
Fast Black K salt 5 mg<br />
Po skončení elektroforézy neoplachujeme kvůli pH v destilované vodě, ale v předem<br />
vychlazeném pufru (je proto třeba proto připravit asi 100 ml pufru). Barvení při 37°C ve tmě<br />
ADH – alcohol dehydrogenase<br />
E.C. 1.1.1.1 – dimer – c – 1 až 3<br />
často variabilní; dosti citlivý na teplotu; někdy se na gelu negativně barví také SOD<br />
Roztok A:<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH = 7.5 40 ml<br />
NAD + 15 mg<br />
MTT 10 mg<br />
PMS 1 mg<br />
Roztok B:<br />
ethanol (chlazený v lednici) 10 ml<br />
Přidat ke gelu roztok A, inkubovat ve tmě při 32°C, po 2-3 minutách přidat ethanol (roztok<br />
B). V případě, že se gel barví slabě, přidávat další dávky ethanolu vždy po 1 hodině; možné je<br />
i prodloužit úvodní inkubaci bez ethanolu až na 10 minut.<br />
37
AAT – aspartate aminotransferase (= GOT – glutamate oxalacetate transaminase)<br />
Isozymy<br />
E.C. 2.6.1.1 – dimer – c, m, p – až 4<br />
často variabilní; častý výskyt sekundárních proužků, které mohou komplikovat alelické vyhodnocení; poměrně<br />
citlivý na teplotu<br />
Roztok A:<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH = 8.4 20 ml<br />
aspartic acid 240 mg<br />
α-ketoglutaric acid 40 mg<br />
Roztok B:<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH = 8.4 20 ml<br />
pyrodoxal-5-phosphate 25 mg<br />
Fast Blue BB salt 50 mg<br />
Fast Violet B salt 50 mg<br />
Roztok A připravovat na světle dostatečně dlouho (min. 15 minut) předem, při rozpouštění<br />
nutno zahřát na cca 50°C, poté nechat zchladnout na pokojovou teplotu. Roztoky A a B<br />
smícháme těsně před inkubací ve tmě (!) a ihned nalijeme na gel. Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
Po inkubaci slijeme barvicí směs, krátce gel opláchneme destilovanou dobou a fixujeme<br />
fixačním roztokem. Dobu fixace je nutno vyzkoušet, u některého materiálu možno přes noc,<br />
někdy ale začínají proužky po určité době (někdy jen 15 min.) slábnout, v té chvíli je nutno<br />
fixaci ukončit. Po skončení fixace slijeme fixační roztok (obsahuje methanol – nebezpečný<br />
odpad!) a gel oplachujeme v destilované vodě, kterou průběžně měníme (dokud je z gelu<br />
zřetelně cítit kys. octová).<br />
DIA – diaphorase<br />
E.C. 1.6.-.- – monomer, dimer, tetramer – c, m – 1 až 4<br />
barví se většinou poměrně rychle, pozor na přebarvení; obvykle alespoň jeden dobře čitelný monomerní lokus +<br />
nějaké další, čtení ale někdy komplikováno sekundárními pruhy<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH = 8.0 50 ml<br />
NADH (reduced) 13 mg<br />
MTT 5 mg<br />
2,6 dichlorindophenol 2 mg (sodium salt hydrate)<br />
Barvení při 37°C ve tmě<br />
ENP – endopeptidase<br />
E.C. 3.4.23.6 – monomer – ? – ?<br />
0,1M Tris–maleic acid buffer, pH = 5.5 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování)<br />
BANA 5 mg (β-N-benzoyl-DL-arginine-α-naphthylamide.HCl)<br />
Fast Black K salt 5 mg<br />
MgCl2.6H2O 25 mg<br />
Po skončení elektroforézy neoplachujeme kvůli pH v destilované vodě, ale v předem<br />
vychlazeném pufru (je proto třeba proto připravit asi 100 ml pufru). Barvení při 37°C ve tmě.<br />
38
EST – esterases<br />
Isozymy<br />
E.C. 3.1.1. – monomer, dimer – c – 2 až 10<br />
poměrně nespecifické barvení, vždy více lokusů; dosti variabilní, vhodný např. pro identifikaci klonů, ale<br />
alelická interpretace většinou obtížná (prolínání lokusů, apod.); poměrně citlivý na teplotu<br />
Esterase buffer, pH = 6.45 60 ml (+ asi 50 ml na oplachování)<br />
1-naphthyl acetate 25 mg (předem rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu)<br />
2-naphthyl phosphate 25 mg (předem rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu)<br />
Fast Blue BB Salt 50 mg<br />
Gel po skončení elektroforézy neoplachujeme v dest. vodě, ale v esterasovém pufru (kvůli<br />
