研究年次報告書

遺 伝 制 御 科 学 特 別 研 究 ユニット
Cellular & Molecular Biology Unit
ユニットリーダー 柴 田 武 彦 ( 理 学 博 士 )
SHIBATA, Takehiko (Dr. Sci.)
キーセンテンス:
1. 相 同 DNA 組 換 えはDNA 分 子 に 内 在 された 機 能 。
2. 相 同 DNA 組 換 えは 遺 伝 情 報 の 多 様 化 に 働 く 一 方 , 繰 り 返 しDNA 配 列 の 均 一 化 にも 働 く。
3. RecOの 組 換 えメディエーター 機 能 をその 正 荷 電 をもつ 領 域 とSSBのC 末 端 の 酸 性 柔 軟 構 造 領 域 との 相
互 作 用 で 説 明 できた。
4. 組 換 えメディエーターRad52の 相 同 組 換 えでの 新 規 機 能 を 明 らかにした。
キーワード:
相 同 DNA 組 換 え, 遺 伝 的 組 換 え, 組 換 え 開 始 制 御 ,DNA 修 復 ,DNA 二 重 鎖 切 断 制 御 , 相 同 DNA 対 合 , 組
換 えホットスポット, 有 性 生 殖 , 減 数 分 裂 , 遺 伝 的 多 様 化 , 遺 伝 子 創 出 ,ミトコンドリアDNAホモプラス
ミー,NMR 分 光 法 ,イネ,シロイヌナズナ, 組 換 えメディエーター,RecA, RecO, SSB, Rad51, Rad52
研 究 概 要
相 同 (DNA) 組 換 えは,2つのDNAを 共 通 配 列 を 糊 代 にしてつなぎ 換 える 遺 伝 現 象 である。DNA 二 本 鎖
切 断 修 復 を 行 うことでゲノムを 保 全 する。また, 有 性 生 殖 では 配 偶 子 形 成 と 遺 伝 的 な 多 様 化 により, 生 物
種 に 環 境 適 応 力 を 付 ける。これを 利 用 したのが 交 配 育 種 である。さらに, 既 存 のDNA 配 列 を 組 み 合 わせて
新 しい 遺 伝 子 を 生 み 出 すことで 病 原 体 抵 抗 力 など, 生 体 防 御 にも 働 くことが 特 に 高 等 動 植 物 で 解 ってきた。
一 方 、 過 剰 な 相 同 組 換 えはかえってゲノムの 安 定 性 を 乱 し、 相 同 組 換 え 不 全 とともに、ガンなど 疾 患 の 原
因 ともなる。 細 胞 が 組 換 えを 何 時 、ゲノムの 何 処 で、どの 程 度 に、 何 を 相 手 に 行 うかが 相 同 組 換 えについ
ての 重 要 な 設 問 である。 我 々は,RecA 蛋 白 質 による 相 同 的 対 合 の 発 見 (Shibata et al., PNAS 1979) 以 来 の
研 究 の 蓄 積 を 背 景 に, 生 体 での 相 同 組 換 え 機 構 と,その 制 御 と 遺 伝 機 能 について, 分 子 の 化 学 反 応 として
理 解 することを 目 指 している。 作 物 等 の 高 速 育 種 や 疾 患 の 予 防 と 医 療 に 役 立 つ 予 知 と 制 御 可 能 な 技 術 も 視
野 に 入 れている。そのために, 生 化 学 ,NMR 等 による 試 験 管 内 での 反 応 ・ 構 造 解 析 を 基 礎 に, 特 に 高 等 植
物 を 対 象 とした 分 子 遺 伝 学 の 手 法 まで 駆 使 している。RecA 蛋 白 質 の 相 同 組 換 え 中 間 体 形 成 活 性 の 発 見 以 来 ,
組 換 え 相 手 の 選 択 をきめる 組 換 え 中 間 体 形 成 の 機 構 , 組 換 えの 場 所 と 時 期 を 決 める 減 数 分 裂 期 および 体 細
胞 の 相 同 組 換 え 開 始 酵 素 とその 制 御 の 解 明 , 組 換 えの 未 知 の 機 能 を 明 らかにしつつあるミトコンドリア
DNAの 組 換 えに 依 存 した 複 製 ・ 分 配 とホモプラスミー 成 立 機 構 など, 核 と 細 胞 質 の 遺 伝 の 基 本 機 構 について,
独 自 の 切 り 口 での 理 解 に 貢 献 している。 体 細 胞 相 同 組 換 えの 人 為 的 誘 導 ・ 抑 制 制 御 で 実 現 した 迅 速 生 体 外
