Nespecifické složky buněčné imunity - Ústav imunologie
Nespecifické složky buněčné imunity - Ústav imunologie
Nespecifické složky buněčné imunity - Ústav imunologie
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Nespecifické</strong> <strong>složky</strong> <strong>buněčné</strong><br />
<strong>imunity</strong><br />
RNDr. Jan Lašťovička, CSc.<br />
<strong>Ústav</strong> <strong>imunologie</strong> 2.LF UK, FN Motol
- Mechanizmy vrozené <strong>imunity</strong> fungují okamžitě<br />
- Ihned následuje časná indukovaná odpověď<br />
- Nevytvoří se imunologická paměť<br />
- Specifická reakce je zahájena jen v případě, že infekce<br />
překoná tyto nespecifické mechanizmy
Patogeny<br />
- Viry, bakterie, houby, prvoci, červi<br />
- Pronikají do těla různými cestami, množí se<br />
a působí onemocnění různým způsobem<br />
- Imunitní systém používá k jejich eliminaci<br />
odlišné mechanizmy
Možné cesty průniku infekce<br />
• Naše tělo je neustále vystaveno<br />
mikroorganizmům přítomným v prostředí<br />
• Kontakt na epiteliálních površích<br />
• Na sliznicích dýchacích cest<br />
• Na střevních sliznicích<br />
• Na sliznicích genitálií<br />
• Při poranění kůže (kousnutí hmyzem)
Antimikrobiální peptidy<br />
Lysozym, fosfolipáza A (sliny)<br />
Histatiny<br />
Trávící enzymy<br />
Lysolipidy<br />
α a β-defensiny (intestinální)<br />
Surfaktanty SP-A, SP-D<br />
opsonizace
Odpověď na průnik mikroorganizmu je rozdělena na několik stádií:<br />
- Lokální nespecifická odpověď se pokusí infekci zlikvidovat<br />
- pokud se to nepodaří, je antigen transportován do lymfatických uzlin<br />
- aktivují se specifické mechanizmy
Mechanizmy nespecifické <strong>imunity</strong>:<br />
• Jsou založeny na rozpoznání chemických<br />
struktur (hlavně sacharidů), na povrchu<br />
mnoha různých mikroorganizmů, ale<br />
nepřítomných na povrchu vlastních buněk<br />
organizmu
Rozpoznávací mechanizmy fagocytů<br />
• Struktury, které se nacházejí na povrchu<br />
mikroorganizmů, ale ne na vlastních nepoškozených<br />
buňkách<br />
• Evolučně velmi konzervované antigeny nezbytné pro<br />
život mikroorganizmů – PAMP (pathogen associated<br />
molecular patterns)<br />
• Endotoxiny (LPS) gramnegativních bakterií<br />
• Peptidoglykany grampozitivních bakterií<br />
• Glukany a manany kvasinek a plísní<br />
• Povrchové fosfolipidy apoptotických buněk<br />
• Tyto struktury jsou rovněž rozpoznávány humorálními<br />
složkami nespecifické <strong>imunity</strong>
Rozpoznávací mechanizmy fagocytů<br />
Receptory, které tyto struktury rozpoznávají, se<br />
označují jako pattern recognition receptors<br />
(PRR):<br />
• Manózový receptor<br />
• Galaktózový receptor<br />
• CD14<br />
• TLR (Toll-like receptory)<br />
• Scavangerové (uklízecí) receptory<br />
• FC receptory
<strong>Nespecifické</strong><br />
rozpoznávání<br />
pomocí Toll-like<br />
receptorů: každý z<br />
TLR receptorů<br />
rozpoznává jeden<br />
či více<br />
mikrobiálních<br />
antigenů přímou<br />
interakcí s<br />
molekulami na<br />
jejich povrchu
Bakteriální LPS<br />
poskytuje signál přes<br />
TLR -4 a aktivuje<br />
transkripční faktor<br />
NFκB, který pak<br />
aktivuje geny kódující<br />
proteiny sloužící k<br />
obraně proti infekci<br />
(TNFα)
• Bakteriální<br />
proteoglykany mohou<br />
být rozpoznány buď<br />
TLR receptory na<br />
povrchu buněk nebo<br />
NOD proteiny v<br />
cytoplazmě<br />
• Obě cesty vedou k<br />
aktivaci transkripčního<br />
faktoru NFκB a k<br />
expresi prozánětlivých<br />
genů
Opsonizace<br />
• Působení složek humorální <strong>imunity</strong><br />
