Fungicid fra reker - Nordic Innovation

Fungicid fra rejer
Projekt nr. P99088
Nordisk Industrifond
Slutrapport
September 2001
Et nordic wood projekt.
Teknologisk Institut
Bioteknik
Ole Frederiksen
2001.11.27
1

2
Forord:
Nordic Wood er den nordiske træindustris forsknings- og
udviklings program, med en målsætning om, at anvendelsen
af træ skal øges. Programmet finansieres af den nordiske
industri, Nordisk Industrifond, Skov- og Naturstyrelsen,
Danmark, Norges Forskningsråd og Vinnov (Verket för
innovationssystem) i Sverige.
Det er kendt, at et stof der kan udvindes af rejeskaller,
chitosan, har fungicid virkning. Det er i dette projekt
undersøgt, om dette forhold kan udnyttes til træbeskyttelse.
Der er i projektet lagt særlig vægt på, at undersøge
mulighederne for at fiksere stoffet i træ, så dette ikke
udvaskes.
Parterne i projektet er på udviklingssiden Norsk Treteknisk
Institutt, ved Fred Evans, Sveriges Provnings- och
Forskningsinstitut ved Jöran Jermer og Dansk Teknologisk
Institut, Bioteknik ved Anne Pia Kock og Ole Frederiksen.
På industrisiden deltog Primex Ingredients A/S, Norge, ved
Thorbjørn Toppe senere afløst af Bjarte Langhelle; Royal
Greenland, Danmark ved Charles Kastberg Christiansen, og
PLUS A/S ved Gert Knudsen
Styregruppen har bestået af Thorbjørn Toppe senere afløst
af Bjarte Langhelle, Primex A/S og Gert Knudsen, PLUS A/S
Projektet er finansieret af Nordisk Industrifond, Nordic Wood
2 programmet, Skov- og Naturstyrelsen, Danmark og
Norges Forskningsråd i Norge samt Vinnov i Sverige.

Indhold
Indhold.................................................................................................... 3
Indledning ............................................................................................... 4
Baggrund ................................................................................................ 6
Status ..................................................................................................... 8
Screening...........................................................................................10
Chitosans fixering på cellulose.............................................................12
Måling af chitosan...............................................................................15
Undersøgelse af fixering i træ..............................................................17
Yderligere forsøg ................................................................................17
Pinus sylvestris...................................................................................18
Modificeret EN 113 .............................................................................20
Chitosans effekt overfor skimmelsvampe og blåsplint............................22
Chitosans effekt overfor alger ..............................................................25
Litteratur.................................................................................................29
3

4
Formål
Det er projektets formål at gennemføre undersøgelser, der
skal optimere og dokumentere chitosans muligheder som
træbeskyttelsesmiddel, med speciel vægt på chitosans
fixering i træ, så dette sikres mod udvaskning.

Indledning
Det er kendt, at et stof der kan udvindes af rejeskaller,
chitosan, har fungicid virkning.(Ghaouth, 1992, Ghaouth,
1994, Hadwiger, 1995) Vi vil i det følgende gennemgå de
undersøgelser, der er gennemført for at undersøge
mulighederne for at udnytte dette forhold til træbeskyttelse.
Undersøgelserne blev i første omgang gennemført som en
screeningsundersøgelse af, om der var forskel på de
forskellige chitosantypers fungicide effekt. Disse
undersøgelser blev gennemført som hæmningstests på
maltagar. Der blev herefter udviklet en metode til
kvantificering af chitosan i opløsning, hvorefter mulighederne
for at binde chitosan til cellulose og træ blev undersøgt og
optimeret. Endelig kunne chitosans effekt som
træbeskyttelsesmiddel over for trænedbrydende svampe
undersøges. Slutteligt blev det undersøgt om chitosan har
effekt på vækst af skimmelsvamp og blåsplint samt alger.
Det har undervejs i projektet vist sig, at chitosan har god
effekt på trænedbrydende svampe, når disse vokser på
næringsmedier, men at stoffet ikke er i stand til at beskytte
træ tilstrækkeligt, når stoffet er imprægneret ind i træet. Der
er i projektet lagt vægt på at undersøge mulighederne for at
fiksere stoffet i træ.
I denne rapport er baggrund og samtlige undersøgelser med
valg af metode, gennemgang af resultater og konklusioner.
5

6
Baggrund
Teknologisk Institut i Danmark har tidligere beskrevet et
aktivstof til træbeskyttelse, der kan fremstilles ud fra
rejeskaller. Dette stof har vist sig at have forebyggende
effekt mod trænedbrydende svampe (Miljøprojekt nr. 424,
1998: 2-deoxy-D-glucose i bekæmpelsesmidler til
byggematerialer). Stoffet i vandig opløsning er blevet testet
og opfylder effektivitetskravene i den europæiske normtest
for træbeskyttelsesmidler: EN 113 (Determination of toxic
values of wood preservatives against wood destroying
basidiomycetes cultured on agar medium) også efter en
kunstig ældningstest – EN 73 efterfulgt af EN 113. Kravene
efter en udvasknings-test - EN 84 efterfulgt af EN 113 blev
dog ikke opfyldt. Der var derfor behov for udvikling af
fixeringsmetoder, før dette kunne opnås. Arbejdet med dette
aktivstof og undersøgelse af litteratur om chitosans fungicide
virkninger sandsynliggjorde et potentiale som aktivstof i
imprægneringsmidler mod trænedbrydende svampe for
svampemidler. Det primære problem, der skulle løses, før
stoffet kunne bringes i anvendelse, syntes at være fixeringen
i træet snarere end effekten. Derfor fokuseredes der i dette
projekt på fixeringen af svampemidlet. Fokus i projektet blev
flyttet over på udnyttelsen af chitosan som aktivstof, på
bekostning af 2-deoxy-D-glucose, idet litteraturen viser, at
chitosan kan adsorbere til cellulose.
Rejeskaller, der er et affaldsprodukt fra rejeindustrien, er i et
vist omfang stadig et problem, bl.a. må det i Norge ikke
mere dumpes i havet. Der er nu opført fabrikker, der kan
forarbejde rejeskaller – dels til rejeskalmel, dels til forædling.
Produktet af forædlingen er her primært chitosan.
Det stof i rejeskaller, der kan omdannes til aktivstof, er chitin.
Dette stof er en polymer af acetyleret glucosamin. Chitin
bliver ved syrebehandling deacetyleret, og bliver herved til
chitosan. Det har vist sig, at chitosan har en hæmmende
effekt over for mikroorganismer – ikke mindst svampe. Det
er i dette projekt undersøgt, om denne effekt kunne
udnyttes til træbeskyttelsesformål. Desuden har chitosan
den egenskab, at det er en positivt ladet polymer. Det er
bl.a. dette forhold, der medfører, at chitosan kan adsorbere
på cellulose.
Cellulose, der jo er en væsentlig del af træet, har en negativt
ladet overflade. Den elektrostatiske interaktion imellem
cellulose og chitosan spiller hermed en vigtig rolle i
chitosans adsorption til cellulose (Roberts, 1992). Dette fænomen
udnyttes i papirindustrien, hvor chitosan ved denne
mekanisme anvendes til at gøre papir elektrisk neutralt ved
at adsorbere til alle de anioniske steder på fiberoverfladen
(Roberts, 1992).