pH), je tedy potřeba připravit min. 100 ml pufru. Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
G6PDH (= G6PD) – glucose-6-phosphate dehydrogenase<br />
E.C. 1.1.1.49 – dimer – c, p – 2<br />
někdy poměrně rychlé barvení, proto pozor na přebarvení<br />
0,05M Tris–HCl buffer, pH = 8,0 50 ml<br />
glucose-6-phosphate 50 mg (disodium salt)<br />
MgCl2.6H2O 50 mg<br />
MTT 10 mg (možno nahradit NBT)<br />
NADP + 6 mg<br />
PMS 2 mg<br />
Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
GLU – β-D-glucosidase (= β-D-glucoside glucohydrolase)<br />
E.C. 3.2.1.21 – dimer – c – 1<br />
0,05M potassium phosphate buff.,pH=6,5 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování)<br />
6-bromo-2-naphthyl-β-D-glucoside 50 mg (rozpustit v 5 ml N,N’-dimethylformamidu)<br />
PVP-40 1 g<br />
Fast Blue BB salt 50 mg<br />
Po skončení elektroforézy neoplachujeme kvůli pH v destilované vodě, ale v předem<br />
vychlazeném pufru (je proto třeba proto připravit asi 100 ml pufru). Inkubace ve tmě při 32°C<br />
60 minut a potom v pokojové teplotě přes noc (ve tmě!)<br />
GDH – glutamate dehydrogenase<br />
E.C. 1.4.1.2 – hexamer, monomer (?) – c – 1<br />
0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,0 50 ml<br />
Na-glutamate 200 mg<br />
CaCl2<br />
50 mg (anhydrous)<br />
NAD + 10 mg<br />
MTT 10 mg<br />
PMS 2 mg<br />
Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
39
HEX – hexokinase (= glucokinase)<br />
E.C. 2.7.1.1 – monomer – c, m, p – 2 až 3<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=7,1 50 ml<br />
glucose 45 mg<br />
MgCl2.6H2O 50 mg<br />
ATP 12,5 mg (disodium salt)<br />
NADP + 12,5 mg<br />
NBT 10 mg<br />
PMS 1,5 mg<br />
glucose-6-phosphate dehydrogenase 40 µl (= 40 U, zásobní roztok 1 U / µl)<br />
Isozymy<br />
Dehydrogenasu přidáváme až jako poslední těsně do již hotového roztoku před aplikací na<br />
gel, promícháme. Inkubace ve tmě při 37°C. Existují i alternativní barvení (vyšší pH, náhrada<br />
některých složek).<br />
IDH – isocitrate dehydrogenase<br />
E.C. 1.1.1.42 – dimer – c – 1<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,0 50 ml<br />
isocitric acid 50 mg (trisodium salt)<br />
MgCl2.6H2O 80 mg<br />
NADP + 10 mg<br />
MTT 8 mg<br />
NBT 8 mg<br />
PMS 2 mg<br />
Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
LAP – leucine aminopeptidase (= AMP – aminopeptidase)<br />
E.C. 3.4.11.- – monomer – c – 2 až 3<br />
obvykle dosti variabilní; velmi citlivý na teplotu a kvalitu vzorku<br />
Roztok A:<br />
0,2M Tris–maleate buffer, pH = 6.0 30 ml (+ asi 50 ml na oplachování)<br />
MgCl2.6H2O 60 mg<br />
L-leucyl-β-naphthylamide hydrochloride 35 mg (rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu, ve tmě)<br />
Roztok B:<br />
0,2M Tris–maleate buffer, pH = 6.0 30 ml<br />
Fast Black K salt 25 mg<br />
Gel po skončení elektroforézy neoplachujeme v dest. vodě, ale v pufru (kvůli pH), je tedy<br />
potřeba připravit min. 100 ml pufru. Gel inkubujeme při 32°C nejprve pouze v roztoku A, po<br />
10 min. přidáme roztok B.<br />
40
MDH – malate dehydrogenase<br />
E.C. 1.1.1.37 – dimer – c, m – 3<br />
Isozymy<br />
Roztok A:<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=7,5 20 ml<br />
malic acid 150 mg (po rozpuštění upravit pH pomocí Na2CO3 na 7,5)<br />
Roztok B:<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=7,5 30 ml<br />
NAD + 15 mg<br />
NBT 15 mg (možno nahradit 10 mg MTT)<br />
PMS 2 mg<br />
Smísíme roztoky a aplikujeme na gel, inkubujeme ve tmě při 32°C.<br />
ME – malic enzyme<br />
E.C. 1.1.1.40 – tetramer – c – 1<br />
0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,0 50 ml<br />
malic acid 150 mg<br />
MgCl2.6H2O 50 mg<br />
NADP + 5 mg<br />
MTT 10 mg<br />
PMS 2 mg<br />
Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
NADHDH (= NDH) – NADH dehydrogenase<br />
E.C. 1.6.99.- – monomer, dimer, tetramer (?) – c, m, p – 1-4 (?)<br />
