Die Bedeutung der Massenspektrometrie in der Umweltanalytik

Die Bedeutung der
Massenspektrometrie in
der Umweltanalytik
Marc J-F J F Suter
Umwelttoxikologie
Juliane Hollender, Hollender,
Heinz Singer
Umweltchemie
Eawag: Das Wasserforschungs-Institut des ETH-Bereichs

1906 Nobel Preis in Physik
Joseph John Thomson
University of Cambridge
Cambridge, UK
r
F
=
r r r
z(
E+
v × B)

1922 Nobel Preis in Chemie
Francis William Aston
University of Cambridge
Cambridge, UK

Anforderungen an die moderne MS
Kombination mit Trenntechnik
- GC, HPLC, UPLC…
Empfindlichkeit
- Spurenanalytik für sehr tiefe Umweltkonzentrationen
- gleichzeitige Analyse von vielen Verbindungen
Hochauflösung, akkurate Masse
- Beispiel Metolachlor
- Identifikation von Unbekannten / Metaboliten
Datenabhängige Experimente
Automatisierte Datenaufbereitung

hydrophil
Polarität
lipophil
Polarität organischer Verbindungen
flüchtige
Carbonsäuren
Freone
Methan
C1-C5
Alkohole
MTBE
DDT
(Alkyl)benzole
C2– C5 KW
Halo-
Essigsäuren
Phenole
Pestizide
Zinnorganische
PCB
PCDD
PCDF
PAK
Tenside
aliphatische KW
Flüchtigkeit
flüchtig nicht-flüchtig
nicht-flüchtig

hydrophil
ionisch
Polarität
Polarität organischer Verbindungen
flüchtige
Carbonsäuren
Freone
Methan
C1-C5
Alkohole
MTBE
EI / CI
DDT
(Alkyl)benzole
C2– C5 KW
Halo-
Essigsäuren
Phenole
APcI
Pestizide
Zinnorganische
PCB
ESI
PCDD
PCDF
PAK
Tenside
LC/MS
aliphatische KW
lipophil neutral lipophil neutral
Molekulargewicht
Flüchtigkeit
flüchtig klein nicht-flüchtig
nicht-flüchtig gross

Ionisationsmethoden
Häufigst gebrauchte Ionisationsmethoden für die
organische Massenspektrometrie
- EI, CI für GC/MS, IR/MS und andere Applikationen
- ESI, APCI für LC/MS
- MALDI für die Bioanalytik

Moderne Massenspektrometer
tandem in space
Triple Quadrupol
Sektorfeldgeräte
Quadrupol – Flugzeit MS
TOF - TOF
Kombinationen
Q-Trap
LTQ-Orbitrap
tandem in time
Quadrupol-Ionenfalle
Ionenzyklotronresonanz MS
Lineare Quadrupol-Ionenfalle
Orbitrap

6`440`000`000 m 3

Murtensee
SPE: Oasis,
Faktor 1000
Massenfilter: 4 ppm
Auflösung: 100‘000
Nachweisgrenzen:
1 – 20 ng/L
Umweltproben: Oberflächenwasser
Relative Abundance
100
50
100 0
50
100 0
50
0
100
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
extrahierte Ionenchromatogramme
Atrazin
Desethylatrazin
Terbutylazin
Simazin
Isoproturon
Diuron
Dimethenamid
Metolachlor
0
0 5 10
Time (min)
15
NL: 1.36E6
165 ng/L
NL: 1.50E5
55 ng/L
NL: 2.60E4
5 ng/L
NL: 1.11E5
20 ng/L
NL: 1.60E5
18 ng/L
NL: 2.03E4
22 ng/L
NL: 9.16E3
NL: 1.30E5
15 ng/L
100
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
100 0
50
0
Tebutam
Diazinon
Bentazon
0 5 10 15
Time (min)
NL: 2.48E4
NL: 4.81E3
NL: 3.82E5
NL: 1.12E4
2,4-D 16 ng/L nicht nachweisbar
Mecoprop
MCPA
Metolachlor-OXA
Metolachlor-ESA
3 ng/L
3 ng/L
NL: 1.70E5
27 ng/L
NL: 1.10E3
NL: 2.55E4
6 ng/L
NL: 1.23E5
20 ng/L