Hvis mængden af chitosan, der kan bindes til cellulose,
primært er afhængig af den elektrostatiske interaktion, vil
mængden af chitosan, der kan bindes til cellulose, kunne
øges, hvis ”ladningstætheden” i chitosanen sænkes, idet
hver chitosankæde vil neutralisere færre aniongrupper på
cellulosen. Denne reduktion i ”ladningstætheden” kan opnås
ved at øge pH eller ved at øge graden af acetylering. Der
nævnes i samme reference (Roberts, 1992), at pH-optimum
for adsorption til cellulose er 8,2.
En anden faktor, der har betydning for mængden af chitosan,
der kan adsorberes til cellulosen, er størrelsen på chitosanen.
Det må forventes, at chitosan med en lav molekylevægt
kan trænge længere ind i træet, hvorimod højmolekylært
chitosan ikke kan forventes at kunne trænge ind i substratet.
(Roberts, 1992). Der er da også fundet en omvendt
proportionalitet mellem chitosanens molekylevægt og den
mængde, der kan adsorbere til cellulose (Roberts, 1992).
Chitosans virkemåde som svampemiddel er tilsyneladende,
at polymerer på syv monomerer og derover er i stand til at
hæmme RNA syntesen hos i hvert tilfælde nogle svampe
(Hadwiger, 1985). Der er også rapporter om antibakteriel
effekt af chitosan. Her er teorien, at det er cationer på chitosans
overflade, der binder til anioner på bakteriens overflade,
og herved ændrer cellemembranens permeabilitet
(Anonym, 1999). Det har ikke været muligt at finde
referencer direkte på chitosan alene anvendt som
træbeskyttelsesmiddel.
En undersøgelse af chitosan som indkapslingsmedum til de
trænedbrydende (hvidmuldsdannende) svampe Coriolus
versicolor og Irpex lacteus har vist, at disse to svampe slet
ikke kan vokse på en hydrogel dannet af chitosan gelatineret
med 5% Na-polyphosphat. Der findes en mængde undersøgelser
af chitosans fungicide effekt på plantepatogene
svampe. Eksempelvis er chitosan i en koncentration på 6
gram pr. liter i stand til at hæmme spiringen af sporer af
skimmelsvampen Botrytis cinerea med 98,7% og hæmning
af radial vækst med over 95%(Ghaouth, 1992). Chitosan er i
stand til fuldstændig at stoppe væksten af den plantepatogene
svamp Pythium aphanidermatum i en koncentration på
400 μg pr. ml. (Ghaouth, 1994).
7

8
Opsummering
Vi har i dette projekt undersøgt mulighederne for at anvende
chitosans fungicide virkning til træbeskyttelse. Litteraturen
beskriver chitosan som særdeles effektivt over for svampe.
Undersøgelser i litteraturen viste også, at det var muligt at
binde chitosan til cellulose ved elektrostatisk interaktion idet
chitosan er negativt ladet, og cellulose er positivt ladet.
Vore undersøgelser har vist, at chitosan blandet i maltagar
er relativt effektivt over for trænedbrydende svampe. Ægte
Hussvamp stoppes fuldstændig af chitosan i en
koncentration på 1 g pr. liter maltagar, Gul Tømmersvamp
opnår en vækst på 25 % af en kontrol uden chitosan ved en
chitosankoncentration på 1 g pr. liter maltagar, mens Broget
Læderporesvamp opnår en vækst på 40 % ved samme
koncentration.
Et biologisk assay viste, at chitosan kan bindes til cellulose
(filterpapir) og bevarer vedhæftningen hertil under
udvaskning.
Et assay til måling af chitosan i opløsning blev udviklet.
Dette assay viste sig dog at være meget følsomt over for
komponenter, der blev vasket ud af træ og måtte derfor
opgives.
Et biologisk assay af chitosans fixering i træ blev anvendt,
og det viste sig her, at der var for stor nedbrydning af de
imprægnerede og udvaskede træklodser.
I en tillempet EN 113 test uden udvaskning, viste det sig, at
chitosan, når det er imprægneret i træ ikke kan hæmme
svampes nedbrydning af dette – sandsynligvis fordi
svampene, når de vokser på træ, udskiller stoffer, der er i
stand til at nedbryde eller detoxificere chitosan.
En undersøgelse af chitosans potentiale som
overfladebehandlingsmiddel til at stoppe vækst af skimmelog
blåsplintsvampe blev herpå gennemført. Der var en vis,
om end utilstrækkelig effekt af chitosan.
En undersøgelse af chitosans potentiale som middel mod
algevækst viste også, at effekten ikke er tilstrækkelig.
Projektgruppen besluttede herefter at afslutte projektet ca.
15 måneder før planlagt, idet det blev vurderet, at
resultaterne ikke har en karakter, der sandsynliggør, at der
kan opnås anvendelige resultater ved yderligere forsøg i
projektperioden.

