Imobilizacija enzima na ugljenične nanocevi - doiSerbia

Imobilizacija enzima na ugljenične nanocevi 

Nevena Ž. Prlainović, Dejan I. Bezbradica, Zorica D. Knežević-Jugović, Aleksandar D. Marinković, 

Petar S. Uskoković, Dušan Ž. Mijin 

Tehnološko–metalurški fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija 

Izvod 

Nanocevi poseduju veliki potencijal primene u raznim oblastima nauke i inženjerstva. Velika 

mehanička čvrstoća, odlična termička i električna provodljivost, veliki odnos površine prema 

zapremini i minimalna difuziona ograničenja čine ih idealnim nosačima za imobilizaciju biomolekula 

kao što su proteini, antigeni, antitela, vitamini, hormoni, antibiotici i dr. U ovom 

radu opisane su tehnika adsorpcije i kovalentnog vezivanja enzima na nemodifikovane, oksidovane 

i amino funkcionalizovane ugljenične nanocevi. Takođe je opisan uticaj površine 

ugljeničnih nanocevi na strukturne promene enzima, kao i na promene u pogledu aktivnosti i 

stabilnosti. 

Ključne reči: ugljenične nanocevi; imobilizacija enzima; adsorpcija; kovalentno vezivanje. 

Dostupno na Internetu sa adrese časopisa: http://www.ache.org.rs/HI/ 

Poslednjih decenija nanomaterijali, zbog jedinstvenih 

svojstava koja poseduju i širokog spektra mogućnosti 

primene, privlače veliku pažnju u mnogim oblastima 

nauke i inženjerstva. Mogu biti u vidu vlakana, žica, 

šipki, cevi, spirala ili prstenova. Ugljenične nanocevi 

(CNT) od njihovog otkrića 1991. godine [1], pa do danas 

jedan su od najproučavanijih materijala. Zbog svojih 

nanodimenzija, velike mehaničke čvrstoće, hemijske 

stabilnosti, termičke i električne provodljivosti nanocevi 

se koriste za proizvodnju biosenzora [2–4], skladištenje 

vodonika [5] i kao „nosači“ lekova [6]. Takođe se primenjuju 

u avio, tekstilnoj, elektronskoj kao i mnogim 

drugim industrijama [7–10]. Dele se na jednoslojne ugljenične 

nanocevi (eng. single walled carbon nanotubes 

– SWCNT), dvoslojne ugljenične nanocevi (eng. double 

Prepiska: N. Prlainović, Tehnološko–metalurški fakultet, Karnegijeva 

4, p. pr. 3503, 11120 Beograd, Srbija. 

E-pošta: nprlainovic@tmf.bg.ac.rs 

Rad primljen: 30. mart, 2011 

Rad prihvaćen: 28. maj, 2011 

PREGLEDNI RAD 

UDK 66.097.3:546.26 

Hem. Ind. 65 (4) 423–430 (2011) 

doi: 10.2298/HEMIND110330028P 

walled carbon nanotubes – DWCNT) i višeslojne ugljenične 

nanocevi (eng. multi walled carbon nanotubes – 

MWCNT) (slika 1). Uvid u njihovu strukturu omogućavaju 

savremeni mikroskopi kao što su transmisioni 

elektronski (TEM), skenirajući elektronski (SEM) i mikroskop 

atomskih sila (AFM). 

CNT se mogu dobiti sledećim tehnikama: 1) električnim 

pražnjenjem [11], 2) hemijskom depozicijom iz 

parne faze (CVD) [12] i 3) laserskom ablacijom (LA) 

[13,14]. 

Enzimi su biološki katalizatori. Veoma su raznovrsni 

i sposobni da katalizuju različite reakcije. Velika specifičnost 

prema supstratu, kao i sposobnost da katalizuju 

samo određenu reakciju omogućavaju razdvajanja racemskih 

smeša i dobijanje optički čistih jedinjenja [16]. 

Slika 1. Molekularni prikaz SWCNT (gore levo) i MWCNT (gore desno) sa tipičnim TEM mikrografima ispod [15]. 

Figure 1. Molecular presentations of SWCNT (top left) and MWCNT (top right) with typical transmission electron micrographs 

(below) [15]. (Reprinted with permission from Oxford University Press). 

Međutim, visoka cena, nedovoljna stabilnost i nemogućnost 

ponovnog korišćenja ograničavaju upotrebu 

nativnih enzima kao katalizatora. Imobilizacija enzima 

je efikasan način da se, u određenoj meri, prevaziđu 

423

N.Ž. PRLAINOVIĆ i sar.: IMOBILIZACIJA ENZIMA NA UGLJENIČNE NANOCEVI Hem. ind. 65 (4) 423–430 (2011) 

ova ograničenja. Prva istraživanja o imobilizaciji enzima 

pojavila su se početkom druge polovine dvadesetog 

veka. Od tada pa do danas imobilisani sistemi našli su 

široku primenu u mnogim industrijskim granama i koriste 

se za dobijanje različitih proizvoda [17–19]. Da li 

će imobilisani enzim naći praktičnu primenu u najvećoj 

meri zavisi od upotrebljenog nosača [20]. Potrebno je 

da ima veliki kapacitet vezivanja enzima, da bude hemijski 

i mikrobiološki stabilan, da omogući lako izdvajanje 

imobilizata iz reakcione smeše, itd. 

