CamSep 5 1

More documents

Recommendations

Info

22 J. Głazowska, M. Kamiński 5.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnych układach faz (The Normal Phase High Performance Liquid Chromatography) Fazy stacjonarne W normalnych układach faz w chromatografii cieczowej ekdysteroidów wykorzystuje się jako fazy stacjonarne kolumny wypełnione żelem krzemionkowym niemodyfikowanym lub modyfikowanym polarnymi grupami, np. –diol (DIOL), -poliol (n-OL), -aminopropylosilan, -aminowymi (NH 2 ) oraz nitrowymi (NO 2 ). Kolumny te stosuje się zarówno w analityce, jak i w semi-preparatywnym i preparatywnym rozdzielaniu ekdysteroidów z ekstraktów szczodraka krokoszowatego. Układ faz normalnych pozwala na rozdzielenie ekdysteroidów o zróżnicowanej polarności, od niepolarnych do polarnych [15, 26]. W przypadku kolumn z polarną fazą stacjonarną kolejność elucji ekdysteroidów nie zależy od rodzaju wypełnienia. Związane jest to z inną naturą oddziaływań jakie mają miejsce na powierzchni złoża pomiędzy grupami hydroksylowymi ekdysteroidów i żelu krzemionkowego. Istotną wadą stosowania żelu krzemionkowego jest jego powolna dezaktywacja w wyniku silnej adsorpcji na jego powierzchni śladowych ilości wody. Jednakże, jeżeli kolumna stosowana jest w tych warunkach w stałej temperaturze oraz jest zrównoważona z eluentem, problem dezaktywacji złoża nie powinien występować [15]. Szczegółowe zestawienie warunków rozdzielania chromatograficznego w normalnych układach faz oraz układach oddziaływań hydrofilowych przedstawia tabela 2. Tabela 2. Table 2. Zestawienie opisów literaturowych warunków rozdzielania ekdysteroidów w normalnych układach faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (NP-HPLC) oraz chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). A list of the NP-HPLC and HILIC separation conditions of ecdysteroids. Układ (Mode) HILIC Kolumna (The kolumn) Zorbax-Sil (DuPont), 250x4,6 mm Warunki Lucji (Elution conditions) Faza ruchoma (Mobile chase) DCM:2-PrOH:H 2O 125:30:2 DCM:2-PrOH:H 2O 125:40:3 lub 100:40:3 DCM:2-PrOH:H 2O 125:15:1 Program elucji (The elution program) Przepływ eluentu (The flow rate) Detekcja (Detection) Litera tura (References) Izokratyczna 1 mL/min 242 nm [15] Cykloheksan:2- PrOH:H 2O (100:40:3) NP Silasorb 600, 5 µm, 250x4 mm Apex II diol column, 5 µm, 150×4,6 mm (GRACE, Wilmington, DE, USA) n-heksan:EtOH:H 2O 812:180:8 Eter dietylowy:ACN:H 2O 880:102:18 DCM:2-PrOH:H 2O 84:15:1 A: MeOH B: DCM Izokratyczna Liniowy program elucji od 2 do 10% B w 20 min Liniowy program elucji od 4 do 10% B w 20 min 0,8 mL/min 1 mL/min MS [27] 242 i 300 nm [23] Fazy ruchome W normalnych układach faz preferowanymi składnikami eluentów stosowanymi w rozdzielaniu ekdysteroidów są dichlorometan i chloroform, modyfikowane alkoholami takimi jak metanol, etanol lub izopropanol. Stosuje się również inne rozpuszczalniki niepolarne do tworzenia eluentu takie jak, n-heksan czy cykloheksan lub eter dietylowy. Niestety te fazy charakteryzują się większą lepkością niż fazy na bazie wody, co powoduje powstawanie dużych oporów przepływu i w konsekwencji wysokie ciśnienie robocze, przy stosunkowo niskim przepływie eluentu. Stosowanie dichlorometanu oraz chloroformu jest niekorzystne również z innego powodu. Rozpuszczalnik te uniemożliwia detekcję ekdysteroidów za pomocą UV dla długości fali 235 i 245 nm, ponieważ absorbują UV w zakresie do 245 nm. Lapenna [23] zaproponował zastosowanie elucji gradientowej o malejącej sile elucyjnej (malejącej zawartości dichlorometanu w fazie ruchomej). Ma to szczególnie zastosowanie w rozdzielaniu związków Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013
Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów… 23 średnio i nisko polarnych, w tym przypadku ekdysteroidów zawierających grupy eterowe i estrowe w miejscu polarnych grup OH. Zastosowanie tego typu układu umożliwia rozdzielenie ekdysteroidów w zależności od ilości grup eterowych oraz możliwość ich rozdzielenia w przypadku bardzo niewielkich różnic w polarności. W rozdzielaniu ekdysteroidów w układzie faz normalnych stosowanie kolumn zrównoważonych z eluentami zawierającymi wodę korzystnie wpływa na ograniczenie „ogonowania” pików oraz poprawia symetrię pików. Jednocześnie należy mieć na uwadze, że nawet niewielkie, dodatkowe ilości wody np. w próbce, powodują powolną dezaktywację fazy stacjonarnej, co skutkuje zmianami w czasach retencji eluowanych pików. Według przeprowadzonych badań [15, 28], najbardziej „odporną kolumną” na zmienne zawartości wody w eluencie jest kolumna Zorbax-Sil. Zauważono, że w przypadku normalnych układów faz rodzaj wypełnienia kolumny oraz obecność wody w fazie ruchomej bądź próbce, nieznacznie wpływa na wartości czasów retencji ekdysteroidów. Obecnie technika wykorzystująca eluenty zawierające znaczne ilości wody (więcej niż 0,1 %) znana jest jako chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC). 5.3. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconych układach faz (The Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography) Fazy stacjonarne W chromatografii ekdysteroidów stosuje się typowe fazy stacjonarne o charakterze hydrofobowym, takie jak, żele krzemionkowe modyfikowane grupami C22, C18, C8, C6, a także grupami fenylowymi. Wypełnienia te charakteryzują się dużą uniwersalnością i możliwością rozdzielenia ekdysteroidów o bardzo szerokim spektrum właściwości fizykochemicznych i zróżnicowanej budowie, a także innych składników matrycy roślinnej. W przypadku ekdysteroidów różnorodność struktury wpływa na kolejność elucji poszczególnych związków. Dlatego istotne jest dobranie indywidualnie najkorzystniejszych warunków chromatograficznych w zależności od posiadanej kolumny i stosowanego układu [15, 20]. Szczegółowe przedstawienie omawianych warunków rozdzielania ecdysteroidów przedstawia tabela 3. Tabela 3. Table 3. Zestawienie opisów literaturowych warunków rozdzielania ekdysteroidów w odwróconych układach faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC). A list of the RP-HPLC separation conditions of ecdysteroids. Kolumna (The column) Warunki elucji (The elution conditions) Faza ruchoma (The mobile phase) Program elucji (The elution program) Natężenie przepływu eluentu (The flow rate) Detekcja (Detection) Litera tura (Referenc es) Lichrospher 100 RP-18e, 250x4.6 mm, 5 μm (Merck, Niemcy) Spherisorb 5ODS2 (Biochrom), 250x4,6 mm C18 Phenomenex Sphereclone ODS2, 5µm, 150mm×4.60mm (Phenomenex, Macclesfield, UK) C6 Phenomenex Sphereclone, 5µm, 150mm×4.6mm (Phenomenex, Macclesfield, UK) Separon SGX C18, 5 µm, 250x4mm Sherisorb ODS-2 Symmetry C18, 150x3,9mm, 5 μm (Waters) Vol. 5, No 1/2013 ACN:H 2O 25:75 (+0.01% TFA) ACN:H 2O 23:77(+0.01% TFA) H 2O:MeOH 50:50 (0.01% TFA) H 2O:2-PrOH 82:18 (0.01% TFA) A: MeOH B: H 2O A: H 2O B: MeOH A: MeOH B: H 2O A:woda B:acetonitryl Izokratyczna 1 mL/min 246 nm [29] Izokratyczna 1 mL/min 242 nm [15, 21] Liniowy program elucji od 30 do 100% w 25 min Liniowy program elucji od 10 do 70% B w 50 min Liniowy program elucji od 30 do 100 % A w 30 min 100 % A 10 min 20-25% B w 0-20min 90% B w 20min 90% B w 20-30min Rekondycjonowanie kolumny 20% B przez 5min 1 mL/min 242 i 300 nm [23] 0,6 mL/min MS [27] 1 mL/min 242 nm [30] 0,7 mL/min 254 nm [31, 32] Camera Separatoria
Page 1 and 2: Siedlce University of Natural Scien
Page 3 and 4: SPIS TREŚCI (CONTENTS) PRACE ORYGI
Page 5 and 6: CAMERA SEPARATORIA Volume 5, Number
Page 7 and 8: Ocena przydatności i optymalizacja
Page 9 and 10: Ocena przydatności i optymalizacja
Page 13 and 14: Właściwości antyoksydacyjne miod
Page 15 and 16: Właściwości antyoksydacyjne miod
Page 19 and 20: Techniki chromatografii w rozdziela
Page 21: Techniki chromatografii w rozdziela
Page 25 and 26: Techniki chromatografii w rozdziela
Page 29 and 30: Krótki przegląd zastosowań cyklo
Page 37 and 38: Wspomnienie o profesorze Henryku La
Page 43 and 44: Instrukcje dla autorów 43 Wzory i
Page 45 and 46: Instrukcje dla autorów 45 Zapory g
Page 47: Instrukcje dla autorów 47 the arti

CamSep 5 1

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?