většinou je tento název používán i pro DIA, resp. nejsou oba enzymové systémy odlišovány (katalyzují téměř<br />
totéž, někdy se oběma barveními barví stejné enzymy, ale někdy ne)<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,4 30 ml<br />
menadion 15 mg (rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu)<br />
NADH (reduced) 17,5 mg<br />
MTT 20 mg<br />
Inkubace ve tmě při 37°C.<br />
PRX – peroxidase<br />
E.C. 1.11.1.7 – monomer – c – 2-13<br />
0,05M sodium acetate buffer, pH=5,0 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování)<br />
CaCl2<br />
11 mg (anhydrous)<br />
3% H2O2<br />
250 µl<br />
3-amino-9-ethyl carbazole 25 mg (rozpustit v 5 ml N,N’-dimethylformamidu)<br />
Gel po skončení elektroforézy neoplachujeme v dest. vodě, ale v pufru (kvůli pH), je tedy<br />
potřeba připravit min. 100 ml pufru. Inkubace v lednici. Po vyvinutí proužků fixace ve<br />
fixačním roztoku.<br />
41
Isozymy<br />
PGI – phosphoglucoisomerase (= GPI – glucosephosphate isomerase, phosphohexose<br />
isomerase)<br />
E.C. 5.1.3.9 – dimer – c, p – 2<br />
někdy se spolu s PGI barví další enzymy (které následují v kaskádě za ním, 6PGDH nebo G6PDH), ale<br />
interpretace je možná, pokud se lokusy nepřekrývají<br />
0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,0 50 ml<br />
fructose-6-phosphate 20 mg<br />
MgCl2.6H2O 24 mg<br />
NADP + 10 mg<br />
MTT 10 mg<br />
PMS 2 mg<br />
glucose-6-phosphate dehydrogenase 7 µl (= 7 U, zásobní roztok 1 U / µl)<br />
Dehydrogenasu přidáváme až jako poslední těsně do již hotového roztoku před aplikací na<br />
gel, promícháme. Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
PGM – phosphoglucomutase<br />
E.C. 2.7.5.1 – monomer – c, p – 2<br />
někdy se spolu s PGM barví další enzymy (které následují v kaskádě za ním, 6PGDH nebo G6PDH), ale<br />
interpretace je možná, pokud se lokusy nepřekrývají<br />
0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,5 50 ml<br />
glucose-1-phosphate 50 mg<br />
MgCl2.6H2O 24 mg<br />
NADP + 10 mg<br />
MTT 10 mg<br />
PMS 2 mg<br />
glucose-6-phosphate dehydrogenase 7 µl (= 7 U, zásobní roztok 1 U / µl)<br />
Dehydrogenasu přidáváme až jako poslední těsně do již hotového roztoku před aplikací na<br />
gel, promícháme. Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
6-PGDH (= 6-PGD, PGD) – 6-phosphogluconate dehydrogenase<br />
E.C. 1.1.1.44 – dimer – c, p – 2<br />
obvykle se barví rychle (pozor na přebarvení); málo citlivý na teplotu; někdy se zároveň negativně barví SOD<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,4 30 ml<br />
6-phosphogluconic acid 10 mg<br />
MgCl2.6H2O 30 mg<br />
NADP + 5 mg<br />
MTT 5 mg<br />
PMS 1 mg<br />
Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
42
SKDH (= SKD) – shikimate dehydrogenase<br />
Isozymy<br />
E.C. 1.1.1.25 – monomer – c, p – 1,2<br />
obvykle se barví rychle (pozor na přebarvení); málo citlivý na teplotu; někdy se zároveň negativně barví SOD<br />
0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,4 30 ml<br />
shikimic acid 30 mg<br />
NADP + 5 mg<br />
MTT 6 mg<br />
PMS 1 mg<br />
Inkubace ve tmě při 32°C.<br />
SOD – superoxide dismutase (= TO – tetrazolium oxidase)<br />
E.C. 1.15.1.1 – dimer, tetramer – c, p – 3<br />
negativní barvení; málo citlivý na teplotu<br />
0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,2 50 ml<br />
NBT 5 mg<br />
EDTA 4,5 mg<br />
riboflavine 1,5 mg<br />
Inkubace ve tmě při 37°C po dobu 20 min a potom na světle (ideálně pod lampou) za<br />
laboratorní teploty až do objevení světlých proužků na tmavém pozadí. Nenechávat na světle<br />
zbytečně dlouho, časem (cca 20 min., třeba vyzkoušet) proužky začínají slábnout (pozadí se<br />
barví i do nich).<br />
43
Obsluha přístrojů<br />
Obsluha přístrojů<br />
Měření koncentrace DNA pomocí spektrofotometru Biowave II<br />
• Přístroj se zapíná/vypíná černým tlačítkem (hlavní spínač) vlevo na přední straně přístroje.<br />
