5 Material und Methoden

5.2 Methoden
5.2.1 Pflanzenanzucht
5 Material und Methoden
Zur Präparation von Chloroplasten und Thylakoiden wurden Erbsenkeimlinge (Pisum sa-
tivum, var. ” Feltham First“) kultiviert. Diese wurden nach 7–14 Tagen geerntet, wobei
die Blätter der Keimlinge noch geschlossen waren. Die Anzucht der Spinatchloroplasten
ist in Molik (2005) nachzulesen.
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Ökotyp Columbia (col-0 bzw. col-5-13) wurde in Er-
de unter Kurztagsbedingungen (8 h Licht/16 h Dunkelheit) kultiviert. Die Blüten- und
Samenbildung erfolgte unter Langtagbedingungen (16 h Licht/8 h Dunkelheit).
5.2.2 Anzucht und Transformation der E.coli Zellen
5.2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Die Hauptkultur (500 ml LB) wurde mit 5 ml Übernachtkultur (20 ml LB) angeimpft
und bei 37°C bis zu einer OD600 = 0,5–0,7 wachsen gelassen. Nach einer zehn minütigen
Ruhephase bei 4°C wurden die Zellen 15 min bei 4 000 x g und 4°C zentrifugiert. Das Bak-
terienpellet wurde in 500 ml sterilem, auf 4°C vorgekühlten ddH2O resuspendiert. Nach
der erneuten Zentrifugation 15 min bei 4°C und 4 000 x g wurde das Pellet in 250 ml eis-
kaltem ddH2O aufgenommen und erneut 15 min bei 4°C und 4 000 x g zentrifugiert. Dieses
Bakterienpellet wurde nun in 1,5 ml eiskaltem 10%igem (v/v) Glycerin aufgenommen, zu
je 40 µl aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
5.2.2.2 E.coli Transformation mittels Elektroporation
Die Transformationsküvetten (Biozym, Oldendorf) wurden zunächst auf Eis vorgekühlt.
Zur Transformation wurden 40 µl elektrokompetente Zellen mit 1–5 µl zu transformieren-
der Lösung (z.B. Plasmid-DNA oder Ligationsansatz) versetzt, gemischt und mit ” E.coli
Pulser“ (Bio-Rad, München) bei 1,8 kV transformiert. Nach der Transformation wur-
den sofort 960 µl SOC-Medium zugegeben, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und
30–60 min bei 37°C inkubiert. Je nach erwartetem Transformationserfolg wurden zunächst
100 µl auf LB-Antibiotika-Platten ausplattiert. Die restlichen 900 µl wurden kurz sedi-
mentiert (30 s, 10 000 x g ) und wiederum in 200–300 µl SOC-Medium aufgenommen und
ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
5.2.2.3 Herstellung Hitzeschock-kompetenter Zellen
Die Hauptkultur (500 ml LB) wurde mit 5 ml Übernachtkultur (20 ml LB) angeimpft
und bei 37°C bis zu einer OD600 = 0,5–0,7 wachsen gelassen. Nach einer zehnminütigen
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