PChP - Bílkoviny mléka - WP+denatur.pdf
PChP - Bílkoviny mléka - WP+denatur.pdf
PChP - Bílkoviny mléka - WP+denatur.pdf
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Procesní chemie potravin<br />
BÍLKOVINY MLÉKA<br />
Sérové bílkoviny<br />
Sérové bílkoviny - genetické varianty<br />
β-Laktoglobulin (β-LG)<br />
162 AK<br />
MW ~ 18 300,<br />
2 disulfidové můstky, 1x volná -SH<br />
2-4 g/L <strong>mléka</strong>; 50 % syrovátkových bílkovin (10 % celk. bílkovin<br />
<strong>mléka</strong>)<br />
agregace v závislosti na pH a teplotě<br />
biologická funkce<br />
denaturace<br />
při i teplotách teplot ch > 72 °C<br />
-SH SH skupiny<br />
vazba na CN<br />
Sérové bílkoviny<br />
základní charakteristika<br />
rozpustnost<br />
tepelná tepeln denaturace<br />
Cys, Cys,<br />
fosforylace<br />
obsah v mléce<br />
nutriční hodnota<br />
separace frakcí<br />
koagulace<br />
gelová gelov filtrace<br />
ionexy<br />
elektroforéza<br />
elektrofor za<br />
78 %<br />
nomenklatura - 6. revize (Farrell et al., 2004)<br />
β-laktoglobulin (β-LG)<br />
genetické varianty A, B , C, …<br />
α-laktalbumin (α-LA)<br />
genetické varianty A, B, C<br />
sérový albumin (BSA)<br />
imunoglobuliny (Ig)<br />
nomeklatura podle lidských Ig<br />
v mléce zejména IgG1, IgG2, IgM, IgA<br />
minoritní bílkoviny<br />
Frakcionace dusíkatých frakcí podle Rowlanda<br />
22 %<br />
4 %<br />
Ig 14 %<br />
β-Lg, α-La, BSA<br />
Primární struktura β-laktoglobulinu<br />
1
Sekundární a terciární struktura β-laktoglobulinu<br />
vysoce uspořádan uspo daná struktura<br />
10-15 10 15 % α- helix<br />
43 % β-struktura struktura<br />
47 % neuspořádan<br />
neuspo daná struktura<br />
Agregace β-laktoglobulinu<br />
ß-Lg<br />
(d=3.6 nm)<br />
(ß-Lg) 2<br />
2.0 3.0 4.0-5.0 6.0-7.0 8.0<br />
Agregace β-laktoglobulinu<br />
(ß-Lg) 8<br />
pH<br />
> 40 °C<br />
Observed Ligand Binding Site (Congrilait 029)<br />
Reproduced from Wu et al.<br />
J.Biol.Chem. 274, 170 (1999)<br />
Vitamin D 2<br />
Cholesterol<br />
Binding site accommodates fatty acids, retinoids, cholesterol, vitamin D and<br />
several other small, greasy molecules.<br />
Agregace β-laktoglobulinu<br />
α-Laktalbumin (α-LA)<br />
123 AK (Asp, Cys,Trp)<br />
MW ~ 14 000<br />
4 disulfidové můstky, ne volná -SH<br />
1-1,5 g/L <strong>mléka</strong>; 20 % syrovátkových bílkovin (3,8 % celk. bílkovin <strong>mléka</strong>)<br />
hlavní bílkovina mateřského <strong>mléka</strong><br />
AK sekvence podobná lysozymu<br />
interakce s galaktosyltransferasou<br />
HAMLET (Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells)<br />
schopnost vázat vápník stabilita<br />
termostabilita<br />
2
Primární struktura α-laktalbuminu<br />
Vazba vápníku v α-laktalbuminu<br />
Terc. struktura α-laktalbuminu<br />
Comparison of apo-bLA (red) and bLA (yellow) structures at the Ca2+-binding site and the<br />