• K pohybu po displeji a výběru požadované (zvýrazněné) volby slouží šipkové klávesy.<br />
• Číselná tlačítka vpravo na přístroji (klávesnice) slouží k psaní textu, vkládání hodnot;<br />
opakovaným stiskem se přepíná mezi malými a velkými písmeny; klávesa 1 slouží<br />
k vkládání mezery; klávesa „C“ = backspace.<br />
• Červené tlačítko (Escape/Cancel) slouží k návratu do předchozího kroku; zastavení měření.<br />
• Modré tlačítko (0A/100%T) slouží k nastavení blanku.<br />
• Zelené tlačítko (Enter) slouží k potvrzení výběru a k provedení měření<br />
• Pro měření koncentrace DNA zvolíme stisknutím příslušného čísla funkci „Life Science“<br />
→ „Nucleic Acid“ → „DNA“<br />
• DNA neměříme přímo, ale zředěnou (koncentrace by mohla být mimo měřitelnost přístroje<br />
a hlavně – nemusíme svojí DNA plýtvat); minimální množství roztoku v kyvetě je 70 µl<br />
• Zadáme ředění vzorku („Dilution Factor“), např. při ředění 1:13 (5 µl DNA + 65 µl vody)<br />
je ředící faktor 14; zvolíme jednotky (ng/µl) a potvrdíme nastavení (ostatní parametry<br />
necháme v původním nastavení)<br />
• Připravíme si referenční vzorek (blank). Bude jím buď voda nebo roztok, ve kterém je<br />
DNA skladována (Elution Buffer D z kitu, TE pufr, apod.) – ve druhém případě tento<br />
roztok ředíme vodou stejným poměrem jako budeme používat pro měření DNA.<br />
• Vložíme kyvetu s referencí a stiskneme modré tlačítko pro nastavení blanku, přístroj ukáže<br />
nulovou absorbanci<br />
• Při měření používáme stále stejnou orientaci kyvety (jedna strana kyvety je opatřena<br />
šipkou)<br />
• Kyvetu několikrát vypláchneme destilovanou vodou ze střičky, kapky vody z kyvety<br />
vyklepeme na buničinu, příp. vysajeme zbytek vody ze dna kyvety pipetou. Kyvetu<br />
opakovaně proplachujeme mezi jednotlivými vzorky.<br />
• Do kyvety pipetujeme zvolené množství vody a DNA, promícháme pipetováním, vložíme<br />
kyvetu se vzorkem do přístroje a stiskneme zelené tlačítko pro měření; přístroj ukáže<br />
koncentraci našeho originálního vzorku DNA (nikoliv koncentraci v kyvetě!)<br />
• Zaznamenáme hodnoty z displeje<br />
• Po skončení měření vyjmeme kyvetu a přístroj vypneme<br />
• Kyvetu necháme odmočit v jarové vodě, vypláchneme destilovanou vodou a necháme<br />
vyschnout na kousku buničiny<br />
44
Zacházení s gradientovým termocyclerem TC-XP Bioerg<br />
• přístroj se zapíná v zadní části přístroje vedle přívodní šňůry<br />
Obsluha přístrojů<br />
• přístroj ovládáme pomocí tlačítek F1–F5 dole pod displejem; pohybujeme se pomocí šipek<br />
vlevo na přístroji, potvrzujeme Entrem<br />
• po spuštění se na základní obrazovce objeví tři ikony:<br />
- ikona File – po stisknutí se zobrazí seznam uživatelů (Users), názvy souborů (File<br />
name) datum vytvoření programu (Save date)<br />
- ikona System – systémová nastavení, např.: nastavení teploty víka, zapnutí/vypnutí<br />
zvukového signálu po skončení programu<br />
- ikona Run<br />
Vytvoření nového programu<br />
• Pokud chceme měnit parametry stávajícího programu označeného kurzorem, stiskneme<br />
klávesu Edit<br />
• Pro vytvoření nového programu stiskneme klávesu F2 (New File)<br />
• Stiskem klávesy F1 (+Seg) zadáváme parametry jednotlivých kroků (tzv. segmentů) jako<br />
teplotu (Temp), čas (Time), rychlost nárůstu/poklesu teploty (tzv. Ramping rate – Ramp);<br />
přednastavená hodnota „#.#“ ve sloupci Ramp značí nejvyšší možnou rychlost<br />
nárůstu/poklesu teplot<br />
• Stiskem klávesy F2 (+Cycle) nastavíme počet cyklů a průběh cyklu, např. from 02 to 04<br />
• Pro tzv. touchdown PCR využijeme sloupec +Temp a +Time<br />
• Sloupec Grad slouží pro vytvoření parametrů teplotního gradientu, číslice 12 znázorňuje<br />
gradient 12 stupňů mezi první a poslední pozicí bloku; teplota mezi jednotlivými pozicemi<br />
se nastaví automaticky, její nárůst od první k poslední pozici je progresivní<br />