Širok dijapazon materijala, organskog ili neorganskog 

porekla, do sada je upotrebljavan kao nosač za 

imobilizaciju različitih enzima [21–34]. Poslednjih godina 

nanomaterijali postaju sve interesantniji u ovoj 

oblasti i veliki broj biomolekula je vezivan za nanocevi 

[35], nanočestice [36,37] i nanovlakna [38–40]. Svojstva, 

kao što su maksimalna površina po jedinici mase, 

minimalna difuziona ograničenja, maksimalna količina 

vezanog enzima i visoka mehanička stabilnost, koje nanocevi 

poseduju, čine ih idealnim nosačima. Osim toga, 

dužina nanocevi omogućava njihovo lako odvajanje jednostavnom 

filtracijom, a to je svojstvo koje ostali nanomaterijali 

ne poseduju. 

Glavni tehnički problem za praktičnu primenu ugljeničnih 

nanocevi u biomedicini i biotehnologiji je nedostatak 

rastvorljivosti u vodenoj sredini. Mogućnost hemijske 

modifikacije i funkcionalizacije njihove površine 

omogućava povećanje diperzibilnosti CNT u vodi, a time 

i primenu u fiziološkom okruženju. Pored disperzije 

oksidacijom pomoću kiselina, nekovalentne disperzije 

pomoću površinski aktivnih materija ili polimera, i 

funkcionalizacije hidrofilnim polimerima, modifikacija 

biološkim i bioaktivnim vrstama, kao što su ugljeni 

hidrati, nukleinske kiseline i proteini, predstavljaju 

načine kojima se povećava rastvorljivost CNT [41]. 

Cilj ovog rada je da se sumira dosadašnji napredak 

upotrebe ugljeničnih nanocevi kao nosača za imobilizaciju 

enzima, kao i da se predoče određeni nedostaci i 

prednosti kako adsorpcije tako i kovalentnog vezivanja. 

Tabela 1. Enzimi imobilisani adsorpcijom na ugljenične nanocevi 

Table 1. Enzymes immobilized by adsorption onto carbon nanotubes 

424 

IMOBILIZACIJA ENZIMA ADSORPCIJOM NA 

UGLJENIČNE NANOCEVI 

Adsorpcija enzima, pa i ostalih proteina, na ugljenične 

nanocevi je relativno jednostavan i jeftin način imobilizacije 

pri kojem ne dolazi do hemijske promene proteina 

i narušavanja jedinstvenih svojstava nanocevi (slika 

2). Međutim, veliki problem pri projektovanju procesa 

predstavlja relativno mala stabilnost tako nastalih 

imobilizata zbog moguće desorpcije proteina sa nosača. 

Tsang i saradnici su pre petnaestak godina prvi objavili 

mogućnost da se mali proteini kao što su metalotionein, 

citohrom C i β-laktamaza mogu adsorbovati na 

unutrašnje i spoljašnje strane ugljeničnih nanocevi 

[42,43]. Od tada je adsorpcija različitih proteina razmatrana 

u velikom broju radova [44–67] i razvijene su 

različite tehnike adsorpcije. Pregled enzima imobilisanih 

adsorpcijom na nanocevi dat je u tabeli 1. 

Slika 2. Fizička adsorpcija enzima na ugljenične nanocevi. 

Figure 2. Physical adsorption of enzymes around CNTs. 

β-Laktamaza, kao prvi korišćeni enzim, adsorbovana 

je i na nemodifikovane i na oksidovane nanocevi [43]. 

Istraživanja su pokazala da je veća aktivnost enzima 

(19%) zadržana u slučaju adsorpcije na oksidovanu površinu. 

Ovo je najverovatnije posledica stvaranja vodoničnih 

veza karboksilnih grupa CNT sa polarnim aminokiselinskim 

grupama enzima koje utiču na očuvanje strukture 

aktivnog centra. Nemodifikovana površina CNT 

znatno je hidrofobnija pa interakcije sa nepolarnim aminokiselinskim 

ostacima enzima dovode do strukturnih 

promena i inaktivacije. 

Električna svojstva CNT čine ove materijale pogodnim 

za proizvodnju biosenzora. Radi toga veliki broj naučnika 

uspešno je adsorbovao glukozo-oksidazu (GOx) 

Enzim Referenca Masa vezanog enzima (µg enzima mg –1 CNT) Relativna aktivnost imobilizata, % 

Amiloglukozidaza 60 564 – 

α-Himotropsin 50 673 1 

Citohrom C 42, 43, 45, 67 – – 

Glukozo oksidaza 46, 47, 63, 64 – – 

α-Glukozidaza 48 – – 

β-Glukozidaza 51 630 20 

Peroksidaza iz rena 57, 66 2250 98 

Peroksidaza iz soje 50 575 28 

Hidrogenaza 59 – – 

β-Laktamaza 43 – 19 

Lipaza 55, 58, 61 53,9 42 

Lizozim 52 – –


[46,47,63,64]. Azamian i saradnici su utvrdili da se posredstvom 

CNT značajno povećava prenos elektrona 

između GOx i elektrode i da se fizičkim vezivanjem, bilo 

na nemodifikovane ili oksidovane nanocevi, zadržava 

zadovoljavajuća aktivnost enzima [46]. Kasnije su Wang 

i saradnici utvrdili da se imobilizacijom GOx znatno poboljšava 

njena stabilnost i da je imobilisani enzim nakon 

mesec dana skladištenja zadržao 96,3% početne 

aktivnosti [47]. 