flanking 310 helix (h2) and alpha-helix (H3)<br />
Chrysina, E. D. et al. J. Biol. Chem. 2000;275:37021-37029<br />
Rozdíly v primární struktuře genetických variant mléčných bílkovin<br />
3
Sérový albumin (BSA)<br />
obsah 0,1-0,4g/L (0,7-1,3% bílkovin <strong>mléka</strong>, 6 % SB)<br />
koncentrace v krvi je 30-40g/L<br />
MW 66 000<br />
primární struktura<br />
582 AK<br />
17 S-S vazeb, 1 volná -SH skupina<br />
homologie úseků<br />
sekundární a terciární struktura - molekula elipsovitého tvaru 3 x 12 nm<br />
biologická funkce<br />
v krvi přenos malých molekul (MK)<br />
vazba Cu 2+ , Ni 2+<br />
potencionální podpora lipolýzy<br />
Imunoglobuliny<br />
Stavba molekuly Ig<br />
dva typy řet etězc zců:<br />
těž ěžký ký H<br />
MW 52000 - 69000<br />
několik kolik typů typ γ (1,2,3,4), α (1,2), μ, ,<br />
δ a ε<br />
určuje ur uje třídu t du Ig: Ig:<br />
G, A, M, D, E<br />
IgG - gamaglobuliny<br />
IgA a IgM - makroglobuliny<br />
lehký L<br />
MW 22400<br />
typ κ a λ<br />
vazba antigenu<br />
variabilní variabiln část st V H, , V L<br />
(cca 110 AK, N-konec) N konec)<br />
konstantní konstantn část st C H, , C L<br />
tvorba polymerů polymer základn kladní jednotky<br />
IgG, IgG,<br />
IgD IgE - jako monomery<br />
IgA - dimer<br />
IgM - pentamer<br />
Imunoglobuliny (Ig)<br />
Obsah<br />
mléko 0,6-1,0g/L (11 % SB)<br />
mlezivo kolem 60 g/L<br />
v krevním séru 22 g/L<br />
MW od 79 000 do 1 000 000<br />
Biologická funkce<br />
Imunoglobuliny<br />
Model molekuly BSA<br />
IgG<br />
IgG1 (73 % Ig, Ig,<br />
v mlezivu podíl pod l ještě je zvýšený) zvý ený)<br />
IgG2 (2,5 % Ig) Ig<br />
MW 150 000 - 170 000<br />
2 x L, 2 x H řet etězec zec<br />
glycidová glycidov složka slo ka<br />
funkce<br />
IgA<br />
18 % Ig<br />
MW 300 000 - 500 000<br />
sekretován sekretov jako dimer - sekreční sekre IgA<br />
J-slo složka ka (MW 25 000)<br />
sekreční sekre složka slo ka (MW 75 000)<br />
FSC (glykoprotein<br />
( glykoprotein - a)<br />
4
Imunoglobuliny<br />
IgM<br />
6,5 % Ig<br />
MW 900 000 - 1 000 000<br />
pentamer základn kladní jednotky (J-slo (J složka) ka)<br />
vysoký obsah vázaných v zaných glycidů glycid<br />
aglutinační aglutina vlastnosti<br />
lakteniny - vysoce specifická specifick aglutinace<br />
L1 - proti Streptococcus pyogenes<br />
L2 - proti Lactococcus lactis<br />
kryoglobuliny<br />
flokulace tukových kuliček kuli ek<br />
nespecifická nespecifick reakce<br />
připojen ipojení bakterií bakteri k tukovým kuličkám kuli<br />
hromadění hromad bakterií bakteri ve vyvstáté vyvst smetaně smetan<br />
omezení omezen metabolické metabolick aktivity bakterií bakteri<br />
Minoritní bílkoviny<br />
bílkoviny obalu TK<br />
1% bílkovin b lkovin <strong>mléka</strong>, ml ka, 50 % membrány membr ny TK<br />
proteoso-peptonová frakce (PP frakce)<br />
