Herstellung kompetenter Zellen und Überprüfung ... - German Weber

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10 Zeit OD Zeit OD 11:45 0 13:15 0,148 13:44 0,276 14:05 0,382 14:16 0,452 13:00 0 13:10 0,101 13:40 0,120 14:30 0,288 14:50 0,430 Tabelle1: Messung vom 18.07.07 Tabelle 2: Messung vom 10.10.07 3.2 Herstellung chemisch kompetenter Zellen (CaCl 2 -Methothode) Anschließend wird die Herstellung chemisch kompetenter Zellen laut dem Protokoll (ALBERT; 2007 a) durchgeführt: Hinweis: Dazu muss zuerst die Bakterienlösung in sterile Eppis umgefüllt werden. Materialien: • Kühlbox • Eppis (steril) • Pipetten und Spitzen • Zentrifuge und Mixer • Inkubator • Plasmid - Lösung • E.coli Bakterien • Calciumchlorid und CaCl 2 in 90% Glycerin Durchführung: • Die Zellen werden 5 min bei 4000 – 5000 rpm und bei 4° C zentrifugiert. • Anschließend wird der Überstand verworfen und die Zellen in dem vorgekühlten Calciumchlorid resuspendiert. • Danach erneut 5 min bei 4000 – 5000 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. • Jetzt muss in jedes Eppi noch ca. 1 ml CaCl 2 in 90% Glycerinlösung pipettiert werden. • Danach kommen alle Eppis in den Gefrierschrank.
11 • Um nachzuweisen, dass die E.coli Bakterien nun chemisch kompetent sind, wird jetzt eine Transformation durchgeführt. Dabei werden die Plasmide pUC18 die wir bei der Isolation erhalten haben und die eine Ampicilin - Resistenz enthalten in die E.coli Bakterien transformiert. 4. Transformation chemisch kompetenter Zellen Material: • Hitzeblock • Plasmid - Lösung • Eis • LB - Medium • Schüttler • Klebeband • Ampicillin- Agarplatten Um die Transformation der Zellen durchführen zu können muss ein Hitzeblock oder ein Wasserbad vorbereitet und die Menge der Plasmide berechnet werden, dies ist mit Hilfe der QIAprep Miniprep Handbook (QIAGEN; 2003) möglich diese Anleitung findet sich auf der Seite 13 unter dem Punkt DNA Yield (bei mir waren es 5 µl). Durchführung: Die Herstellung kompetenter Zellen wird nach Protokoll durchgeführt (ALBERT; 2007 a): Wichtig: Alle Arbeitsschritte müssen bei 4° C stattfinden! • Bevor mit der Transformation begann werden kann, müssen die Zellen auf Eis aufgetaut werden, dies dauerte ca. 20 Minuten beim ersten Mal werden gleich die neuen noch nicht eingefrorenen Bakterien verwendet. • Nach dem auftauen der Zellen, wird die berechnete Menge an Plasmid - Lösung dazugegeben, darauf folgt ein Hitzeschock von 30 - 50 s bei 42°C im Wasserbad oder Hitzeblock. • Danach werden die Bakterien für 2 Minuten auf Eis gestellt und 400 µl LB -Medium dazu pipettiert. • Anschließend kamen die Zellen für eine Stunde bei 37°C auf den Schüttler (das Eppi muss mit einem Streifen Klebeband auf dem Schüttler fixiert werden). • Nach einer Stunde werden die Zellen auf Ampicillin- Agarplatten ausplattiert um zu kontrollieren ob die Bakterien das Plasmid aufgenommen haben. 5. Auswertung : Um zu beweisen, dass die Bakterien die vorher kein Plasmid hatten, nun eins aufgenommen haben werden diese zu 50 µl auf Ampicillin -Agarplatten ausplattiert und über Nacht in den Inkubator gegeben. Wenn die Bakterien das Plasmid aufgenommen haben, so müssen sie auf
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Seite 3 und 4: 3 1. Einleitung Das Thema der Facha
Seite 5 und 6: 5 2.2 Der Nachweis der Isolation de
Seite 7 und 8: 7 Abbildung 1: Foto der Färbung de
Seite 9: 9 3.1.2 Vorbereitungen der Chemikal
Seite 13 und 14: 13 5.2 Ergebnis: Diagramm 1: Ergebn
Seite 15: 15 7. Anhang: Schülererklärung: I

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