単 クローン 抗 体 生 産 技 術 ADLib 法 (ADLib system; Seo et al., Nature Biotech. 2005) は, 我 々の 相 同 組 換
えについての 基 礎 研 究 の 積 み 上 げの 成 果 であり, 既 に 実 用 に 供 している。
1. 相 同 組 換 え 開 始 制 御 機 構 についての 生 化 学 , 構 造 ・ 分 子 生 物 学 ( 美 川 , 井 上 , 新 宮 , 井 川 , 柴 田 )
相 同 組 換 えの 要 は, 相 同 DNA 対 合 という, 二 本 鎖 切 断 端 等 に 由 来 する 一 本 鎖 DNA 領 域 が, 修 復 の 鋳 型 と
なる 二 重 鎖 DNA( 情 報 供 与 DNA)に 割 り 込 み,その 相 補 鎖 と 塩 基 対 をつくる 反 応 である( 図 1)。 相 同 DNA
対 合 は, 核 では,ATPを 必 要 とするRecA( 原 核 生 物 )やRad51( 真 核 生 物 ) 等 のRecA 型 蛋 白 質 が 行 う。 我 々
は,RecAとは 分 子 構 造 もまったく 異 なり, 相 同 DNA 対 合 をATPなしで 行 うMhr1( 出 芽 酵 母 ミトコンドリ
ア),Rad52( 真 核 生 物 核 ) 等 の 一 群 の 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 群 を 明 らかにした。RecA 型 とATPを 必 要 とし
な 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 による 反 応 を 比 較 解 析 することで, 相 同 的 組 換 えの 基 本 機 構 の 解 明 を 目 指 している。
一 方 , 調 節 機 構 を 明 らかにするために,RecA 型 蛋 白 質 に 作 用 して 相 同 DNA 対 合 反 応 の 機 能 調 節 に 働 く
蛋 白 質 群 , 組 換 えメディエーター( 原 核 生 物 では RecO-RecR; 真 核 生 物 では,Rad52, Brca2 等 )の 作 用 機
構 の 研 究 も 合 わせて 行 っている。 相 同 組 換 えにおいて,3’ 単 鎖 DNA 領 域 ができると,その 保 護 をおこな
う 単 鎖 DNA 結 合 蛋 白 質 が 先 に 結 合 し, 相 同 DNA 対 合 に 働 く RecA 型 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 の 単 鎖 DNA
への 結 合 を 邪 魔 する。 組 換 えメディエーターは, 単 鎖 DNA 結 合 蛋 白 質 が 結 合 している 単 鎖 DNA へ,RecA
型 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 を 結 合 させる 蛋 白 質 として 発 見 された。RecA や Rad51 は 組 換 えメディエーターを
研 究 年 報

図 1. 相 同 DNA 組 換 えの DNA 反 応 。DNA 二 重 鎖 切 断 端 が 加 工 されて、 一 対 の 3’ 突 出 単 鎖 DNA 領 域 ができる。その 一
方 へ、 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 が 働 いて、DNA 二 重 鎖 切 断 修 復 の 鋳 型 になる 同 じ 塩 基 配 列 をもつ 二 重 鎖 DNA ( 情 報 供 与
DNA) へ 割 り 込 んでその 相 補 配 列 と 塩 基 対 合 する。この 段 階 を 相 同 DNA 対 合 という。 鋳 型 鎖 と 対 合 した 単 鎖 DNA の 3’
末 端 から 修 復 合 成 が 起 こり、 切 断 で 失 われた 塩 基 配 列 を 回 復 する。その 後 、3’ 単 鎖 DNA 領 域 が、 修 復 合 成 で 置 き 換 えら
れた 単 鎖 DNA 部 分 (D ループ)とアニールすると、ホリデー 中 間 体 を 経 て、 交 叉 型 組 換 え 体 ができる。このときジーンコンバ