Od velikog značaja za aktivnost i stabilnost adsorbovanog 

enzima je uticaj površine ugljeničnih nanocevi na 

njegovu strukturu. Interakcije između površine CNT i 

enzima mogu biti veoma snažne. Pretežno su hidrofobne 

[52,55], kao posledica polarnih i aromatičnih 

aminokiselinskih ostataka, zatim mogu biti elektrostatičke 

[51], kao i vodonične veze [54]. Karajanagi i saradnici 

su bili prvi koji su proučavali uticaj površine CNT 

na strukturu i aktivnost enzima [50]. Adsorbovali su 

strukturno i funkcionalno različite enzime (α-himotripsin, 

CT i peroksidazu iz soje, SBP) i utvrdili da je, kada 

enzim i CNT dođu u kontakt, adsorpcija spontana, da 

prati krivu prividnog zasićenja i da se gotovo maksimalna 

moguća količina enzima (575 μg SBP mg –1 CNT i 673 

μg CT mg –1 CNT) adsorbuje već posle jednog minuta. 

Međutim, FTIR spektroskopija je pokazala da postoje 

značajne promene u sekundarnoj strukturi (α-heliks i β- 

-nabrane ploče) što ima za posledicu veliki gubitak enzimske 

aktivnosti, od 99% za CT i 72% za SBP. Ove rezultate 

je interesantno uporediti za rezultatima do kojih 

su, nešto kasnije, došli Palwai i saradnici [57]. Oni su 

adsorbovali peroksidazu iz rena, HRP, pri čemu je vezano 

2250 μg HRP mg –1 CNT uz 98% zadržane biološke 

aktivnosti. Ove razlike mogu biti posledica različitih tehnika 

adsorpcije koje su primenjene, ali i razlika u karakteristikama 

samih enzima. 

Hidrolitički enzimi, kao što su lipaze, uspešno su adsorbovane 

na ugljenične nanocevi [55,58,61]. Shah i saradnici 

[58] ustanovili su da je lipaza iz Candida rugosa 

nakon adsorpcije na CNT, u prisustvu goveđeg seruma 

albumina zadržala 97% biološke aktivnosti, dok su Pavlidis 

i saradnici [61] adsorpcijom lipaze na funkcionalizovane 

CNT, pored aktivnog, dobili i izuzetno stabilan 

imobilizat. Struktura aktivnog centra i specifičan mehanizam 

delovanja lipaza omogućavaju imobilizaciju na 

ugljenične nanocevi ne samo u vodenim rastvorima, 

već i u organskim rastvaračima i jonskim tečnostima. 

Najnovija istraživanja [62] pokazuju da se adsorpcijom 

u jonskim tečnostima na sobnoj temperaturi aktivnost 

imobilisane lipaze u odnosu na aktivnost nativne lipaze 

može povećati čak 6 puta. 

IMOBILIZACIJA ENZIMA NA UGLJENIČNE NANOCEVI 

KOVALENTNIM VEZIVANJEM 

Nedostatak jakih vezivnih sila može dovesti do desorpcije 

molekula enzima sa površine nosača. Na taj na- 

čin dolazi do gubitka mase vezanog enzima i smanjenja 

stabilnosti imobilisanog preparata. Da bi se rešio ovaj 

problem enzim se za površinu ugljeničnih nanocevi vezuje 

stvaranjem pravih hemijskih veza. S obzirom na 

hemijsku inertnost CNT, bilo kakva kovalentna imobilizacija 

zahteva prethodnu hemijsku modifikaciju radi 

uvođenja funkcionalnih grupa na njihovu površinu. Najčešće 

su to karboksilne grupe zbog lakoće njihovog 

uvođenja i mogućnosti vezivanja sa amino grupama enzima. 

Kontrolom reaktanata i/ili reakcionih uslova može 

se kontrolisati položaj i gustina karboksilnih grupa na 

površini CNT, što se može iskoristiti za kontrolisanje 

položaja i gustine vezanog enzima [68]. Univerzalni način 

za kovalentno vezivanje enzima na oksidovane nanocevi 

je aktivacija diimidom. N-etil-N´-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid 

(EDC) sa karboksilnim grupama 

CNT formira visoko reaktivni i nestabilni intermedijer 

koji sa amino grupom enzima formira stabilnu amidnu 

vezu. Istraživanja su, kao i u slučaju adsorpcije, započela 

vezivanjem proteina, poput albumina, streptavidina 

i feritina, kada su Huang i saradnici [69] objavili da 

posredstvom EDC-a dolazi do njihovog vezivanja. Međutim, 

u nedostatku kontrolnih eksperimenata ne može 

se sa sigurnošću tvrditi da se radi isključivo o kovalentnoj 

imobilizaciji. Lee i saradnici su nakon toga 

imobilisali peroksidazu i TEM i AFM mikrografima jasno 

potvrdili uspešnost vezivanja [70]. Utvrdili su da dodatak 

10 mM EDC povećava efikasnost vezivanja za oko 

20%, kao i da je, kada se on koristi, aktivnost imobilisanog 

enzima veća za oko 3 puta. Takođe su utvrdili da 

dolazi do značajnog proširenja pH optimuma, pa tako 

imobilisana peroksidaza, za razliku od nativne peroksidaze 

koja je najaktivnija na pH 7, maksimalnu aktivnost 

ispoljava u širokom pH opsegu od 4–9. 

Da bi se povećala stabilnost nastalog intermedijera i 

sprečile intermolekulske interakcije EDC sa karboksilnim 

grupama proteina, imobilizacija se vrši u prisustvu 

N-hidroksisukcinimida (NHS) ili njegovog sulfo derivata 

(sulfo-NHS), u proceduri u dva koraka, kao što je prikazano 

na šemi 1. Za kovalentnu imobilizaciju enzima 

na CNT uglavnom se koristi ova tehnika [60,71–76]. 

