Les cèl·lules ciliades ototoxicitat i regeneració - Silvia Asenjo - Aula

1.INTRODUCCIÓIMOTIVACIONS 

 

Avuiendia,estemmoltbeninformatssobreelsproblemesdedisminucióde 

l’audicióod’hipoacúsiaquecomportaunaexposicióprolongadaasorollsfortsenuna 

societatonelsjovess’exposenavolumsdemúsicamoltalts.Delamateixamanera, 

sombenconscientsquel’edatpotportarproblemesd’oïdaquenoméspodenser 

solucionats amb l’ús d’audiòfons. No obstant, l’ototoxicitat produïda per diferents 

fàrmacs, és encara un camp que requereix molts estudis científics. La pèrdua de 

l’audicióapareixambladestrucciódelescèllulesciliadescoclearsivestibularsde 

l’oïda,quesónmecanoreceptorsimprescindiblesperl’audicióil’equilibri,queenelcas 

del’espèciehumana,comalagranmajoriadelsmamífers,nopodenserregenerades 

uncopsóndestruïdes.Elsestudisrealitzatsalrespecte,s’handutatermeambdos 

objectiusdiferents:elpoderidentificarelscompostosquecausenlasevadestrucciói 

elsquel’eviten,ianalitzarelsmecanismesderegeneraciódelescèllulesciliadesen 

altresvertebratspertrobarunamanerad’induiraquestescèllulesaaquestprocésen 

l’espèciehumana. 

Elsestudisenaquestscampsespodenrealitzarambdiferentsvertebrats.Per 

aquesttreballhemtriatelpeixzebra(Daniorerio),quehademostratseridonipera 

aquestsestudis.Lapopularitatd’aquestpeixhaanatcreixentpocapocgràciesales 

sevescaracterístiques,ihaestatmoltinteressantelpoderrealitzarlapartexperimental 

deltreballambaquestvertebrat. 

Ens hem plantejat estudiar l’ototoxicitat de tres antibiòtics (gentamicina, 

claritromicinaiazitromicina),il’otoprotecció(aplicantvitaminaC),aixícomestudiarels 

mecanismes de regeneració de les cèllules ciliades en aquest peix després de la 

destrucciócausadapelsototòxics.Hemintentatexplorarmésafonsl’ototoxicitatdela 

claritromicinaidel’azitromicina,antibiòticssobreelsqualsnoméshemtrobatunestudi 

realitzatambporcdeGuinea,idelsqualsnos’hacomprovatambcertesal’efecte 

ototòxic;peraaixòelshemcomparatambunototòxicbenreconegutcomésla 

gentamicina. 

Amésamés,hemaportatcomanovetatunestudid’otoproteccióambla 

vitaminaC,sobrelaqualnoexisteixenestudisespecíficsenaquestcamp,peròquees 

1

trobadinsdelgrupdelsantioxidants,quesónsubstànciesconsideradesotoprotectores. 

Perúltim,hempogutobservarelsmecanismesderegeneraciódelescèllulesciliades 

enelpeixzebradesprésdeladestrucciócausadapelsantibiòticsaplicats. 

Hemdutatermeaquesttreballderecercaambl’objectiudecombinardos 

campsquecreiematractiusidegraninterès:labiologiailamedicina,jaquetotsels 

resultatsobtinguts,iengeneral,elsestudisd’aquesttipus,busquenl’aplicaciódirecta 

enl’espèciehumana.Haestatmoltinteressantpodertreballarambembrionsihaver 

tingutaccésaunvertebratcomelpeixzebra,unésserviuambunescaracterístiques 

especials,queelfanunmaterialadequatperaqueststipusd’estudis.Finalment,una 

fitaqueensvammarcarendecidireltemadeltreball,vasereldedescobrirelmónde 

larecercaidelmètodeexperimentalallaboratori,unmónenelqual,treballarmoltde 

temps no és sinònim de tenir èxit. La paciència i el saber superar els obstacles 

esdevenenessencials. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

2.OBJECTIUSDELTREBALLIHIPÒTESI 

 

OBJECTIUS 

 

 

 

 

Enprimerlloc,demostrardemaneraexperimentalcomdiversessubstàncies 

 

actuensobrelescèllulesciliadesdelsneuromastsdelpeixzebra:destruintlos 

(ototòxics)oevitantlasevadestrucció(otoprotectors). 

Ensegonlloc,comprovarexperimentalmentelsmecanismesderegeneracióde 

lescèllulesciliadesenelpeixzebradesprésdelasevadestrucció. 

Finalment,establirunarelacióentrelarespostadelescèllulesdesuportdels 

HIPÒTESIS 

 

 

 

 

neuromasts del peix zebra i el grau d’ototoxicitat de vàries substàncies a 

diferentsconcentracions. 

Com hipòtesi principal, creiem que els antibiòtics macròlids azitromicina i 

 

claritromicinatenenunefecteototòxicsobrelescèllulesciliades,produintuna 

destruccióreversibleenelpeixzebra,alserpossiblelasevaregeneracióapartir 

deladiferenciaciódelescèllulesdesuport. 

Comhipòtesisecundària,creiemquelaproliferaciódelescèllulesdesuport 

 

queoriginarànovescèllulesciliades,esproduiràabanscommajorhagiestat 

l’efecteototòxic. 

3

4

3.INTRODUCCIÓTEÒRICA 

 

3.1.L’OÏDAHUMANA 

 

L’oïdaésunòrgansensorialespecialitzatenduesfuncionsdiferents:l’audiciói 

l’equilibri. Es divideix en tres parts: l’oïdaexterna, l’oïda mitjana i l’oïda interna. 

Mentrequeelcomplexvestibulardel’oïdainternaéselsensorprimariperl’equilibri,la 

restadel’oïdaestàrelacionadaambl’audició. 

 

3.1.1.Anatomia 

 

L’oïdahumanaestàsituadaacadascundelslateralsdelcrani,entrel’articulació 

delamandíbulail’osmastoidal,quedantinclosadinselpenyaldel’ostemporal 

 

3.1.1.1.L’oïdaexterna 

Estàconstituïdapelpavellóauditiuipelconducteauditiu.Elpavellóauditiu,també 

anomenatorella,ésunaestructuraaccessòria,cartilaginosairecobertadepell,que 

varia de forma i de localització segons l’espècie, depenent de les necessitats de 

supervivènciadecadascuna.Elconducteauditiu,quetambééscartilaginós,tétancatel 

seuextreminternperunafinamembranaanomenadamembranatimpànicaotimpà, 

queseparal’oïdaexternadel’oïdamitjana.Elconducteauditiuestàunamicacorbati 

produeixceraperevitarl’arribadad’agentsexteriorscominsectesobrutíciaaltimpà, 

queésmoltsensible. 

 

3.1.1.2.L’oïdamitjana 

Ésunacavitatplenad’airequeconnectaamblafaringeatravésdelatrompa 

d’Eustaqui.Aquestaúltimanormalmentestàcollapsada,tancantl’oïdainterna,però 

s’obre quan és necessari equilibrar la pressió de l’oïda mitjana amb la pressió 

atmosfèrica,enmastegar,empassarobadallar.Elmartell,l’enclusail’estrep,sóntres 

ossospetitsdel’oïdamitjanaunitsentresiperunspetitsmúsculs.Unextremdel 

5

martellestàfixatalamembranatimpànica,il’extremdel’estrepestàunitauna 

membranamoltprimaqueseparal’oïdamitjanadel’oïdainterna. 

 

 

 

Tallfrontaldel’oïdahumanaquecomprènl’oïdaexterna,lamitjanailainterna 

Modificatdelareferènciabibliogràfica20. 

 

 

6

3.1.1.3.L’oïdainterna 

 

Estàsituadadinselpenyaldel’ostemporaliinclouduesestructuressensitives 

diferents:l’aparellvestibular,òrganperifèricdel’equilibri,ilacòcleaocargol,òrgan 

acústic. 

L’aparell vestibular inclou el vestíbul i els conductes semicirculars, que 

presentenenundelsseusextrems,unadilatacióenformad’ampolla,onestrobenles 

cèllules sensorials ciliades i les seves corresponents cèllules de suport. Els tres 

conductes semicirculars: el superior, l’extern i el posterior, estan disposats 

perpendicularment entre si, estant així, orientats en els tres plans de l’espai. Les 

terminacions nervioses en contacte amb les cèllules ciliades, formaran el nervi 

vestibular. 

Lacòcleaésunaestructuraenformad’espiralde35mm,queestàformadaper 

unapartòssiaexterna,anomenadalaberint ossi,iunapartinternamembranosa, 

anomenadalaberintmembranós.Perunabanda,ellíquidqueestrobaalvoltantdel 

laberintmembranóss’anomenaperilinfa,id’altrabanda,ellíquidqueestrobaalseu 

interiors’anomenaendolinfa.Lacòcleaestàdivididalongitudinalmententrescanals 

tubulars,queesvanfentmésestretsamesuraqueensapropemalseufinal.Elprimer 

éselcanalvestibular,queestàtancatalasevabaseperlafinestraoval,quejuntament 

ambunaltrediscmembranós,anomenatfinestrarodona,télafunciódesepararla 

còcleaqueestàplenadelíquid,del’oïdamitjanaqueestàplenad’aire.Elsegon 

s’anomenacanaltimpànic,estàconnectatambelcanalvestibularitélabasetancada 

perlafinestrarodona.L’últimdelscanalsestrobaentreelsdosprecedentsis’anomena 

canalcoclear.Aquestcanalcontél’òrgandeCorti,onestrobenlescèllulesciliades, 

formant,sobreunamembranaanomenadamembranabasilarqueseparaelscanals 

timpànicicoclear,detresacincfileresalapartexternadelcargol,ialapartinterna 

unasolafila.Cadacèllulaciliadadelapartinterna,estàconnectadaambunafibra 

nerviosa,mentrequelescèllulesciliadesexternesesconnectenpergrups.Totesles 

fibresnerviosesprocedentsdel’òrgandeCorti,s’ajuntenformantelnervicoclear. 

Elnervicoclearielnervivestibularcomponenelnerviauditiu,fanjuntsel 

trajecte fins el bulb cerebral, on desemboquen per separat als nuclis coclear i 

vestibular. 

7

SecciótransversaldelacòcleaModificatdelareferènciabibliogràfica23. 

3.1.2.Lescèllulesciliades 

 

Les cèllules ciliades són mecanoreceptors, que vol dir que detecten la 

deformació física causada per estímuls com la pressió, el tacte, l’estirament, el 

movimentoelso,quesóntotesellesformesd’energiamecànica.Al’oïdahumana 

interna,tenenunaestructuracomuna:cadacèllulaciliadaestàinseridaenunteixitde 

cèllulesdesuport,ilasevabaseestàencontacteambunafibranerviosa.Amésamés, 

cadacèllulaciliadatéentre30i150prolongacionspilosesanomenadescilis.Ales 

cèllules ciliades coclears, tots els cilis són mòbils (estereocilis), mentre que les 

cèllulesciliadesvestibularstenenuncilicentralimmòbil(cinocili). 

8

Estructuradel’ÒrgandeCortiModificatdelareferènciabibliogràfica16. 

3.1.3.Fisiologiadel’audicióil’equilibri 

 

En els mamífers, com en la majoria de vertebrats, equilibri i audició van 

estretament relacionats. L’oïda dels mamífers és un òrgan que conté dos 

mecanoreceptors diferents, i cadascun transforma l’energia que es produeix en 

moure’sellíquidquecontenenenunimpulsnerviósopotenciald’acció(onade 

descàrregaelèctrica),queespropagaperunafibranerviosafinselscentrescerebrals 

del’audició.Perunabanda,tresconductessemicircularsconnectatsqueofereixen 

informaciósobrel’orientaciódelcapenl’espai,sónessencialspelmantenimentde 

l’equilibridelcos.D’altrabanda,unesaltresestructures,podenconvertirlesvibracions 

del’aireoonessonoresenvibracionsdelfluidquecontélacòclea,fetimprescindible 

per l’audició. En ambdós casos, els receptors sensorials primaris, són les cèllules 

ciliades,quepodenvibrarenrespostaalsmovimentsdelfluidquelesenvolta. 

 

 

9

3.1.3.1.L’audició 

Lesonessonoresquearribenfinslanostraoïda,determinen,enprimerlloc,que 

lamembranatimpànicavibriamblamateixafreqüènciaqueaquestso.Acteseguit,els 

tresossos(martell,enclusaiestrep),transportenlesvibracionsperl’oïdamitjanai 

l’estreptransmetlesvibracionsaunamembranalafinestraoval,quealhoracrea 

ones de pressió al líquid de la còclea. Aquestes ones viatgen a través del canal 

vestibularfinsl’àpexdelacòclea,continuantatravésdelcanaltimpànicidissipantse 

quan arriben de nou a la finestra oval. Les ones de pressió, que durant aquest 

recorreguthanarribatalcanalvestibular,exerceixenunapressiósobreelcanalcoclear 

ilamembranabasilar,queestàcobertaperlamembranatectòria(onestrobenles 

cèllulesciliades).Comaconseqüència,lamembranabasilarvibracapamunticapavall, 

produintseunfregamententrelescèllulesciliadesqueesseparendelamembrana 

tectòria,id’aquestamaneraelsseusciliss’inclinenendiferentsdireccionssegonsla 

vibració.Finalment,lainclinacióproduïdadespolaritzalescèllulesciliades,produintse 

potencialsd’acció,quesóntransmesosaunesfibresnervioses,queatravésdelnervi 

coclear,transmetenlasensaciócaptadaalcervell. 

 

 

3.1.3.2.L’equilibri 

Lessensacionsrelacionadesamblaposiciócorporalesgenerend’unamanera 

moltsimilaralessensacionsdesoproduïdestantenelséssershumanscomenla 

majoriademamífers.Darreralafinestraoval,trobemunvestíbulquecontédues 

càmeresdiferents:l’utricleielsàcul,quesónessencialsperalsentitdel’equilibri. 

L’utricle,amésamés,s’obreentresconductessemicircularsquecompletenl’aparell 

del’equilibri. 

Lescèllulesciliadesestandistribuïdesengrupsdinsdelsàculidel’utricle,itots 

elsseuscilisestanprojectatsenunmaterialgelatinósquecontémoltsotòlits,quesón 

petitespartículesdecarbonatdecalci.Comqueaquestmaterialésméspesatque 

l’endolinfaqueestrobadinsdelsàculidel’utricle,lagravetatfaràqueaquestmaterial 

exerceixiunapressiócapavallsobreelscilis,icomaconseqüència,lescèllulesciliades 

10

enviïnunasèrieconstantdepotencialsd’accióatravésdelesneuronessensorialsidel 

nervivestibularfinselcervell. 

Segons els diferents angles corporals, l’otòlit estimularà diferents cèllules 

ciliades, ja que la posició del cap canviarà respecte la gravetat, i augmentarà o 

disminuiràl’alliberaciódepotencialsd’acció.Seguintunmecanismesimilar,lescèllules 

dedinselsconductessemicirculars,enestardistribuïtsenelstresplansespacials 

detectencanvisenlafreqüènciaderotacióoelsmovimentsangularsdelcap. 