• Fc receptory fagocytů<br />
• Komplementové receptory<br />
• Proteiny akutní fáze:<br />
• Lektin vážící manózu (MBL)<br />
• C reaktivní protein (CRP)<br />
• Sérový amyloid P
Salmonella typhi – její dlouhý bičík je rozpoznán Toll-like receptory
Fagocyty a fagocytóza<br />
• Evolučně velmi starý proces<br />
• Dva hlavní typy buněk - profesionální<br />
fagocyty: neutrofilní a eozinofilní<br />
granulocyty a monocyty (makrofágy)
Makrofágy jsou aktivované patogenními<br />
mikroorganizmy, pohltí je a zahájí zánětlivou<br />
odpověď<br />
Makrofágy exprimují řadu receptorů pro<br />
bakterální komponenty včetně receptorů pro<br />
karbohydráty (manózový a glukanový<br />
receptor), lipidy (LPS receptor) nebo jiné<br />
bakteriální komponenty (Toll-like receptory).<br />
Navázání bakterie na receptory stimuluje<br />
fagocytózu a pohlcení bakterie do<br />
intracelulárních váčků zvaných fagozómy,<br />
kde jsou zničeny.<br />
Signál přes některé receptory, jako např.<br />
TLR, způsobí sekreci prozánětlivých<br />
cytokinů jako IL-1β, IL-6 a TNF-α a lipidové<br />
mediátory zánětu.
Proces fagocytózy
Likvidace pohlceného mikroorganizmu<br />
• Baktericidní látky (bazické peptidy<br />
defensiny)<br />
• Hydrolytické enzymy (proteázy katepsiny,<br />
lysozym, kyselé hydrolázy)<br />
• Nízké pH (3,5 - 5)<br />
• BPI (bactericidal permeability-increasing<br />
protein)
Likvidace pohlceného mikroorganizmu<br />
• Aktivace enzymů: NADPH-oxidáza,<br />
myeloperoxidáza, superoxid dismutáza<br />
• Reaktivní kyslíkové intermediáty (ROI):<br />
- superoxidový radikál O 2<br />
- (molekula kyslíku<br />
s připojeným elektronem)<br />
- Singletový kyslík, H 2O 2 , hydroxylový<br />
radikál a chlornanové anionty Cl -<br />
- ROI jsou používány hlavně pro likvidaci<br />
pohlcených extracelulárních patogenů
Likvidace pohlceného mikroorganizmu<br />
• Oxid dusnatý (NO), produkovaný NO<br />
syntázou<br />
• Je hlavním nástrojem zabíjení<br />
intracelulárních parazitů<br />
• Baktericidní látky a ROI se mohou<br />
uvolňovat i do okolních tkání
Oxidační vzplanutí je způsobeno přechodným zvýšením<br />
spotřeby kyslíku během produkce mikrobicidních kyslíkových<br />
metabolitů
Neutrofily tvoří první vlnu buněk, které<br />
opouští cévy a vstupují do místa infekce<br />
• V místě infekce jsou cévy rozšířené<br />
• Leukocyty mohou být v kontaktu s<br />
endotelem<br />
• Endotel v místě infekce exprimuje pod<br />
vlivem TNF-α a IL-8 selektiny, molekuly<br />
ICAM-1 a ICAM-2<br />
• Dochází k extravazaci (diapedéze)<br />
neutrofilů
Infekce stimuluje makrofágy k produkci<br />
cytokinů a chemokinů, které spouštějí<br />
zánětlivou reakci
Bakteriální LPS<br />
poskytuje signál přes<br />
TLR -4 a aktivuje<br />
transkripční faktor<br />
NFκB, který pak<br />
aktivuje geny kódující<br />
proteiny sloužící k<br />
obraně proti infekci<br />
(TNF-α)
Aktivace Toll-like receptorů spouští produkci<br />
prozánětlivých cytokinů a chemokinů a expresi<br />
kostimulačních molekul<br />
• Toll signalizační dráha vede také k<br />
povrchové expresi kostimulačních molekul<br />
• Tyto molekuly, nazývané B7.1 (CD80) a<br />
B7.2 (CD86), jsou povrchové proteiny<br />
exprimované makrofágy a DC v odpověď<br />
na signál z TLR-4. Tyto molekuly pak<br />
spolu s MHC II aktivují naivní T buňky
Bakteriální LPS přes Toll signální cestu<br />
indukuje změny v Langerhansových<br />
buňkách (nezralé dendritické bb).<br />
- Stimuluje je k migraci do lymfatických uzlin<br />
- Působí změny v expresi povrchových molekul<br />
(CD80 , CD86 a MHC )<br />
Tím je zahájena specifická imunitní reakce (stimulace<br />
CD4 T-buněk).