Summary
In this project we have investigated the possibilities of using
the fungicide effect of Chitosan for wood protection. The literature
describes Chitosan as being especially effective on
fungi. Research work in the literature also showed that it was
possible to bind Chitosan to cellulose by electrostatic interaction
as Chitosan is negatively charged, and cellulose is
positively charged.
Our research has shown that Chitosan mixed with malt agar
is relatively effective to wood decaying fungi. Serpula lacrymans
is stopped totally by Chitosan in a concentration of 1
g/l malt agar, Coniophora puteana have a growth of 25% of
a control without Chitosan with a Chitosan concentration of 1
g/l malt agar, whereas Coriolus versicolor has a growth of
40% at the same concentration.
A biological assay showed that Chitosan can be bound to
cellulose (filter paper) and keeps the attachment under
washing.
An assay for measurement of Chitosan in a solution was developed.
However, this assay turned out to be very sensitive
to components washed out of wood and consequently it had
to be abandoned.
A biological assay of the fixation of Chitosan in wood was
used, and here it turned out that the decay of the preserved
and washed wood blocks was too high.
In an adapted EN 113 test without washing it turned out that
Chitosan, when preserved in wood, cannot obstruct the fungal
decay of the wood – probably because the fungi, when
they grow on wood, liberates compounds that are able to
break down or detoxify Chitosan.
A research of the potential of Chitosan as a surface preservation
agent to stop growth of mould and blue stain was then
made. It showed a certain, yet unsatisfactory effect of Chitosan.
A research of the potential of Chitosan as an agent against
growth of algae also showed that the effect was not satisfactory.
The project group then decided to end the project approx. 15
months before scheduled as it was estimated that the results
do not have a character that makes it probable that any usable
results can be achieved by further experiments in the
project period.
9

10
Screeningsundersøgelse
Screening
De første undersøgelser, der blev gennemført var en
screening af, hvilke typer af chitosan, der havde den største
toxiditet over for trænedbrydende svampe. To
brunmuldsdannere, nemlig Ægte Hussvamp (Serpula lacrymans)
og Gul Tømmersvamp (Coniophora puteana) samt en
hvidmuldsdanner, nemlig Broget Læderporesvamp (Coriolus
versicolor) blev udvalgt til testen.
Kriteriet for udvælgelse af koncentrationer af chitosan var,
hvad der ville væ re økonomisk konkurrencedygtigt i forhold
til de eksisterende aktivstoffer.
Metode
Microbial Inhibitory Test – hæmning af svampevækst på
vækstmedium blandet med chitosan blev gennemført.
Chitosan i forskellige koncentrationer blev iblandet en maltagaropløsning
og hældt på petriskåle, der efter størkning
blev podet med svamp, hvorefter vækstdiameteren dagligt
blev målt.
Der blev anvendt 6 forskellige slags chitosan, mærket TD
018, TMD 029, TM 296, TM 615, TM 727, TM 772.
Forskellen bestod dels i forskelle i deacetyleringsgrad, dels i
størrelse af molekylerne. Chitosanen blev opløst i 0,1 M
eddikesyre under opvarmning og omrøring. Efter opløsning
blev der justeret med 4 M og 1 M NaOH til pH 7. De færdige
chitosanopløsninger blev strømmet (opvarmet til 100°C uden
tryk) i 30 minutter, og derefter blandet med en autoklaveret
maltagarblanding.
Det var ikke muligt at blande chitosanopløsning og maltagarblanding
inden autoklavering, da chitosanen herved
bundfældedes. De færdige koncentrationer af chitosan var 1
g/l, 0,5 g/l og 0,1 g/l .
Petripladerne blev podet med frisk mycelium fra hver af de
tre forskellige trænedbrydende svampe. Der blev lavet 3
replika af hver svamp, for hver chitosankoncentration og
derudover også en kontrol uden chitosan. Inkuberingen
foregik ved RH 70 % og 20 °C.
Efter en lagfase blev vækstdiameteren målt dagligt i to
retninger, vinkelret på hinanden.
Resultat
Resultaterne for undersøgelsen af koncentrationen på 1 g
chitosan pr. l. er gengivet i det følgende. Bemærk at nogle
linier kan være sammenfaldende, og derfor ikke til at skelne
fra hinanden. Dette gælder f. eks. Ægte Hussvamp, hvor der
ikke var vækst ved nogen type af chitosan.

VÆKST(mm)
VÆKST(mm)
30
25
20
15
10
5
12
10
8
6
4
2
Ægte Hussvamp, 1 g/L.
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
DAG
Gul Tømmersvamp, 1 g/L.
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
DAG
TD 018
TMD 029
TM296
TM 615
TM727
TM 772
KONTROL
td 018
tmd 029
tm 296
tm 615
tm 727
tm 772
kontrol
11

12
VÆKST(mm)
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Broget læderporesvamp, 1 g/L.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
DAG
Diskussion og konklusion
Ægte Hussvamp hæmmes fuldstændigt ved en
chitosankoncentration på 1 g/l.
Ved tilsætning af 1 g chitosan pr. l. vækstmedium hæmmes
Gul Tømmersvamp med ca. 75% i forhold til kontrollen uden
chitosan. Der er ikke væsentlig forskel på effekten af de
forskellige chitosantyper.
Ved tilsætning af 1 g chitosan pr. l. vækstmedium hæmmes
Broget Læderporesvamp med ca. 60% i forhold til kontrollen
uden chitosan. Der er ikke væsentlig forskel på effekten af
de forskellige chitosantyper.
Ved chitosankoncentrationer på 0,5 g/l kunne der kun hos
Ægte Hussvamp ses væsentlig reduktion, nemlig en
hæmning på ca. 90% af kontrollen, mens Gul
Tømmersvamp og Broget læderporesvamp havde en
hæmning på 10 - 40 % af kontrollen uden chitosan.
Ved chitosankoncentrationer på 0,1 g/l kunne der ikke ses
betydende reduktion af væksten i forhold til kontrollen uden
chitosan.
TD 018
TMD 029
TM296
TM615
TM 727
TM 772
KONTROL