 

 

3.1.4.Patologiadel’audició 

 

Hihatrestipusdiferentsd’hipoacúsia:l’hipoacúsiadeconducció,lacentralila 

neurosensorial.Laprimerapottenirdiferentscausesquevariendesdel’obstrucciódel 

conducteauditiucausadaperlapresènciadeceraodesecreciócomaconseqüència 

d’unainfecció,finsl’apariciód’unamalaltiaotraumatismequeimpedeixilavibració 

delstresossosdel’oïdamitjana.Finsitotenaquestúltimcasexisteixentècniquesmolt 

eficientsdereconstrucció.L’hipoacúsiacentraléselresultatdeldanyocasionatales 

vies neurals que es troben entre l’oïda i el còrtex cerebral o del dany ocasionat 

directamentaaquestúltim.Aqueststipusdepatologiesnosóngairefreqüentsies 

deuen a accidents cerebrovasculars com les embòlies o a tumors. Per últim, 

l’hipoacúsianeurosensorial,lamésfreqüent,apareixcomaconseqüènciadeldany 

ocasionatalesestructuresdel’oïdainterna,ienespecialalescèllulesciliades.La 

pèrdua d’aquestes cèllules també pot afectar l’equilibri, que està estretament 

relacionatambl’audició.Unaalteraciódelcanalvestibularidelescèllulesciliadesdel 

sàcul,del’utricleidelsconductessemicirculars,podriaportaraunaincapacitatper 

mantenirelcosenequilibri,l’apariciódelasensaciódevertigenod’inestabilitat,entre 

d’altres. 

Les cèllules ciliades de l’oïda humana es produeixen totes durant el 

desenvolupamentembrionari,ienmamífersnopodenregenerarsedesprésdelaseva 

destrucció.Enl’ésserhumà,lapèrduadecèllulesciliadeséslaprincipalcausade 

sordesa.Aquestapèrduavedeterminadaperl’edat,pertraumessonors,permalaltiesi 

11

per medicaments, drogues o altres substàncies que poden resultar tòxiques. 

Actualment,davantd’unapèrduad’aquestescèllules,l’únicremeiésl’úsd’audiòfons, 

encaraquetambéexisteixenelsimplantscoclears,quehandemostratserbastant 

eficaços.Actualment,moltsinvestigadorsexplorenestratègiesperreproduirelprocés 

de regeneració que té lloc en les aus i vertebrats inferiors, que inclouen el 

trasplantamentdecèllulesmareneuralsilateràpiagenèticaperinduircèllulesno 

sensorialsadiferenciarseacèllulesciliades.Tambés’estanrealitzantestudisamb 

vertebratsquetenenaquestacapacitatderegeneracióamblafinalitatd’identificarels 

gensimplicatsenelprocés.D’altrabanda,tambés’hanrealitzatis’estanrealitzant 

estudis per identificar les substàncies que, o bé destrueixen les cèllules ciliades 

(ototòxics),obéevitenquealtressubstàncieslesdestrueixin(otoprotectors). 

 

3.1.4.1.Agentsototòxics 

Els agents ototòxics són aquells que causen lesions sobre les estructures 

vestibulars i coclears de l’oïda humana. Aquestes substàncies poden destruir les 

cèllulesciliades,iaixòtindràlesconseqüènciescomentadesanteriorment.Hihaurà 

substàncies que només tinguin efecte sobre les estructures coclears, d’altres que 

noméseltinguinsobrelesvestibulars,ialtressobreambdues.Amés,elsmecanismes 

del’accióototòxicapodenvariard’unasubstànciaal’altre. 

Elsprimerscasosd’ototoxicitatesvanmanifestardesprésdelaintroduccióde 

l’estreptomicina (antibiòtic del grup dels aminoglicòsids) al 1944 per tractar la 

tuberculosi.Apartird’aquellmoments’hananatidentificantlessubstànciesque,com 

l’estreptomicina,podendestruirlescèllulesciliades.Enelcasd’aquestaminoglicòsid, 

esvapoderobservarunadestruccióirreversibled’aquestescèllules,mentrequealtres 

substàncieshanmostratnomésunlleugerefecteototòxic,quecausaunalesióales 

cèllulesciliades,peròquedesapareixquanesdeixad’administraraquestasubstància. 

Lareversibilitatdel’efectecausatsobrelescèllulesciliadesdependràdeltipusde 

substància,ladosiadministradaideltempsd’exposició.Elqueéssegur,però,ésque 

noespodràproduirlaregeneraciódelescèllulesciliadesal’oïdahumana. 

Elsantibiòticsaminoglicòsidstriguenmolteneliminarseuncopestrobendins 

delcos,inoméspodensereliminatspelsronyons.Aixídoncs,lasevaprolongada 

12

permanènciadinsdelslíquidsdel’oïda,elsconverteixenunspotentsototòxics.Aquest 

efecteesveuaccentuatquanexisteixenproblemesal’aparellrenal.Engeneral,aquest 

tipusd’antibiòticssónagressiusicausentantladestrucciódelescèllulesciliades 

vestibulars com de les coclears. Els aminoglicòsids causen destrucció de cèllules 

ciliadesinduintaquestescèllulesal’apoptosi,ésadir,alamortcellularprogramada.A 

concentracionsmoltelevades,apareixenlesionsenaltrestipusdecèllules.Unexemple 

d’antibiòtics aminoglicòsids són: la neomicina, la gentamicina, la tobramicina i 

l’estreptomicina.Hihaaltrestipusd’antibiòticsototòxicsqueactuensobrelescèllules 

ciliades d’una manera diferent, augmentant la presència d’espècies reactives de 

l’oxigen,quesónmolèculesinestablesresultantsdereaccionsd’oxidacióireducció 

incompletes,quereaccionenràpidamentamblamajoriademolèculesbiològiques. 

L’excésd’aquestesespèciestindràunefectesobrelescèllulesciliades. 

Unaltregrupdefàrmacsd’efecteototòxicsónelsantineoplàstics,quesón 

derivatsdelplatí.D’aquestgrup,elcisplatíéselquemajorefecteototòxiciirreversible 

hademostrattenir.Pelcontrari,algunsfàrmacsdelmateixgrup,handemostrattenir 

unefecteototòxicreversible.Amésamés,enelssalicilatselsderivatsdel’aspirina 

(àcidacetilsalicílic),enelsdiürèticspotentsienalgunsantiinflamatoris,s’haobservat 

un efecte ototòxic però només en pacients tractats amb dosis molt elevades i 

majoritàriamentreversibles.Encombinarelsdiürèticsambantibiòtics–sobretotamb 

aminoglicòsids , l’efecte ototòxic es veu accentuat. De cara a la nostra part 

experimental,calafegirqueelsantibiòticsdelgrupdelsmacròlidscoml’azitromicinao 

laclaritromicina,nohanmostratunefecteototòxicevident,iquepertantlaseva 

ototoxicitatésdubtosa.Finalment,lesdroguesielsverinsindustrialscomelsofre,el 

monòxiddecarboniilessalsdeplomodemercuri,produeixenlesionscoclearsi 

vestibulars. 

 

3.1.4.2.Agentsotoprotectors 

Elsagentsotoprotectorssónaquellsqueevitenladestrucciódelescèllules 

ciliades. Hi ha dos tipus diferents de substàncies otoprotectores: els agents 

antiapoptòticsielsantioxidants.Elsprimersinterrompenelsenyalmolecular–activat 

peralgunstipusd’ototòxics,queindueixlescèllulesciliadesacomençarl’apoptosio 

13

mort cellular programada. Els segons, neutralitzen l’excés d’espècies reactives de 

l’oxigenoaugmentderadicalslliurescausatpelsototòxics,excésqueproduiriala 

destrucciódelescèllulesciliadessinofosneutralitzat.Elsantioxidants,quesón 

otoprotectors,obés’enllaçaranambaquestesespèciesreactivesdel’oxigen,obé 

s’enllaçaranamblesmolèculesquelesformaran,evitantquelescèllulesciliadeses 

veginafectades.Algunsdelsantioxidantsenelsqualss’haobservatefecteotoprotector 

ambcertesa,sónlametioninaunaminoàcid,l’ebselen–unantiinflamatori,ola 

vitaminaE.Amésamés,s’hacombinatvitaminaEambvitaminaC,is’haobservatun 

majorefecteotoprotector. 

 

 

3.2.ELPEIXZEBRA(Daniorerio) 

 

ElDaniorerio,mésconegutcomapeixzebra,ésunpeixteleosti 1 delafamília 

delsciprínids 2 ,originaridelsriusd’Índia.Tambééscomúcomapeixd’aquarijaqueés 

fàcildemanteniridecriar. 

 

3.2.1.Descripcióicaracterístiquesgeneralsdelpeixzebra 

 

Elpeixzebrarepaquestnomgràciesalescincratlleshoritzontalsiblavosesque 

téalscostatsdelseucos.Lasevamidahabitualésde4cm,peròlamàximaésde6,4 

cm,iviuennormalmententre2i3anysencaptivitat.Ésfàcildistingirlesfemelles 

adultes,quesónamplesiplatejades,delsmasclesadults,quesónprimsitenenla 

panxagroga.Aixòseràmoltútildecaraalareproducciód’aquestpeixallaboratori,ja 

quepermetràtriarfàcilmentelsindividusqueesvolencreuar. 

Elpeixzebras’utilitzamoltenlesinvestigacionsbiològiquesmodernesjaque 

presentaunescaracterístiquesqueelfanidoniperatreballarhiexperimentalment.Va 

aparèixercomaorganismemodelperlainvestigació,ambeltreballpionersobre 

1 Unadelestresclassesquecomprenenelsactinopterigisopeixosd’aletesradiades. 

2 Famíliadepeixosdel’ordredelscipriniformes(peixosdotatsd’esqueletintern),queviuenenaigües 

dolces. 

14

mutagènesideGeorgeStreisingeretal.(referència10),quevanreconèixertotesles 

virtutsdetreballarambaquestpeix. 

 

Existeixendostipusdemanipulacionspossiblesenpeixzebra:lesgenètiquesi 

lesexperimentals.Genèticamentésmoltfàcildemanipulariensofereixlapossibilitat 

decrearlíniestransgèniquesqueseranpràctiquesdecaraalsdiferentstipusd’estudis 

queesvulguinrealitzar.EnelDaniorerioésfàcilobservarelspatronsd’expressiódels 

gensenvariesestructuresmitjançantlatinciódecèllulesambcolorantsfluorescents 

específics,gràciesaunadelessevescaracterístiquesmésimportants:latransparència. 

Aquestapropietatenfacilitatantlamanipulacióexperimentalcomlagenèticad’aquest 

peix,oferintlapossibilitatdelaobservacióinvivosensenecessitatd’obrirnitallar 

teixitsdelessevescèllules.Durantelscincprimersdiesdevida,elsembrionstenen 

tantatransparènciaquefinsitotsensetenyirlescèllulesse’npodendistingiralgunes 

ambunbonmicroscopi. 

Unsaltreselementsquefanqueelpeixzebrasiguiidoniperalainvestigació, 

sónlasevaràpidareproducció,queamésamésespotproduirduranttotl’any,i 

l’elevatnombred’ousqueponenpercadaposta.Ambduespropietatsfacilitenl’accésa 

ungrannombred’embrionsperaferestudis.Apartdelasevaràpidareproducció,el 

Danioreriotéundesenvolupamentembrionarimoltràpid,jaqueen24hunembrió 

d’unacèllulapassaatenirunaaparençasemblantalad’unpeix,icomquetenen 

fecundació externa, totes les fases del seu desenvolupament embrionari són 

accessiblesallaboratori. 

Finalment,elfetquefinselscatorzediesdesprésdelafecundació,elsembrions 

puguinabsorbirmolèculesatravésdelapell,iqueelspeixosmésvellspuguinabsorbir 

atravésdelesbrànquies,ensfacilitaràl’administraciódesubstànciesalsembrionsials 

adults,jaquepodranserafegidesal’aiguaiserabsorbidesdirectamentd’aquesta. 

 

3.2.2.Desenvolupamentembrionari 

 

Duranteldesenvolupamentembrionari,l’embriódepeixzebraestrobaprotegit 

dinsd’unsacamniòticocòrion.Elsousdepeixzebra,comelsdelesaus,elsdels 

15

èptilsielsdelamajoriadepeixos,sóntelolecítics,quesignificaquecontenenunagran 

quantitatdevitel,queésunconjuntdesubstànciesalimentàries.Comaconseqüència, 

lasegmentacióquedónaorigenal’embrióeslimita,només,aunapetitaregióenforma 

dediscsensevitelperòambcitoplasma,anomenatpolanimal.Totalarestadel’ou,on 

estrobaelvitel,s’anomenapolvegetatiu.Degutaaquestadivisióenduesparts,la 

segmentació de l’embrió de l’ou de peix zebra és una segmentació discoïdal 

meroblàstica 3 (del grec meros, part i de les cèllules en les quals es dividirà el 

citoplasma,anomenadesblastòmers). 

 

Segmentaciódiscoïdalmeroblàstica(vistadesdedalt) 


 

Lesprimeresdotzedivisionscellularsdelcitoplasmaessucceeixenràpidament 

(15minutscadauna),iesprodueixenalpolanimal,sobreelvitel.Aquestacapade 

cèllules rep el nom de blastoderma o blastodisc. Aproximadament a la desena 

segmentació,lesdivisionscellularss’alenteixen,elmovimentdelescèllulesesfa 

evident i es poden distingir tres poblacions cellulars diferents: la capa sincítica 4 

vitellina,quepodemdividireninternaiexterna,iésl’espaienelqualellímitdel 

blastodermaesfusionaamblacèllulavitellina,lacapaenvoltantvitellina,queésla 

zona constituïda per les cèllules que envolten el blastoderma, i que només es 

convertiranenunacapadeproteccióqueméstards’eliminarà,ifinalmentlescèllules 

profundes, que es troben entre els dos anteriors i formen la zona que originarà 

veritablementl’embrió.Uncopacabadalasegmentació,ladivisióenaquestesparts 

determinalaformaciód’unablàstula,queésunamassadecèllules.Elperíodede 

blastulaciódelpeixzebracomençaaproximadamentales2h15mindesprésdela 

fecundacióiduraunes3h. 

3 Formaciód’unamòrulaodiscdecèllulesquedescansasobreunamassadevitel. 

4 Capadecèllulesambmoltsnuclis. 

16

Acontinuaciócomençaunprocésdegastrulacióquel’embriócompletaales 

10h30minpostfecundacióiquesuposaunareorganitzaciódelescèllulesdela 

blàstula.Alafaseinicial,lescèllulesprofundesmigrencapal’exteriorperintercalarse 

amblescèllulesméssuperficialsformantl’epiblast,iunesaltresformenl’hipoblasten 

endinsarsecapalacapasincíticavitellina.Lagastrulaciócomençaambunprocés 

anomenatepibòlia,durantelquallescèllulesprofundesdelblastodermamigrencapal 

polvegetatiuiacabenenvoltantlacèllulavitellina.Quanlescèllulesblastodèrmiques 

han recobert la meitat de la cèllula vitellina, la zona formada per l’epiblast i 

l’hipoblast,queestàformantunanellgerminatiu,augmentadegruixiesformentres 

capesgerminals:l’ectoderma,querecobreixl’embrió,l’endodermailamesoderma, 

queestrobaentrelesduesprecedents. 

 

 

GastrulacióModificatdelareferènciabibliogràfica18. 

