Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
© 2009 Bio<strong>tehnoloogia</strong> õppetool – Ants Kurg<strong>Antisense</strong> <strong>tehnoloogia</strong> <strong>ja</strong> <strong>RNAi</strong><strong>Antisense</strong> oligonukleotiidid on lühikesed,sünteetilised üheahelalised DNA oligomeerid võinende derivaadid, mis on disainitud seondumatugevalt <strong>ja</strong> spetsiifiliselt komplementaarsetemRNA järjestustega märklaudkoe rakkudestagades vastava geeni ekspressiooniinhibeerimise või peatamise. Vastavaltülesannetele peavad antisense oligomeerid omamaküllalt pikka eluiga vereplasmas <strong>ja</strong> rakutsütoplasmas, olema vastupidavad ekso- <strong>ja</strong>endonukleaasidele, mitte seonduma teistevalkudega ning mitte omama toksilisi efekte.Esimesena kasutati antisense ühenditenaüheahelalisi DNA järjestusi (JOONIS). Antudoligomeerid sisenesid rakku endotsütoosi abil, kuidnende kasutamine on piiratud tingituna lühikesestelueast plasmas <strong>ja</strong> rakus, sest nad hüdrolüüsitakseväga kiiresti nukleaaside poolt. Järgmisse gruppi, Igeneratsiooni antisense molekulide hulka, kuuluvadfosforotioaadid <strong>ja</strong> metüülfosfonaadid (JOONIS).Nendes ühendites on fosfaatgrupi üks hapnikuaatom asendatud vastavalt kas väävli või metüülrühmaga,mis tõstab stabiilsust nukleaaside suhtes.Antud ühendid on vees hästi lahustuvad, sisenevadrakku endotsütootilise mehhanismi abil <strong>ja</strong> omavadkõrget afiinsust mRNA vastavate järjestuste suhtes.Spetsiifilisuse tagamiseks peaksid nad sisaldama17-25 nukleotiidi jääki. Kõik praeguseks a<strong>ja</strong>ks raviotstarbelkasutatavad (Vitravene (Fomivirsen,ISIS 2922)) või kliinilistesse katsetustesse jõudnudantisense oligomeerid on fosforotioaadid.<strong>Antisense</strong> <strong>tehnoloogia</strong> toimemehhanismEnamus antisense oligomeere aktiveerivadpeale mRNA märklaudjärjestusega seondumistribonukleaas RNaasH-i, mis tunneb spetsiifiliseltära RNA-DNA kompleksi <strong>ja</strong> hüdrolüüsibheterokaksikahelas oleva RNA ahela, milletulemusel translatsioon peatub. Arvatakse, et sellinemehhanism prevaleerib enamuse antisensemolekulide korral. Kuid mitte kõik antisenseoligomeerid, nagu näiteks metüülfosfonaadid <strong>ja</strong>peptiid nukleiinhapped, ei aktiveeri RNaasH-dpeale seondumist mRNA molekuliga. Teiseksmehhanismiks on translatsiooni blokeerimine,mille puhul antisense oligonukleotiid takistabribosoomi seondumist <strong>ja</strong> edasi liikumist piki mRNAahelat. Tavaliselt disainitakse antisense oligonukleotiidnii, et ta oleks komplementaarnetranslatsiooni start koodonit ümbritsevajärjestusega.Kuidas saavad antisense oligonukleotiidid rakku?See ei ole päris täpselt teada. Aktiivse endotsütoosi(JOONIS) tulemusel satuvad oligonukleotiididendosoomi <strong>ja</strong> mitte tsütoplasmasse. Endosoomis onoligonukleotiidid mRNA-dest eraldatud rakumembraanilesarnase membraaniga. Tavaliseltlõhutakse nad nukleaaside poolt ära <strong>ja</strong> väljutatakseeskotsütoosil. Nukleaasi resistentsed kimäärsedmetüülfosfonaat / fosfodiester oligonukleotiidid(samuti ka fosfodiester <strong>ja</strong> fosforotioaat struktuurid)võetakse