Asuri i saradnici [71,74] objavili su da se 172 µg SBP, 

168 µg subtilizina, 203 µg lipaze i čak 1300 µg HRP 

može vezati na 1 mg CNT. Da bi dokazali da se radi o 

kovalentnom vezivanju kontrolne eksperimente su radili 

u odsustvu EDC/NHS i utvrdili da je procenat nespecifičnog 

vezivanja manji od 5%. Takođe su ispitali uticaj 

kovalentnog vezivanja na sekundarnu strukturu enzima, 

pri čemu je CD (cirkularni dihroizam) spektroskopija pokazala 

da je nakon imobilizacije zadržano oko 50–70% 

nativne strukture. Kovalentna imobilizacija u ovom slučaju 

pozitivno je uticala na termalnu i operacionu stabilnost 

i stabilnost pri skladištenju. Poluvreme života se, 

na primer, za lipazu produžilo 14 puta, dok je imobilisana 

SBP nakon stote upotrebe u šaržnom reaktoru 

425


Šema 1. Šematski prikaz vezivanja proteina za oksidovane CNT pomoću EDC u prisustvu NHS. 

Scheme 1. Schematic presentation of conjugation of proteins to carboxylated CNT using EDC in the presence of NHS. 

zadržala čak 70% aktivnosti, isto koliko je zadržala i nakon 

30 dana skladištenja. 

Kovalentnom imobilizacijom amiloglukozidaze na 

ugljenične nanocevi dolazi do narušavanja stukture i velikog 

gubitka aktivnosti nativnog enzima (97%). Ovakve 

promene u strukturi i aktivnosti mogu se objasniti formiranjem 

amidnih veza. Zbog toga su Cang-Rong i saradnici 

[60] pokušali da zamene položaj grupa kako bi 

sam proces imobilizacije imao što manji uticaj na aktivnost 

enzima (šema 2). 

Pre procesa imobilizacije modifikovali su i enzim i 

oksidovane CNT. Oksidacijom pomoću perjodata uveli 

su karbonilne grupe na površinu enzima, a karboksilne 

grupe na površini ugljeničnih nanocevi modifikovali u 

amino grupe. Ispostavilo se da je ovim metodom došlo 

Šema 2. Kovalentno vezivanje oksidovanog enzima na amino finkcionalizovane ugljenične nanocevi. 

Scheme 2. Covalent immobilization of oxidized enzyme on amino-functionalized carbon nanotubes. 

426 

do značajnog povećanja aktivnosti (56%), ali da se vezala 

manja količina enzima, 142 µg amiloglukozidaze po 

1 mg CNT. Međutim, u ovom slučaju se mora uzeti u 

obzir funkcionalizacija ugljeničnih nanocevi u više koraka 

i pretpostavka da se sve prisutne karboksilne grupe 

nisu modifikovale u amino grupu. 

Alonso-Lomillo i saradnici su pri imobilizaciji hidrogenaze 

imali nešto drugačiji pristup [77]. Najpre su na 

površini ugljeničnih nanocevi, jakim π–π interakcijama, 

formirali mono sloj 4-nitrofenil grupa, a nitro grupe su 

u sledećem koraku redukovali u amino grupe. Dalje su 

imobilizaciju, stvaranjem amidnih veza između karboksilnih 

grupa enzima i amino grupa sa površine CNT, vršili 

pomoću EDC/NHS, kao što je ranije opisano.


Ono što je bitno napomenuti, i što predstavlja prednost 

u odnosu na veoma jednostavnu tehniku adsorpcije, 

jeste povećanje termalne, operacione i stabilnosti 

pri skladištenju u slučaju kovalentnog vezivanja za površinu 

CNT (tabela 2). Čak i u slučaju velikog gubitka 

aktivnosti ova tehnika ima prednost jer pruža mogućnost 

ponovnog korišćenja imobilizata. 

Tabela 2. Enzimi imobilisani kovalentnim vezivanjem na ugljenične nanocevi 

Table 2. Enzymes immobilized by covalent attachment onto carbon nanotubes 

ZAKLJUČAK 

Ugljenične nanocevi su važna klasa novih materijala. 

Poseduju brojna svojstva zbog kojih su korisne u tehnologiji 

i industriji. Pokazale su se kao dobar nosač za 

imobilizaciju enzima. Veliki odnos površine prema zapremini 

(oko 300 m 2 g –1 ) obezbeđuje veliku količinu 

vezanog enzima, poseduju mogućnost uvođenja različitih 

funkcionalnih grupa na površinu i mogućnost formiranja 

više veza sa molekulom enzima. Aktivnosti imobilisanih 

enzima su uglavnom manje od aktivnosti nativnih, 

ali povećanje stabilnosti koje se postiže imobilizacijom 

kao i mogućnosti reciklacije nadoknađuju ovaj 

nedostatak. Dalji problemi se ogledaju u poteškoćama 

vezanim za industrijsku primenu posebno u okviru uvećanja 

razmera procesa. Uvođenje nosača nano dimenzija 

proširuje granice imobilizacije i otvara mogućnosti 

razvoja novih ekonomičnih postupaka. Eksponencijalni 

napredak u ovoj oblasti vrlo brzo će omogućiti razvoj 

komercijalnih imobilisanih enzima na bazi ugljeničnih 

nanocevi. 

Zahvalnica 

Autori se zahvaljuju Ministarstvu prosvete i nauke 

Republike Srbije na finansijskoj pomoći u toku izrade 

ovog rada (projekti 172013, III 46010 i III 45019). 

LITERATURA 

[1] S. Iijima, Helical microtubules of graphitic carbon, Nature 

354 (1991) 56–58. 

[2] B. Qiu, Z. Lin, J. Wang, Z. Chen, J. Chen, G. Chen, An 

electrochemiluminescent biosensor for glucose based 

on the electrochemiluminescence of luminol on the 

nafion/glucose oxidase/poly(nickel(II)tetrasulfophthalo- 

cyanine)/multi-walled carbon nanotubes modified electrode, 

Talanta 78 (2009) 76–80. 