 

 

La distribució de les capes germinals juga un paper molt important en la 

formaciódelsdiferentsòrgansisistemesdel’embrió.Perunapart,lamesoderma 

lateraliventraloriginaràestructuresdesuportidemovimentcomlasang,elsmúsculs 

17

oelcor.D’altrabanda,lamesodermadorsaloriginaràelnotocordi 5 ielssomites 6 ,i 

induiràl’ectodermaaformarlamajorpartdelsistemanerviós,començantperla 

formaciódelaplacaneural 7 ideltubneural 8 .Del’endodermaderivaranestructures 

tantimportantscomelspulmonsoeltubdigestiu. 

 

 

Desenvolupamentembrionaridelpeixzebralesprimeres24hores 


5 

Ficordósituatentreeltubneuralil’intestíenfaseembrionària,ques’esténalllargdelcos 

parallelamentalsistemanerviósiqueesdesenvolupaapartirdelaparetdorsal. 

6 

Estructuresembrionàriesd’origenmesodèrmicdorsolateralquedonenllocatotalamusculaturaaxial, 

l’esqueletiladermis. 

7 

Expansióplanadelteixitneuralenlaregiódorsaldelagàstrula. 

8 Estructuraderivadadelaplacaneuralqueoriginaelsistemanervióscentral. 

 

18

Enelpeixzebra,entreles10iles24hdesprésdelafecundació,elssomiteses 

desenvolupenicomencenaservisibleselsòrgansprimarisques’estanformant.Amés, 

la punta de la cua comença a ferse més evident i les primeres cèllules es van 

diferenciant.Tambéapareixenelsprimersmovimentsdel’embrióielsacvitellíestà 

bendefinit.Ales19helcerebelestàcomençantaformarse,elcervelltambé,es 

podendistingirlesvesículesòtiquesielsullsbastantbenformats,ieltubneuraljaestà 

quasideltotformat.Ales24h,tambéespodenapreciarelsglòbulsrojosdelasangiel 

movimentdelcor,iengeneral,l’embrióestàmoltbenformatijatéformadepeix.Per 

alnostretreballexperimental,les48hvanserunmomentimportant,jaqueesformen 

elsneuromastsdelalínialateral(vegi’sapartatdelalínialateral),queaniranmadurant 

micaamicaamblaformaciódetoteslescèllulesciliadesqueelsconstitueixen.Ales48 

hpostfecundació,elsembrionsdepeixzebranedenlliurement,tenenelreflexde 

fugidaisónsensiblesaltacte.Eltercerdiapostfecundació(72h),desprésdetotel 

desenvolupament seguit, s’enllesteix la formació dels òrgans i estructures més 

importants. De cara al nostre treball, cal remarcar que els cinc primers dies, els 

embrionstenenelgraudetransparènciamàximaicomencenamostrarunarespostaa 

estímulsacústics. 

 

 

3.2.3.Mantenimenticriadepeixzebraallaboratori 

 

Elsadultsdepeixzebrasóndefàcilmantenimentjaquepodenviureenaiguade 

l’aixeta,sempreiquanaquestanosiguidemalaqualitat.Unaqualitatdel’aiguano 

gairebonapodràempitjorarlasalutdelspeixos,ferlosméssusceptiblesadiferents 

malaltiesiferdisminuirlasevacapacitatreproductora.Sinoesdisposad’aiguadebona 

qualitat,espodenmantenirenaiguadestilladaalaquals’afegeixensalsiminerals,ies 

potcrearuncircuittancatenelquall’aiguaestorniaferserviruncoppurificada. 

Aquestaaiguadestilladaambsalsimineralss’anomenaSystemwater 9 .Elsembrions 

requereixensemprecondicionsmésestrictesjaquenoespodenfercréixerenaiguade 

9 Aiguadestilladaamb40gdesals“InstantOcean”(unacomposicióespecial)percadalitred’aigua. 

19

l’aixetasensetractar.Amés,quanesfancréixerelsembrionsenplaquesdePetris’hi 

ha d’afegir un antifúngic per evitar l’aparició de fongs que puguin menjarse els 

embrions. 

Elspeixoszebrasónfotoperiòdicsenlasevareproducció,produintembrions 

cada matí en estat salvatge,. Al laboratori es pot triar el moment de la seva 

reproducció,agafantnombressimilarsdemasclesifemelles,separantlosambuna 

placatransparentperpermetrecontactenomésvisual,icontrolantelcicledianitenun 

laboratoriilluminat.Deixantlosalesfosquesdurantunanitsenceraidestapantlos 

l’endemà,esproduiràlafecundacióentreurelaseparació,iespondranunbon 

nombred’ousperacadafemellasana(3050ous),en30minuts.Uncoppostoselsous, 

esretornenalstancsgeneralselsmasclesifemellesseleccionatsperaquedescansin,i 

se’lsposamenysaliment.Ésmoltimportantl’alimentaciódelsadultsperlapostad’ous 

jaqueenseralimentatsenexcés,engreixaranidonaranunespostesmoltméspobres. 

Durantelsprimersdies,elsembrionss’haurandemantenirenSystemwater,i 

sempre que es posin en una placa de Petri,s’haurà d’intentar canviar diàriament 

l’aigua.Elsembrionsdepeixzebrasobreviuenatemperaturesentre24ºCi31ºCencara 

quelamillortemperaturaperalseucreixementésde28,5ºC.Amés,mantenirlaplaca 

de Petri ben tapada amb un vidre de rellotge a aquesta temperatura, crea unes 

condicionsidealsperalseubondesenvolupament.Elsembrionsdeixaranelcòrionque 

elsprotegiadosotresdiesdesprésdelafecundació,idurantlaprimerasetmanapost 

fecundaciónoserànecessarialimentarlos.Passadalasetmana,s’haurand’alimentar 

ambinfusionsdemicroorganismes,ipassatselsnoudiesjaespodranalimentarde 

microorganismesipetitesgambes.Amesuraquevancreixent,s’had’anaraugmentant 

laquantitatd’aliment.Encomplirvintiundies,jaespodranmoureatancsiser 

alimentatsambmenjard’adults. 

 

3.2.4.Elpeixzebracomamodelperestudiarlaregeneraciódelescèllulesciliades 

 

Comelshumans,elpeixzebraésunvertebrat,fetqueestableixunarelaciómés 

properaentreambdós,sentaixísimilarsenalgunsaspectesbiològicscomalgunsgens, 

lafisiologia,l’anatomiaoelsprocessosdelseudesenvolupament.Aquestessimilitudsel 

20

converteixen en un model millor i alternatiu als models d’invertebrats utilitzats 

normalmentcomlaDrosophilaMelanogaster 10 ,quenoobstant,sónapropiatsper 

comparacionsanivelldelabioquímicaoanivellcellular.Sinofospelspatronsde 

desenvolupamentilasevaanatomia,quefanútilelpeixzebraperferestudissobre 

embriologiaisobremutacionsdelsaltresvertebrats,tambéhihainvertebratsmolt 

indicatsperaqueststipusd’estudis.Aquests,però,notenenelmateixgraudesimilitud 

queelpeixzebra.Unaltretipusd’estudiqueesrealitzaambpeixzebraésl’anàlisi 

genètica,podentidentificarelsgensnecessarisperadiferentsprocessosbiològicsa 

travésdemutacions.Ésmoltfàcilproduirpeixostransgènics,introduintnouDNAal 

DNAdelescèllules,ambl’objectiud’analitzarlaregulaciód’unsdeterminatsgensila 

funciód’aquests,operfacilitarl’estudid’undeterminattipusdecèllula. 

Enl’espèciehumana,igualqueenaltresmamífers,ladestrucciódelescèllules 

ciliadesdel’oïdaésirreversible;noesprodueixlasevaregeneració.Encanvi,les 

mateixescèllulesenelspeixos,enausoenaltresvertebrats,esregenerenapartirde 

laproliferaciódelescèllulesdesuportqueestrobenalseuvoltant,que,contràriament 

alesdel’oïdahumanasíquetenenlacapacitatdeformarnovescèllulesciliades.La 

regeneracióesprodueixmitjançantunprocésanomenatproliferació,pelqualuna 

cèlluladesuportoriginaunacèlluladelseumateixtipusiunacèllulaciliada.Amésa 

més,estudisrecentsdemostrenquelescèllulesciliadespodenserregeneradesperun 

altreprocésanomenattransdiferenciació,pelqualunacèlluladesuportesdiferencia 

directamentacèllulaciliada. 

Gràciesalasevatransparència,elpeixzebraenspermetestudiarlaregeneració 

de les cèllules ciliades sense necessitat de tallar teixits. A més, algunes línies 

transgèniques existents incorporen la fluorescència de les cèllules ciliades sense 

necessitatdetenyirles.Finalment,elDanioreriofacilitamoltelsestudisderegeneració 

desprésdeladestruccióinduïdadecèllulesciliadesambototòxics,jaquepodem 

obtenir un gran nombre d’embrions ràpidament i aquests poden absorbir els 

compostosatravésdelapell.Acontinuaciós’expliquenlescaracterístiquesprincipals 

10 Tambéanomenadamoscadelafruita,ésuninsecteques’utilitzamoltperl’experimentaciógenètica, 

jaqueaproximadamentel61%delsgensdelsqualsessapquecodifiquenmalaltiesenl’home,podenser 

identificatsenaquestamosca. 

21

del’audicióidel’equilibrid’aquestspeixosperlamillorcomprensiódelperquèaquests 

estudisderegeneracióesrealitzenambDaniorerio. 

 

3.2.4.1.Audicióiequilibri 

Elspeixos,igualquealtresvertebrats,tenenl’oïdainternaapropdel’encèfal. 

Encaraquenotinguincòclea,elspeixostenenunsàcul,unutricleiunsconductes 

semicirculars,dinsdelsquals,elmovimentdelsotòlitsestimulalescèllulesciliades.A 

diferènciadel’oïdadelsmamífers,ladelspeixosnoestàobertacapal’exteriornité 

unamembranatimpànica.Enelseucas,lesvibracionsdel’aiguacausadesperlesones 

sonores,sónconduïdesatravésdel’esqueletdelcapfinsl’oïdainterna,onesposenen 

movimentelsotòlitsis’estimulenlescèllulesciliades.Labufetanatatòria,queestà 

plenad’aire,tambévibra,ipotcontribuiralatransmissiódelesonessonoresfins 

l’oïda.Amésamés,algunspeixostenenaparelldeWeber,unconjuntd’ossosque 

condueixlesvibracionsdesdelabufetanatatòriafinsl’oïdainterna.Pelquefaalsentit 

del’equilibri,elpeixzebratéunsistemasensorialanomenatlínialateralques’explicaa 

continuació. 

 

3.2.4.1.1Lalínialateral 

Lalínialateralésunsistemasensorialquetenenlamajoriadepeixosid’amfibis 

al llarg dels dos costats del seu cos. Aquest sistema conté uns grups cellulars 

anomenatsneuromasts,queobéestrobensobrelasuperfíciedelcos,obésota 

l’epidermis,iqueestanformatsperungrupdecèllulessensorialsciliadesenvoltades 

percèllulesdesuport.Elscilisd’aquestsmecanoreceptorsestrobendinsunamassa 

gelatinosaanomenadacúpula,iestrobenorientatscapalconductedelalínialateral, 

queconnectaelsneuromasts.Quanl’aiguaentrapelsporusdelapelliflueixatravés 

d’aquest conducte, la cúpula s’inclina i com a conseqüència es despolaritzen les 

cèllulesciliadesiesprodueixenpotencialsd’accióquesóntransmesosatravésdels 

axonsoprolongacionsdelesneuronessensitives,pelnervilateralfinsalcervell. 

Lalínialateralésundelsprincipalssistemessensorialsqueutilitzenelspeixosi 

elsamfibisperdetectarelsmovimentsivibracionsdel’aigua,fetqueelspermet,entre 

d’altrescoses,ladetecciódedepredadors,depossiblepresesid’altrespeixosalseu 

22

voltant.Desdelpuntdevistadel’úsdelpeixzebrapelsestudisd’ototoxicitatide 

regeneraciódelescèllulesciliades,lalínialateralofereixlapossibilitatd’estudiarmés 

fàcilmentaquestsfenòmenssensenecessitatd’estudiarl’oïda,quecontélesmateixes 

cèllules, però en més quantitat i molt més juntes, fet que dificulta molt el seu 

recompte. 

 

ciliades 

SistemasensorialdelínialateralModificatdelareferènciabibliogràfica13. 

 

 

3.2.4.2. Experiments farmacodinàmics sobre la regeneració de les cèllules 

Elsestudisderegeneraciódecèllulesciliadesques’hanrealitzat,hanutilitzat 

mamíferscomelratolíielporcdeGuinea,ocellscomelcolom,amfibis,ipeixoscomel 

Daniorerio.Enunprincipi,elsestudisambpeixzebraerennomésbiològics,iservien 

23

perl’estudidelsòrgans.L’any1981Streisingeretal.(referència10)vandesenvolupar 

elprimerestudidemutagènesienpeixzebra.Aquestgrupd’investigadorsd’Oregon,és 

actualment,unareferènciaenestudisambpeixzebra.Inicialment,lesinvestigacionses 

centravenenmutacionscausantsdedefectesmorfològics,peròelsdarrersestudis 

sobremutagènesiescentrenenlesmutacionsfuncionals.Leslíniestransgèniquesde 

peixzebrafruitdemoltsd’aquestsestudis,estancatalogadesiespodenconsultarales 

pàgines web del Zebrafish Information Network (ZFIN), el National Center for 

BiotechnologyInformation(NCBI)ielEnsemblTraceArchive,basesdedadesútilsa 

l’horadedissenyarunestudi(referència29). 

Al1994Westerfield(referència26)vaestablirlescondicionsdemantenimenti 

decriadelpeixzebraallaboratori,publicantlaGuiaperl’úsdelpeixzebraallaboratori, 

quetotselsinvestigadorssegueixen.Sóntanteslesvirtutsdetreballarambaquestpeix, 

quelesàreesd’estudidelpeixzebrasónnombroses:lafuncióneuronalsensitiva,la 

facultatdecontraure’sdelcorilafreqüènciacardíaca,eltractegastrointestinal,la 

nefrona 11 ,laretinaielcàncer.Enespecial,elpeixzebratémoltd’interèspelsestudis 

farmacològics.Elsestudisfarmacodinàmicssónposteriorsalsdemutagènesiiutilitzen 

líniestransgèniquesespecífiquespercentrarmillorelcampd’estudi. 

Lanecessitatdedesenvoluparmètodesperregenerarlescèllulessensorials 

auditives (cèllules ciliades), d’identificar els compostos que les destrueixen i de 

desenvolupartècniquesotoprotectoresperaplicarenpacientstractatsambfàrmacs 

ototòxics,hapropiciatl’estudidelaregeneraciódelescèllulesciliadesdelpeixzebra 

perpartdediferentsgrupsdecientífics. 

La regeneració de les cèllules ciliades dels neuromasts del peix zebra és 

conegudadesde1990.S’hademostratl’ototoxicitatd’antibiòticsaminoglicòsidscomla 

gentamicina (1995) i la neomicina (2003), d’antineoplàstics com la vinblastina i el 

cisplatí(2005)idemetallscomelcoure(2006),aixícomlacompletaregeneraciódeles 

cèllules ciliades a partir de la diferenciació de les cèllules de suport (1990) i la 

regeneració d’aquestes mitjançant la transdiferenciació (2000). A més a més, s’ha 

demostratl’otoprotecciódavantl’efected’unototòxicentrestipusd’agentsdiferents: 

11 Lesnefronessónunitatsestructuralsifuncionalsdelsronyons,encarregadesderegularlaconcentració 

d’aiguaidesubstànciessolublesenaquesta.Seranlesencarregadesd’excretarelquenoésnecessaripel 

cosenformad’orina. 