ージョンを 伴 うこともある(DNA 二 重 鎖 切 断 修 復 経 路 )。 一 方 、 他 方 の 切 断 端 に 由 来 する 3’ 単 鎖 DNA 領 域 が、 鋳 型 から 離
れた 新 生 単 鎖 DNA とアニールすると SDSA 経 路 へ 進 み、 置 き 換 え 型 の 組 換 え(ジーンコンバージョン) 体 だけができる。A
と a, X と x、Y と y は、それぞれ 対 立 遺 伝 形 質 を 示 す。A 遺 伝 子 でのジーンコンバージョンとX 遺 伝 子 とY 遺 伝 子 間 での 交 叉
を 示 す
必 ず 必 要 とする。これまでに 知 られている 組 換 えメディエーター,RecO,Rad52, Brca2 は,いずれも,
ATP を 必 要 としない 相 同 DNA 対 合 活 性 を 持 つがその 意 義 は 分 っていない。
(1) 相 同 DNA 対 合 では, 二 重 鎖 DNA の 塩 基 対 間 の 距 離 が 開 く 必 要 がある。 塩 基 対 間 が 開 くと 必 然 的 に 二
重 ラセンの 捻 じれ(Twist)が 緩 む。 立 体 構 造 も 進 化 的 な 系 統 も 互 いに 異 なる ATP を 必 要 としない 一 群 の
相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 群 について,その 組 換 え 反 応 の 共 通 な 中 間 体 である 蛋 白 質 に 結 合 した 単 鎖 DNA の 立
体 分 子 構 造 を TR-NOE 法 で 解 析 した 結 果 , 酵 母 ミトコンドリアの Mhr1, 原 核 生 物 の RecO, 細 菌 ウイル
スの RecT, 酵 母 の Rad52 に 結 合 した 単 鎖 DNA は,ATP アナログ 存 在 下 で RecA やヒト Rad51 に 結 合 し
た 単 鎖 DNA と 同 じ,デオキシリボースの 2’ CH と 次 位 の 塩 基 とがスタックして 伸 長 した 構 造 をとることを
明 らかした( 図 2; Masuda, et al., JBC 2009, Mikawa et al. 未 発 表 )。この 伸 びた 構 造 が 二 重 鎖 DNA の 伸
長 , 二 重 ラセンを 緩 めるにも 働 くと 考 えられている。 単 鎖 DNA 結 合 蛋 白 質 がなくても,Rad52 は Rad51
による 相 同 DNA 対 合 を 助 けることを 発 表 している(Arai et al. JBC 2005)。この 共 同 機 能 について,Rad52
上 の 二 重 鎖 DNA 結 合 部 位 へ 導 入 した 変 異 の 影 響 を 解 析 した 結 果 , 酵 母 の Rad52 が 二 重 鎖 DNA を 捉 えて
Rad51 へ 受 け 渡 すことで,Rad51 による 相 同 DNA 対 合 を 促 進 することを 明 らかにした(Arai et al. JBC
2011; 日 大 生 物 資 源 の 新 井 直 人 博 士 との 共 同 研 究 )。 現 在 ,Rad52 上 の Rad51 との 相 互 作 用 部 位 に 入 れた
変 異 の 効 果 の 解 析 などを 行 っている (この 部 分 は 日 大 生 物 資 源 の 新 井 直 人 博 士 , 早 稲 田 大 学 の 胡 桃 坂 仁 志 博
士 と 香 川 亘 博 士 との 共 同 研 究 )。
平 成 23 年 度

(2) バクテリアでは,RecO-RecR が 代 表 的 な
組 換 えメディエーターである。 単 鎖 DNA に 結
合 した 単 鎖 DNA 結 合 蛋 白 質 である SSB を
RecO が 自 身 の 結 合 で 置 き 換 えるが,その 分 子
機 構 は 分 っていなかった。NMR, 標 的 変 異 導
入 , 生 化 学 解 析 により,RecO の 正 荷 電 をもつ
領 域 と SSB の C 末 端 の 酸 性 の 柔 軟 構 造 領 域 と
の 相 互 作 用 により,SSB から 単 鎖 DNA がほ
どかれ,RecO が DNA に 結 合 し,RecA の 単
鎖 DNA への 結 合 を 促 進 するという 独 自 の 機
構 モデルを 支 持 する 結 果 を 得 た(Inoue et al.