eelistatult rakku retseptor-vahendatudendotsütoosi <strong>ja</strong> vedelikfaasi pinotsütoosi poolt. Kuilisada oligonukleotiididele lipofiilseid rühmi (nagukolesterool) siis võib toimuda ka adsorptsioon.Tegelikult ei ole eriti veenvalt näidatud passiivsediffusiooni toimumine oligonukleotiididega, millelon päris oluline laeng. Samuti ei tohiksfüsioloogiliselt terve raku endosoom oluliseltlekkida.Kuidas siis?Erinevate gruppide poolt on katsetatud mitmeidstrateegiaid, et parandada ebaefektiivseid“looduslikke” mehhanisme. Kõige enam levinudtehnika on tekitada oligonukleotiidide komplekskatioonsete lipiididega. Kasutatakse ka muidmehhanisme näit. bakteriaalset toksiini streptolüsiinO ning samuti elektroporatsiooni.Geeniekspressiooni kontroll RNA-ga<strong>Antisense</strong> RNA on komplementaarne mRNA-ga.Kui samas rakus esinevad komplementaarsed sense<strong>ja</strong> antisense RNA molekulid, siis võib see viiastabiilsete duplekside moodustumisele, mishakkavad segama geenide ekspressioonitranskriptsiooni tasemel, RNA protsessingut või katranslatsiooni. <strong>Antisense</strong> RNA vahendatudmehhanisme kasutatakse geeniekspressiooniregulatsiooni mehhanismina looduses nii arvukatelprokarüootidel kui ka väiksemas ulatuseseukarüootidel.Teatud geenide inhibitsiooni võib saavutada niiantisense RNA või antisense oligonukleotiidideotsesel sisestamisel rakkudesse. Samuti on võimaliksisestada rakkudesse antisense transgeen (transgeenon promootori suhtes pööratud) <strong>ja</strong> saavutadaantisense RNA stabiilne süntees ning pikaa<strong>ja</strong>linegeeni ekspressiooni inhibitsioon.Kui asetada antisense konstruktid indutseeritavapromootori kontrolli alla, siis on võimaliksaavutada ka konditsionaalset geeni vaigistamist.<strong>Antisense</strong> <strong>tehnoloogia</strong>te puhul on võimalikkasutada erinevaid meetodeid:Ribosüümid on katalüütilised RNA molekulid,mis on võimelised läbi viima RNA substraadi kohtspetsiifilistlõikamist ning mõningatel juhtudel kaligeerimist. Kui sisestada antisense RNA-sseribosüümi katalüütiline tsenter võimaldab seesuunata ribosüümi teatud kindlate mRNAmolekulide suhtes, mis seejärel lõigatakse katki <strong>ja</strong>1 http://www.biotech.ebc.ee/
© 2009 Bio<strong>tehnoloogia</strong> õppetool – Ants Kurgdegradeeritakse. Ribosüümide peamine eelistavalise antisense RNA ees seisneb selles, etribosüümide funktsionaalne aktiivsus taastub pealemRNA lõikamist ning on seetõttu nad võimelisedinaktiveerima palju mRNA molekule samal a<strong>ja</strong>l kuitavaline antisense inhibitsioon põhineb sense <strong>ja</strong>antisense RNA molekulide stöhhiomeetriliselseondumisel.Thomas R. Cech <strong>ja</strong> Sidney Altman said 1989.aastal Nobeli keemia preemia RNA katalüütilisetoime avastamise eest.Ribosüüme on kasutatud geeniekspressiooniinhibeerimiseks eukarüootidest kõigepealtDrosophila-l. Samuti on ribosüüme kasutatudimeta<strong>ja</strong> rakuliinides eelkõige onkogeenideuurimisel ning viirusresistentsuse saavutamiseks.Palju on uuritud HIV-i ribosüüm vahendatudinhibitsiooni ning on saavutatud ka eduretroviirusvektorite kasutamisel, eriti vektoritepuhul, mis sisaldavad mitmeid ribosüüme.Kuna