24

factors neurotròfics 12 , antioxidants i antiapoptòtics, però no s’ha demostrat que 

aquestscondueixinalaregeneraciódelescèllulesciliades.Tambés’haobservatquela 

regeneraciós’originaalesprimeresfileresdecèllulesdesuportqueenvoltenles 

cèllulesciliadesalsneuromasts(2008). 

Nohihaestudisquedemostrinototoxicitatd’antibiòticsmacròlidsenelpeix 

zebra,peròs’hapublicatalguncasd’ototoxicitatperpartdelaclaritromicinaenl’ésser 

humà(2005)ialgunestudiquedemostraototoxicitatenelporcdeGuineatantambla 

claritromicinacomamblaazitromicina,tambémacròlid(2001).Enprincipi,nos’havia 

observatlaregeneraciódelescèllulesciliadesenmamífers,peròlapublicacióde 

l’estudideregeneraciód’aquestescèllulesenelporcdeGuineal’any2005,vareactivar 

elsestudisenaquestalíniadetreball.Elsestudisderegeneraciódelescèllulesciliades 

hauran d’orientarse cap a la recerca d’una solució (tractaments, implants...) a la 

pèrduadelescèllulesciliadesdel’oïdahumana. 

 

 

3.3.ELCICLECELLULAR 

 

Elciclecellularéslabasepelcreixement,perlarenovaciócellulariperla 

transmissiódecaracterístiqueshereditàriesd’unageneraciódecèllulesaunaaltra.El 

ciclecellularincloudesdel’apariciód’unacèllulapermitosi–procésdedivisió 

cellular,finsqueaquestacèllulaoriginalageneraciósegüentdecèllulespelmateix 

procediment.Lescèllulesdescendentssempretindranelmateixprogramagenèticque 

lesprogenitores,ialhoratindrantoteslamateixainformaciógenètica.Elciclecellular 

constadediferentsfases,queespodendividirendosgransgrups:lainterfaseque 

comprènlafaseG1,lafaseSilafaseG2perordre,ilafaseMquecomprènlamitosiila 

citocinesi(divisiódelcitoplasma).Lamitositambéesdivideixenprofase,metafase, 

anafaseitelofase.Lasuccessiódetotesaquestesfasesqueintegrenelciclecellular, 

estàreguladaperunsenzimsanomenatsquinasesdependentsdelaciclina(cdk’s),que 

tenenlacapacitatd’afegirgrupsfosfataaltresproteïnesperactivarlesodesactivarles. 

Lesquinasesnomésespodranactivarsis’uneixenamblaciclina(subunitatdeles 

12 Molèculesqueregulenelcreixementimantenimentdelesneurones. 

25

quinases)adequada.Noobstant,hihauràalgunescèllulesqueestrobaranenunestat 

denoproliferacióanomenatfaseG0. 

 

FasesdelamitosiModificatdelareferènciabibliogràfica19. 

 

 

LaprimerafasedelciclecellularéslafaseG1(del’anglèsgap1,interval1).És 

unperíodeenelqualnohihasíntesideDNA,peròessintetitzenelsribosomes,elRNA 

detransferència,elRNAmissatgeridiversosenzims.Ésadir,ésunafasedepreparació 

perlareplicaciódelDNA.Amésamés,lamembrananucleardesapareix.Aquestafase 

téunaduraciód’entre6i12hores. 

DurantlafaseS,elDNAdelacèllulaesreplica.Enaquestperíode,esdupliquen 

elscromosomesicadascund’ellss’enganxaalseucromosomareplicatperunpunt 

anomenat centròmer. Els anomenem cromosomes dobles, cadascun dels seus 

componentsésunacromàtide,ilesduessóncromàtidesgermanes.D’aquestamanera, 

lacèllulacontéeldobled’informaciógenèticaqueabans.Decaraalanostrapart 

experimental, és necessari remarcar que poder detectar que una cèllula està en 

26

aquestafasedelciclecellularensindicaqueesproduiràunaproliferació,iquepertant 

s’originaranduesnovescèllules.Aquestafaseduraràentre6i8hores. 

Lafasequemarcaelfinaldelainterfaseielcomençamentdelamitosiéslafase 

G2.Durantaquestafaseessintetitzenlesproteïnesqueformaranlesfibresdelfus 

acromàticilesdel’àster,duesestructuresdevitalimportànciadurantlamitosijaque 

permetransepararelscromosomesdobles.Enaquestperíodecomençatambéuna 

condensaciódelscromosomesquetambéesfaranméscurts,degutalacondensació 

delacromatinaqueestrobaalscromosomesiqueestàformadaperDNA,proteïnes 

histonesid’altresquenosónhistones.Leshistonessónproteïnesdebaixamassa 

molecular que s’han conservat evolutivament en eucariotes i alguns procariotes. 

AquestacondensacióésfaràevidentalafaseM,iésespecialmentimportantdecaraa 

lapartexperimentaldeltreball,jaquenomésesprodueixenlescèllulesqueestanen 

divisió,fetqueensindicaràaquellescèllulesqueestanenproliferació,mentrequeels 

cromosomesquenoestrobencondensatssónelsdelescèllulesquenoesdividiran. 

Normalment,lafaseG2téunaduracióaproximadade3o4hores. 

Lacèllulainicialamitosiambeldobledematerialgenètic.Laprimeraetapade 

lamitosiéslaprofase;períodequecomençaambladuplicaciódelcentrosoma,queés 

unorgànulcellularformatperdoscentríolsquesónunspetitsorgànulsquees 

trobenaparellatsdinsdematerialproteic.Cadacentrosomamigraràaunpoloposatde 

lacèllula.Acontinuació,apareixenunsmicrotúbuls,quesóncilindresllargsformats 

perlaproteïnatubulina,queconstitueixenunfusacromàtic,anomenataixíperla 

formasimilaralsfusosdefustaonescargolavaabanselfil.Almateixtemps,unsaltres 

microtúbulssurtenradialmentdelscentrosomesperformarelsàsters,unsembolcalls 

defilalvoltantdecadacentrosoma.Acontinuació,elscromosomesescondenseniles 

fibresdelfusacromàtics’allarguenfinsqueesvanunintaunapartdelscentròmers 

anomenadacinetocor.Cadacentròmertédoscinetocors,ilesfibresqueprovenendels 

dospolsdiferentsdelacèllula,s’uneixenalcinetocorquequedaencarataelles. 

Durantlametafase,lescromàtidesgermanes,ésadir,elscromosomesdobles, 

migrencapalcentredelacèllulaformantunaplacametafàsica. 

La següent fase de la mitosi és l’anafase, i s’inicia amb la separació del 

centròmerqueuneixlescromàtidesgermanes.Uncopseparades,cadacromàtidees 

27

desplaçacapapolsoposatsdelacèllulaatretsperlesfibresdelfusacromàtic,quevan 

estirantfinsqueellesmateixesesparteixenperlameitat. 

Latelofaseésladarrerafasedelamitosi,icomençaquanelscromosomesja 

hanarribatalsseusrespectiuspols.Acadapolelscromosomess’agrupenitornenano 

estar condensats, i les fibres del fus desapareixen. Finalment apareixen dos 

membranes nuclears, una per a cada grup de cromosomes que es troben a pols 

oposats,formantdosnuclis,unperacadacèllulaqueesformarà. 

Desprésdelamitosijatrobemlafasefinaldelciclecellular:lacitocinesi.Ala 

superfíciedelacèllulacomençaaaparèixerunsolcdesegmentació,queessituaa 

l’equadoroneraelcentredelfusacromàtic.Aquestsolcesvafentmésprofundi 

oprimeixlamembranaplasmàtica,finsqueelscostatsenfonsatsdelamembranaes 

trobeniesfusionen,completantladivisiócellular.S’hauranformatduescèllules 

novesquetindranexactamentlamateixainformaciógenèticaquelasevaprogenitora. 

Lamitosiilacitocinesisónmoltbreus,jaqueescalculaqueocupennomésel5%detot 

elciclecellular. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

28

4.PARTEXPERIMENTAL 

 

4.1.INTRODUCCIÓALAPARTEXPERIMENTAL 

 

Afinalsdel2009vàremconcertarunaentrevistaamblaDra.BertaAlsinaper 

rebreorientaciópelquefeiaaltemadeltreball.Apartird’aquellmoment,partintd’una 

delessevespropostes,vamdecidireltemadefinitiu,vamformularelsobjectiusivam 

elaborareldissenyexperimentalielcalendariaseguir.Comqueeltemaescollitiel 

dissenyexperimentalrequerienmaterialmoltespecífic,totalapartexperimentalesva 

haver de dur a terme al Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona (PRBB) sota la 

supervisiódelaDra.BertaAlsina,quivaferpossibleelpoderdisposardelslaboratorisi 

delsestrisdelPRBBsenseproblemes. 

Lapartexperimentaldeltreballesvarealitzarelsmesosdejunyidejuliolde 

l’estiudel2010,jaqueesvannecessitarvàriessetmanesseguidesimolteshoresdiàries 

seguidesperadurlaaterme,fentimpossiblelasevarealitzaciódurantelcursescolar. 

Primeramentesvancreuarmasclesifemellesdepeixzebra(Daniorerio)dela 

líniatransgènicabrn3:GFPperobtenirelsembrionsambelsqualsesvanduraterme 

totselsexperiments.Aquestalíniatransgènicatéincorporatungenquecodificauna 

proteïnadefluorescènciaverda(GFPoGreenFluorescentProtein)alaregiódelsgens 

quecontrolalescèllulesciliades,iensseràmoltútilpernohaverdetenyiraquestes 

cèllulesambuntintespecíficanomenatDASPEI 13 . 

Esvaanarassegurantelbonmantenimentd’aquestsembrionsdiarerediafins 

elcinquèdiapostfecundació,quantotsvanserexposatspergrupsde20o21,durant 

24hadiferentsconcentracionsdevàriessubstàncies(ototòxiquesiotoprotectores). 

Elsembrionsdecincdiesjaestanbenformatsinosóntantsensiblescomelsembrions 

demenystemps,tenenungraudetransparènciamàximipodenabsorbirmoltbéles 

substànciesatravésdelasevapell.Totesaquestescondicionselsfeienidonisper 

començarelstractamentsambantibiòtics(ototòxics)ivitaminaC(otoprotector). 

Passadesles24hdesdel’exposició,vamesbandirelsembrionsivamesperar 

24hmésperobservarl’efecteototòxic.Aldiasegüent,uncoppassadesles24h,vam 

13 2(4((dimethylamino)styryl)Nethylpyridiniumiodide) 

29

comptarelnombred’embrionssuperviventsalstractamentsienvamfixar 14 alguns 

per fer el recompte de cèllules ciliades supervivents a l’exposició a diferents 

substànciesambl’objectiudepoderdeterminarelgraud’ototoxicitatdediferents 

antibiòticsiobservarl’efectedel’otoprotector.Aquestmateixdiaesvantenyirles 

cèllules en fase S del cicle cellular amb BrdU 15 per poder dur a terme la 

immunohistoquímical’endemà,perestudiarlaregeneraciódelescèllulesciliades.La 

immunohistoquímicaésunatècnicabasadaenl’úsd’anticossosespecíficsperdetectari 

fervisiblesunsantígens 16 concrets.CaldestacarquelatincióambBrdUésnomésd’una 

horaiquepertant,lescèllulesmarcadesseranlesquedurantaquesttempsestiguin 

enlafaseS.Vamesperarfinsl’endemàperdonarunmargeperaques’iniciésla 

regeneració. 

Abansdeduratermelaimmunohistoquímica,quevaocupardosdies,vamfixar 

totselsembrionsperpararlaregeneraciódelescèllulesciliadesenelmateixmoment. 

Perestudiarelsmecanismesderegeneració,vamaplicardiferentsanticossosalllargde 

totelprocés,dividintelsembrionsendosgrupsdiferents:aquellsenelsqualsvolíem 

marcarlescèllulesenfaseM(marcantleshistones3(H3)presentsdurantaquesta 

fase,coms’explicaalapartteòrica),iaquellsenelsqualsensinteressavamarcarles 

cèllulesenfaseS(reconeixenteltintespecíficBrdUaplicateldiaanterior).Uncop 

acabada,ensvapermetrecomençarelrecomptefinaldecèllulesciliadesidecèllules 

de suport en fase S per estudiar la regeneració i relacionarla amb el nivell de 

destruccióperototoxicitat.LescèllulesenfaseM,però,novantenyirsebédurantel 

procedimentiensvamhaverdelimitaraestudiarlaregeneracióapartirdelescèllules 

de suport en fase S i les cèllules ciliades regenerades mitjançant la proliferació 

d’aquestescèllulesdesuport. 

 

 

 

14 Aplicaciód’unfixador,queésunasubstànciaquedesnaturalitzaiinsolubilitzalesproteïnes,ibloqueja 

l’apoptosi.Tambéevitaelcreixementdebactèries.Aplicarunfixadorserveixpermatarl’embrióiqueles 

sevescèllulesquedinparadesal’instant,sensedeteriorarsedesprésdelamortdel’embrió. 

15 5bromo2deoxyuridine.Ésunnucleòtidhalogenat(Br)sintètic,anàlegdelatimidina.L’analogiaamb 

latimidinapermetsubstituirlaenlafaseSdelciclecellular,queésquanaquestaestrobapresent. 

16 Proteïnaqueidentificauntipusdecèllula. 

30

4.2.MATERIALSIMÈTODES 

 

Notapreliminar:Hemconsideratdeltotnecessaridetallartoteslestècniquesitotsels 

procedimentsseguits,diaadia,perlacomprensiód’aquestapartexperimental,encara 

quesiguind’unallargàriaconsiderable. 

 

Vamseguirelsegüentcalendari: 

 

Dia28dejunydel2010 

Ales17.00hbaixemalsestabularisdelPRBB,onpreparemtrestancsdepostes 

ambtresmasclesitresfemellesdepeixzebradelalíniatransgènicabrn3:GFPpera 

cadascun,ielsdeixemdescansarduranttotalanitperfacilitarlafecundaciól’endemà. 

 

Materialperlapreparaciódelstancsdepostes 

- Peixoszebraadults(9masclesi9femelles)delalíniatransgènicautilitzadaque 

estrobenalstancsoaquarisdel’estabularionestana28,5ºC,iunapalaamb 

reixaperagafarlos. 

- 3tancsdeplàsticilessevestapes,3separadorsdeplàstictransparentqueens 

permetransepararmasclesifemellesd’unmateixtancduranttotalanitper 

estimularlos,i3tancsunamicaméspetitsiamblabaseambforatsllargs,que 

s’inserirandinselstancsiquepermetranuncoppostoselsembrions,que 

aquestsespuguinseparardelsadults–quenopassaranpelsforatsique 

puguinserretornatsdelstancsdepostesalsseusaquarisinicials. 

- ElmedioSystemwaterqueposaremdinselstancsdepostes,iunatelaper 

 

taparideixaralesfosqueselstancsdepostesperdeixardescansarelsadults 

perlafecundació. 