Chitosans fixering i cellulose
På basis af ovenstående undersøgelser blev chitosans
fixering til cellulose undersøgt ved et biologisk assay.
Metode
50μl opløsning af chitosan (2g/l) i 01 M eddikesyre bufret
ved pH 5, blev pipetteret ud på cellulose filterpapir
(Whatman nr. 1) med en diameter på 1,1 cm. På halvdelen
af disse filterpapirer blev der herefter pipetteret 50 μl 0,1 M
Tris/HCl buffer, pH 8,2. (Dette er pH-optimum for den
elektroniske interaktion mellem chitosan og cellulose)
(Roberts, 1992).
Halvdelen af filterpapirerne blev vasket ud ved at ligge 12
timer i ledningsvand.
Filterpapirerne placeredes herefter på petriskåle med maltagar
(40 g malt/l, 25 g agar/l)
Der er tre replica med kontroller uden chitosan.
Efter placering af filterpapirerne på maltagaren sprayedes en
sporesuspension af skimmelsvampen Aspergillus niger ud
over petriskålene. Skålene blev herefter placeret i
klimakammer med RH 70 % og 20 °C.
I denne undersøgelse blev den mest langkædede type af
chitosan - TD018 - og den mest kortkædede type – TM615 -
brugt.
Efter en måned blev væksten på skålene evalueret efter
følgende skala:
0 svarer til ingen vækst på filterpapiret
1 betyder vækst, men mindre end halvdelen af papiret er
dækket af svamp
2 betyder at mere end halvdelen, men ikke hele filterpapiret
er dækket af svamp
3 betyder, at hele filterpapiret er dækket af svamp.
13

14
Degree of growth of A. niger
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
-fix/-leaching
Resultat:
Resultaterne (gennemsnit af de tre replica) viser, at A. niger
hæmmes af chitosan hvad enten dette er den kortkædede
eller den langkædede form. Et biologisk assay som dette vil
altså kunne vise indhold af chitosan.
Uden et fixeringstrin er der stadig en smule chitosan tilbage
på cellulosen, efter udvaskningsproceduren, da væksten
stadig er noget hæmmet i forhold til kontrol uden chitosan.
Fixeringstrinnet, hvor pH hæves til 8,2, sænker chitosans
toxiditet, specielt for TM615, den korte kæde af chitosan.
Efter udvaskningen er der stadig hæmning – en smule bedre
hæmning end efter udvaskning uden fixering. Effekten på
toxiditeten af den højere pH værdi på TM615 er også
forsvundet efter udvaskningen.
Diskussion og konklusion
Control of chitosan fixation to cellulose
-fix/+leaching
+/- fixation and leaching
+fix/-leaching
Konklusionen er, at vækst af Aspergillus niger på cellulose
på maltagar hæmmes næsten totalt af chitosan, og at der er
en positiv effekt på fixering af at hæve pH til 8,2 i cellulosen
inden denne udvaskes.
+fix/+leaching
TD018
TM615
Control

Måling af chitosan efter fixering i træ
Ved undersøgelse af chitosans binding til træ og andre
materialer vil det være en stor fordel, hvis mængden af
chitosan i f. eks. udvaskningsvand kan måles. Dette vil
betyde, at det ikke vil være nødvendigt at benytte den langsomme
og relativt dyre (arbejdskrævende) metode som et
biologisk assay er. I dette tilfælde skal træ imprægneres
med chitosan, og herefter eventuelt fixeres og udvaskes.
Hvis der kan findes en metode til måling af koncentration af
chitosan i opløsning vil vi kunne måle koncentrationen i
udvaskningsvandet. Alternativet til disse målinger er, at
træklodserne udsættes for vækst af trænedbrydende
svampe, så effekten af imprægnering kan ses direkte på
svampenes nedbrydning af træet. Denne sidste metode til
undersøgelse af fixering er selvsagt langsommelig, idet der
må regnes med en inkubering på svamp i 16 uger før vi
kender effekten af imprægnering, fixering og udvaskning.
Der findes imidlertid ingen metoder til analyse af chitosan
koncentration i opløsning, hvorfor en sådan metode måtte
udvikles.
Det vides, at nogle farvestoffer, eksempelvis Erytrosin B,
kan farve chitin, den fuldt acetylerede type af chitosan.
Chitin er imidlertid uopløselig i vand. Den primære ide i
udviklingen at dette assay var, at tilsætte farve (Erytrosin B)
til opløsninger af chitosan (ved pH-værdier under 5, hvor
chitosan er fuldt opløseligt) i en række kendte
koncentrationer, bundfælde chitosanen ved at hæve pH til 9,
hvor chitosan er uopløseligt. Ved tilstedeværelse af farve i
denne proces er forventningen, at der bindes farve til
chitosan, når denne bringes på uopløselig form. Herved kan
der fjernes en farvemængde, der er proportional med den
mængde chitosan der udfældes. Hermed kan chitosankoncentrationen
i en opløsning kvantificeres ved at måle
ændring i farveintensitet efter at pH er hævet og
chitosan/farvekomplex er bundfældet ved nedspinning.
Vi kan altså måle absorbansen på supernatanten, og
derudfra fremstille en standardkurve ud fra en række kendte
koncentrationer af chitosan. Jo mere farve supernatanten
indeholder, jo mindre farve vil være bundet til chitosan, dvs.
jo mindre chitosan vil den givne væske have indeholdt. Når
man så har en væske med en ukendt koncentration af
chitosan, kan man måle absorbansen af denne, og derefter
aflæse koncentrationen af chitosan på standardkurven.
Metode
Chitosantype TD 018, TMD 029 og TM 615 i
koncentrationerne
10 g/L; 1 g/L; 0,5 g/L; 0,1 g/L; 0,05 g/L; 0,02 g/L;
O,1 M eddikesyre, pH 5
Erytrosin B, 90 mg/l.
Trisbuffer 0,1 M ved pH 7, pH 8 og pH 9
15