2-3 3 % bílkovin b lkovin <strong>mléka</strong> ml ka<br />
štěpy py β-CN, CN, PP 3 ?<br />
složka slo ka 3 - membrány membr ny TK<br />
termostabilní<br />
termostabiln<br />
vazba na CN micely při i neutráln neutr lním m pH - sladká sladk x kyselá kysel syrovátka syrov tka<br />
laktoferin (LF) a transferin (TF)<br />
kravské kravsk mléko ml ko 100 mg/kg, mlezivo 1250 mg/kg<br />
600 - 700 AK, MW 75 000 - 77 000 (Lf ( Lf), ), 77 000 - 93 000 (Tf ( Tf)<br />
vazba Fe 3+ - antibakteriáln<br />
antibakteri lní účinky inky<br />
vázan zaná glycidická glycidick složka slo ka<br />
ceruloplasmin - vazba Cu<br />
proteiny s vázanými vitaminy - kyselina listová (FBP), D, B12 , B2 β2-mikroglobulin (laktolin)<br />
98 AK - homologické homologick sekvence s C H a C L řet etězc zců Ig<br />
α1-kyselý glykoprotein<br />
enzymy, růstové faktory, bifidus faktor<br />
kininogen - bradykinin<br />
DENATURACE<br />
A<br />
SRÁŽENÍ BÍLKOVIN MLÉKA<br />
Minoritní bílkoviny<br />
Přenos imunoglobulinů u savců<br />
Denaturace a srážení bílkovin <strong>mléka</strong><br />
denaturace<br />
definice<br />
denaturační denatura činidla inidla <br />
projevy denaturace<br />
denaturace x koagulace<br />
kyselé srážení CN<br />
CN – hydrofobní hydrofobn bílkovina lkovina<br />
koagulace po ztrátě ztr vnější vn šího ho náboje n boje – potlačen potla ení disociace karboxylových skupin <br />
<br />
stanovení stanoven izoelektrického<br />
izoelektrick ho bodu<br />
přídavek davek kyseliny<br />
[CN-(COO- ) 2Ca] n (váp. sůl CN) + 2n CH3CHOHCOOH <br />
[CN-(COOH) 2 ] n (nerozp.) + n (CH3CHOHCOO) 2Ca (rozp. mléčnan vápenatý)<br />
Ca 3 (PO 4 ) 2 + 2 CH 3 CHOHCOOH (CH 3 CHOHCOO) 2 Ca +CaH 4 (PO 4 ) 2<br />
(koloid. fosforečnan) (rozp. fosforečnan)<br />
5
Příklady denaturačních reakcí Chování koloidních roztoků v závislosti na pH prostředí<br />
Schématické znázornění molekuly kaseinu při různém pH Kyselé srážení kaseinu<br />
postupné změny při snižování pH:<br />
5,8 - 5,7 50 % Ca rozpuštěno, rozpu no, změny zm ny reologických vlastností vlastnost<br />
5,2 ztráta ztr ta soudržnosti soudr nosti CN micel<br />
4,9 CCP rozpuštěn rozpu<br />
4,8 - 4,6 - 4,2 izoelektrické izoelektrick srážen sr ení CN<br />
< 2,5 vznik CN +<br />
proteolytické štěpy β-CN<br />
γ-CN – koagulace při p i pH 4,6<br />
<br />
proteoso-peptonov<br />
proteoso peptonová frakce v roztoku<br />
vliv teploty<br />
t
Štěpení k-kaseinu chymosinem<br />
Charakteristika 6-kasein Para-6-kasein Kaseinomakropeptid<br />
Poč et AK 169 105 64<br />
MW peptid. řetě zce 19023 12269 6754<br />
MW vč etně glycidů .19550 12269 .7280<br />
Glycidy na 100 AK 1.4 0 3.6<br />
Poč et (-) nábojů .19.5 8.0 .12.5<br />
Poč et (+) nábojů 15.5 12.5 4<br />
Poč et zbytků SerP 1(2) 0 1(2)<br />
Poč et -S-S- mů stků 1 1 0<br />
Sladké srážení kaseinu<br />
Sekundární fáze<br />