[3] J. Wang, Carbon-nanotube based electrochemical biosensors: 

A review, Electroanalysis 17 (2005) 7–14. 

[4] S. Sotiropoulou, V. Gavalas, V. Vamvakaki, N.A. Chaniotakis, 

Novel carbon materials in biosensor systems, Biosens. 

Bioelectron. 18 (2003) 211–215. 

Enzim Referenca Masa vezanog enzima (µg enzima mg –1 CNT) Relativna aktivnost imobilizata, % 

Amiloglukozidaza 60 290 – 

Glukozo oksidaza 72 – – 

Peroksidaza iz rena 66, 70, 71, 73, 75 1300 49 

Peroksidaza iz soje 71, 74 172 55 

Hidrogenaza 77 – – 

Lipaza 74, 76, 78 203 58 

Subtilizin 71, 74 168 54 

[5] S.M. Lee, Y.H. Lee, Hydrogen storage in single-walled 

carbon nanotubes, Appl. Phys. Lett. 76 (2000) 2877– 

–2879. 

[6] G. Pastorin, W. Wu, S. Wieckowski, J. Briand, K. Kostarelos, 

M. Prato, A. Bianco, Double functionalisation of 

carbon nanotubes for multimodal drug dilivery, Chem. 

Commun. 11 (2006) 1182-1184. 

[7] A.R. Köhler, C. Som, A. Helland, F. Gottschalk, Studying 

the potential release of carbon nanotubes throughout 

the application life cycle, J. Cleaner. Prod. 16 (2008) 

927–937. 

[8] R.H. Baughman, A.A. Zakhidov, W.A. de Heer, Carbon 

nanotubes—the route toward applications, Science 297 

(2002) 787–792. 

[9] Z. Wu, Z. Chen, X. Du, J.M. Logan, J. Sippel, M. Nikolou, 

K. Kamaras, J.R. Reynolds, D.B. Tanner, A.F. Hebard, A.C. 

Rinzler, Transparent, Conductive carbon nanotube films, 

Science 305 (2004) 1273–1276. 

[10] E. Artukovic, M. Kaempgen, D.S. Hecht, S. Roth, G. Grüner, 

Transparent and flexibile carbon naotube transistors 

Nano. Lett. 5 (2005) 757–760. 

[11] V.N. Popov, Carbon nanotubes: properties and applications, 

Mater. Sci. Eng. R. 43 (2004) 61–102. 

[12] M. Jose-Yacaman, M. Miki-Yoshida, L. Rendon, J.G. Santiesteban, 

Catalytic growth of carbon microtubules with 

fullerene structure, Appl. Phys. Lett. 62 (1993) 202–204. 

[13] A. Thess, R. Lee, Crystalline ropes of metallic carbon 

nanotubes, Science 273 (1996) 483–487. 

[14] H. Dai, Carbon Nanotubes: Synthesis, Integration, and 

Properties, Acc. Chem. Res. 35 (2002) 1035–1044. 

[15] K. Donaldson, R. Aitken, L. Tran, V. Stone, R. Duffin, G. 

Forrest, A. Alexander, Carbon Nanotubes: A review of 

their properties in relation to pulmonary toxicology and 

workplace safety, Toxicol. Sci. 92 (2006) 5–22. 

[16] C.H. Wong, G.M. Whitesides, in Tetrahedron Organic 

Chemistry Series, Enzymes in Synthetic Organic Chemis- 

427


try, Vol. 12, 1 st ed., J.E Baldwin, P.D Magnus (Eds.), 

Elsevier Science, Oxford, 1994. 

[17] J.F. Liang, Y.T. Li, V.C. Yang, Biomedical application of 

immobilized enzymes, J. Pharm. Sci. 89 (2000) 979–990. 

[18] P. Bajpai, Application of enzymes in the pulp and paper 

industry, Biotechnol. Prog. 15 (1999) 147–157. 

[19] A. Schmid, F. Hollman, J.B. Park, B. Buler, The use of 

enzymes in the chemical industry in Europe, Curr. Opin 

Biotechnol. 13 (2002) 359–366. 

[20] E. Emregul, S. Sungur, U. Akbulut, Polyacrylamide–gelatine 

carrier system used for invertase immobilization, 

Food chem. 97 (2006) 591–597. 

[21] R.M. Blanco, P. Terreros, M. Fernández-Pérez, C. Otero, 

G. Díaz-González, Functionalization of mesoporous silica 

for lipase immobilization: Characterization of the support 

and the catalysts, J. Mol. Catal. B 30 (2004) 83–93. 

[22] G. Bayramoglu, M. Yilmaz, M.Y. Arica, Preparation and 

characterization of epoxy-functionalized magnetic chitosan 

beads: laccase immobilized for degradation of reactive 

dyes, Bioproces. Biosyst. Eng. 33 (2010) 439–448. 

[23] F.M. Gomes, E.B. Pereira, H.F. de Castro, immobilization 

of lipase on chitin and its use in nonconventional biocatalysis, 

Biomacromolecules 5 (2004) 17–23. 

[24] D. Mijin, V. Nikolić, M. Mišić-Vuković, D.V. Vuković, The 

kinetic behaviour of catalase immobilized on Amberlite 

IRA – 410, J. Serb. Chem. Soc. 53 (1988) 625–630. 

[25] D.Ž. Mijin, M.M. Mišić-Vuković, G.V. Vunjak-Novaković, 

D.V. Vuković, Kinetic behaviour of lipase from Candida 

cylindracea, J. Serb. Chem. Soc. 58 (1993) 525–531. 