Metodologiaperprepararelstancsdepostes 

Primerament,omplimelstrestancsdeplàsticambelmediextretdelcircuitque 

connectatotselstancsdel’estabulari,hiinserimelstrestancsambforatsiafegimels 

separadorsdeplàstictransparents.Totseguit,agafemtresfemellesd’unmateixaquari 

31

inicialamblapalaambreixa,ilesposemaunabandadelseparador.Acontinuació, 

agafem també els mascles i els posem a l’altra banda del separador. Aquest 

procedimentelseguimperalstrestancsdepostes,peròobtenimelspeixosadultsde 

tancsinicialsdiferentspersiundelstancscontéadultsmalaltsonodeltotsansque 

puguinpondreousenvellits.Finalmenttapemelstancsdepostesielsdeixemales 

fosquessotaunateladuranttotalanit. 

 

 

Fotografiad’undelstancsdepostesrealitzadaambunacàmerafotogràficaalsestabularisdel 

PRBB.Hipodemdistingirlabaseambforatsllargsdeltancdeplàsticqueenspermetràseparar 

elsadultsdelsous,elseparadortransparent,ifinalment,masclesifemellesabandaibandadel 

separador. 

 

 


Ales11.00htraiemelsseparadorsdelstrestancsdepostesiesperemmitja 

horaperaqueescreuinmasclesifemelles,iponguinelsous.Passataquesttemps, 

observemquejahihaprouousalfonsdelstancsengeneral,iprocedimatornarels 

adultsdepeixzebraalsseustancsinicialsaprofitantqueelspodemsepararfàcilment 

delsousgràciesalstancsambforats.Acontinuació,traspassemelsembrionsaplaques 

dePetriielsnetegemperdeixarlosdinslaincubadorafinsl’endemà.Perlatarda 

preparemtrestancsdepostesmés,seguintelmateixprocedimentquepelsanteriors, 

32

perdisposardemésembrionsperrealitzarelsmateixosexperimentsambaquesta 

segonaposta.Perfertotl’esmentat,utilitzemelsegüentmaterialiseguimlasegüent 

metodologia: 

 

Materialpeltraspàsdelsembrionsalesplaques 

- 2plaquesdePetride80mmdediàmetre,amblessevestapes,iidentificades 

ambladatadefertilitzaciódelsembrionsd’aquestaprimeratanda.Només 

necessitaremduesplaquesjaqueundelstancsdepostesnoensserviràentenir 

moltpocsembrions. 

- 1palaambreixamoltfinaperonnopassinelsembrionsqueencaranoarriben 

 

als2mmdellargadaiSystemwater.. 

Metodologiapertraspassarelsembrionsaplaques 

Uncopemtretelsadultsambelstancsforadatsielshemretornatalsaquaris 

inicials,posemSystemwaterdinslesplaquesperposarhielsembrions.Acontinuació, 

buidemelcontingutd’undelstancsdepostessobrelapalaambcolador,iaboquemels 

ousques’hanquedatalcoladormentrequeelmedibrutqueestrobavaaltancha 

passatatravésd’elldinsd’unadelesduesplaquesdePetriquehempreparat.Ambel 

tancdepostesrestant,femelmateixperòposemelsembrionsdinsl’altraplaca. 

Finalment,posemlestapessobrelesplaquesitransportemelsembrionsdel’estabulari 

allaboratoriperlasevaneteja. 

 

 

Materialpernetejarelsembrions 

 

 

- LesduesplaquesdePetriqueportemdesdelsestabularisiduesdenoves, 

tambébenidentificades. 

- 1lupadegranaugmentperpodersepararcorrectamentelsembrionsquesón 

moltpetitsdelabrutícia.També,Systemwater,blaudemetilè(queésun 

antifúngic)i1ampolladevidregraduadade500ml. 

33

Metodologiapernetejarelsembrions 

Primerament,ompliml’ampolladevidregraduadadeSystemwaterihiafegim 

l’antifúngicfinsqueladissolucióagafauncolorblauclar.Acontinuació,posemunade 

lesplaquesambembrionssotalalupaianemxuclantelsembrionsqueprosperaran 

intentantagafarelmínimdebrutíciapossibleambells,ielspassemaunadeles 

plaquesdePetribuides.Femelmateixamblasegonaplacad’embrions,peròelsanem 

posantal’altraplacabuida.Peracabar,posemlesduesplaquesambelsembrionsdins 

la incubadora on estaran a 28,5ºC, que és la temperatura òptima pel seu 

desenvolupament. 

 

Nota:semprequeacabemdemanipular(netejar,exposarasubstàncies...)elsembrions 

mentrenoelsfixem,elsdeixaremdinslaincubadora. 

 

Imatgesdelsembrionsdurantlesprimeresdivisionsdelblastodisc: 

 

 

Fotografies realitzades al PRBB amb una lupa de gran augment a 50x. Són una sèrie de 

fotografiesfetescada15minaproximadamentpermostrarlaràpidasegmentaciódiscoïdal 

meroblàsticadel’embriódepeixzebra.A)Encaranos’haproduïtcapdivisiódelblastodisc.B) 

Primeradivisióenduescèllules.C)Divisióenquatrecèllules. 

 

 


Seguintelmateixprocedimentquepeldiaanterior,esprodueixlafecundaciói 

obtenimelsembrionsdelasegonatandadelsqualsenfemlaneteja.Totseguit, 

34

preparemlesdissolucionsodilucionsstockdelsantibiòticstriatscomaototòxicsidela 

vitaminaCtriadacomaotoprotector,alsqualsseranexposatselsembrionsdela 

primeratandaquatrediesméstard.Elsdelasegonatandas’hiexposaranundia 

desprésqueaquestsprimers. 

 

Observacionssobreelsembrionsquejatenen24h 

Elsembrionsjatenenunaspectemoltsemblantald’unpeix,ipodemveureque 

segueixenelritmedecreixementqueelspertoca,jaqueelquepodemobservar 

coincideixamballòexplicatal’apartatdedesenvolupamentembrionaridelapart 

teòrica.Unadelesestructuresques’estàformantiqueesdistingeixclaramentésl’ull. 

Amés,elsembrionsjamouenlacua,fetqueensdificultafotografiarlos. 

 

 

FotografiarealitzadaalPRBBambunalupadegranaugmenta50x.Ésunaimatged’unembrió 

de24h,enlaqualpodemapreciarelprincipidelaformaciódel’ullitambéelmovimentdela 

cua. 

 

 

Criterideselecciódesubstànciesototòxiquesiotoprotectores 

Lessubstànciesalesqualselsembrionsseranexposatsunsdiesméstard,les 

vamtriarenfereldissenyexperimental.Aquestessubstànciessón:lagentamicina,la 

azitromicina,laclaritromicinailavitaminaC. 

35

Lagentamicinaésunantibiòticquepertanyalgrupdelsaminoglicòsids,sobre 

elsqualsexisteixennombrososestudisquedemostreniafirmenambcertesaelseu 

efecteototòxic.Elsembrionsexposatsaaquestantibiòticdegranefecteototòxicens 

serviranperassegurarl’observaciódeladestrucciódecèllulesciliadesicomapuntde 

referènciaperdeterminarsielsaltresantibiòticscausenunefectemajoromenorsobre 

aquestescèllules. 

L’azitromicinailaclaritromicina,sóndosantibiòticsdelgrupdelsmacròlids, 

sobre els quals no existeixen gaires estudis sobre ototoxicitat, i que per tant ens 

donaranlapossibilitatdeprovar,gairebésensereferènciesanteriors,elsseuefecte 

ototòxic. 

Finalment,vamescollirlavitaminaCoàcidascòrbic,dereconegutefecte 

antioxidant, ja que s’ha demostrat que els agents antioxidants són otoprotectors. 

Utilitzar totes aquestes substàncies, ens servirà per observar l’efecte que tenen 

diferentscompostossobrelescèllulesciliadesdelpeixzebraicompararloambl’efecte 

d’aquestessubstànciesquans’hiafegeixunotoprotector.Méstard,ensserviràper 

compararlarespostadelescèllulesdesuportsegonselgraudedestrucciódecèllules 

ciliadesproduïdaperdiferentsototòxics. 

 

Grupsdesubstànciesalesqualsseranexposatselsembrions 

Enfereldissenyexperimental,esdeterminenelsdiferentsgrupsdesubstànciesales 

qualsexposaremelsembrions.Elsdividiremen16grups,quedistribuiremendues 

plaquesde12pous. 

 

Alaprimeraplacadepouss’hifaranelssegüentsgrups: 

2grupscontrol:ensserviranperferelrecomptedecèllulesciliadesenelscasos 

normalsenelsqualsnos’aplicacapototòxic. 

Gentamicina5M:concentracióquedeterminemapartird’altresestudisrealitzats 

ambneomicina. 

Gentamicina10M:ensserveixperassegurarunefecteototòxicenelcasquela 

concentracióanteriornosiguisuficient. 

36

Azitromicina5M:perpodercompararbéambl’efecteproduïtperlamateixa 

concentracióengentamicina. 

Azitromicina10M:compelcasanterior. 

Claritromicina5M:perlesmateixesraonsqueperl’azitromicina. 

Claritromicina10M:compelcasanterior. 

 

Alasegonaplaca,elspousqueesfaransón: 

2grupscontrol 

Gentamicina 5 M i vitamina C 200 M (quantitat basada en estudis científics 

realitzats amb vitamina E com a otoprotector): ens servirà per observar l’efecte 

otoprotectordelavitaminaCencomparaciópelpoudegentamicina5M. 

Gentamicina 5 M i de vitamina C 400 M: ens servirà per comparar l’efecte 

otoprotectordelavitaminaCsegonslaconcentració,fixantnosenelcasanterior. 

Gentamicina10MivitaminaC200M:ensserviràpercompararambelpoude 

gentamicina5MivitaminaC200M. 

Gentamicina10MivitaminaC400M:percompararambelpoudegentamicina5 

MivitaminaC400M. 

Claritromicina10MivitaminaC200M:percompararambelscasosanteriorde 

gentamicina10MamblesduesconcentracionsdiferentsdevitaminaC. 

Claritromicina10MivitaminaC400M:comenelcasanterior. 

 

Objectiudelacreaciód’aquestsgrups 

La primera placa ens servirà per observar l’efecte ototòxic de diferents 

substàncies,iméstardperestudiarlaregeneraciódelescèllulesciliadesenrelacióal 

nivelldedestrucciód’aquestescèllulesenelpeixzebraialadiferenciaciódeles 

cèllulesdesuport. 

Lasegonaensserviràperestablirunarelacióentreconcentracionsd’ototòxic, 

d’otoprotectoripercomparar,igualqueperlaprimeraplaca,elsefectesototòxicsde 

diferents substàncies. A la segona placa, els pous són principalmentdedicats a la 

gentamicinajaquel’efecteototòxicestàgarantit,is’haafegitlaclaritromicina10M 

perpodercompararl’efecteotoprotectordelavitaminaCenelsdosantibiòtics. 

37

Tenintencomptelesconcentracionsquevolemposaralspous,icalculantque 

percadapouhiposarem2,5mldelíquid,lesdissolucionsstockqueespreparensónles 

següents:unadissoluciódegentamicina500M,unadissoluciódeclaritromicina25 

Mjaquea500Mnoesdissolbéelmedicament,ielmateixperl’azitromicinaqueal 

finallafemde250MiunadissoluciódevitaminaC20mM. 

 

Preparemlesdissolucionsambelmaterialimètodesqueestrobenacontinuació: 

 

Materialperprepararlesdissolucionsstock 

- Azitromicina en pols, claritromicina en pols, vitamina C en comprimits 

efervescents i gentamicina líquida (vegi’s annex on s’especifiquen els noms 

comercials,composicions,etc). 

- 1falcon 17 perladissoluciódeclaritromicina,i3eppendorfs 18 de4mlde 

capacitat per la gentamicina, la claritromicina i l’azitromicina. Tots ells 

s’identifiquencorrectamentperevitarconfusions. 

- 1bàsculadegranprecisió,1agitador,Systemwater,1pipetaGilson 19 d’1mli 

 

elsseuscorresponentsbroquets,1culleraipaperd’alumini. 

Metodologiaperlapreparaciódelesdissolucionsstock 

(vegi’sannexpelscàlculsdequantitats) 

Per preparar la dissolució d’azitromicina, posemel paper de platasobre la 

bàsculaiiniciemaquestadesdezero.Amblacullera,pesemelmedicamentenpolsfins 

arribar als 3,8 mg (0,1 mg més del que s’hauria de posar, que és la quantitat 

aproximadaquequedaatrapadaalpaperd’alumini),iutilitzantelpaperd’alumini 

d’embut,poseml’azitromicinadinsl’eppendorfihiafegim2mldeSystemwater. 

Finalmenthoposemaagitar. 

17 Tubsdeplàsticgraduats,ambtapa,utilitzatsperpreparardissolucions.Elsutilitzatspernosaltreseren 

de50mldecapacitat. 

18 

Petitstubsdeplàsticdebasecònicaambtapa,generalmentdecapacitat1,5ml.Moltutilitzatsquan 

s’hadeferservirlamicrocentrifugadora. 

19 

Pipetesdegranprecisióidisponiblesambcapacitatsmoltvariades. 

38

PerprepararladissoluciódevitaminaCseguimelmateixprocedimentqueper 

l’anteriorperòposem3,6mgdevitaminaC(comptemdenouamb0,1mgdemargeja 

quenecessitemnomés3,5mg),iafegim1mldeSystemwater. 

Perprepararladissoluciódeclaritromicinapesem7,4mgdelamateixamanera 

quepelsanteriors,ielsposemdinselfalconienrasemambSystemwaterfinsels40ml. 

Finalment, preparem la dilució stock de gentamicina posant 0,06 ml de 

gentamicinalíquidadinsd’uneppendorfambunapipetaGilsoniutilitzantelmateix 

estri,hiafegim0,94mldeSystemwater.Desprésd’agitartoteslesdissolucions,les 

guardemalanevera(4ºC)finslasevautilització. 

 

FotografiafetaallaboratoridelPRBBambunacàmerafotogràfica.Hipodemveure 

duespipetesdeprecisióGilsondecapacitats20200l(esquerra)i1001000l(dreta), 

ambelsseuscorresponentsbroquets. 

 

 

Dia2dejulioldel2010 

Netegemelsembrionsdelaprimerapostacomhovamferanteriorment,però 

quananemanetejarlasegonapostaveiemquetotselsembrionshanmort. 

 

Problema: La pèrdua d’aquests 300350 embrions de la segona posta – com per 

disponibilitatdetempsnoespotprepararunaaltrapostasuposaqueesdisposidela 

meitatdelsembrionsprevistosperduratermetotselsexperiments.Aquestamortde 

39

lasegonaposta(queestavadisposadaenduesplaquesdiferentsperòquealcontrari 

que per la primera posta, totes les femelles provenien del mateix tanc), es deu 

seguramentaquelesfemellesdelstancsvanadquirirunamalaltiadegutalapresència 

d’algunfongaltancinicialicomaconseqüència,elsembrionsestavenmalalts.També 

podriaserdegutal’apariciód’algunfong,queennohaverestatnetejateldiadel 

naixement dels embrions, hagi produït la seva mort. No obstant, aquesta última 

explicacióéspocprobablejaquevanserbennetejatseldiaabansdelnaixement,ies 

potobservarquelesplaquesnosemblengairebrutescomperproduirlamortdels 

embrions.Tambéésnecessariafegirqueelmedienelqualestrobenelsembrions 

conté un antifúngic, així doncs, és més probable que el problema provingui dels 

progenitors. 