flokulace gel<br />
volné voln Ca 2+ ionty<br />
t > 8-10 10°C<br />
kontinuální sýření, imobilizace<br />
synereze<br />
řízen zení koagulace<br />
složen slo ení a ošet o etřen ení suroviny (genet ( genet. . varianty, konc. konc.<br />
CN, tučnost, tu nost, chlazení, chlazen , pasterace... )<br />
pH, pH,<br />
teplota<br />
dávka vka syřidla, sy idla, CaCl 2<br />
zpracování zpracov sýřeniny sý eniny (teplota, velikost zrna, ...<br />
Terciární fáze<br />
proteolýza CN účinkem inkem zbytků zbytk syřidla sy idla<br />
volba syřidla sy idla<br />
dávkov vkování<br />
pH – vazba enzymu na CN<br />
termostabilita<br />
termostabilita<br />
Koagulace mléčných bílkovin – tepelná koagulace<br />
termostabilita<br />
CN – značná zna odolnost (150°C/20s, (150 C/20s, 130°C/20min, 130 C/20min, 100°C/60min)<br />
100 C/60min)<br />
WP – denaturace v pořad po adí:<br />
Ig (65-70 (65 70°C) C)<br />
BSA (70-75 (70 75°C) C)<br />
β-LG LG (72-85 (72 85°)<br />
α-LA LA (85-90 (85 90°C) C)<br />
ppf (>90 90°C) C)<br />
společné srážení denaturovaných bílkovin – výtěžnost, konzistence<br />
koprecipitáty<br />
koprecipit ty<br />
termotvaroh<br />
kysané kysan mléčné ml výrobky<br />
Kaseinomakropeptid<br />
MW ~ 8000; ? závislost na pH<br />
negativní náboj v širokém rozmezí pH<br />
cca 30 % vázaná glycidická složka - glykomakropeptid (GMP)<br />
aminokyselinové složení:<br />
vysoký podíl pod l esenciáln esenci lních ch Ak (Thr Thr, , Lys)<br />
vysoký obsah rozvětvených rozv tvených AK (Val, Ile) Ile<br />
neobsahuje aromatické aromatick AK (Phe ( Phe, , Tyr, Tyr,<br />
Trp)<br />
fyziologické a biologické vlasrnosti<br />
AK složen slo ení dietetikum (fenylketonurie<br />
fenylketonurie, , onemocnění onemocn jater)<br />
redukce sekrece žalude aludečních ch šťáv<br />
prebiotikum<br />
prevence osteoporózy, osteopor zy, trombóz tromb z a zubního zubn ho kazu<br />
technologické vlastnosti<br />
tvorba pěny p ny<br />
emulgace<br />
možnosti izolace<br />
Koagulace mléčných bílkovin<br />
Koagulace rozpouštědly – efekt závislý na snížení dielektrické konstanty<br />
ethanol<br />
alkoholová alkoholov zkouška zkou ka<br />
příprava prava micelárn micel rního ho CN<br />
smetanové smetanov likéry, lik ry, deserty<br />
acetonitril – odstranění odstran bílkovin lkovin pro HPLC<br />
Vysolování<br />
vysoká vysok hustota náboje n boje disociovaných solí sol – hydratační hydrata obal<br />
frakcionace bílkovin b lkovin<br />
Sůl Srážen Sr ená bílkovina lkovina<br />
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
KAl(SO KAl(SO4<br />
) 2<br />
CN<br />
CaCl 2<br />
CN<br />
MgSO 4 – nas. nas.<br />
roztok CN + globuliny<br />
(NH 4) ) 2 SO 4 – polonas. polonas.<br />
roztok CN + globuliny<br />
(NH 4) ) 2 SO 4 – nas. nas.<br />
roztok CN + globuliny + albuminy<br />
NaCl CN + bílkoviny b lkoviny syrovátky syrov tky ( ( WPNI)<br />