[26] Z. Knežević, Lj. Mojović, B. Adnađević, Immobilization of 

lipase on a hydrophopic yeolite type Y, J. Serb. Chem. 

Soc. 63 (1998) 257–264. 

[27] Z. Knežević, N. Milosavić, D. Bezbradica, Z. Jakovljevic, R. 

Prodanovic, Immobilization of lipase from Candida 

rugosa on Eupergit® C supports by covalent attachment, 

Biochem. Eng. J. 30 (2006) 269–278. 

[28] M.G. Žuža, S.S. Šiler-Marinković, Z.D. Knežević-Jugović, 

Preparation and characterization of penicillin acylase 

immobilized on Sepabeads EC-EP carrier, Chem. Ind. 

Chem. Eng. Q. 13 (2007) 205–210. 

[29] M.G. Žuža, S.S. Šiler-Marinković, Z.D. Knežević-Jugović, 

Immobilization of penicillin acylase from Escherichia coli 

on comercial Sepabeads EC-EP carrier, Acta Per. Tech. 

38 (2007) 173–182. 

[30] Z.D. Knežević-Jugović, J.J. Damnjanović, D.I. Bezbradica, 

D.Ž. Mijin, The immobilization of lipase on Sepabeads: 

characterization and application in geranyl butyrate synthesis 

in a low aqueous system, Chem. Ind. Chem. Eng. 

Q. 14 (2008) 245–249. 

[31] Z.D. Knežević-Jugović, S.V. Šaponjić, D.I. Bezbradica, D.Ž. 

Mijin, Immobilization of lipase on Sepabeads and its 

application in pentyl octanoate synthesis in a low aqueous 

system, Acta Per. Tech. 39 (2008) 139–152. 

[32] D. Bezbradica, D. Mijin, M. Mihailović, Z. Knežević-Jugović, 

Microwave-assisted immobilization of lipase from 

Candida rugosa on Eupergit® supports, J. Chem. Technol. 

Biotechnol. 84 (2009) 1642–1648. 

[33] Z. D. Knežević-Jugović, D.I. Bezbradica, D.Ž. Mijin, M.G. 

Antov, The immobilization of enzyme on Eupergit® sup- 

428 

ports by covalent attachment, Methods Mol. Biol. 679 

(2011) 99–111. 

[34] N.Ž. Prlainović, Z.D. Knežević-Jugović, D.Ž. Mijin, D.I. 

Bezbradica, Immobilization of lipase from Candida rugosa 

on Sepabeads®: the effect of lipase oxidation by 

periodates, Bioprocess Biosys. Eng. 34 (2011) 803-810. 

[35] Y. Gao, I. Kyratzis, covalent immobilization of proteins 

on carbon nanotubes using the cross-linker 1-ethyl-3-(3- 

-dimethylaminopropyl)carbodiimide – a critical assessment, 

Bioconjugate Chem. 19 (2008) 1945–1950. 

[36] C.P. Govardhan, Crosslinking of enzymes for improved 

stability and performance, Curr. Opin. Biotechnol. 10 

(1999) 331–335. 

[37] D. Häring, P. Schreier, Cross-linked enzyme crystals, 

Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 35–38. 

[38] L. Wu, X. Yuan, J. Sheng, Immobilization of cellulase in 

nanofibrous PVA membranes by electrospinning, J. 

Membr. Sci. 250 (2005)167–173. 

[39] B,C, Kim, S. Nair, J. Kim, J.H. Kwak, J.W. Grate, S.H. Kim, 

M.B. Gu, Preparation of biocatalytic nanofibres with 

high activity and stability via enzyme aggregate coating 

on polymer nanofibres, Nanotechnology 16 (2005) 

S382–S388. 

[40] K.N. Chua, W.S. Lim, P. Zhang, H. Lu, J. Wen, S. Ramakrishna, 

K.W. Leong, H.Q. Mao, Stable immobilization of 

rat hepatocyte spheroids on galactosylated nanofiber 

scaffold, Biomaterials 26 (2005) 2537–2347. 

[41] Y. Lin, S. Taylor, H. Li, K.A.S. Fernando, L. Qu, W. Wang, 

L. Gu, B. Zhou, Y.P. Sun, Advances toward bioapplications 

of carbon nanotubes, J. Mater. Chem. 14 (2004) 

527–541. 

[42] Z. Guo, P.J. Sadler, S.C. Tsang, Immobilization and visualization 

of dna and proteins on carbon nanotubes, 

Adv. Mater. 10 (1998) 701–703. 

[43] J.J. Davis, M.L.H. Green, H.A.O. Hill, Y.C. Leung, P.J. Sadler, 

J. Sloan, A.V. Xavier, S.C. Tsang, The immobilisation 

of proteins in carbon nanotubes, Inorg. Chim. Acta. 272 

(1998) 261–266. 

[44] F. Balavoine, P. Schultz, C. Richard, V. Mallouh, T.W. Ebbesen, 

C. Mioskowski, Helical crystallization of proteins 

on carbon nanotubes: a first step towards the development 

of new biosensors, Angew. Chem., Int. Ed. 38 

(1999) 1912–1915. 

[45] R.J. Chen, Y. Zhang, D. Wang, H. Dai, Noncovalent Sidewall 

Functionalization of Single-Walled Carbon Nanotubes 

for Protein Immobilization, J. Am. Chem. Soc. 123 

(2001) 3838–3839. 

[46] B.R. Azamian, J.J. Davis, K.S. Coleman, C.B. Bagshaw, 

M.L.H. Green, Bioelectrochemical Single-Walled Carbon 

Nanotubes, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 12664–12665. 