• Po vytvoření programu stiskneme klávesu F5 (Save), zadáme jméno uživatele a název<br />
vytvořeného programu a potvrdíme klávesou F3 (Save)<br />
Spuštění programu<br />
• Vložíme PCR zkumavky, stripy nebo destičku se vzorky.<br />
• Zaklapneme víko bloku a dotáhneme (ne silou!)<br />
• Stiskneme klávesu F1 (File), vyhledáme svůj uživatelský profil a po označení příslušného<br />
programu kurzorem stiskneme klávesu F5 (Run)<br />
• Po spuštění programu se na displeji zobrazí jméno uživatele, název programu, celkový čas,<br />
zbývající čas, číslo a grafický průběh právě probíhajícího cyklu, počet cyklů, teplota víka<br />
apod.<br />
Zastavení programu<br />
• Po skončení programu stiskem klávesy Stop a opětovným potvrzením stiskem F1 (Stop).<br />
45
Zacházení s termocyclerem Biometra T3000 se třemi bloky<br />
• Přístroj se zapíná/vypíná na přední straně vpravo dole tlačítkem „Power“<br />
Obsluha přístrojů<br />
• přístroj ovládáme pomocí tlačítek dole pod displejem a na pravé straně, pohybujeme se<br />
pomocí šipek, potvrzujeme Entrem, mažeme tlačítkem Cancel<br />
• základní obrazovka ukazuje několik ikon:<br />
- Ikona Info: zobrazení informací o blocích – právě činný (active) nebo volný (inactive)<br />
- Ikona Systém – informace o typu přístroje, nastavení signalizace konce programu,<br />
navolení požadovaného jazyka, nastavení kontrastu na displeji apod.<br />
- Ikona Start/stop – zapnutí/vypnutí programu<br />
- Ikona Edit – vytvoření nového programu nebo změna parametrů již uloženého<br />
programu<br />
Vytvoření nového programu<br />
• Stiskneme klávesu Edit.<br />
• Vybereme adresář, do kterého chceme program uložit, stiskneme Enter.<br />
• Vybereme podadresář a klikneme na Edit.<br />
• Po zobrazení abecedy vložíme název programu a potvrdíme stiskem Name OK.<br />
• Nastavíme teplotu víka (Lid Temperature) na 99°C a zapneme funkci předehřívání<br />
(Preheating ON), potvrdíme stiskem Enter.<br />
• Nastavíme teplotní program – teplotu (Temp) vkládáme čísly, čas (Time) zadáváme buď<br />
v sekundách nebo lze minuty, příp. hodiny oddělit tečkou („3.30“ znamená 3 min 30 s,<br />
„1.5.0“ znamená 1 hod 5 min 0 s,); pro nastavení chlazení po skončení programu<br />
stiskneme „0“, objeví se „Pause“<br />
• Pro nastavení cyklování, najedu na konec řádku základního cyklu a do sloupce „←“<br />
vložíme číslo, které udává počáteční krok základního cyklu (k tomuto kroku, např. 2 se<br />
bude přístroj po každém dokončeném základním cyklu vracet a opakovat cyklus od tohoto<br />
kroku); do sloupce „#“ vložíme počet cyklů -1<br />
• program uložím „Save pgm“<br />
Spuštění programu<br />
• Vložíme PCR zkumavky, stripy nebo destičku.<br />
• Zaklapneme víko bloku a dotáhneme (ne silou!)<br />
• Stiskneme Start/Stop, vybereme blok a po rozbalení adresáře program, který chceme<br />
spustit a stiskneme Start.<br />
• Po spuštění programu se začne zahřívat víko, displej zobrazuje teplotu a čas právě<br />
probíhajícího kroku, teplotu víka; čas do konce programu se objeví po stisknutí „Info“.<br />
• Ve chvíli, kdy víko dosáhne zadané teploty (standardně 99 °C), je automaticky přitlačeno<br />
na zkumavky, začíná vlastní reakce a na displeji je znázorňován průběh reakce.<br />
• Po ukončení programu se zapne zvukový signál, povolíme víko a můžeme vyndat produkty<br />
PCR reakce.<br />
• V průběhu PCR reakce je možné vytvářet či editovat další programy.<br />
46
Měření na pH-metru Hanna pH 211<br />
Kalibrace<br />
• Doporučuje se provádět nejméně 1× týdně, pro přesné měření 1× denně.<br />
Obsluha přístrojů<br />
• Pro kalibraci použijeme vždy pufr pH = 7,01 a druhý (pH = 4,01 nebo 10,01) zvolíme<br />
podle toho, jestli plánujeme měření v kyselé nebo v zásadité oblasti.<br />
• Zapneme přístroj tlačítkem vpravo pod displejem, ukáže se hodnota pH a teplota.<br />