Davantd’aquestimprevist,adaptemelsexperimentsalnombred’embrionsde 

quèdisposemqueésaproximadament320,lameitatdelaquantitatprevista. 

 

Observacionssobreelsembrionsdelaprimeraposta: 

Aquestsembrionsjatenen72h.Enlasevanetejaveiemqueestanforadel 

còrion,iquesónmoltpocselsquenohanprosperat.Eliminarempertanttotselsque 

estanmorts,labrutíciaielscòrionsbuits.Elsquehanprosperatjamesurenentre3mm 

i4mmdellargadainomésd’1mmd’amplada,tenenjabenformadal’oïda,elsulls,la 

cuaimoltesaltresestructures,ilagranmajoriajaneden. 

 

 


Exposemelsembrionsalesdiferentssubstàncies,pergrupsde20percadapou 

d’unadelesplaqueside21pelsdel’altra. 

 

Materialperexposarelsembrionsaototòxicsiotoprotectors 

- 2plaquesde12pousamblessevestapes,iambtotselspousidentificatssegons 

lessubstànciesquehiposarem. 

- 1pipetaGilsond’1mliunade0,2ml,ambelsseusbroquetscorresponents, 

queaniremcanviantpercadadissoluciódiferentqueagafem,i1pipetaPasteur. 

40

- Les2plaquesdePetrionsónelsembrions,lesdissolucionsstockdelsantibiòtics 

ilavitaminaC,il’ampollaambSystemwater. 

Metodologiaperexposarelsembrionsaototòxicsiotoprotectors 

Enprimerlloc,abansdeposarelsembrionsdinselspous,elspreparemambles 

seves substàncies segons els grups establerts anteriorment. Per cada pou anirem 

utilitzantbroquetsdiferentsperlespipetesGilsonpernobarrejarsubstàncies.Atots 

elspous,tantdelaprimeracomdelasegonaplaca,hiposem0,05mlmenysdemedi, 

tenintencomptequequans’afegeixinelsembrionsaniranacompanyatsd’unamicade 

Systemwaterdelesplaquesonestrobaven. 

 

Primeraplaca:posemelsantibiòticssensecombinarambvitaminaC,ianemdiluintles 

dissolucionsstockenelspousperobtenirlesconcentracionsadequadesen2,5mlde 

líquid. 

Als2pousdecontrolposemunaquantitatdeSystemwateraproximadade2,45ml 

amblapipetaPasteur.Enaquestcas,comquetotésSystemwater,noésnecessari 

calcularquantitats. 

Alpoudegentamicina5Mnecessitemdiluir100vegadesl’stockdegentamicina500 

M,posant0,025mldeladissolucióstocki2,425mldeSystemwater.Alpoude 

gentamicina10Mdiluïm50vegadesl’stock,posant0,05mldeladissolucióstocki2,4 

mldeSystemwater. 

Alpoud’azitromicina5Mnecessitemdiluir50vegadesl’stockd’azitromicina250 

M,iposem0,05mldel’stocki2,4mldeSystemwater.Alpoud’azitromicina10M 

necessitemdiluirl’stock25vegadesiposem0,1mld’aquesti2,35mLdeSystemwater. 

Alpoudeclaritromicina5Mdiluïm50vegadesl’stockdeclaritromicina25M, 

posant0,5mld’aquestiafegint1,95mldeSystemwater.Alpoudeclaritromicina10 

Mdiluïm25vegadesl’stock,posant1mld’aquesti1,45mldeSystemwater. 

 

Segonaplaca:combinemamblavitaminaCsegonselscàlculsfets. 

Als2pousdecontrolposemunaquantitataproximadade2,45mldeSystemwater 

amblapipetaPasteur. 

41

Alpoudegentamicina5MivitaminaC200Mhiposem0,025mldel’stockde 

gentamicina,0,025mldel’stockdevitaminaCi2,4mldeSystemwater.Alpoude 

gentamicina5MivitaminaC400Mhiposem0,025mldel’stockdegentamicina, 

0,05mldel’stockdevitaminaCi2,375mldeSystemwater. 

Alpoudegentamicina10MivitaminaC200Mhiposem0,05mlstockde 

gentamicina,0,025mldel’stockdevitaminaCi2,375mldeSystemwater.Alpoude 

gentamicina10MivitaminaC400Mhiposem0,05mldel’stockdegentamicina, 


Alpoudeclaritromicina10MivitaminaC200Mhiposem1mldel’stockde 

claritromicina,0,05mldel’stockdevitaminaCi1,425mldeSystemwater.Alpoude 

claritromicina10MivitaminaC400Mhiposem1mldel’stockdeclaritromicina, 


 

Finalment,uncoppreparatstotselspous,anemagafantelmàximd’embrions 

possible(procéslenttenintencomptequeelsembrionsnedenràpidament)ambuna 

pipetaPasteur,fentlosbaixarfinslapuntadelapipetaPasteurperintentarposarel 

mínimdeSystemwaterdinselspous.Posem21embrionspercadapoudelaplaca 

d’ototòxics(laprimera)i20percadapoudelaplacadecombinacionsambvitaminaC 

(lasegona).Uncophemacabat,deixemlesduesplaquesdepousdinslaincubadorai 

esperemfinsl’endemà. 

Observacions 

 

Dinsdelspousquecontenenclaritromicina,tantdelaprimeraplacacomdela 

segona,veiemquelaclaritromicinanos’hadissoltbéiqueunapartesdipositaalfons 

dels pous. Al pou de claritromicina 10 M amb vitamina C 200 M, i al pou de 

claritromicina5M,laquantitatdeclaritromicinaqueesdipositaalfonsésmolt 

superior,especialmentenelprimer.Seràunaobservacióatenirmoltencomptea 

l’horad’analitzarelsresultats. 

 

42

FotografiafetaallaboratoridelPRBBambunacàmerafotogràfica.Hipodemveurel’ampolla 

devidreambSystemwateriantifúngicblau,unapipetadeprecisióGilson,unadelesplaques 

dePetriambembrionsilesduesplaquesde12pous. 

 

 


Esbandim els embrions un cop han estat 24 h exposats a ototòxics i a 

otoprotectors,estornenadeixaralaincubadorajaquehemdedonarundiademarge 

per observar bé la destrucció de cèllules ciliades abans que comenci la seva 

regeneració. 

 

Materialperesbandirelsembrions 

- MoltespipetesPasteur,jaquelesaniremcanviantpercadapou,ibroquets 

grocs de pipetes Gilson que posarem a la punta de les Pasteur, que ens 

permetranagafarmillorelSystemwaterbrutquehaquedatalesbandesdels 

pous. 

- 1placadePetrirodonaonaniremposantSystemwaternoupercadapouque 

esnetegiiondeixaremnedarelsembrionsmentrenetegemelseupou,ipaper 

higiènic. 

- Les2plaquesde12pousontenimelsembrions,il’ampollagraduadaamb 

Systemwateriantifúngic. 

43

Metodologiaperesbandirelsembrions 

PrimeramentposemSystemwaternetdinslaplacadePetrirodonaiutilitzemla 

sevatapaperanarposantelcontingutallençardelspous.Pelprimerpouutilitzemuna 

pipetaPasteurperagafarelsembrions,ielsposemalaplacarodonaambSystemwater 

net per a que s’esbandeixin, intentant posar el mínim de líquid del pou amb els 

embrions.NetegemelpouagafanttotelseucontingutambunapipetaPasteurambun 

broquetpernetejarbétotselsracons.Acontinuació,ambunapipetaPasteurdiferent 

agafemmedidel’ampollagraduada,elposemdinsdelpouiremovembéperassegurar 

quenohiquedigensd’ototòxic.Finalmentbuidemelpoudenouihiposemmedinoui 

elsembrionsquenedavenalaplaca.Aquestprocedimentesvarepetintpercadapoui 

anemcanviantelSystemwaterdelaplacaonnedenelsembrionsperesbandirsei 

toteslespipetesPasteurques’utilitzen.Elpaperhigiènicésnecessaripernetejarels 

pousdeclaritromicinajaqueennoestarbendissoltahemd’assegurarnosqueno 

quedienganxadaalfonsdelpou.Pelspousdecontrolsimplementtraiemunabonapart 

delSystemwaterdedinsienposemdenou.Uncopacabemamblesduesplaques,les 

deixemdinslaincubadora. 

 

 


Fem el recompte d’embrions morts en el tractament amb ototòxics (vegi’s 

Figura 1 i Figura 2 a l’apartat d’anàlisi i discussió dels resultats), i a continuació 

determinemquinsembrionsesnecessitaranperduratermelaimmunohistoquímicai 

tenyirlescèllulesenfaseSiMdelciclecellular,iaquellsembrionsquenomésserviran 

pelrecomptedecèllulesciliadesunsdiesméstard.Aquestsúltimssónfixatsaquest 

mateix dia, abans que comenci la regeneració. Els altres els preparem per la 

immunohistoquímica,fentlatincióambBrdU.Perferlaimmunohistoquímicatenyim 

lescèllulesenfaseSambBrdUdecolorvermell(hihaméscolorsperòaquestésideal 

jaquelescèllulesciliadesestantenyidesd’uncolorverdgroguenc),abansquecomenci 

laregeneració.Lescèllulesdesuportque esdiferenciaranacèllulesciliadeses 

trobaranenfaseS. 

 

44

Fotografiad’unembriódepeixzebrade6diesidelgrupcontrol,realitzadaambunalupade 

granaugmenta32x.Jatélesestructuresiòrgansmésimportantsformatsipodemapreciarel 

seualtnivelldetransparència,perexemple,jaquel’ulldelcostatquenoenfoquemesveuper 

darreral’ullqueveiemdirectament.Tambépodemapreciarl’oïdadecolornegre,iunamicaper 

sotaseu,decolormarrómoltclar,estrobaelcor. 

 

 

Criterisseguitsendividirelsembrionsengrupssegonselsrecomptesqueesvolenferi 

lamostraquenecessitem 

Comquel’efecteototòxicsobrelescèllulesciliadesésmoltsimilarencada 

exemplardepeixzebra,ielnombred’embrionséslimitat,elrecomptedecèllules 

ciliadesperlaprimeraplaca(nomésd’ototòxics),esfaràperunamostrade5embrions 

quejaésprourepresentativa.Noobstant,s’agafaunembriómés(6entotal)persiun 

delsembrionsestudiatshaperduteltransgènic(encasosmoltpuntuals).Enferel 

recompteestriaranels5exemplarsal’atzar,inomésenelcasquetrobemqueun 

d’ellshaperduteltransgènic,s’agafaràelsisè.Perlasegonaplaca,comquenomésla 

necessitemperlapartd’ototoxicitatid’otoprotecciódeltreball,enprincipiespodrà 

duratermeelrecompteper15exemplarsdecadapou,peròcomesveuràmés 

endavant,enstrobaremambunproblemaqueensobligaràaferlosobre5exemplars 

percadapou.Aixòensfacilitaràlacomparacióamblaprimeraplaca.Perfacilitarels 

recomptesqueesduranatermeelsdiesvinents,posemtotselsembrionsdelsquals 

comptaremlescèllulesciliadesenunaplacade24pous,totsbenidentificats,iamb 

medinouacadapou.Acontinuacióelsfixaremielsguardaremalanevera(4ºC),tapats 

45

ambpaperd’aluminifinsqueesprocedeixialrecompte,perevitarquelesseves 

cèllulesciliadesperdinlafluorescència. 

 

Materialperfixarelsembrions 

- PFA4%(unfixador),guantsiunacampanaperlasevamanipulaciójaqueés 

tòxic. 

- Lesplaquesdepousonestanelsembrionsqueesfixaran. 

- 2pipetesPasteuriunbroquetdepipetaGilson. 

- 1novaplacadepousonhiposaremSystemwaterdelesplaquesdepous. 

 

Metodologiaperfixarelsembrions 

Amblesprecaucionsnecessàries,agafemlesplaquesdepousambembrionsper 

fixarilesposemdinslacampana.Pouperpouseguimelmateixprocediment,que 

consisteixentreureelmàximdeSystemwaterpossibleutilitzantlapipetaPasteuramb 

elbroquet,peròsensedeixarelsembrionssensegensdelíquid,iacontinuació,amb 

unaaltrapipetaPasteurhiposemelPFA4%.Uncopfixatsesdeixendinslaneveraa 

4ºC. 

 

 

MaterialperlatincióambBrdU 

Per la preparació de la dissolució de 10 mM que aplicarem, necessitem la 

dissolucióstockdeBrdUa10mg/mlquetenimenuneppendorf,iSystemwater. 

1pipetaGilsond’1ml,unfalcon,paperd’alumini,1pipetaPasteurilesplaques 

ambelsembrionsques’exposaranalBrdU. 

 

MetodologiaperlatincióambBrdU 

Primeramentpreparemladissolució10mMdeBrdU.Perferho,utilitzemla 

pipeta Gilson per agafar 0,9 ml de System water i els posem dins d’un falcon. A 

continuacióafegimels0,45mldel’stockdeBrdUihoagitembé.Finalment,ambuna 

pipetaPasteurdistribuïmelcontingutdelfalconalspousdelesplaquesdepousamb 

elsembrionsambelsqualsdurematermelaimmunohistoquímica.Deixemdescansar 

46

durantunahoraelsembrionsenBrdUipassataquesttempselsesbandimseguintel 

mateixprocedimentqueanteriorment.Uncopesbandits,elsdeixemreposartotalanit 

perlasevafixaciól’endemà. 

 

 


Esbandimelsembrionsfixatscomelsvamesbandiranteriormentperòprenent 

més precaucions per eliminar el fixador i substituirlo per una solució isotònica 

anomenadaPBS,quefaràqueelsembrionsfixatsesconservinmillorquedinsdelPFA. 

Aquestasoluciólavolemal1x 20 itenimlainiciala10x.Pertant,posem25mldePBS 

10xenunaprovetaienrasemfinslamarcade250mlambl’aiguadestillada(estèrili 

sense sals) per diluir deu vegades la solució inicial. A més a més, comencem el 

recomptedecèllulesciliadesdelsembrionsquevanserseparatsnomésperaobservar 

l’efecteototòxicdediferentssubstàncies,ésadir,elsembrionsqueacabemd’esbandir 

(veurel’apartat:Del9dejuliolal29dejuliol,iveurelaTaula1ilaTaula2del’apartat 

deresultatspelsrecomptes). 

AquestmateixdiafixemelsembrionsexposatsaBrdUeldiaanterior,seguintel 

mateixprocedimentideixantlosalaneverauncopenllestidalafixació. 

 

 


Comencemlaimmunohistoquímicabend’hora,jaqueésunprocedimentmolt 

llargqueenllestireml’endemà.Elprotocolqueseguimésl’estàndardperBrdU.El 

procedimentéscomúpertotselsembrionsfinsundeterminatpunt,enelqualseparem 

elsqueensserviranperobservarlescèllulesenfaseMielsqueensserviranper 

observarlesqueestanenfaseSoques’hanregeneratapartird’aquestesúltimes. 

Tenyiraquestescèllulesensserviràperpoderobservarelsmecanismesde 

regeneraciódelescèllulesciliadesapartirdelaproliferaciódelescèllulesdesuport 

queestrobenalvoltantdelsneuromasts. 