ribosüümid on RNA konstruktid <strong>ja</strong> seetõttuüsna heaks märklauaks nukleaasidele, siis näiteksgeeniteraapia seisukohalt on va<strong>ja</strong> valmistada <strong>ja</strong>sisestada terve transgeenne konstrukt, milleltribosüüme hakatakse valmistama.Kosuppressioon iseloomustab sense transgeenivõimet suppresseerida homoloogilisi endogeenseidgeene. Sellist üllatavat fenomeni näidatiesmakordselt transgeensetel taimedel, kui soovitisuurendada endogeense valgu (õiepigmentpetuuniatel) kogust sisestades taime genoomi antudgeeni ekstra koopiaid. Arvati, et täiendavatekoopiate sisestamine tõstab endogeense ensüümihulka, mille tulemusel tekiks rohkem pigmenti.Üllatusega täheldati, et umbes 50% taimedelsaavutati hoopis vastupidine efekt, st. õied olidhoopis valged või õrnalt värvunud. Seega viibtransgeeni täiendavate koopiate integratsioon mõnevõi isegi kõigi transgeenide suppressioonile ning kahomoloogiliste endogeensete geenide kosuppressioonile.Kosuppressiooni on näidatud ka loomadel<strong>ja</strong> seentel.Kosuppressiooni mehhanism on kompleksne, st.geeni vaigistamine võib toimuda niitranskriptsioonilisel kui ka posttranskriptsiooniliseltasemel.Mis seda põhjustab? Kuigi transgeeni pooltindutseeritud geeni vaigistmine paistab mõnedeltaimedel olevat seotud geeni spetsiifilisemetülatsiooniga (transkriptsiooniline geenivaigistamine(TGS)), siis osa sellest protsessisttoimub post transkriptsioonilisel tasemel.Erinevates uuringute käigus näidati, et homoloogisitranskripte küll tehakse, kuid need degradeeritaksekiiresti tsütoplasmas <strong>ja</strong> ei kogune.Posttranskriptsiooniline geeni vaigistamine(PTGS), mille kohta esialgu arvati, et on tegemistveidra <strong>ja</strong> segava fenomeniga, mille esinemine onpiiratud vaid petuuniate <strong>ja</strong> mõne teise taimeliigigaon käesolevaks a<strong>ja</strong>ks muutunud molekulaarbioloogiaüheks kuumimaks teemaks. Viimastelaastatel on selgunud, et PTGS toimub nii taimedelkui ka loomadel ning tema funktsiooniks on ilmseltkaitse viiruste vastu <strong>ja</strong> transposoonide vaigistemine.RNA interferentsEsimesed tõendid selle kohta, et dsRNA võibpõhjustada geeni vaigistamist saadi nematood C.elegans’i uuringutel. Avastati, (Guo & Kempheus,1995, Cell 81:611-620), et antisense RNAkasutamisel geeniekspressiooni allasurumiseksvähendas antisense RNA sisestamine loomulikultsihtmärkgeeni ekspressiooni, kuid sedasama tegi kakontrollina kasutatud sense RNA. Algselt jäi seefenomen selgitamata, kuid alles 1998 avastati (Fireet al., 1998, Nature, 391:806-811), et süstides C.elegans’i nii sense kui antisense RNA segu, saaditulemuseks tunduvalt efektiivsem geenivaigistaminekui eraldi sense või antisense RNAkasutamisel. Tegelikult oli va<strong>ja</strong> vaid mõne dsRNAmolekuli sisestamist rakku, et täielikult vaigistadahomoloogilise geeni ekspressioon. Seega on vastavefekt nagu ribosüümide puhul katalüütiline <strong>ja</strong> mittestöhhiomeetriline. Lisaks sellele kutsus dsRNAsüstimine nematoodi soolde esile geenivaigistamine kogu ussil <strong>ja</strong> isegi ussi järglasteesimesel põlvkonnal. Avastati ka, et kuinematoodidele sööta baktereid, kelles