• Elektrodu i teploměr důkladně opláchneme destilovanou vodou ze střičky, opatrně osušíme<br />
buničinou.<br />
• Vložíme elektrodu i teploměr do kalibračního pufru pH = 7,01. Otvor na spodní části<br />
kyvety (nad baničkou) musí být pod hladinou pufru!<br />
• Necháme chvíli ustálit, spustíme kalibraci tlačítkem „CAL“.<br />
• Přístroj začne kalibrovat, vlevo bliká „Not ready“. Počkáme, dokud se nápis nezmění na<br />
„Ready CFM“, potvrdíme stiskem tlačítka „CFM“.<br />
• Šipkami (označeny °C / °C) vybereme hodnotu pH druhého kalibračního pufru<br />
(zobrazuje se na displeji úplně vpravo).<br />
• Vyjmeme elektrodu i teploměr z pufru, opláchneme destilovanou vodou, vysušíme<br />
a vložíme do druhého kalibračního pufru.<br />
• Bliká „Not ready“, počkáme, dokud se nápis nezmění na „Ready CFM“, dokončíme<br />
kalibraci stiskem tlačítka„CFM“.<br />
• Pokud ihned nepokračujeme měřením, vypneme přístroj.<br />
• Vyjmeme elektrodu i teploměr, opláchneme destilovanou vodou, osušíme buničinou<br />
a vložíme do čepičky s uchovávacím pufrem (Storage solution; pokud v něm nebude<br />
ponořená celá banička elektrody, doplnit).<br />
Měření pH<br />
• Zapneme přístroj.<br />
• Opláchneme elektrodu i teploměr destilovanou vodou, opatrně osušíme buničinou.<br />
• Vložíme elektrodu i teploměr do roztoku, otvor na spodní části kyvety (nad baničkou) musí<br />
být pod hladinou.<br />
• Na displeji se zobrazuje teplota a hodnota pH. Počkáme, než se hodnota pH ustálí.<br />
• Po skončení měření, pokud nepokračujeme dalším roztokem, vypneme přístroj.<br />
• Vyjmeme elektrodu i teploměr, opláchneme destilovanou vodou, osušíme buničinou<br />
a vložíme do čepičky s uchovávacím pufrem (Storage solution; pokud v něm nebude<br />
ponořená celá banička elektrody, doplnit).<br />
47
1) Elektroforéza a příprava gelů<br />
TBE pufr (zásobní roztok)<br />
Roztoky a pufry<br />
10× konc. 20× konc.<br />
Tris-base 108 g 216 g<br />
Boric acid 55 g 110 g<br />
Na2-EDTA 9,3 g 18,6 g<br />
rozpustit v dest. H2O, doplnit do 1000 ml 1000 ml<br />
Ředění na konc. 1× (elektroforéza, příprava gelů):<br />
10× konc. 20× konc.<br />
1 l 5l 1 l 5 l<br />
TBE 100 ml 500 ml 50 ml 250 ml<br />
dest. H2O 900 ml 4500 ml 950 ml 4750 ml<br />
TAE pufr (10× konc. zásobní roztok)<br />
1000 ml<br />
Tris-base 48,46 g<br />
Acetic acid (glacial) 12,01 g<br />
Na2-EDTA 3,72 g<br />
rozpustit v dest. H2O, doplnit do 1000 ml<br />
Tris-glycine<br />
1 l 3 l<br />
Tris-base 2,5 g 7,5 g<br />
Glycine 18 g 54 g<br />
dest. H2O ~ 900 ml ~ 2700 ml<br />
úprava pH pomocí HCl pH = 8,3<br />
doplnit dest. H2O do objemu 1 l 3 l<br />
Roztoky a pufry<br />
Ředění do spodní vany elektroforézy: Tris-glycine buffer 2400 ml + dest. H2O 1800 ml<br />
Pufr pro separační gel – isozymy (1,82M Tris-HCl, pH = 8,9)<br />
50 ml 100 ml 200 ml<br />
Tris-base 11,05 g 22,1 g 44,2 g<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 170 ml<br />
úprava pH pomocí HCl pH = 8,9<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 200 ml<br />
Pufr pro zaostřovací gel – isozymy (69mM Tris-H3PO4, pH = 6,9)<br />
50 ml 100 ml 200 ml<br />
Tris-base 0,42 g 0,83 g 1,66 g<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 170 ml<br />
úprava pH pomocí H3PO4<br />
pH = 6,9<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 200 ml<br />
48
Zásobní roztok akrylamidu<br />
100 ml 200 ml<br />
Acrylamide 40 g 80 g<br />
N,N′-Methylenebisacrylamide (BIS) 1 g 2 g<br />
rozpustit v dest. H2O, doplnit do: 100 ml 200 ml<br />
Roztoky a pufry<br />
Pozor! Obě látky jsou velmi jedovaté, pracujeme v plášti, rukavicích a při vážení v roušce!<br />
Loading buffer<br />
Bromphenol Blue 0,025 g<br />
Xylene Cyanol FF 0,025 g<br />
Glycerol 3 ml<br />
SYBR Green I 20 µl<br />
doplnit sterilní dest. H2O do objemu 10 ml<br />
rozpipetovat po 1 ml, uchovávat ve tmě v –20°C.<br />
100 bp Ladder (500 µg/ml) + LB<br />
100 bp ladder 20 µl<br />