JBC 2011; この 部 分 は 首 都 大 学 東 京 伊 藤 隆 教
授 との 共 同 研 究 )。
2. 高 等 植 物 の 相 同 組 換 え 開 始 制 御 機 構 の 活 用
による 新 世 代 ゲノム 加 工 技 術 ( 柴 田 , 新 宮 ,
美 川 , 井 川 )
作 物 など 高 等 植 物 において,ゲノム 中 の 任
B-form ecRecA 結 合 DNA hsRAD51 結 合 DNA
ecRecT 結 合 DNA ecRecO 結 合 DNA sc-mtMhr1 結 合 DNA
図 2. 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 に 結 合 した 単 鎖 DNA の 立 体 構 造
ATP 要 求 型 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 : ecRecA, 大 腸 菌 RecA;
hsRAD51, ヒト Rad51。
ATP を 必 要 としない 相 同 DNA 対 合 蛋 白 質 : ecRecT, 大 腸 菌 不 完
全 ウイルスの RecT; ecRecO, 原 核 生 物 の RecO; sc-mtMhr1,
パン 酵 母 ミトコンドリアの Mhr1 (Masuda et al., 2009 JBC)
意 の 狙 った 遺 伝 子 だけを 加 工 する 標 的 技 術 が 希 求 されているが 未 だ 存 在 しない。これは, 原 理 的 には 生 物
が 自 然 に 行 う 相 同 組 換 え 機 構 を 活 用 できれば, 実 現 できる。しかし, 高 等 植 物 における 相 同 組 換 えの 研 究
はあまり 成 果 報 告 が 無 く, 理 解 が 極 めて 限 られている。そこで,まず, 代 表 的 な 作 物 であり,モデル 単 子
葉 植 物 であるイネと,モデル 双 子 葉 植 物 であるシロイヌナズナを 材 料 に, 減 数 分 裂 期 相 同 組 換 え 開 始 の 分
子 機 構 の 理 解 を 目 指 した 研 究 を 始 めた。この 研 究 は,ニワトリ 培 養 免 疫 細 胞 において 高 頻 度 ( 集 団 の 1/4~
1/2) 標 的 組 換 えを 独 自 の 手 法 で 誘 導 することに 成 功 したことを 背 景 としている。 理 研 と 東 京 農 大 との 共 同
研 究 によって,イネに 4 種 ,シロイヌナズナに 3 種 ある 組 換 え 開 始 酵 素 SPO11 候 補 遺 伝 子 のほゞ 全 てにつ
いて,cDNA を 用 いた 発 現 系 を 構 築 し, 蛋 白 質 を 活 性 型 で 単 離 する 手 法 を 確 立 した。シロイヌナズナには,
3 種 の SPO11 ホモログがあり,その 内 2 種 が 減 数 分 裂 に 働 く。そのひとつ,AtSPO11-1 について DNA 結
合 表 面 とその 減 数 分 裂 機 能 を 明 らかにした。このように 試 験 管 内 で 示 される 活 性 と 生 体 での SPO11 の 機 能
とを 結 びつけたのは,この 成 果 が 初 めてである (Shingu et al., FEBS J. 2010)。さらに,SPO11 は,II 型
トポイソメラーゼの 反 応 中 間 体 形 成 と 同 じ 機 構 で, 組 換 え 開 始 cis 配 列 に DNA 二 本 鎖 切 断 を 入 れるといわ
れているが,SPO11 自 身 に 二 本 鎖 切 断 活 性 があるかは 実 証 されていない。そこで,ショウジョウバエの spo11
機 能 欠 損 個 体 を 用 いた 異 種 アッセイ 系 を 開 発 した。このアッセイ 系 を 用 いて,シロイヌナズナの 2 種 の
SPO11 オルソログ,AtSPO11-1 と AtSPO11-2 とは, 他 の 植 物 由 来 の 蛋 白 質 因 子 の 助 けなしに, 二 本 鎖 切
断 を 行 うことが 初 めて 示 された(この 部 分 は, 京 都 工 芸 繊 維 大 学 草 野 好 司 博 士 , 東 京 農 大 若 狭 暁 博 士 との
共 同 研 究 )。
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Key Sentence :
1. Homologous DNA recombination is an intrinsic DNA function
2. Homologous recombination plays roles in both genetic diversification of genomes, and
homogenization of repeated DNA sequences.