Cytokiny uvolňované fagocyty<br />
aktivují akutní fázi odpovědi<br />
• TNF-α, IL-1β a IL-6: endogenní pyrogeny<br />
• Zvýšení tělěsné teploty<br />
• Syntéza proteinů akutní fáze<br />
• C-reaktivní protein se váže na fosfocholin<br />
na bakterální stěně, opsonizuje a spouští<br />
komplementovou kaskádu<br />
• Konečný efekt prozánětlivých cytokinů je<br />
leukocytóza
TNF-α je důležitým cytokinem, který<br />
kontroluje lokální obranu proti infekci, ale<br />
pokud je uvolňován systémově, má<br />
destruktivní účinky.
Cytokiny TNF-α, IL-1β a IL-6 mají široké spektrum biologických aktivit,<br />
které pomáhají koordinovat odpověď organizmu na infekci
Interferony jsou<br />
antivirové proteiny<br />
produkované<br />
buňkami jako<br />
odpověď na virovou<br />
infekci.<br />
Vážou se na<br />
interferonové<br />
receptory na<br />
buňkách a indukují<br />
syntézu proteinů<br />
inhibujících replikaci<br />
virů (oligoadenylát<br />
syntetáza, PKR<br />
kináza)
Poruchy fagocytózy<br />
Chybějící nebo snížená tvorba oxidativních produktů fagocytujících buněk<br />
je příčinou závažného onemocnění chronické granulomatosy<br />
(chronic granulomatous disease, CGD).<br />
Onemocnění se projevuje opakujícími se těžkými infekcemi, které<br />
způsobují bakterie, kvasinky i plísně. Obyčejně probíhají formou<br />
zápalu plic nebo abscesů kůže, tkání a orgánů.<br />
Onemocnění je nejčastěji způsobené mutací genu kódujícího enzym<br />
fagocytární NADPH-oxidasu na chromozomu X, kdy tento enzym má<br />
sníženou nebo nulovou aktivitu.<br />
Aktivovaná NADPH-oxidasa zdravých jedinců katalyzuje reakci, při níž<br />
NADPH* reaguje s kyslíkem za vzniku NADP+ a superoxidového<br />
radikálu O2-, ze kterého následnými reakcemi vzniká singletový kyslík,<br />
peroxid vodíku, hydroxylový radikál a chlornan. Tyto reaktivní oxidační<br />
meziprodukty jsou zodpovědné za ničení patogenů uvnitř fagocytů po<br />
jejich ingesci
Testování fagocytózy<br />
• Testy ingesce<br />
• Baktericidní test<br />
• Testy oxidačního metabolizmu<br />
• Chemiluminiscence
Testy ingesce<br />
• Testují schopnost fagocytů pohltit cizorodý<br />
materiál<br />
• Používané substráty: bakterie nebo kvasinky,<br />
mikrosférické hydrofilní partikule (MSHP),<br />
velikost 1μM<br />
• Suspenze částic se inkubuje s krví pacienta, pak<br />
se zhotoví nátěr na sklíčko<br />
• Fagocytární aktivita = podíl fagocytujících<br />
neutrofilů ze 100<br />
• Fagocytární index = počet pohlcených částic na<br />
buňku
Testy ingesce<br />
• Výpovědní hodnota testů ingesce v rutinní diagnostice je<br />
velmi malá – primární porucha fagocytózy neexistuje<br />
• K výraznému snížení fagocytózy dochází jen u velmi<br />
těžkých klinických stavů<br />
• Použití spíše pro výzkumné účely<br />
• Pokud se použijí inertní partikule, testuje se<br />
nereceptorově zprostředkovaná fagocytóza<br />
• Nezralé neutrofily nejsou schopny partikule pohltit<br />
• Stafylokoky vyžadují opsonizaci sérovými Ig<br />
• Kvasinky vyžadují opsonizaci komplementem C3b<br />
• Patologické výsledky mohou odrážet i poruchy<br />
opsonizace
Baktericidní test<br />