 

20 1xesrefereixalaconcentracióquenormalmenttéunasubstància.Quanunnombre(N)diferenta1 

acompanyila“x”,voldràdirqueaquellasolucióestàNvegadesmésconcentradaquelanormal. 

47

Elsanticossosqueutilitzaremperlaimmunohistoquímicasón: 

PelstractatsambBrdU: 

Primaris:antiBrdUmouseiantiGFPrabbit 

Secundaris:antimousevermelliantirabbitverd 

PelsdeH3: 

Primaris:antiH3rabbitiantiGFPmouse 

Secundaris:antirabbitvermelliantimouseverd 

 

ElsanticossosprimarisreconeixeranelBrdU,lahistona3(H3)olaGFP(quejahi 

és, però volem reforçar el tint verd), i els anticossos secundaris reconeixeran els 

anticossosprimaris,isónelsquiportaranlafluorescència.Elsanticossoss’acompanyen 

delnomdel’animaldelquals’haextretelsèrumqueelsistemaimmunitariprodueix 

comarespostaaladetecciódelaestructuraqueliinjectem.Aquestsèruméselque 

nosaltresutilitzem.Unanticòssecundarinoméspodràreconèixerl’anticòsprimaridel 

mateixtipus;ésadir,mousenoméspodràreconèixerienganxarseaunaltremouse,i 

rabbitnomésreconeixeràrabbit. 

 

Materialperlarealitzaciódelaimmunohistoquímica 

14eppendorfs,moltespipetesPasteur,1agitador,1proveta,2falcon,lacampana, 

elsguants,broquetsgrocsdelespipetesGilson,lespipetesGilsonde1ml,200l,i 

10l,1pipetus,1pipetadevidre,iampollesdevidregraduadesperprepararles 

dilucions. 

Laplacadepousontenimelsembrions,duesplaquesde5pousperposarels 

embrionsalfinaldetotelprocediment,unanevera(4ºC)iuncongelador(20ºC). 

Lessubstànciesquenecessitarem:PFA4%,PBS1xpreparatelsdiaanterior,5N 21 

HCl,Blocking 22 ,50%MeOH 23 ,100%MeOH,aiguadestillada,Systemwater,Tween 

20 24 (quejuntamentambelPBS1xensserviràperfabricarPBT),proteinasaK 25 ,iels 

21 Lanormalitatéslamassad’àcidobasequedónaoacceptaunmoldeionshidrogenpercadalitrede 

solució. 

22 

Solucióquebloquejal’excésdetinciónoabsorbidaperlescèllulestenyides.Ensfacilitalabona 

observaciód’aquestes. 

23 

Metanol.Creapetitesperforacionsalamembranadelescèllules,facilitantlapenetraciódel’anticòs. 

24 Detergentquefacilitalapenetracióalsteixits. 

25 Enzimquedigereixproteïnes,facilitantl’accésalnuclidelescèllules. 

48

anticossos primaris antiBrdU mouse, antiH3 rabbit, antiGFP rabbit i antiGFP 

mouse. 

Metodologiaperlarealitzaciódelaimmunohistoquímica 

Hemdetenirencomptequesemprequeensreferimaferunanetejaoferun 

rentat,ensreferimatreurelasubstànciaqueestrobavaanteriormentdinsdelspous, 

substituirlaperunadenovaiposaraagitarundeterminattemps.Elsembrionssempre 

estrobarancobertsambpaperd’aluminipernoperjudicarlafluorescència.Amésa 

més,totselspassosesrealitzenencadaundelspousdelaplaca. 

Primerdetotesbandim(seguintelmateixprocedimentqueanteriorment)els 

embrionsquefaremserviriqueestavenexposatsaPFA,peròencomptesdeSystem 

water,utilitzemPBS1xielsposemaagitar10minperaquelanetejasiguiméseficaç. 

Uncoppassataquesttemps,traiemelPBSambunapipetaPasteurambunbroquet 

grocperamésprecisióicomencemelprocésdedeshidratació.Aquestprocésservirà 

perferpetitsforatsalamembranadelescèllulesperdeixarpassarl’anticòsque 

aplicaremalfinaldetot.Comencemladeshidratacióutilitzant,sempre,unapipeta 

Pasteurperposar50%MeOHalspousqueacabemdebuidardePBS,ielsposema 

agitar10min.Acontinuació,MeOH100%,jaquedeshidratemprogressivament,iho 

posemaagitar10min.Finalment,posemlaplacadepousalcongelador2h. 

Elsegüentpaséstornarahidratar,tambéprogressivament.Primertraiemel 

100%MeOHambunapipetaPasteurambbroquet,elsubstituïmper50%MeOHi 

posemaagitar10min.Totseguit,femunrentatde10minambPBS1x.Mentrestant, 

preparemladiluciódePBTquefaremserviracontinuació.ElPBThad’estarcompost 

per0,1%deTween20ilarestadePBS1x.Pertant,utilitzemunapipetaGilsonper 

posar2,5mldeTween20dinslaprovetaienrasemfinslamarcade250mlambPBS1x. 

Posemtotaladilucióresultantenunaampollagraduadade500ml,itornemapreparar 

ladilucióperomplirl’ampolla.Finalmentidentifiquemambllapispermanentaquesta 

ampolla,jaquel’hauremdeferservirenvàriesocasions.Passatsels10min,traiemel 

50%MeOHiposemlesplaquesaagitar10minmésambPBT.Enaquests10mindels 

qualsdisposemabansdedonarperenllestidalahidratacióicomençarunanovaetapa, 

preparemunadiluciódeProteinasaKqueésunenzimquedigereixproteïnesper 

49

facilitarl’accésdelsanticossosalnuclidelescèllulesenPBT.Aquestadilucióhadeser 

de10g/mlperòl’obtenimapartird’unaaltraa10mg/ml.Aixídoncs,utilitzemuna 

pipetaGilsonperposar7ldeProteinasaKienrasemfinslamarcade7mlambPBTen 

unfalcon. 

Uncopacabadalahidratació,traiemelPBTdelaplacadepousperposarla 

ProteinasaKpreparada,ilacolloquemal’agitadordurant20min.Acontinuaciótraiem 

laProteinasaKiomplimelspousambPBTielsposemaagitar15min.Totseguit,fem 

unrentatde15minambPBTnou,ienacabarelcanviemper4%PFA.Enacabat, 

traiemelfixadorifemtresrentatsde3mincadaunambunadilucióal0,1%deTween 

20ambaiguadestillada,quepreparemposant0,25mldeTween20dinsd’unfalconi 

enrasantambl’aiguadestilladafins25ml. 

Apartird’aquestpunt,establimunadivisióentreelsembrionsdelsquals 

tenyiremlescèllulesenfaseMdelciclecellulariaquellsdelsqualstenyiremlesque 

estanenfaseSos’handiferenciatacèllulesciliadesapartird’unacèllulaenaquesta 

fasetenyidaambBrdUeldiaanterior.Comquedisposemdemoltpocsembrionspera 

cadapou,decidimseparartresoquatreembrionsdecadapouendiferentseppendorfs, 

queidentifiquemambunllapispermanent,indicantsihiaplicaremantiBrdU(pelsdela 

faseS)oantiH3(pelsdelafaseM),itambél’ototòxicalqualvanserexposats.Abans 

deseguirambelprocediment,preparemunadissoluciód’HCl2N(normalitat)apartir 

de10mld’HCl5Nqueagafemamblapipetadevidreielpipetus,iqueposemdins 

d’unaampolladevidregraduada,onafegim15mld’aiguadestillada. 

MentrequeelsembrionsdelqualstenyiremlescèllulesenfaseMestana 

l’agitador,alsaltreselsfemunrentatamb2NHClde3min.Desprésrenovemaquesta 

mateixasubstànciaifemunnourentatd’1h.Passataquesttemps,traieml’HClifem 

dosrentatsde5minambPBT,tantpelstractatsambBrdUcompelsembrionsdeH3. 

MentrestantpreparemelBlockingperalsdosgrupsd’embrions.Preparemaquesta 

dilució,posantambunapipetaGilson,1mldeHorseSerum(HS)i7,5mldeBobine 

AlbuminSerum(BAS)dinsd’unfalcon,ienrasemfinslamarcadels50mlambPBT.Un 

copacabatselsrentatsambPBT,enfemunambBlockingde30min,durantelsquals 

preparemlesquantitatsd’anticossosprimarisalsqualsexposaremelsembrionsaquest 

mateixdia,ielsanticossossecundaris,queseranaplicatsl’endemà. 

50

Calculemqueentotaltindremprouamb400ldedissolucióresultantpels 

anticossosprimariscombinatspelsdeBrdU,ielmateixperòambelsseusanticossos 

corresponentspelsdeH3.Tenintencomptelesconcentracionsinicialsdecadaanticòs, 

quenomésenelcasdel’antiGFPrabbitéseldoble,posem(utilitzantunapipeta 

Gilson)endoseppendorfsdiferents: 

 

Eppendorf1BrdU:1ld’antiGFPrabbit,2ld’antiBrdUmousei397ldePBT 

Eppendorf2H3:1ld’antiGFPmouse,1ld’antiH3rabbiti398ldePBT 

Elsanticossossecundarisespreparentambépergrupsiexactamentdelamateixa 

manera,iesdeixen,benidentificats,alcongeladorfinsl’endemà. 

 

Un cop enllestida la preparació dels anticossos primaris, posem 7 l de la 

combinaciód’anticossoscorresponent(segonssiésdelsquevolempertenyirlafaseSo 

laM),acadaeppendorfambembrions,utilitzantpipetesGilson.Intentemquetotsels 

embrionsdinsl’eppendorfquedinsubmergitsenelsanticossos,ielsdeixemtotalanit 

dins la cambra frigorífica sobre un agitador i tapats amb paper d’alumini per no 

perjudicarlafluorescència. 

 

 


Esbandim els embrions que han passat tota la nit exposats als anticossos 

primarisiapliquemelssecundaris.Seguimambelsrecomptesdecèllulesciliades 

(veuretauladeresultatsiapartatdel9dejuliolal29dejuliol). 

 

Materialperesbandirbéelsembrions 

VàriespipetesPasteuribroquetsdepipetesGilson. 

ElPBTpreparatanteriorment. 

1agitador. 

Elsembrionsdinsdelseppendorfsbenidentificats. 

Paperd’alumini. 

51

Metodologiaperesbandirelsembrionsexposatsaanticossos 

Primerament,traiemelsembrionsdelacambrafrigoríficaiamblespipetes 

PasteurcombinadesambelsbroquetsdelespipetesGilson,anemtraientelsanticossos 

delseppendorfsiposanthimoltdePBT.Femdosrentatsde20minambPBT.Per 

assegurarunabonaneteja,realitzemtresrentatsmésambPBTnouperòde5min. 

 

 

Materialperaplicarelsanticossossecundaris 

Elseppendorfsonestrobenelsembrions. 

Lesduescombinacionsdiferentsd’anticossossecundarispreparadeselsdiaanterior. 

1pipetaGilsonambelsseuscorresponentsbroquetsivàriespipetesPasteur. 

1agitador. 

 

Metodologiaperaaplicarelsanticossossecundaris 

AnemtraientelPBTdelseppendorfsambunapipetaPasteurambbroquet,que 

enspermetràfermésfàcilnoaspirarelsembrions(quesónmoltpetits),iacontinuació 

posem7ldelacombinaciód’anticossoscorresponentacadagrupd’embrionsamb 

unapipetaGilson.Quanacabem,posemelseppendorfstapatsambpaperd’aluminia 

l’agitador2h.Passataquesttemps,traiemelsanticossosifem6rentatsde15minamb 

PBTnoucadavegada.FinalmentdeixemelseppendorfsambelsembrionsenPBTdins 

lanevera,semprebentapatsambpaperd’alumini. 

 

Del9dejuliolal29dejulioldel2010:Recomptes 

AlgunsdiesesvaalPRBBperfertotselsrecomptes;tantelsdedestruccióde 

cèllulesciliadesperl’efecteototòxiccomelrecomptedecèllulesenfaseSiles 

cèllulesciliadesregenerades.Acontinuacióestrobatantelprocedimentseguitper 

comptarcèllulesciliadesicèllulesenfaseScomelscriterisseguitsperferhoiels 

problemestrobatsencadacas. 

 

 

 

52

CRITERISUTILITZATSPELSRECOMPTES 

Comqueésimpossibleferelrecomptedelescèllulesciliadesdel’oïdaodetots 

elsneuromasts,se’ntrientresenconcretperanalitzar.Estractadelstresprimers 

neuromastsques’aprecienalcosdelsembrionsdesprésdelpetitgrupqueestrobaala 

puntadelacua.Atribuïmelnúmero1,2i3alsneuromastsanalitzats,perordre, 

començantperlacuadel’embrió.Encomptarnomésanalitzaremelsneuromasts 

d’uncostatdel’embrió,encaraqueabandaibandadelcosestrobaranneuromasts 

queescorresponen. 

 

 

Fotografia d’un embrió d’una setmana, del grup control, feta amb un microscopi amb 

fluorescènciadelPRBBiunaugmentde32x.Espodenapreciartantlescèllulesciliadesde 

l’oïdacomlesdelsneuromasts.1.Assignemaquestnombrealprimerneuromastdelqual 

comptaremlescèllulesciliades.2.Assignem aquestnombrealsegon neuromastdelqual 

comptaremlescèllulesciliades.3.Nombreassignataltercerneuromastdelqualcomptaremles 

cèllulesciliades. 

 

Perferelsrecomptesposeml’embrióelmàximdecostatpossible.Ambel 

microscopienfoquemamb20xperduratermeelrecompte,jaqueamb40xésmés 

fàcilaixafarelsembrionsiésnecessariposarunolid’immersióespecialperlabona 

observació,fetquefariamoltméslentelprocés.Uncopenfocatamb20x,comptemla 

capaonesveuenméscèllulesciliades,inocomptemelpuntons’ajuntentoteselles, 

queésmoltfluorescent. 

 

53

Materialpelrecomptedecèllulesciliades(comúpertotselsrecomptes) 

PipetesPasteur. 

1llapishidròfobivaselina. 

Portaobjectesde24x60icobreobjectesde24x24. 

Elsembrionsaobservarambellíquidonestroben. 

Microscopielectrònicilupa,ambdósambfiltresdefluorescènciaverdaivermella. 

 

Metodologiageneralpelrecomptedecèllulesciliades 

Primeramentdibuixemunrectangleounquadratsobreelportaobjectesambel 

llapishidròfobiposemdoscobreobjectesabandaibandadelportaobjectes,deixantun 

espai entre ells, limitat pel rectangle dibuixat. A continuació posem una mica de 

vaselina sobre els límits dels cobreobjectes que miren cap al rectangle dibuixat i, 

utilitzantunapipetaPasteuragafemelsembrionsquevolemobservar,elsposem(amb 

elseulíquid)dinselrectangle,iintentemposarlosdecostat.Enacabat,posemasobre 

uncobreobjectesquequedaràbenagafatgràciesalavaselina.Finalment,podem 

procediralaobservacióambelmicroscopi,quecomptaambfiltresperlesdiferents 

fluorescènciescomlavermellaolaverda. 

 

Recomptesdelsembrionsmortsperototoxicitat 

Pel recompte d’embrions morts dels primers dies no es va fer servir el 

microscopi,sinólalupa. 