C15H23O2N1Cl1: C15 H23 O2 N1 Cl1 p(gss, s/p:40) Chrg...
Relative Abundance
10 0
80
60
40
20
0
284.1412
285.1445
286.1387
287.1417
288.1444 289.1470 290.1496 291.1522 292.1549
284 285 286 287 288 289 290 291 292 293
m/ z
C15H23O2N1Cl1: C15 H23 O2 N1 Cl1 p(gss, s/p:40) Chrg...
Relative Abundance
10 0
80
60
40
284.1412
286.1387
20
285.1444
0
284 285 286
287.1417
287
288.1443
288
m/ z
C289 290 291
15H23O2N1Cl1 292
C15H23O2N1Cl1: C15 H23 O2 N1 Cl1 p(gss, s/p:40) Chrg...
Relative Abundance
10 0
Hochauflösung
80
60
40
20
0
284.1412
285.1446
286.1382
m/Δm 1‘000
m/Δm 10‘000
m/Δm 100‘000
287.1416
288.1442 289.1469 290.1496 291.1522 292.1549
284 285 286 287 288 289 290 291 292
m/ z
O
N
Metolachlor
O
Cl

100
Orbitrap
LTQ
80
60
40
20
Datenabhängige Experimente
interessierendes Signal
30 sec
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0.1 sec 2 sec 0.1 sec 2 sec
P Full Scan MS (50 – 1000)
P Full Scan MS
Liste der Vorläuferionen: [M+H] + /[M-H] - der Zielverbindungen
MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS
MS/M
Auflösung m/Δm
Orbitrap: Pre-Scan 7‘500
Full Scan 100‘000
LTQ (Iontrap): bis zu 7‘500

\\eawag-nas\wul$\...\SBA_D_05032_3_10 01.11.2005 16:00:54 Greifensee 220605
XTerra C18 50x2, 15 min, 10 ul inj, Greifensee 220605, hoehere CE, 100000
SBA_D_05032_3_10 RT: 0.01 - 15.01 Mass: 100.00 - 400.00 NL: 5.00E7
Intensität
Intensity
Intensität
Orbitrap Full Scan
100
50000000
45000000
40000000
35000000
30000000
50
25000000
20000000
15000000
10000000
5000000
0 0
2 4 6 8 10 12 14
Time (min)
0 2 4 6 8 10 12 14
HPLC-Trennung (min)
LTQ MS/MS Scan
100
50
0
50
0 2 4 6 8 10 12 14
HPLC-Trennung (min)
Identifizierung von Schadstoffen
100
150
150
200
100
250
250
300
m/z
200
350
350
400
300
Masse (m/z)
400
Exakte Masse (m/z)
5ng/l Isoproturon
im Greifensee
Exakte Masse:
207.1497
Data-dependent
MS/MS:
207-> Fragment
HPLC-Trennung (min)

Relative Abundance
100 Orbitrap Scan (TIC), ESI pos.
80
60
40
20
0
60
40
20
0
50-2000 m/z
100
Extracted Ion Chromatogram
80 284.1412 m/z
100
80
60
40
20
Metolachlor
N O
O Cl
Data dependent MS-MS scan (TIC)
284.14 → 80 - 300 m/z
Identifizierung von Metolachlor im
Murtensee
Orbitrap Spectrum
14.5 min
14.5 min
14.5 min
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min)
Relative Abundance
Relative Abundance
100
100 0
100
0
100
0
Measured
284.1413
0.3 ppm
(100%)
Calculated
0
284.0 284.5 285.0 285.5
m/z
286.0 286.5
LTQ MS-MS Spectrum
Measured
Predicted
285.1445
missing
207.0
162.1 252.1
207.1
286.1382
(26%)
1 ppm
284.1412
(100%)
285.1445
(17%)
286.1379
(33%)
252.1
265.1
266.2
266.1
80 120 160 200 240 280
m/z
284.1

T Wahli, D Bernet, 2001

Vorhersage der Summenformel
Orbitrap Chromatogramm

Metolachlor [M+H] = 284.14163 ± 2 ppm
Verwendete Elemente
Vorhersage der Summenformel
C, H, O, N, Cl, S, P, Si, Al, Fe 215 mögliche Elementkombinationen
Cl
Chemische
Valenzen
27 mögliche Elementkombinationen
Stickstoff-Regel
10 mögliche Elementkombinationen
nur C, H, O, N,
Cl, P, S
3 mögliche Elementkombinationen
Isotopen-Muster
1 mögliche Elementkombination