• Testuje všechny fáze fagocytózy včetně<br />
usmrcení pohlceného mikroorganizmu<br />
• Substrátem je živý mikroorganizmus: C.<br />
albicans, S. aureus, Pseudomonas<br />
• Hodnocení se provádí různými způsoby:<br />
mikroskopicky, cytometricky
Testy oxidačního metabolizmu<br />
• Nitroblue tetrazolium chlorid (NBT)<br />
• iod nitroblue tetrazolium (INT)<br />
• Testuje se kyslíkový metabolizmus granulocytů<br />
(schopnost tvořit kyslíkové radikály) pomocí<br />
schopnosti redukovat bezbarvé tetrazoliové soli<br />
na tmavě modré formazány<br />
• Odečítá se na sklíčku (mikroskopicky) nebo na<br />
destičkách (fotometricky)
Chemiluminiscence<br />
• Kvantitativní sledování oxidačního<br />
vzplanutí<br />
• Fagocyty při oxidačním vzplanutí vytvářejí<br />
vysoce reaktivní kyslíkové metabolity.<br />
Během těchto procesů vznikají emise<br />
fotonů a to se projevuje chemiluminiscencí<br />
fagocytů. Toto chemické světlo se zesiluje<br />
luminolem a detekuje na<br />
chemiluminometru
Měření oxidačního vzplanutí<br />
průtokovou cytometrií (FagoFlow)<br />
• Princip<br />
• Test je založen na měření respiračního<br />
(oxidačního) vzplanutí granulocytů po jejich<br />
stimulaci inaktivovanými bakteriemi E. coli.<br />
• Po ingesci bakterií je ve fagocytech aktivována<br />
NADP-oxidáza,která spustí respirační (oxidační)<br />
vzplanutí.<br />
• Vznikající reaktivní meziprodukty uvnitř fagocytů<br />
oxidují dihydrorhodamin 123(DHR123) na<br />
fluorescenční produkt rhodamin 123, který je<br />
detekován průtokovým cytometrem.
Histogram populace kontrolních nestimulovaných<br />
granulocytů po inkubaci s DHR123.<br />
Histogram populace stimulovaných granulocytů.<br />
Vzorek byl inkubován s bakteriemi E. coli a DHR123.
O 2 NEZÁVISLÉ MECHANIZMY:<br />
imunochemické stanovení defensinů<br />
stanovení lysozymu<br />
deficience specifických granul
Další testy nespecifické <strong>imunity</strong><br />
- adherence<br />
- chemotaxe:<br />
Rebuckovo kožní okénko (in vivo)<br />
agarózový test (formylmethionylleucylfenylalanin)<br />
Boydenova komůrka<br />
(nitrocelulózový filtr)
AKTIVACE A ADHERENCE FAGOCYTUJÍCÍCH BUNĚK:<br />
je testována schopnost adherovat k pevným povrchům<br />
je testována přítomnost a denzita exprese adhezivních molekul<br />
imunofluorescencí<br />
LAD-I syndrom: - absence řetězce (CD18) integrinového heterodimeru LFA-1
CHEMOTAXE:<br />
orientovaný pohyb granulocytů v chemoatraktivním gradientu<br />
migrace granulocytů pod agarózou<br />
poruchy chemotaxe:<br />
- primární defekty: syndrom líných leukocytů<br />
- sekundární defekty: diabetes, popáleniny
Další testy nespecifické <strong>imunity</strong><br />
Test aktivace bazofilů:<br />
Bazofily společně s mastocyty jsou klíčovými<br />
buňkami časné fáze alergické reakce<br />
(vysokoafinitní receptor pro Fc fragment IgE)<br />
Dochází k degranulaci a k expresi CD63<br />
Možno měřit cytometricky
Další testy nespecifické <strong>imunity</strong><br />
Eozinofilní kationický protein (ECP)<br />
ECP patří mezi preformované granulární proteiny<br />
eozinofilů, uvolňují se při aktivaci<br />
Stanovujeme chemiluminiscencí