3. We revealed detailed mechanism for the displacement of SSB on single-stranded DNA by RecO.
4. We found a new function of Rad52, by which Rad52 assists Rad51-catalyzed ATP-dependent
homologous DNA pairing.
Key Word :
homologous DNA recombination, genetic recombination, cellular regulation on
recombination-initiation, DNA repair, cellular regulation on DNA double-strand breakage, homologous
DNA pairing, recombination hotspots, sexual reproduction, meiotic recombination, genetic
研 究 年 報

diversification, gene creation, mitochondrial DNA homoplasmy, Arabidopsis thaliana, rice Oryza sativa,
NMR, gene targeting, recombination mediator
Outline
The major goal of our research is to understand the molecular mechanisms and principles
governing homologous DNA (or genetic) recombination in genetic inheritance and evolution.
Homologous recombination is the rearrangements of segments between a pair of homologous DNAs,
and functions in error-free DNA double-stranded break repair. Thus, it contributes to the genome
stability. On the other hand, it is assumed, and has partly been proven by our "ADLib system", that in
response to environmental changes, homologous recombination reassembles parts of genes or
DNA-sequences using sequence similarity, and thus creates new genes for adapting to new
environments. A key reaction in homologous recombination is "homologous (DNA) pairing", in which a
single-stranded DNA tail derived from an end of a double-stranded break, is base-paired with a
complementary sequence in a template double-stranded DNA for the repair. I discovered
RecA-catalyzed homologous pairing, which requires ATP (Shibata et al., PNAS 1979). Since then,
eukaryotic orthologues of RecA were found as Rad51 and Dmc1. We found a new class of homologous
pairing proteins, which do not require ATP (Kagawa et al. JBC, 2001 : Ling & Shibata, EMBO J 2002).
Using NMR, we found that a unique extended DNA structure was induced in the common homologous
pairing intermediates by both the RecA-family proteins (RecA, Rad51) and the new class of homologous
pairing proteins from various origins (bacterial RecO, bacteriophage RecT and yeast mitochondrial
Mhr1) (Nishinaka et al., PNAS 1997; Masuda et al., JBC 2009). This result clearly indicates that the
homologous pairing is catalyzed by the same mechanism independent of the homologous pairing
proteins involved and of the requirement for ATP, and suggests that homologous recombination is an
intrinsic molecular function of DNA (Shibata et al., PNAS 2001 for review; Masuda et al., JBC 2009).
We found the novel roles of a homologous pairing protein in DNA-replication, partitioning and
homoplasmy (a type of gene homogenization) in yeast mitochondrial DNA inheritance, in which ROS
(reactive oxygen species) act as a regulatory mediator (Hori et al., NAR 2009; see Ling & Shibata Genes
2011, Shibata & Ling Mitochondrion 2007 for review). The development of new genome-wide
technologies based on knowledge obtained by our basic research is within our scope. Based on our
research on the effects of chromatin structural dynamics on the initiation of homologous recombination,
we invented the ADLib System, for the rapid and immunotolerance-free ex-vivo production of natural
monoclonal antibodies (Seo et al., Nature Biotech 2005).