[47] S.G. Wang, Q. Zhang, R. Wang, S.F. Yoon, J. Ahn, D.J. 

Yang, J.Z. Tian, J.Q. Li, Q. Zhou, Multi-walled carbon nanotubes 

for the immobilization of enzyme in glucose 

biosensors, Electrochem. Commun. 5 (2003) 800–803. 

[48] R.J. Chen, S. Bangsaruntip, K.A. Drouvalakis, N.W.S. 

Kam, M. Shim, Y. Li, W. Kim, P.J. Utz, H. Dai, Noncovalent 

functionalization of carbon nanotubes for highly 

specific electronic biosensors, Proc. Natl. Acad. Sci. 

U.S.A. 100 (2003) 4984–4989.


[49] N.Q. Jia, L.J. Wang, L. Liu, Q. Zhou, Z.Y. Jiang, Bamboolike 

CNX nanotubes for the immobilization of hemoglobin 

and its bioelectrochemistry, J. Phys. Chem., B 108 

(2004) 3760–3764. 

[50] S.S. Karajanagi, A.A. Vertegel, R.S. Kane, J.S. Dordick, 

Structure and Function of Enzymes Adsorbed onto 

Single-Walled Carbon Nanotubes, Langmuir 20 (2004) 

11594–11599. 

[51] J.M. Gomez, M.D. Romero, T.M. Fernandez, Immobilization 

of β-Glucosidase on carbon nanotubes, Catal. 

Lett. 101 (2005) 275–278. 

[52] K. Matsuura, T. Sait, T. Okazaki, S. Ohshima, M. Yumura, 

S. Iijima, Selectivity of water-soluble proteins in singlewalled 

carbon nanotube dispersions, Chem. Phys. Lett. 

429 (2006) 497–502. 

[53] L. Song, J. Meng, J. Zhong, L.F. Liu, X.Y. Dou, D.F. Liu, 

X.W. Zhao, S.D. Luo, Z.X. Zhang, Y.J. Xiang, H.Y. Xu, W.Y. 

Zhou, Z.Y. Wu, S.S. Xie, Human fibrinogen adsorption 

onto single-walled carbon nanotube films, Colloids Surf. 

B 49 (2006) 66–70. 

[54] X.J. Li, W. Chen, Q.W. Zhan, L.M. Dai, L.Sowards, M. 

Pender, R.R. Naik, Direct measurements of interactions 

between polypeptides and carbon nanotubes, J. Phys. 

Chem., B 110 (2006) 12621–12625. 

[55] S.S. Karajanagi, H.C. Yang, P. Asuri, E. Sellitto, J.S. Dordick, 

R.S. Kane, Protein-assisted solubilization of singlewalled 

carbon nanotubes, Langmuir 22 (2006) 1392– 

–1395. 

[56] P. Asuri, S.S. Karajanagi, H. Yang, T.J. Yim, Increasing 

Protein Stability through Control of the Nanoscale Environment, 

Langmuir 22 (2006) 5833–5836. 

[57] N.R. Palwai, D.E. Martyn, L.F.F. Neves, Y. Tan, D.E. Resasco, 

R.G. Harrison, Retention of biological activity and 

near-infrared absorbance upon adsorption of horseradish 

peroxidase on single-walled carbon nanotubes, 

Nanotechnology 18 (2007) 235601 (5 pp). 

[58] S. Shah, K. Solanki, M.N. Gupta,Enhancement of lipase 

activity in non-aqueous media upon immobilization on 

multi-walled carbon nanotubes, Chem. Cent. J. 1 (2007) 

30–35. 

[59] A.R. Liu, T. Wakayama, C. Nakamura, J. Miyake, N.A. 

Zorin, D.J. Qian, Electrochemical properties of carbon 

nanotubes-hydrogenase conjugates Langmuir-Blodgett 

films, Electrochim. Acta. 52 (2007) 3222–3228. 

[60] J.T. Cang-Rong, G. Pastorin, The influence of carbon nanotubes 

on enzyme activity and structure: investigation 

of different immobilization procedures through enzyme 

kinetics and circular dichroism studies, Nanotechnology 

20 (2009) 255102 (20 pp). 

[61] I.V. Pavlidis, T. Tsoufis, A. Enotiadis, D. Gournis, H. Stamatis, 

Functionalized Multi-Wall Carbon Nanotubes for 

Lipase Immobilization, Adv. Eng. Mater. 12 (2010) B179– 

–B183. 

[62] H.K. Lee, J.K. Lee, M.J. Kim, C.J. Lee, immobilization of 

lipase on single walled carbon nanotubes in ionic liquid, 

Bull. Korean Chem. Soc. 31 (2010) 650–652. 

[63] A. Guiseppi-Elie, C.H. Lei, R.H. Baughman, Direct electron 

transfer of glucose oxidase on carbon nanotubes, 

Nanotechnology 13 (2002) 559–564. 

[64] S. Sotiropoulou, N.A. Chaniotakis, Carbon nanotube array-based 

biosensor, Anal. Bioanal. Chem. 375 (2003) 

103–105. 

[65] S. Chen, R. Yuan, Y. Chai, L. Zhang, N. Wang, X. Li, Amperometric 

third-generation hydrogen peroxide biosensor 

based on the immobilization of hemoglobin on multiwall 

carbon nanotubes and gold colloidal nanoparticles, 

Biosens. Bioelectron. 22 (2007) 1268–1274. 

[66] X. Yu, D. Chattopadhyay, I. Galeska, F. Papadimitrakopoulos, 

J.F. Rusling, Peroxidase activity of enzymes bound 

to the ends of single-wall carbon nanotube forest electrodes, 

Electrochem. Commun. 5 (2003) 408–411. 