oliekspresseeritud nematoodi mingile geenilespetsiifiline dsRNA saadi sama efekt <strong>ja</strong> isegi ussideleotamine dsRNA lahuses indutseeris geenivaigistamise. Need strateegiad tegid võimalikukssuure arvu C. elegans-i knock-out mutantidesaamise erinevate geenide funktsiooni uurimiseks.Samuti töötati väl<strong>ja</strong> strateegiad <strong>RNAi</strong> kasutamiseksDrosophila’s. Seal küll söötmine spetsiaalsedsRNA-d ekspresseeriva pärmitüvega eiõnnestunud, kuid mikroinjektsioonil saadi siiskiefekt.2006.a. said Andrew Z. Fire <strong>ja</strong> Craig C. Mello<strong>RNAi</strong> avastamise eest Nobeli meditsiinipreemia.Kuidas <strong>RNAi</strong> töötab?<strong>RNAi</strong> töötab kaheetapiliselt:Initsiatsiooni etapis lõigatakse kas otse võitransgeeni koosseisus rakkudesse viidud dsRNAlühikesteks 21-23 nukleotiidi pikkusteks smallinterfering ehk siRNA-deks. siRNA-sid toodetakseDicer ensüümi poolt, mis kuulub dsRNAspetsiifliste ribonukleaaside RNaasIII perekonda <strong>ja</strong>on ATP sõltuv ensüüm. Lõikamise tulemuselsaadakse 19-21 bp pikkused dupleksid ehk siRNAd,millest igaühel on kahenukelotiidiline 3’ üleulatuvots.Teises etapis seonduvad siRNA dupleksid rakutsütoplasmas inaktiivsele nukleaasi kompleksile,mis seejärel aktiveerub ning moodustub nn. <strong>RNAi</strong>ndutseeritud vaigistus kompleks (RNA inducedsilencing complex (RISC)). See on <strong>RNAi</strong> põhiline2 http://www.biotech.ebc.ee/
© 2009 Bio<strong>tehnoloogia</strong> õppetool – Ants Kurgefektorkompleks. RISC kompleksid on erinevasuurusega – väiksemad 100-160 kDa, suurimadkuni 500 kDa. Peale kaksikahelalise RNA sidumisteraldatakse RISC kompleksis siRNA aheladüksteisest. Järgmises etapis seondub RISCkompleks siRNA komplementaarse mRNAga.Viimases etapis antud märklaud mRNAlagundatakse tänu RISC kompleksi nukleaasseleaktiivsusele. Tekkivad mRNA lõigud hävitataksening valgusüntees peatub. Antud protsess on tänusiRNA spetsiifilisele järjestusest sõltuvalepaardumisele mRNAga spetsiifiline.<strong>RNAi</strong> nähtus on levinud paljudes organismidesnagu taimed, pärmid, ussid, putukad <strong>ja</strong> imeta<strong>ja</strong>d.Pikka kaheahelalist RNAd ei saa aga kasutadaimeta<strong>ja</strong>rakkudes, kuna see põhjustab rakus viirusevastaseid reaktsioone, mis tunnevad ära dsRNA <strong>ja</strong>viivad raku surmani.Seejärel avastati, et sünteetilisi lühikesi 21-25nukleotiidi pikkusi dsRNA ahelaid, nn. siRNA-sidkasutades on võimalik lagundada rakus siRNAlehomoloogse järjestusega mRNAd kahjustamatasellega raku elutegevust. Sünteetilised siRNAd onstruktuurselt sarnased looduslikult tekkivateanaloogidega – ka neil on dsRNA mõlema ahela 3’otsa kaks nukleotiidi paardumata. siRNAdekasutamine on tänapäeval üks populaarsemaidgeenimanipulatsiooni tehnikaid. On loodud suuredsiRNAde kogud, mida saavad kasutada kõikteadlased. Samuti on <strong>RNAi</strong> <strong>tehnoloogia</strong> jõudnud kameditsiini. Mitmed farmaatsiakompaniid onalustanud kliinilisi katsetusi kasutamaks siRNAsidhaiguste raviks.Miks <strong>RNAi</strong>?RNA interferentsi on leitud erinevatel organismidelnagu näiteks taimed, seened <strong>ja</strong> loomad: Drosophilamelanogaster, Caenorhabditis elegans ning isegihiirtel <strong>ja</strong> sebrakalal (vöödiline pisidaanio). Selliseluniversaalsel rakulisel vastsel peaks olema olulinefunktsioon. Kuid mis see on?Mõned võimalused:1. Mõningatel taime <strong>ja</strong> loomaviirustel onkaheahelalise (ds)RNA genoomid. Lisaks selleleesineb taime <strong>ja</strong> loomaviirusi, mille RNA genoomkonverteeritakse peremeesrakus lühia<strong>ja</strong>liseltdsRNA-ks. Seega võib <strong>RNAi</strong> olla vahend nendeviiruste infektsiooni vastu hävitades nende mRNA<strong>ja</strong> blokeerides seega oluliste viirusvalkude sünteesi.2. Transposoonid ("junk" DNA) Neid võibtranskribeerida RNA molekulideks, millest mõnedregioonid on kaheahelalised. <strong>RNAi</strong> võib needhävitada.3. RNA interferents võib olla mingi praegu meiletundmatu geeniekspressiooni kontrolliv protsess võiselle osa.<strong>RNAi</strong> tööriistana?<strong>RNAi</strong> avastamine on lisanud molekulaarbioloogidearsenali uue <strong>ja</strong> väga perspektiivse tööriista, milleabil on saanud võimalikuks teha väga erinevategeenide knock-out eksperimente.Vt: Sönnichsen et al., 2005 Full-genome <strong>RNAi</strong>profiling of early embryogenesis in Caenorhabditiselegans. Nature 2005 Mar 24;434(7032):462-9.Antud eksperimendis süstiti 20,326 C.elegans’igeenile vastavad dsRNA-d (98% kõigist!!!) <strong>ja</strong>vaadeldi iga konstrukti efekti antud organismiembrüonaalsele arengule meioosi lõpust alates(peale vil<strong>ja</strong>stamist) läbi teise mitootilise <strong>ja</strong>gunemisekuni 4 rakulise embrüoni. Leiti vähemalt 661 geeni,mis muudavad selle perioodi jooksul mõndprotsessi. Umbes pooled neist osalesid raku<strong>ja</strong>gunemisel <strong>ja</strong> pooled raku üldises metabolismis.Veel ca 1000 geeni andsid fenotüüpilise efekti, misilmnes hilisema arengu käigus.Kuna <strong>RNAi</strong>-d saab kasutada erinevates kudedesvalitud a<strong>ja</strong>hetkel, annab see rea eeliseid tavaliseknockout eksperimendi ees, kus mittetöötav geentekitatakse juba iduliinis ning see võib tappaembrüo enne kui seda saab uurida.Võib sisse viia ka vektori, millelt pidevaltsünteesitakse meid huvitava geeni vastast siRNA-d.Brummelkamp et. al. (2002) A system for stableexpression of short interfering RNAs in mammaliancells. Science Apr 19; 296(5567):550-3<strong>RNAi</strong>-d on perspektiivne võitluses viirusinfektsioonidevastu. Juba 2002 aastal ilmus kakstööd, milles näidati et inimese koekultuuri rakke onvõimalik kaitsta polioviiruse <strong>ja</strong> HIV-1 vastusiRNA-dega, mis on komplementaarsed antudviiruste poolt kodeeritud RNA-dega.VT. Ülevaade <strong>RNAi</strong>-st Ghildiyal and Zamore(2009) Small silencing RNA-s: an expandinguniverse. Nat. Rev. Genet. vol:10, Feb, pp.94-108.<strong>RNAi</strong> inimeste teraapiasKuna <strong>RNAi</strong> puhul on sihtmärk väga spetsiifiline,siis on <strong>RNAi</strong> kasutamine üksikute geenideekspressiooni väl<strong>ja</strong> lülitamiseks väga kuum teema.Sellel baasil loodetakse luua uus klass ravimeid.Nukleiinhappe põhistest antiviiruslikest aineteston terve rida juba leidnud tee kliiniliste katsetustestaadiumi. VT: Haasnoot etal., (2007) <strong>RNAi</strong>nterference against viruses: strike andcounterstrike. Nat Biotech vol:25, No 12 pp1435-1443.Samuti on erinevad firmad katsetamas antisenseteraapia võimalusi muude haiguste vastu. VT:(2007) <strong>Antisense</strong> – down, but not out. Nat Biotechvol: 25 No 5 pp. 497-499Näiteks on uuritud protoonkogeen BCL-2-gakomplementaarset antisense RNA-d, eesmärgiga3 http://www.biotech.ebc.ee/