1. Molecular functions of the proteins involved in the initiation of homologous recombination
(Tsutomu MIKAWA, Jin INOUE, Yoshinori SHINGU, Shukuko IKAWA, Takehiko SHIBATA)
In these studies, we analyze the molecular functions and interactions between proteins
involved in homologous recombination at an atomic resolution, by the use of NMR and other
spectroscopic means in addition to biochemical ones and site-directed mutagenesis. Generally
homologous pairing is catalyzed by RecA-family proteins (RecA, Rad51 and Dmc1). Within cells,
3'-single-stranded tails derived from double-stranded breaks are the first intermediates for the repair
of the double-stranded breaks, but the single-stranded DNA-regions are immediately coated by
single-strand binding protein (SSB, RPA), which prevents the binding of RecA-family proteins.
Recombination mediators are proteins that help the loading of RecA or Rad51 to the single-stranded
tail previously covered with SSB or RPA. Rad52 is the prototype, and bacterial RecO and eukaryotic
Brc2 are the members. So far analyzed, all recombination mediators catalyze homologous DNA pairing
without the requirement for ATP. While there are homologous recombination systems that are
independent of RecA-family proteins but are dependent on ATP-independent homologous pairing
protein (Mhr1 in yeast mitochondria; RecT in plasmid recombination in E. coli for examples), all
homologous recombination system involving ATP-dependent homologous pairing protein (RecA or
Rad51) requires a recombination mediator.
We are addressing the question how and why two kinds of homologous pairing proteins,
ATP-independent one and ATP-dependent one, cooperate in homologous recombination. Even in the
absence of single-strand binding protein, RPA, yeast Rad51 requires Rad52 to catalyze efficient
平 成 23 年 度

ATP-dependent homologous pairing of double-stranded DNA and homologous single-stranded DNA,
under a set of in vitro conditions (Arai et al., JBC 2005; Collaboration with Dr. Hitoshi KURUMIZAKA
& Dr. Wataru KAGAWA, Waseda University). We analyzed the effects of the replacements of basic
amino acid residues that constitute the second DNA binding site of Rad52. This study revealed that in
this cooperation, double-stranded DNA first binds to Rad52, which passes the DNA to Rad51 to finish
homologous pairing.
We investigated the detailed molecular mechanisms of recombination mediator functions that
help the loading of RecA/Rad51 onto single-stranded DNA coated with single-strand binding proteins
(SSB/RPA). We analyzed the replacement of SSB on single-stranded DNA by RecO by use of NMR,
site-directed mutagenesis and biochemical analyses, and obtained results that supported a model in
which the interaction between the acidic C-terminal flexible domain with basic residues of RecO
stimulates the dissociation of SSB from the single-stranded DNA and the binding of RecO to the DNA
(Inoue et al., JBC 2011; Collaboration with Dr. Yutaka ITO, Tokyo Metropolitan University).
2. The initiation of plant meiotic DNA recombination by AtSPO11s, Arabidopsis meiotic SPO11
homologues.
(Yoshinori SHINGU and Takehiko SHIBATA)
SPO11 is generally responsible to introduce site- and timing-specific double-stranded breaks
to initiate meiotic homologous recombination, but the biochemical features of SPO11 has not been
characterized, probably because of unsuccessful isolation of active SPO11 in vitro. We succeeded to
isolate SPO11s from plants, each of which have multiple species of SPO11 homologues unlike yeasts,
fungi, worm, insects and mammals. Among such plant SPO11s, we identified the responsible amino
acid residues of AtSPO11-1, one of two Arabidopsis meiotic SPO11s, consisting of a DNA-binding
surface, which plays a role in meiosis (Shingu et al FEBS J 2010). Although it is assumed that SPO11
introduces double-stranded breaks by a mechanism similar to the formation of a cleavage intermediate
of type II DNA topoisomerases, there are no direct evidence to support that SPO11 has an active center
of the activity. In order to analyze the double-stranded breaking activity of SPO11, we developed a
heterospecific Drosophila bioassay by use of meiosis in Drosophila melanogaster. This bioassay
demonstrated double-stranded breaking activity of two meiotic SPO11 of Arabidopsis, AtSPO11-1 and
AtSPO11-2, expressed ectopically in the absence of plant protein-cofactors. Thus, AtSPO11s were
shown for the first time to have an intrinsic double-stranded breaking activity (Shingu et al. to be
published; Collaboration with Kohji KUSANO, Drosophila Genetic Resource Center, Kyoto Institute of
Technology, and Kyo WAKASA, Department of Agriculture, Tokyo University of Agriculture).