sterilní dest. H2O 180 µl<br />
Loading Buffer 40 µl<br />
λ DNA Hind III digest (500 µg/ml) + LB<br />
λ DNA Hind III digest 20 µl<br />
sterilní dest. H2O 180 µl<br />
Loading Buffer 40 µl<br />
2) Izolace, ředění a srážení DNA<br />
TE pufr (10× koncentrovaný zásobní roztok)<br />
50 ml 100 ml 250 ml 1000 ml (konc.)<br />
Tris-base 0,61 g 1,21 g 3,03 g 12,11 g (0,1M)<br />
Na2-EDTA 0,19 g 0,37 g 0,93 g 3,72 g (0,1M)<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 220 ml ~ 900 ml<br />
úprava pH pomocí HCl / NaOH pH = 8,0 pH = 8,0<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 250 ml 1000 ml<br />
T0.1E pufr (10× koncentrovaný zásobní roztok)<br />
50 ml 100 ml 250 ml 1000 ml (konc.)<br />
Tris-base 0,61 g 1,21 g 3,03 g 12,11 g (0,1M)<br />
Na2-EDTA 0,019 g 0,037 g 0,093 g 0,37 g (0,01M)<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 220 ml ~ 900 ml<br />
úprava pH pomocí 1M HCl pH = 8,0<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 250 ml 1000 ml<br />
49
100mM Tris-HCl pufr, pH = 8,3<br />
50 ml 100 ml 250 ml<br />
Tris-base 0,61 g 1,21 g 3,03 g<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 220 ml<br />
úprava pH pomocí 1M HCl pH = 8,3<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 250 ml<br />
0,5M NaOH – viz část 7) Ostatní<br />
Roztoky a pufry<br />
2% CTAB<br />
100 ml 250 ml 500 ml (konc.)<br />
CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) 2,0 g 5,0 g 10,0 g (2% w/v)<br />
Tris-base 1,21 g 3,03 g 6,06 g (0,1M)<br />
Na2-EDTA 0,74 g 1,86 g 3,72 g (0,02M)<br />
NaCl 8,18 g 20,45 40,91 g (1,4M)<br />
dest. H2O ~ 80 ml ~ 220 ml ~ 450 ml<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml<br />
Sodium acetate<br />
3M 0,05M, pH = 5,0<br />
100 ml 100 ml 200 ml 500 ml<br />
Sodium acetate (anhydrous) 24,61 g 0,41 g 0,82 g 2,05 g<br />
dest. H2O - ~ 80 ml ~ 180 ml ~ 450 ml<br />
úprava pH pomocí kys. octové - pH = 5,0<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 100 ml 200 ml 500 ml<br />
3) AFLP<br />
R/L buffer (10× koncentrovaný)<br />
Tris-base 0,121 g (0,1M)<br />
dest. H2O 8 ml<br />
upravit pH pomocí kys. octové pH = 7,5<br />
magnesium acetate tetrahydrate 0,214 g (0,1M)<br />
potassium acetate 0,491 g (0,5M)<br />
dithiothreitol (DTT) 0,077 g (0,05M)<br />
doplnit dest. H2O do objemu 10 ml<br />
rozpipetovat po 1 ml, uchovávat ve tmě v –20°C.<br />
50
4) Isozymy – izolace<br />
0,1M Tris-HCl pufr, pH = 8,3<br />
50 ml 100 ml 250 ml<br />
Tris-base 0,61 g 1,21 g 2,42 g<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 220 ml<br />
úprava pH pomocí HCl pH = 8,3<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 250 ml<br />
75mM Tris-H3PO4 pufr, pH = 7,5<br />
50 ml 100 ml 250 ml<br />
Tris-base 0,45 g 0,91 g 2,27 g<br />
dest. H2O ~ 35 ml ~ 80 ml ~ 220 ml<br />
úprava pH pomocí H3PO4<br />
pH = 7,5<br />
doplnit dest. H2O do objemu 50 ml 100 ml 250 ml<br />
Izolační pufr „Viola“ (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)<br />
Roztoky a pufry<br />
30 ml 50 ml 100 ml (konc.)<br />
0.1M Tris-HCl pH = 8.3 pufr 30 ml 50 ml 100 ml (0,1M)<br />
ascorbic acid 58 mg 97 mg 194 mg (11mM)<br />
sodium metabisulfite 148 mg 247 mg 494 mg (26 mM)<br />
2-mercaptoethanol 148 µl 246 µl 492 µl (70 mM)<br />
úprava pH pomocí HCl pH = 8,0 (před přidáním PVP!)<br />
PVP 1,2 g 2 g 4 g (4% w/v)<br />
Nelze dlouhodobě uchovávat, krátkodobě v lednici<br />
Izolační pufr „Gentiana“ (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)<br />
30 ml 50 ml 100 ml (konc.)<br />
0.1M Tris-HCl pH = 8.3 pufr 30 ml 50 ml 100 ml (0,1M)<br />
L-glutathione reduced 0,3 g 0,5 g 1 g (1% w/v)<br />
MgCl2.6H2O 60 mg 100 mg 200 mg (10 mM)<br />
2-mercaptoethanol 30 µl 50 µl 100 µl (0,1% v/v)<br />
sucrose 1,5 g 2,5 g 5 g (5% w/v)<br />
Nelze dlouhodobě uchovávat, krátkodobě v lednici<br />
Izolační pufr „Luzula“ (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)<br />