© 2009 Bio<strong>tehnoloogia</strong> õppetool – Ants Kurgrakendada seda teatud B-rakuliste lümfoomide <strong>ja</strong>leukeemiate korral.Hiirtele näiteks on intravenoosselt süstitudapolipoproteiin B mRNA-le spetsiifilist siRNA-d,mille tulemusel langes apolipoproteiin B mRNA <strong>ja</strong>vastava valgu hulk ning alanes kolesterooli tase.Vastavad ravimid on käesoleval a<strong>ja</strong>l samutikliiniliste katsetuste erinevates staadiumides.Mikro RNA-dOluline on siin see, et ühe miRNA abil võibreguleerida sadu mRNA molekule.Näiteks let-7 mikro RNA osa tuumorigeneesis, let-7kui tuumor-supressor miRNA.Vt. Büssig etal., (2008) let-7 microRNAs indevelopment, stem cells and cancer. Trends in Mol.Med. vol:14, No9, pp.400-409.Mikro RNA-d (miRNA-d) avastati 1993.a. VictorAmbros-e laboris C. elegans’i uuringutel. Need onendogeensed üheahelalised 19-24 nukleotiidipikkused RNA molekulid. 2001.a. avastati, eterinevate organismide (taimed, loomad) genoomidkodeerivad suurt hulka regulatoorse funktsioonigaväikeseid RNA molekule, mida hakati nimetamamiRNA-deks. Samuti näidati, et Dicer ensüümprotsessib miRNA-sid ning mõlemadinkorporeeritakse RNA-induced silencing complex(RISC-i).2003.a näidati, et miRNA-d valmivad tuumas ningsamal aastal kasutati esimest korda miRNA-de invivo vaigistamist kunstlikult disainitud <strong>ja</strong>keemiliselt valmistatud oligonukleotiidide abil,mida nim. antagomir-ideks.Käesolevaks a<strong>ja</strong>ks on teada, et miRNA-dreguleerivad rohkem kui 30% imeta<strong>ja</strong>te geenidest.Samuti eeldatakse, et inimesed ekspresseerivadtuhandeid miRNA-sid, millest praeguseks onkirjeldatud ca 700.Vt. miRBase http://microrna.sanger.ac.ukNeed miRNA-d inhibeerivad <strong>ja</strong> pärsivad sellegatuhandete mRNA-de translatsiooni.Seega on miRNA-de avastamine andnud uuri<strong>ja</strong>televõimaluse kasutada „looduslikku“ posttranskriptsioonilistinterferentsi, mis on väga suuretähtsusega meditsiini <strong>ja</strong>oks.Erinevalt paremini tuntud <strong>RNAi</strong>-st, mis kasutabkaheahelalisi lühikesi RNA molekule (siRNA-d)mis vaigistavad ühe geeni, siis üks miRNAmolekul võib olla suunatud 250-500 erinevamRNA molekuli vastu, avades sellegaravimiarenduses täiesti uued perspektiivid. VT:Flynt and Lai (2008) Biological principles of microRNA-mediated regulation: shared themes amiddiversity. Nat. Rev. Genet. vol.9, Nov, pp.831-842.Üheks miRNA teraapia võimalikuksrakendusvaldkonnaks on vähiteraapia. Siinüritatakse rakendada miRNA inhibiitoreid(antagomir-e) miRNA-de taseme normaliseerimisel.Spetsiifiliste miRNA-de inhibeerimisel ontõenäoliselt võimalik tõsta mõnede tuumorsupressor geenide mRNA-de ekspressioonitaset.4 http://www.biotech.ebc.ee/
Change language