Vorhersage der Summenformel
Ergebnis der Summenformel-Vorhersage mit Hilfe des Orbitrap Spektrums:
284.1398 = C15 H23 Cl N O2
Datenbank
380 mögliche Substanzstrukturen
Metolachlor ähnliche Struktur fremde Struktur
377
weitere
Strukturen
Strukturaufklärung mit Hilfe der MS/MS-Fragmentierung
Software zur Spektrenvorhersage, eigene Bibliotheken

Automatisierte Datenaufbereitung
automatische Suche nach
Komponenten, mit wählbaren w hlbaren
Kriterien
klare Organisation der
Full Scan und MS/MS
Spektren

Molekulare Reaktion auf Stress
Estradiol@ 1 mg/L Nonylphenol@ 1 mg/L
Estradiol@ 0.1 mg/L Nonylphenol@ 0.1 mg/L
2D-Gels von Proteinextrakten von exponierten Zebrafischeiern
Shrader et al
Ecotoxicology
2003

Molekulare Reaktion auf Stress
Venn Diagramme von unterschiedlich exponierten
Zebrafischeiern
(A) 1.0 ppm, (B) 0.1 ppm
Shrader et al
Ecotoxicology
2003

ACN / H 2O to waste
2D Flüssigchromatographie
Fl ssigchromatographie
HV
Buffer (%)
C18 SCX
C18
100 micron fused silica capillary
60
40
20
Buffer (%)
60
step II: salt pulse
40
20
100 - 300 nL/min
step I: reverse-phase
reverse phase gradient
0
0 20 40 60 80 100
0
0 20 40 60 80
Time (min)
100
Time (min)

12 step mudPIT Experiment
Zeit
0
5
10
20
30
40
50
60
% Salz Pulse
70
80
90
100

Relative Abundance
100
80
60
40
20
LC/MS für die Identifikation extrahierbarer
Proteine
experimentelles
MS/MS-Spektrum
0
100 200 300 400 500 600 700
m/z
Relative Abundance
Vergleich der
Spektren
Datenbanksuche nach Peptiden
mit ähnlicher Vorläufermasse
theoretisches Spektrum
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z
automatische Proteinidentifikation
100
80
60
40
20
Relative Abundance
100
80
60
40
20
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z
Relative Abundance
100
80
60
40
20
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z
Eng et al. JASMS,
5, 976 (1994)

Protein-
mischung LC
MS
enzymatische
Aufspaltung
LC/MS für die Identifikation extrahierbarer
Proteine
Abundance
Time
Filtrierte Daten
Abundance
1 2 3
m/z
Bioinformatik
MS/MS
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z
…
Computer Cluster
Relative Abundance
Relative Abundance
100
Relative Abundance
80
60
40
20
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z
1
2
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z
3

LC/MS für die Identifikation extrahierbarer
Proteine

Reproduzierbarkeit in shotgun proteomics
nicht alle Proteine einer Probe werden auch identifiziert
intensive Proteine werden mit hoher Reproduzierbarkeit
identifiziert, wenig intensive nicht.
Die Statistik zeigt, dass sieben bis zehn MudPIT-
Analysen nötig sind um mit 95% Sicherheit sagen zu
können, dass alle identifizierbaren Proteine gefunden
wurden.

Reproduzierbarkeit in shotgun proteomics
nicht alle Proteine einer Probe werden auch identifiziert
intensive Proteine werden mit hoher Reproduzierbarkeit
identifiziert, wenig intensive nicht.
Nature Biotechnology 22, 985 - 992 (2004)
Eberhard Durr, John R Yates III, et al

Proteinexpression in Zebrafischeiern
nach Exposition mit Cd und Estradiol

Schlussfolgerung
LC/MS ist heute eine Routinemethode
Empfindlichkeit ist ein Problem in komplexen Matrizen
- Ionensuppression
- gleichzeitige Analyse von vielen Verbindungen
- Nadel im Heuhaufen
Hochauflösung, akkurate Masse, datenabhängige
Experimente
- hilfreich für die Identifikation von Unbekannten / Metaboliten
Automatisierte Datenaufbereitung
- bottle-neck für die Auswertung der Resultate