研 究 年 報

Principal Investigator
柴 田 武 彦 Takehiko Shibata
Research Staff
岩 崎 わかな Wakana Iwasaki
新 宮 良 宣 Yoshinori Shingu
井 上 仁 Jin Inoue
井 川 粛 子 Shukuko Ikawa
土 田 信 夫 Nobuo Tsuchida
美 川 務 Tsutomu Mikawa
中 村 寬 夫 Hiroo Nakamura
篠 原 赳 Takeshi Shinohara
Students
櫻 井 潤 治 Junji Sakurai
奥 居 沙 弥 Saya Okui
森 脇 義 仁 Yoshihito Moriwaki
岩 澤 秀 樹 Hideki Iwasawa
倉 持 裕 吾 Yugo Kuramochi
高 橋 雅 弘 Masahiro Takahashi
岩 沢 佳 尚 Yoshinao Iwasawa
原 佳 那 Kana Hara
神 蔵 祐 典 Yusuke Kamikura
井 上 雄 Yu Inoue
黒 澤 恒 平 Kohei Kurosawa
伊 藤 将 Masaru Ito
山 田 真 太 郎 Shintaro Yamada
米 田 詩 織 Shiori Yoneda
岡 村 美 佳 Mika Okamura
大 岩 利 和 Toshikazu Ooiwa
此 村 直 人 Naoto Konomura
佐 藤 晃 子 Akiko Sato
畔 上 奈 々 子 Nanako Azegami
神 澤 渉 Wataru Kamizawa
鈴 木 啓 介 Keisuke Suzuki
川 口 あゆみ Ayumi Kawaguchi
Assistant and Part-timer
香 川 亜 子
松 本 初 恵
細 野 美 子
中 川 佳 子
広 里 惠 子
Visiting Members
太 田 邦 史
廣 明 秀 一
伊 藤 隆
胡 桃 坂 仁 志
草 野 好 司
若 狭 暁
川 崎 勝 己
高 橋 栄 夫
西 村 善 文
丹 羽 修 身
山 田 貴 富
久 郷 和 人
大 里 修 一
瀬 尾 秀 宗
橋 本 修 一
高 久 誉 大
立 和 名 博 昭
長 土 居 有 隆
明 石 知 子
末 松 和 美
両 角 佑 一
針 谷 直 人
城 口 敦 弘
森 山 隼 介
高 橋 恒 太
宮 井 俊 輔
八 木 研
小 島 久 美 子
小 山 智 加
高 岩 亜 希
Ako Kagawa
Hatsue Matsumoto
Yoshiko Hosono
Yoshiko Nakagawa
Keiko Hirosato
Kunihiro Ohta
Hidekazu Hiroaki
Yutaka Ito
Hitoshi Kurumizaka
Kohji Kusano
Kyou Wakasa
Katsumi Kawasaki
Hideo Takahashi
Yoshibumi Nishimura
Osami Niwa
Takatomi Yamada
Kazuto Kugou
Shuichi Ohsato
Hidetaka Seo
Shuichi Hashimoto
Motoki Takaku
Hiroaki Tachiwana
Nagadoi Aritaka
Satoko Akashi
Kazumi Suematsu
Yuichi Morozumi
Naoto Harigai
Atsuhiro Joguchi
Shunsuke Moriyama
Kouta Takahashi
Shunsuke Miyai
Ken Yagi
Kumiko Kojima
Chika Koyama
Aki Takaiwa

川 田 滋 久
佐 々 木 剛
高 橋 直 樹
奥 村 浩 美
中 村 晃 歩
内 木 智 朗
辻 融
岡 村 健 太 郎
Shigehisa Kawada
Go Sasaki
Naoki Takahashi
Hiromi Okumura
Akiho Nakamura
Tomoaki Uchiki
Tsuji Toru
Kentaro Okamura