30 ml 50 ml 100 ml (konc.)<br />
75mM Tris-H3PO4 pufr, pH = 7,5 30 ml 50 ml 100 ml (75mM)<br />
ascorbic acid 15 mg 25 mg 50 mg (3 mM)<br />
1,4-Dithioerythritol (DTE) 36 mg 60 mg 120 mg (7,8 mM)<br />
2-mercaptoethanol 30 µl 50 µl 100 µl (0,1% v/v)<br />
PVP 1,2 g 2 g 4 g (4% w/v)<br />
Nelze dlouhodobě uchovávat, krátkodobě v lednici<br />
51
5) Isozymy – barvení<br />
Roztoky a pufry<br />
Tris-HCl pufry<br />
0,1M Tris-HCl 0,05M Tris-HCl<br />
100 ml 250 ml 500 ml 100 ml 250 ml 500 ml<br />
Tris-base 1,21 g 3,03 g 6,06 g 0,61 g 1,51 g 3,03 g<br />
dest. H2O ~ 80 ml ~ 220 ml ~ 450 ml ~ 80 ml ~ 220 ml ~450 ml<br />
úprava pH pomocí HCl pH = 8,4 pH = 8,5<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml 100 ml 250 ml 500 ml<br />
Návod platí zásobní roztoky s nejvyšším používaným pH, pufry stejných koncentrací s nižším<br />
pH připravíme z těchto zásobních roztoků úpravou pH pomocí HCl.<br />
Tris-Maleate (Tris-Maleic acid)<br />
0,1M Tris-Maleate, pH = 5,5 0,2M Tris-Maleate, pH = 6,0<br />
100 ml 200 ml 500 ml 100 ml 200 ml 500 ml<br />
Tris-base 0,61 g 1,21 g 3,03 g 1,21 g 2,42 g 6,06 g<br />
Maleic acid 1,61 g 2,32 g 5,80 g 2,32 g 4,64 g 11,61 g<br />
dest. H2O ~ 80 ml ~ 180 ml ~ 450 ml ~ 80 ml ~ 220 ml ~450 ml<br />
úprava pH pomocí NaOH pH = 5,5 pH = 6,0<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 200 ml 500 ml 100 ml 200 ml 500 ml<br />
Esterasový pufr (Esterases buffer, pH = 6,45)<br />
100 ml 200 ml 500 ml (konc.)<br />
NaH2PO4 . 2 H2O 1,56 g 3,12 g 7,80 g (0,1M)<br />
Na2HPO4 . 12 H2O 0,72 g 1,43 g 3,59 g (0,02M)<br />
dest. H2O ~ 80 ml ~ 180 ml ~ 450 ml<br />
úprava pH pomocí NaOH pH = 6,45<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 200 ml 500 ml<br />
Potassium phosphate buffer<br />
a) zásobní 0,1M K2HPO4 c) smíchání zás. roztoků<br />
100 ml 250 ml 500 ml pH K2HPO4 KH2PO4<br />
K2HPO4 (bezv.) 1,74 g 4,35 g 8,71 g 5,8 8,5 ml 91,5 ml<br />
dest. H2O ~ 80 ml ~ 220 ml ~ 450 ml 6,0 13,2 ml 86,8 ml<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml 6,2 19,2 ml 80,8 ml<br />
6,4 27,8 ml 72,2 ml<br />
b) zásobní 0,1M KH2PO4 6,5 32,95 ml 67,05 ml<br />
100 ml 250 ml 500 ml 6,6 38,1 ml 61,9 ml<br />
KH2PO4 (bezv.) 1,36 g 3,40 g 6,80 g 6,8 49,7 ml 50,3 ml<br />
dest. H2O ~ 80 ml ~ 220 ml ~ 450 ml 7,0 61,5 ml 38,5 ml<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml 7,2 71,7 ml 28,3 ml<br />
7,4 80,2 ml 19,8 ml<br />
7,6 86,6 ml 13,4 ml<br />
roztok o finální koncentraci 0,05M připravíme naředěním<br />
hotového 0,1M roztoku daného pH, upravíme pH pomocí 7,8 90,8 ml 9,2 ml<br />
K2HPO4 (zvýšení) nebo KH2PO4 (snížení) 8,0 94 ml 6 ml<br />
52
6) Isozymy – fixace<br />
Fixační roztok (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)<br />
500 ml 1000 ml<br />
Kys. octová 50 ml 100 ml<br />
Glycerol 50 ml 100 ml<br />
dest. H2O 150 ml 300 ml<br />
Methanol 250 ml 500 ml<br />
7) Ostatní<br />
1M HCl<br />
100 ml 250 ml 500 ml<br />
dest. H2O ~ 70 ml ~ 200 ml ~ 400 ml<br />
konc. HCl (35%) 8,83 ml 22,07 ml 44,14 ml<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml<br />
Roztoky a pufry<br />
Roztoky NaOH<br />
0,5M NaOH 1M NaOH 10M NaOH<br />
100 ml 250 ml 100 ml 250 ml 100 ml 250 ml<br />
dest. H2O ~ 70 ml ~ 220 ml ~ 70 ml ~ 220 ml ~ 70 ml ~ 200 ml<br />
NaOH (bezvodý) 2 g 5 g 4 g 10 g 40 g 100 g<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 100 ml 250 ml 100 ml 250 ml<br />
Při přípravě 0,5M NaOH pro izolaci DNA použít místo destilované vody Milli-Q vodu,<br />
vysterilizovat v autoklávu.<br />
1M H3PO4<br />
100 ml 250 ml 500 ml<br />
dest. H2O ~ 70 ml ~ 200 ml ~ 400 ml<br />
konc. H3PO4 (85%) 6,74 ml 16,86 ml 33,71 ml<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml<br />
1M kys. octová<br />
100 ml 250 ml 500 ml<br />
dest. H2O ~ 70 ml ~ 200 ml ~ 400 ml<br />
kys. octová (čistá) 5,72 ml 14,30 ml 28,60 ml<br />
doplnit dest. H2O do objemu 100 ml 250 ml 500 ml<br />
53