16
Fremstilling af standardkurve
Til hver prøve (opløsning af chitosan) blev der tilsat 2 ml
Trisbuffer, 2 ml erytrosin B 90 mg/L og 2 ml
chitosanopløsning i en kendt koncentration.
Til reference blev der tilsat 2 ml eddikesyre i stedet for
chitosanopløsning.
Hver prøve blev whirlymixet, derpå sat på rystebord ved 70-
80 rpm. i 1 time og derefter whirlymixet igen. Herefter
forventes det, at al den farve, der kan bindes til chitosanen,
er bundet.
Herefter bundfældes chitosan med farve ved nedspinning:
15000 rpm. i 15 min.
Til sidst blev der målt absorbans på supernatanten.
Ved måling af absorbans på udvaskningsvæskerne, blev
den samme fremgangsmåde anvendt som ved
absorbansmålingerne til standardkurven.
Resultat:
Ved fremstillingen af standardkurverne kunne der opnås
korrelationskoefficienter på over 0,99 ved pH 9 for alle
undersøgte typer af chitosan og korrelationskoefficienter på
over 0,95 ved pH 8 for alle undersøgte typer af chitosan.
Ved pH 7 var korrelationskoefficienterne på under 0,95.
Diskussion og konklusion
Metoden virker altså glimrende ved opløsning af chitosan i
0,1 M eddikesyre i vand, hvis pH hæves til over 8.
Vi kunne herefter konkludere, at metoden måtte være
brugbar til undersøgelse af chitosanindholdet i det vand, der
benyttes til at udvaske chitosanimprægnerede træklodser, til
undersøgelse og optimering af chitosanets fixering i træ.
pH 9 blev anvendt ved undersøgelse af udvaskningsvandet
fra imprægnerede og udvaskede træklodser.

Undersøgelse af fixering i træ
Metode
En modificeret EN 84 test blev anvendt til undersøgelse af
chitosans fixering i træ.
EN 113 klodser af fyrresplint (Pinus sylvestris) og bøg(Fagus
sylvatica) blev imprægneret med chitosan – 10 g/l. ved pH
5. Konditioneringen af klodserne fulgte anvisningerne givet i
EN 113. Efter konditionering blev halvdelen af klodserne
udsat for et fixeringstrin, hvor klodserne blev imprægneret i
en 0,1 M Trisbuffer, pH 9. Konditionering efter fixering fulgte
anvisninger givet i EN 113.
Herefter blev alle klodser udvasket iht. anvisninger givet i EN
84, og udvaskningsvandet blev bevaret, så
chitosanindholdet kunne måles i dette.
Resultat
I den her beskrevne udvaskningsprocedure er det
sandsynligt, at der er vasket stoffer ud af træet, som
indfluerer på det assay, der tidligere er omtalt. Der kunne
ikke opnås tilstrækkelig sikkerhed for, at de koncentrationer,
der kunne måles, var de rigtige.
Yderligere undersøgelse af fixering
Udvikling af det ovenfor beskrevne assay blev undersøgt
ved imprægnering af træklodser med chitosan og direkte
herefter målinger af vægtforøgelse samt tørring til konstant
vægt og registrering af tørvægtforøgelse. Vi havde hermed
et mål for, hvor meget chitosan der var optaget i klodserne.
Klodserne blev herefter slebet halvt igennem. Slibestøvet
blev placeret i 0,1 M eddikesyre i rystebord i en time,
hvorefter slibestøvet blev spunnet ned, og chitosanindholdet
i supernatanten blev undersøgt. Op til 27 % af den
forventede mængde chitosan i dette assay kunne genfindes.
En yderligere procedure, hvor chitosanet blev fældet ud og
spunnet ned, hvorefter supernatanten med eventuelle
opløste stoffer fra træet kunne fjernes, blev gennemført.
Denne ekstra procedure forbedrede dog ikke genfindingen
af chitosan.
Diskussion og konklusion
Denne metode blev herefter opgivet til dette formål, i det de
lave koncentrationer af chitosan og den lave
genfindingsprocent gør, at disse metoder til hurtig
undersøgelse af fixering måtte opgives.
Det blev herefter besluttet undersøge fixeringen i et biologisk
assay.
17

18
Biologisk assay af fixering af chitosan
De træklodser, der var imprægneret med chitosan og herpå
udvasket (oprindeligt med henblik på at undersøge
chitosankoncentrationen i udvaskningsvandet), blev herefter
undersøgt i et biologisk assay, hvor det blev undersøgt, om
der var forskel i nedbrydningen af træklodserne, afhængigt
af om chitosanet var fixeret (ved at øge pH til 8,2 i træet)
eller ej.
Klodserne blev eksponeret for trænedbrydende svampe og
inkuberet i 16 uger iht. EN113, men kun med to svampe,
nemlig Gul Tømmersvamp (Coniophora puteana) og Broget
Læderporesvamp (Coriolus versicolor).
“Vægttab kontrol” viser vægttabet i de uimprægnerede
klodser, der ligger ved siden af de imprægnerede klodser.
Resultat:
Chitoclear TD018 (lang polymer af chitosan):
Træart Svamp Udvask- Fixering Vægttab Vægttab,
ning
(%) kontrol (%)
Pinus sylvestris Coniophora
puteana
+ - 6 8
Fagus sylvatica Coriolus
Versicolor
+ - 21 25
Coniophora
puteana
+ + 8 8
Pinus sylvestris
Fagus sylvatica Coriolus
Versicolor
Chitoclear TM615 (kort polymer af chitosan):
+ + 24 25
Træart Svamp Udvask- Fixering Vægttab Vægttab,
ning
(%) kontrol (%)
Pinus sylvestris Coniophora
puteana
+ - 10 13
Fagus sylvatica Coriolus
versicolor
+ - 23 28
Pinus sylvestris Coniophora
puteana
+ + 9 7
Fagus sylvatica Coriolus
versicolor
+ + 27 27
Diskussion og konklusion
Vægttabet i de imprægnerede klodser er meget højt og
meget langt fra acceptabelt iht. EN 113. I EN 113 defineres
et godt resultat som værende, når gennemsnitlige vægttab
er under 3% og ingen emner overstiger 5% vægttab.
Sammenlignet med den hæmning der kunne ses i vor
microbial inhibitory test og fixeringsundersøgelsen på ren

cellulose, er vægttabet meget højt og ikke umiddelbart
forklarligt. Det ses endvidere at brunmuldsdanneren Gul
Tømmersvamp, Coniophora puteana, i kontrollen ikke kan
nedbryde fyrreklodserne til det sædvanlige niveau. Dette kan
skyldes, at dette individ af svampen har nået et stadium,
hvor den ikke længere er så aktiv som den plejer – alene af
denne grund må denne undersøgelse forkastes. Den ringe
nedbrydning i kontrollen kan også skyldes, at der fra den
imprægnerede klods er en afdunstning, som Gul
Tømmersvamp ikke kan tåle. Denne forklaring er dog ikke
sandsynlig, da der ikke umiddelbart er flygtige stoffer i
imprægneringsvæsken. Forklaringen på det store vægttab i
de imprægnerede klodser kunne skyldes ringe toxiditet af
chitosan i træ, eller det kunne skyldes, at chitosanet mod
forventning blev vasket ud, og altså ikke kunne bindes til
cellulose i træ.
19