[67] S. Boussaad, N.J. Tao, R. Zhang, T. Hopson, L.A. Nagahara, 

In situ detection of cytochrome c adsorption with 

single walled carbon nanotube device, Chem. Commun. 

13 (2003) 1502–1503. 

[68] K. Jiang, L.S. Schadler, R.W. Siegel, X. Zhang, H. Zhang, 

M. Terronesd, Protein immobilization on carbon nanotubes 

via a two-step process of diimide-activated amidation, 

J. Mater. Chem. 14 (2004) 37–39. 

[69] W.J. Huang, S. Taylor, K.F. Fu, Y. Lin, D.H. Zhang, T.W. 

Hanks, A.M. Rao, Y.P. Sun, Attaching Proteins to Carbon 

Nanotubes via Diimide-Activated Amidation, Nano Lett. 

2 (2002) 311–314. 

[70] Y.M. Lee, O.Y. Kwon, Y.J. Yoon, K. Ryu, Immobilization of 

horseradish peroxidase on multi-wall carbon nanotubes 

and its electrochemical properties, Biotechnol. Lett. 28 

(2006) 39–43. 

[71] P. Asuri, S.S. Bale, R.C. Pangule, D.A. Shah, R.S. Kane, J.S. 

Dordick, Structure, Function, and Stability of Enzymes 

Covalently Attached to Single-Walled Carbon Nanotubes, 

Langmuir 23 (2007) 12318–12321. 

[72] Y.H. Lin, F. Lu, Y. Tu, Z.F. Ren, Glucose biosensors based 

on carbon nanotube nanoelectrode ensembles, Nano 

Lett. 4 (2004) 191–195. 

[73] X. Yu, S.N. Kim, F. Papadimitrakopoulos, J.F. Rusling, 

Protein immunosensor using single-wall carbon nanotube 

forests with electrochemical detection of enzyme 

labels, Mol. BioSyst. 1 (2005) 70–78. 

[74] P. Asuri, S.S. Karajanagi, E. Sellitto, D.Y. Kim, R.S. Kane, 

J.S. Dordick, Water-soluble carbon nanotube-enzyme 

conjugates as functional biocatalytic formulations, Biotechnol. 

Bioeng. 95 (2006) 804–811. 

[75] X. Yu, B. Munge, V. Patel, G. Jensen, A. Bhirde, J.D. 

Gong, S.N. Kim, J. Gillespie, J.S. Gutkind, F. Papadimitrakopoulos, 

J.F. Rusling, carbon nanotube amplification 

strategies for highly sensitive immunodetection of cancer 

biomarkers, J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 11199– 

–11205. 

[76] P. Ji, H. Tan, X. Xu, W. Feng, Lipase Covalently Attached 

to Multiwalled Carbon nanotubes as an efficient catalyst 

in organic solvent, Am. Inst. Chem. Eng. J. 56 (2010) 

3005–3011. 

[77] M.A. Alonso-Lomillo, O. Rudiger, A. Maroto-Valiente, M. 

Velez, I. Rodriguez-Ramos, F.J. Munoz, V.M. Fernandez, 

A.L. De Lacey, Hydrogenase-coated carbon nanotubes 

for efficient H 2 oxidation, Nano Lett. 7 (2007) 1603– 

–1608. 

[78] Q. Shi, D. Yang, Y. Su, J. Li, Z. Jiang, Y. Jiang, W. Yuan, 

Covalent functionalization of multi-walled carbon nanotubes 

by lipase, J. Nanopart. Res. 9 (2007) 1205–1210. 

429


SUMMARY 

IMMOBILIZATION OF ENZYMES ONTO CARBON NANOTUBES 

Nevena Ž. Prlainović, Dejan I. Bezbradica, Zorica D. Knežević-Jugović, Aleksandar D. Marinković, Dušan Ž. Mijin 

Faculty of Technology and Metallurgy, University of Belgrade, Belgrade, Serbia 

(Review paper) 

The discovery of carbon nanotubes (CNTs) has opened a new door in nanotechnology. 

With their high surface area, unique electronic, thermal and mechanical 

properties, CNTs have been widely used as carriers for protein immobilization. 

In fact, carbon nanotubes present an ideal support system without diffusional 

limitations, and also have the possibility of surface covalent functionalization. 

It is usually the oxidation process that introduces carboxylic acid groups. 

Enzymes and other proteins could be adsorbed or covalently attached onto 

carbon nanotubes. Adsorption of enzyme is a very simple and inexpensive immobilization 

method and there are no chemical changes of the protein. It has also 

been found that this technique does not alter structure and unique properties of 

nanotubes. However, a major problem in process designing is the relatively low 

stability of immobilized protein and desorption from the carrier. On the other 

hand, while covalent immobilization provides durable attachment, the oxidation 

process can reduce mechanical and electronic properties of carbon nanotubes. It 

can also affect the active site of enzyme and cause the loss of enzyme activity. 

Bioimmobilization studies have showed that there are strong interactions between 

carbon nanotubes surface and protein. The retention of enzyme structure 

and activity is critical for their application and it is of fundamental interest to 

understand the nature of these interactions. Atomic force microscopy (AFM), 

transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM) and 

circular dichroism (CD) spectroscopy provide an insight into the structural changes 

that occur during the immobilization. The aim of this paper is to summarize progress 

of protein immobilization onto carbon nanotubes. 

430 

Keywords: Carbon nanotubes • Enzyme 

immobilization • Adsorption • Covalent 

attachment

Imobilizacija enzima na ugljenične nanocevi - doiSerbia

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?