K44Fe(CN)6 4Fe(CN)6 + Zn SO 4<br />
odstranění odstran bílkovin lkovin<br />
Pb(CH Pb(CH3COO)<br />
odstranění odstran bílkovin lkovin v kondenzovaném kondenzovan m mléce ml ce<br />
COO) 2<br />
Mikropartikulace syrovátkových bílkovin<br />
Native globular<br />
state (3 nm)<br />
Heat induced dairy nano- and micro-structures:<br />
Particulation of ß-lactoglobulin in whey<br />
Unfolding<br />
Exposition of<br />
reactive groups<br />
Heat induced<br />
aggregation and<br />
crosslinking<br />
(Size control by shear)<br />
7
Funkční vlastnosti mléčných bílkovin<br />
Tvorba gelu WP – dle pH, iontové síly<br />
částicový sticový – tvorba agregátů agreg<br />
vláknitý vl knitý<br />
nejsilnější nejsiln ší interakce 1-2 1 2 pH od IEB<br />
Vlastnosti gelu<br />
mechanické mechanick vlastnosti - pevnost<br />
teplota<br />
rychlost záhřevu z evu<br />
koncentrace bílkovin, b lkovin, čistota istota<br />
pH > 6,5 – pevné, pevn , pružné pru<br />
průhlednost pr hlednost<br />
pH 4 – 6 zakalené, zakalen , měkk m kké, , špatn patná vazba vody<br />
nižší ni ší pH – průhledn pr hledné (měkk (m kké, , křehk k ehké)<br />
Copolymer gel<br />
Kinetically - induced co-gels<br />
WP<br />
FG<br />
Protein - covered fat globules/protein<br />
casein<br />
casein<br />
micelle<br />
Denaturace vysokým<br />
hydrostatickým tlakem<br />
Active phase - separated gels<br />
starch<br />
Complex mixed gel<br />
protein<br />
matrix<br />
gum B<br />
gum A<br />
Funkční vlastnosti mléčných bílkovin<br />
Rozpustnost<br />
rovnováha rovnov ha mezi odpudivými a přita p itažlivými livými silami<br />
odpudivé odpudiv síly: ly:<br />
elektrostatické elektrostatick (CN)<br />
hydratační hydrata (WP)<br />
přita itažliv livé síly ly<br />
vnější vn ší faktory<br />
pH, pH,<br />
soli, teplota, močovina, mo ovina, TCA<br />
význam<br />
Termostabilita<br />
Tvorba gelu →<br />
CN<br />
WP - tvorba gelu při p i záhřevu z evu<br />
denaturace nativních nativn ch bílkovin b lkovin<br />
agregace<br />
tvorba vláken, vl ken, pásů p<br />
další další<br />
spojování spojov a tvorba sítě s<br />
Funkční vlastnosti mléčných bílkovin<br />
Hydratace, vazba vody, bobtnání<br />
Viskozita<br />
Chování na fázovém rozhraní<br />
pěnivost nivost<br />
emulgace<br />
Vytvoření filmu<br />
difuse k rozhraní rozhran<br />
adsorpce na fáz. . rozhraní rozhran<br />
konformační konforma změny zm ny bílkoviny b lkoviny<br />
Stabilizace<br />
sterická sterick<br />
β-CN CN<br />
αs1 s1 – CN<br />
S-S S vazby (β-LG) ( LG)<br />
Chemické reakce bílkovin<br />
Reaktivní skupiny: -COOH, -<br />
NH2, =NH, -OH, -NH-CO-, -SH<br />
Hydrolýza peptidové vazby<br />
enzymaticky<br />
biologicky aktivní aktivn peptidy<br />
úprava prava funkčních funk ch vlastností vlastnost<br />
kyselá kysel<br />
Reakce při záhřevu <br />
8
Change language