20
Modificeret EN 113
Det blev herefter undersøgt, om ovenstående forhold
skyldes manglende fixering eller manglende toxiditet af
chitosan i træet. Dette blev gjort ved imprægnering af
træklodser med chitosan og uden udvaskning. Klodserne
blev herefter udsat for vækst af svampe (Gul Tømmersvamp,
Coniphora puteana eller Broget Læderporesvamp,
Coriolus versicolor) i 10 uger. Denne test ville afsløre
eventuel manglende toxiditet af chitosan i træ.
Metode
Halve EN 113 klodser imprægneres med chitosan.
Klodserne har dimensionerne 50 mm x 25 mm x 7,5 mm.
Der er i alle tilfælde benyttet klodser af fyrresplint, Pinus
sylvestris.
Efter imprægnering og iht. EN 113 med koncentrationer på
0; 1; 2; 3; eller 4 gram chitosan pr. liter
imprægneringsvæske (0,1 M eddikesyre) og efterfølgende
konditionering blev klodserne udsat for vækst af enten Gul
Tømmersvamp, Coniphora puteana eller Broget
læderporesvamp, Coriolus versicolor i 10 uger. Der
undersøgtes to typer af chitosan – en langkædet (TD018) og
en kortkædet, TM615. Denne modificerede form af EN 113
er valgt, fordi den er hurtigere end en fuld EN 113, og
alligevel giver brugbare indikationer af toxiditeten i en
screeningssituation.
Resultat
Vægttab %
50
40
30
20
10
0
0
1
Modificeret EN 113/EN 84
2
3
4
Kontrol
Koncentration af chitosan
(TM615) (g/l)
EN 113 C.
versicolor
EN 113 + EN 84 C.
Versicolor
En 113 C. puteana
EN 113 + EN 84 C.
puteana

Vægttab %
40
30
20
10
0
0
Modificeret EN 113 /EN 84
1
2
3
4
Control
Koncentration af chitosan
TD018 (g/l)
Diskussion og konklusion
Resultaterne viser, at ingen af de undersøgte typer af
chitosan har nogen betydende virkning på nedbrydning af
træet. Disse resultater er højest overraskende, idet
toxiditeten end ikke er i nærheden af den toxiditet, der er vist
i tidligere gennemført Microbial Inhibitory Test. Årsagen til
dette er ikke umiddelbart til at gennemskue, men den kan
skyldes, at svampene, når de vokser i træ, udskiller en
række stoffer, der er i stand til at nedbryde eller detoxificere
chitosan. Når svampene vokser på et rigt medium som
maltagar, er de ikke induceret til at udskille disse stoffer,
hvorfor chitosans toxiske virkning er voldsom. (Kurt
Messner, pers. kom.)
EN 113 C.
versicolor
EN 113 + EN 84
C. Versicolor
En 113 C.
puteana
EN 113 + EN 84
C. puteana
21

22
Chitosans effekt over for skimmelsvampe/blåsplint
Skimmelsvampe og blåsplintsvampe udgør en risiko for
træværk, så snart det er fældet og efterfølgende ved
sekundær opfugtning. Disse svampe skæmmer træets
udseende og kan indendøre medføre indeklimaproblemer.
Angreb af skimmel og blåsplintsvampe kan forebygges ved
overfladebehandling med et effektivt middel, der hæmmer
spiring og vækst af disse svampe. Det er undersøgt om
chitosan har effekt overfor skimmel- og blåsplintsvampe.
Skimmeltest
Emner af fyrresplint med en dimension på 5 cm x 2,5 cm x
0,75 m endefladeforsegles med paraffin. Herefter behandles
de med chitosanopløsninger på henholdsvis 5 og 10 g/l. Der
anvendes 2 typer chitosan, TD018 og TM615. Emnerne
behandles på de 4 sider med chitosan med et forbrug
svarende til 6m 2 /l. Dette forbrug er valgt, dels ud fra hvad
emnerne har kunnet suge, dels ud fra de mængder der
normalt bruges ved en overfladebehandling.
Til testen er anvendt 4 skimmelsvampe: Alternaria sp,
Aspergillus versicolor, Cladosporium sphaerospermum og
Trichoderma viride/harzianum. Disse svampe er hyppigt
forekommende i ude- og indemiljøet på opfugtede konstruktioner.
Svampene er rendyrket fra prøver modtaget i
forbindelse med konstaterede angreb af skimmelsvampe i
bygninger.
Svampene er rendyrket på V8-agar tilsat antibiotika. De rene
kulturer er herefter dyrket på V8-agar uden tilsætning af antibiotika.
Sporerne er høstet ved til hver plade at tilsætte 10
ml sporesuspensionsopløsning (0,5 g Tween 80 og 0,5 g
agar i 1000 ml ionbyttet vand) og herefter frigøre sporerne
med en drigalskispatel. Suspensionen filtreres gennem vat,
hvorefter antallet af sporer tælles i tællekammer for hver
svamp. Suspensionerne, som alle 4 indeholder ca 10 5
sporer pr. ml blandes herefter. De behandlede emner, som
er strålesteriliseret med 2 x 5 kGy, dyppes herefter i
sporesuspensionen, hvorefter de placeres på autoklaverede
hårrør på 14 cm petriskåle med V8-agar. Graden af vækst
aflæses efter 1 uge og herefter 1 gang ugentligt. Graden af
vækst inddeles i en 5-delt skala, hvor:
÷ ingen vækst
+ vækst kun på siderne
++ vækst på sider og på under 25% af overfladen
+++ vækst på sider og på mellem 25 og 75 % af
overfladen
++++ vækst på over 75 % af emnet
Resultat:

Efter 1 uges inkubering er der vækst på alle emner. Efter 3
ugers inkubering er væksten på alle emner ++++. Væksten,
som ses på pladerne, er udelukkende forårsaget af
Trichoderma viride/harzianum, som må have udkonkurreret
de øvrige 3 svampe.
Diskussion og konklusion
Også effekten over for skimmelsvampe er voldsomt påvirket
af, om chitosanet er på træ. Vi ser ingen brugbar effekt af
chitosan over for skimmelsvampe. Chitosan kan altså ikke
anvendes til beskyttelse af træværk mod skimmelvækst efter
fældning og heller ikke ved efterfølgende sekundær
opfugtning.
Blåsplintprøvning
Emnerne af fyrresplint, med en dimension, som beskrevet i
EN 152, part 1: Test methods for wood preservatives;
Laboratory method for determining the preventive
effectiveness of a preservative treatment against blue stain
in service. Part 1: Brushing procedure, endefladeforsegles
med paraffin. Herefter behandles de med opløsninger på 5
og 10 g/l af chitosantyperne TD018 og TM615. Emnerne
behandles på overfladen inklusiv de rundede hjørner i en
mængde svarende til et forbrug på 6 m 2 /l. Efter afdunstning,
vil emnerne ifølge standarden skulle eksponeres i 6
måneder udendørs, denne eksponering er for at spare tid
ikke udført. I den aktuelle test er emnerne herefter direkte
efter afdunstningen skåret i nye dimensioner ifølge
standarden, hvor bl.a. endefladeforseglingen er fjernet.
Emnerne strålesteriliseres, hvorefter de som beskrevet i
standarden dyppes i en sporesuspension af Aureobasidium
pullulans og Schlerophoma pithyophila, placeres i glas på
vermiculite opfugtet til mætning, og derefter påføres 15 ml
sporesuspension på overfladen.
Efter 6 ugers inkubering ved 70% RH og 20°C, evalueres
graden af vækst på overfladen og misfarvningens
indtrængning i hvert enkelt emne.
Overfladevæksten evalueres ifølge standarden ud fra
følgende skala:
0 Ingen synlig blåsplint
1 Højst 10 pletter med en diameter på højst 2 mm
2 Sammenhængende angreb på op til 1/3 af overfladen
eller misfarvet i streger eller i områder på op til 50% af
arealet
3 Over 1/3 af overfladen sammenhængende misfarvet
eller over 50% i områder.
23

24
Resultat efter 6 ugers eksponering
På alle emner ses misfarvning på overfladen.
Behandling Score efter 6 ugers eksponering
Eddikesyre 3-3-3-3
TD018, 5 g/l 3-3-3-3
TD 018, 10 g/l 2-3-3-3
TM 615, 5 g/l 3-2-3-3
TM 615, 10 g/L 1-1-2-2
Efter 6 ugers eksponering ses en hæmning af blåsplint
behandlet med en opløsning af TM615 på 10 g/l.
EN 152 (modificeret): Blåsplint trængt ind:
Behandling Score efter 6 ugers eksponering
Zone fri for Blåsplint
mm:
Max Min Gnst
Kontrol 2 0 0,2
TD018, 5 g/l 7 0 0,2
TD 018, 10 g/l 2 0 0,2
TM 615, 5 g/l 8 0 1,5
TM 615, 10 g/L 9 0 1,5
Der ses en hæmning af blåsplint behandlet med en
opløsning af TM615 på 5 og 10 g/l. Hæmningen er dog ikke
stor.
Diskussion og konklusion
TM615 er i stand til at hæmme blåsplint til en vis grad.
Hæmningen er dog ikke så stor, og i sammenhæng med, at
skimmelsvampehæmningen ikke er tilstrækkelig konkluderes
det, at chitosan i sig selv ikke er tilstrækkeligt til at yde
beskyttelse af nyfældet og sekundært opfugtet træ imod
skimmel- og blåsplintsvampe

Chitosans effekt over for alger
Alger udgør et kosmetisk problem på udendørs eksponeret
træ. Der findes ikke godkendte og effektive midler på
markedet til forebyggelse og bekæmpelse af alger.
Chitosans effekt over for alger er derfor afprøvet. Ved udendørs
eksponering over jord kan udvaskningen være stor.
Derfor er det vigtigt, såfremt chitosan har en effekt på
algevækst, at undersøge om chitosan i tilstrækkelig
mængde kan binde sig til overfladen.
Algeprøvning
Emner af kaliumsilikatplader (MASTERCLAD) på 10 x 10 cm
behandles på 1 side med chitosan opløsninger af
chitosantyperne TM615 og TD018 med koncentrationer på
henholdsvis 5 og 10 g/l i en mængde svarende til et forbrug
på 6 m 2 /l.
Grønalgen Stichococcus bacillaris, SCCAP K-0150 dyrkes
på plader med næringsmedium. (Bold solution modified (BS)
50x konc. – fortyndes i demin. vand tilsættes agar,
autoklaveres og ophældes i petriskåle) i klimakammer ved
21°C med 16 timer lys pr. døgn.
En algesuspension fremstilles ved til pladerne med den
udvoksede alge at tilsætte 10 ml BS-opløsning og derefter at
skrabe algerne fri med en drigalskispatel
Plader inokuleres vha. pensel i en stribe langs midlinie af
emnerne på den behandlede flade. Herefter placeres
emnerne i plastbokse på vermiculite opfugtet til mætning i
klimakammer, med 16 timers lys pr. døgn.
Emnerne sprøjtes under inkuberingen hver 14. dag med BSopløsning.
Efter 4 ugers eksponering evalueres væksten.
Materialer og metoder
To koncentrationer af chitosan (5 hhv. 10 g/liter) afprøves i
en mængde på 0,17 l pr. kvadratmeter. Chitosanen påføres
vandbestandige kaliumsilikatplader. Alger (Stichococcus
bacillaris SCCAP K-0150 (grønalge)) påføres efter
konditionering. Væksten evalueres efter 4 og 8 uger i 20
°C/70%RH, 16 timer lys pr. døgn.
Væksten af alger bedømmes ud fra følgende skala:
0 Påført ”algesuppe” død og affarvet
1 Sporadisk forekomst af alger i påføringsstriben
2 Tydelig forekomst af alger i påføringsstribe
3 Tydelig forekomst af alger i påføringsstribe og uden for
denne
25

26
Resultat
Efter 4 ugers inkubering ses på alle emner tydelig forekomst
af alger i påføringsstriben, svarende til en score på 2.
Diskussion og konklusion
Det ses, at chitosan ikke har tilstrækkelig effekt til at kunne
anvendes mod alger i praksis.

Opsummering og konklusion:
Vi har i dette projekt undersøgt mulighederne for at anvende
chitosans fungicide virkning til træbeskyttelse. Litteraturen
beskriver chitosan som særdeles effektivt over for svampe.
De svampe der er beskrevet effekt på i litteraturen er
primært plantepatogene svampe. En undersøgelse af
chitosan som gelatineringsmedium til de trænedbrydende
(hvidmuldsdannende) svampe Trametes versicolor (syn.
Coriolus versicolor) og Irpex lacteus har vist, at disse to
svampe slet ikke kan vokse på en hydrogel dannet af
chitosan gelatineret med 5 % Na-polyphosphat.(Hirano, S.
et. a., 1976) Undersøgelser i litteraturen viste også, at det
var muligt at binde chitosan til cellulose ved elektrostatisk
interaktion idet chitosan er negativt ladet, og cellulose er
positivt ladet. Denne interaktion er optimal ved pH 8,2.
Vore undersøgelser har vist, at chitosan blandet i maltagar
er relativt effektivt over for trænedbrydende svampe. Ægte
Hussvamp stoppes fuldstændig af chitosan i en
koncentration på 1 g pr. liter maltagar, Gul Tømmersvamp
opnår en vækst på 25 % af en kontrol uden chitosan ved en
chitosankoncentration på 1 g pr. liter maltagar, mens Broget
Læderporesvamp opnår en vækst på 40 % ved samme
koncentration.
Et biologisk assay viste, at chitosan kan bindes til cellulose
(filterpapir) og bevarer vedhæftningen hertil under
udvaskning.
Et assay til måling af chitosan i opløsning (til undersøgelse
af chitosanindhold i udvaskningsvand fra
chitosanimprægneret træ) blev udviklet, med en
korrelationskoefficient på over 0,99.
Dette assay viste sig dog at være meget følsomt over for
komponenter, der blev vasket ud af træ og måtte derfor
opgives.
Et biologisk assay af chitosans fixering i træ blev derfor
anvendt – en tillempet EN 84/EN 113 test. Det viste sig her,
at der var stor nedbrydning af de imprægnerede og
udvaskede træklodser. Dette kunne skyldes, at chitosanet
var udvasket eller, at chitosans toxiditet var forringet i træ.
Dette blev undersøgt i en tillempet EN 113 test uden
udvaskning. Det viste sig her, at chitosan, når det er
imprægneret i træ ikke kan hæmme svampes nedbrydning
af dette – sandsynligvis fordi svampene, når de vokser på
træ, udskiller stoffer, der er i stand til at nedbryde eller
detoxificere chitosan.
En undersøgelse af chitosans potentiale som
overfladebehandlingsmiddel til at stoppe vækst af skimmelog
blåsplintsvampe blev herpå gennemført. Der var en vis,
om end utilstrækkelig effekt af chitosan.
En undersøgelse af chitosans potentiale som middel mod
algevækst viste også, at effekten ikke er tilstrækkelig.
Projektgruppen besluttede herefter at afslutte projektet ca.
15 måneder før planlagt, idet det blev vurderet, at
resultaterne af de allerede udførte forsøg ikke har en
karakter, der sandsynliggør, at der kan opnås anvendelige
resultater ved yderligere forsøg i projektperioden.
27

Litteratur
Anonym: Food Safety and Security, August 1999
Frederiksen O., A. P. Koch, 1998: Miljøprojekt nr. 424, 1998:
2-deoxy-D-glucose i bekæmpelsesmidler til byggematerialer,
1998
Ghaouth, Ahmed El, J. Arul, J. Grenier, A. Asselin:
Antifungal Activity of chitosan on two postharvest pathogens
of strawberry fruits.
Phytopatology Vol 82, No 4, 1992.
Ghaouth, Ahmed El, J. Arul, J. Grenier, N. Benhamou, A.
Asselin, R. Belanger: Effect of chitosan on cucumber plants:
Suppresion of Pyhium aphanidermatum and induction of
defence reactions. Phytopatology Vol 84, No 3, 1994.
Hadwiger, L. A., D. F. Kendra, B. W. Fristensky, W.
Wagoner: Chitosan both activates genes in plants and
inhibits RNA synthesis in fungi. I: Chitin in Nature and
Technology ed. R. Muzzarelli, Plenum Press, 1985.
Hirano, S., R. Yamaguchi: N-acetylchitosan Gel: A
polyhydrate of chitin. Biopolymers. Vol 15, 1685-1691, 1976.
Messner, Dr. Kurt: Technische Universität Wien, Institut für
Biochemische Technologie und Microbiologie, Wien, Østrig
Pers kom.
Roberts, George A. F.: Chitin Chemistry, Macmillan, 1992.
European standard: EN 113 Wood preservatives.
Determination of toxic values of wood preservatives against
wood destroying basidiomycetes cultured on agar medium
(laboratory method). 1996
European standard: EN 73: Wood preservatives.
Accelerated ageing of treated wood prior to biological
testing. Evaporative ageing procedure. 1988
European standard: EN 84: Wood preservatives.
Accelerated ageing of treated wood prior to biological
testing. Leaching procedure. 1997
European standard: EN 152, part 1: Test methods for wood
preservatives; Laboratory method for determining the
preventive effectiveness of a preservative treatment against
blue stain in service. Part 1: Brushing procedure. 1988.
29