 

 

Recomptesdelescèllulesciliadesdestruïdesperl’efectedelsototòxicsiperl’efecte 

combinatd’ototòxicsiotoprotectors 

Seguimelsmètodesdescritsanteriormentperrealitzarelsrecomptesinofem 

cap observació inesperada fins arribar a la placa d’ototòxics combinats amb 

otoprotectors, on dels quinze embrions dels quals hauríem de disposar per fer 

estadístican’hihamoltsque,perl’efectetòxicinesperatdelavitaminaC,tenenmort 

percompletdecèllulesciliades,iseguramenttambédemoltesaltres. 

 

54

Regeneraciódelescèllulesciliadesapartirdelescèllulesdesuport.Estudidels 

mecanismesderegeneració. 

EnelcasdelBrdUidelpH3,ensservimdelapantalladel’ordinadorconnectat 

almicroscopiperveureonestansituadeslescèllulesenfaseSilescèllulesenfaseM 

respectealescèllulesciliadesquehansobreviscutalaototoxicitat,jaquepodem 

posarelditsobrelapantalladel’ordinadoronsónaquestescèllulesicanviarelfiltre 

defluorescènciaipassardeveurelafluorescènciaverdadelescèllulesciliadesaveure 

lescèllulesenlesfasesqueestudiem.Siposemelditsobreelneuromasticanviemla 

fluorescència,lescèllulesenfaseSpelsdeBrdUilescèllulesenfaseMpelsdeH3que 

sóncèllulesdesuportqueestanapuntdediferenciarseacèllulesciliadesestanal 

voltant del neuromast, mentre que les que es troben en vermell just a sota del 

neuromastsóncèllulesciliadesnovesregenerades. 

 

 

 

FotografiarealitzadaambelmicroscopielectrònicdelPRBBambunaugmentde40x.Ésla 

superposiciódelescèllulesciliadessupervivents(encolorverd)delneuromast3d’unembrió 

tractatambclaritromicina5MilescèllulestenyidesambBrdU(encolorvermell).Podem 

observarquatrecèllulesciliadesnítidesenprimerpla(ialgunamésqueenferlasuperposició 

noesveubé)iduescèllulesdesuportenfaseSodescendentsd’aquestes.Sotaelneuromast,es 

podenapreciarduestaquesvermellesqueenferlasuperposiciós’hanvistdifuminades,ique 

sónlescèllulesciliadesregenerades. 

55

Problemestrobatsenferelsrecomptesperestudiarlaregeneraciódelescèllules 

ciliadesapartirdelescèllulesdesuport 

LatinciódelescèllulesenfaseMnohafuncionatencaraqueelprocediment 

segueixelprotocold’immunohistoquímica.Elsanticossos,obéelsprimarisobéels 

secundarisnos’hanfixatbé.Encanvi,eltractamentambBrdUhafuncionatbéipodem 

procediralrecompte. 

 

 

4.3.RESULTATSDELAPARTEXPERIMENTAL 

 

Hemfetlessegüentsabreviaturesalestaulesifigures(enalgunestaulesesmatisaran 

algunesaltresnotacionspuntuals): 

Genta5:gentamicina5M, 

Genta10:gentamicina10M 

Azitro5:azitromicina5M 

Azitro10:azitromicina10M 

Claritro5:claritromicina5M 

Claritro10:claritromicina10M 

VitC200:vitaminaC200M 

VitC400:vitaminaC400M 

n1:neuromast1 

n2:neuromast2 

n3:neuromast3 

C.C:cèllulesciliades 

C.S:cèllulesdesuport 

 

4.3.1.Efectedelsototòxicsidelsotoprotectorspelquefaalamortgeneraldels 

embrions 

 

Elsresultatsobtingutsalaprimeraisegonaplacavenenreflectitsalafigura1i2 

respectivament. 

56

Nombred'embrions 

FIGURA1.Supervivènciad'embrionsalaprimeraplaca(ototòxics) 

24 

22 

20 

18 

16 

14 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

Control Control Genta5 Genta10 Azitro5 Azitro10 Claritro5 Claritro10 

Embrionsmorts 0 0 1 8 0 0 0 0 

Embrionsvius 21 21 20 13 21 21 21 21 


FIGURA2.Supervivènciad'embrionsalasegonaplaca(ototòxicsi 

otoprotector) 

24 

22 

20 

18 

16 

14 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

Control Control 

Genta5 

VitC200 

Genta5 

VitC400 

Genta10 

VitC200 

Genta10 Claritro10 

VitC400 VitC200 

Claritro 

10VitC 

400 

Embrionsmorts 0 0 0 0 1 2 3 0 

Embrionsvius 20 20 20 20 19 18 17 20 

Nota:hauremdetenirencomptequealspousdeclaritromicina5Miclaritromicina10M 

ambvitaminaC200M,laquantitatdel’antibiòticquenoesdissoliabé,dipositadaalfonsdel 

pou,ésmoltsuperiorquealspousdeclaritromicina10Miclaritromicina10Mambvitamina 

C400M.Especialmentalpoudeclaritromicina10MambvitaminaC200M,laquantitat 

d’antibiòticdipositadaalfonseramoltsuperior. 

57

4.3.2. Efecte dels ototòxics i dels otoprotectors sobre les cèllules ciliades dels 

neuromasts 

 

Elsrecomptesdecèllulesciliadesdelaprimeraisegonaplacaesmostrenalestaules1 

i2respectivament. 

 

TAULA1.Supervivènciadecèllulesciliadesalaprimeraplaca 

 

 

 

Embrió1 Embrió2 Embrió3 Embrió4 Embrió5 

58 

MitjanadeC.Cper 

neuromast 

n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 ((n)/15)* 

Control 7 6 8 8 8 7 6 8 6 7 6 6 7 7 6 6.86 

Genta5 6 5 6 5 6 5 5 5 5 3 4 3 5 6 7 5.06 

Genta10 6 7 6 4 5 6 5 2 4 7 5 3 4 4 5 4.86 

Claritro5 8 6 7 5 6 5 5 7 7 5 6 5 6 

Claritro10 6 7 7 8 6 8 7 6 4 6 7 5 6 6 7 6.4 

Azitro5 5 7 7 7 6 7 8 4 5 7 7 6 7 5 4 6.13 

Azitro10 5 5 5 6 4 7 6 8 7 8 5 7 6 6 6 6.06 

*(n)/12)perlaclaritro5 

 

Nota:lamitjanadecèllulesciliadesperneuromasthaestatcalculadasumantlaxifraobtingudapercada 

neuromastidividintentreelnombredeneuromastsdelsqualss’hancomptatlescèllulesciliades. 

Enelcasdelaclaritromicina5Mnoméshempogutcomptarlescèllulesciliadesdequatreembrions 

perquèdosdelssisembrionsagafatspelrecompteteniencompletamortdecèllulesciliades.Això 

seguramentésdegutalamaladissoluciód’aquestantibiòtic,quecomjas’haexplicatanteriormentala 

partdeMaterialsiMètodes,esvaacumularengranquantitatalfonsdelpoudeclaritromicina5M.

TAULA2.Supervivènciadecèllulesciliadesalasegonaplaca 

 

 

Embrió1 Embrió2 Embrió3 Embrió4 Embrió5 

59 

Mitjanade 

C.Cper 

neuromast 

n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 ((n)/15) 

Genta5VitC200 4 6 4 6 5 4 5 4 5 6 6 4 4 5 5 4.86 

Genta5VitC400 5 6 4 3 6 4 4 5 7 6 3 6 4 3 4 4.66 

Genta10VitC200 6 5 5 4 4 5 4 6 6 4 5 4 5 5 6 4.93 

Genta10VitC400 6 7 4 4 5 6 4 4 7 4 6 6 3 3 4 4.86 

Claritro10VitC200 5 4 6 5 3 4 4 6 5 5 2 5 5 6 6 4.73 

Claritro10VitC400 4 4 6 6 4 7 4 8 5 5 5 6 4 7 8 5.53 

Nota:lamitjanadecèllulesciliadesperneuromasthaestatcalculadasumantelnombredecèllules 

ciliadessuperviventsacadaneuromastidividintlasumaentreelnombredeneuromastsdelsqualss’han 

comptatlescèllules. 

 

 

EfectedelavitaminaCsobrelescèllulesciliades 

Lamortcompletadecèllulesciliadesobservadaalasegonaplacaenlescombinacions 

d’antibiòticsamblesduesdosidevitaminaCesreflecteixalafigura3.


FIGURA3.EmbrionsambmortgeneraldeC.Calasegonaplaca 

(ototòxicsiotoprotector) 

16 

14 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

Genta5 

VitC200 

Genta5 

VitC400 

Genta10 

VitC200 

Genta10 

VitC400 

Claritro10 

VitC200 

EmbrionsambC.Cmortes 4 3 5 4 5 7 

EmbrionsambC.Cvives 11 12 10 11 10 8 

Claritro10 

VitC400 

Nota:noconsideremunmarged’errord’unembrióenelsembrionsambmortcompletadecèllules 

ciliades,jaque,encaraqueexisteixilapossibilitatd’unapèrduapuntualdeltransgènic,entotsels 

embrionsesvaobservarquehihaviapresènciadefluorescència,peròformantunpicotejatpertotelcos, 

volentdirquelescèllulesciliadeshavienestèselseucontingutpelcosdel’embrióenmorir. 

 

4.3.3.Regeneraciódelescèllulesciliadesdelsneuromastsapartirdelescèllulesde 

suport 

 

Elrecomptedecèllulesciliadessupervivents,lesregeneradesilesdesuportenfase 

SesmostraalaTaula3.AlaTaula4escomparalamitjanadecèllulesciliades 

superviventsabansidesprèsdelBrdU,ialaTaula5,esmostralamitjanadecèllules 

desuportenfaseS. 

 

 

 

 

 

 

 

 

60

TAULA3.Cèllulesciliadesregeneradesapartirdelescèllulesdesuport 

 

C.Csupervivents C.Cregenerades C.SenfaseS 

 

 

E1 

E2 

E3 

E1 E2 E3 E1 E2 E3 

n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 n1 n2 n3 

Control 7 8 8 6 6 7 8 6 6 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 

Genta5 4 5 5 3 6 6 3 6 4 0 2 1 0 0 0 1 1 0 2 1 2 1 0 1 0 2 0 

Genta 

10 

Claritro 

5 

Claritro 

10 

2 5 6 0 2 0 0 0 0 

6 5 5 7 7 7 0 1 2 0 1 0 2 0 2 1 0 2 

4 4 5 6 4 7 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 2 

Azitro5 6 5 7 1 1 1 1 3 2 

Azitro 

3 5 6 4 6 5 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 

10 

E1.embrió1,E2.Embrió2,E3.Embrió3 

 

Nota:Delstresoquatreembrionsagafatsencadacasperferelrecompte,enalgunscasosun,dosofins 

hitottresembrionstenienunamortcompletadecèllules,sobrelaqualtambéenfaremladiscussióa 

l’apartatd’Anàlisiidiscussiódelsresultats.Enaquestscasosesvapoderobservarclaramentquenohem 

detenirencomptelapèrduapuntualdeltransgènic,jaquevamveurequelafluorescènciaestavaestesa 

pelcosdel’embrió,formantunpicotejatfluorescent,volentdirquelescèlluleshanmortielseu 

continguts’haestèspertotelcos. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

61

TAULA4.ComparacióentrelescèllulesciliadessuperviventsalaTaula1ialaTaula3 

 

 

 

MitjanaC.CsuperviventsTaula1per 

neuromast 

62 

MitjanaC.CsuperviventsTaula3per 

neuromast 

Control 6.86 6.88 

Genta5 5.06 4.66 

Genta10 4.86 4.33 

Claritro5 6 6.16 

Claritro10 6.4 5 

Azitro5 6.13 6 

Azitro10 6.06 4.83 

Nota:lamitjanadelaTaula1jalateníemcalculadaanteriorment,enaquestcasnomésafegimdenoula 

mitjanadelescèllulesciliadessuperviventperneuromastdelaTaula3.Perferho,sumemtotsels 

nombresdecèllulesdetotselsneuromastsdecadaembrió,idividimentreeltotaldeneuromasts 

analitzats,quedependràdelnúmerod’embrionsdelsqualshaguempogutcomptarlescèllulesciliades. 

Hemdetenirencomptequeaquestaúltimamitjanas’hafetambmoltmenysembrions(enalgunscasos 

nomésambun),iquepertantnoéssignificativa.Noobstant,ensserviràpercompararmínimamentamb 

l’anteriormitjanaobtingudaabansdelBrdUiestablirunefectetemporal.

TAULA5.Resumdelataula3:lescèllulesdesuport 

 

MitjanadecèllulesdesuportenfaseSpergrupdeneuromast(1,2o3) 

63 

mitjanadels3 

neuromast 

N1=(n1)/(3,2o1) N2=(n2)/(3,2o1) N3=(n3)/(3,2o1) (N1+N2+N3)/3 

Control 0.66 0.33 0 0.33 

Genta5 1 1 1.33 1.11 

Genta10 0 0 0 0 

Claritro5 1.5 0 2 1.16 

Claritro 

10 

0.5 0.5 1 0.66 

Azitro5 1 3 2 2 

Azitro10 0 0 0 0 

Nota:lamitjanadelescèllulesdesuportenfaseSperneuromast(N1,N2oN3),haestatrealitzada 

individualmentpercadagrupdeneuromast1,2o3delsembrions,sumantlesxifresobtingudespel 

mateixneuromastendiferentsembrionsidividintentre3,2o1segonselnombredeneuromastsdels 

qualss’hapogutsumarlaxifraobtingudaperundeterminatneuromast.Enalgunsnoméspodemdividir 

entre1jaquelamostrad’embrionseramoltreduïdaenteniralgunsembrionsambmorttotalde 

cèllulesciliades,coms’haexplicatalanotaadjuntaalaTaula3. 

Lamitjanadelstresneuromastsjuntss’hacalculatrealitzantlasumadelesmitjanesobtingudespercada 

neuromast(1,2o3),idividintentre3.

5.ANÀLISIIDISCUSSIÓDELSRESULTATS 

 

5.1. EFECTE DELS OTOTÒXICS I DELS OTOPROTECTORS PEL QUE FA A LA MORT 

GENERALDELSEMBRIONS 

 

Hemobservat,tantalaFigura1comalaFigura2,quealesconcentracions 

aplicadesexisteixunatoxicitatgeneralperpartdelsantibiòtics,quefinsitotpoden 

causarlamortdelsembrions.AlaFigura1,jase’nsconfirmaqueaquestatoxicitat 

generalestàestretamentrelacionadaambl’agressivitatdelsantibiòtics,jaquela 

gentamicinaesmostrabastantméstòxicaqueelsmacròlidstriatsentotselsaspectes 

quehemanalitzat:lamortdelsembrionsiladestrucciódecèllulesciliades. 

AlaFigura2veiemquelavitaminaChafetdisminuirlamortd’embrionsper 

toxicitatsicomparemamblamortd’embrionsalaprimeraplaca.Aquestefecteesfa 

mésevidentenelspousdegentamicina10M.Noobstant,alaFigura2,tambéveiem 

quealpoudeclaritromicina10MivitaminaC200Mtambés’haproduïtunamort 

d’embrionssuperioralsdegentamicina,seguramentdegutalamaladistribuciódela 

claritromicinaennodissoldre’sbé,problemadelqualjahemparlatal’apartatde 

Materialimètodes. 

Detotaixò,podemdeduirquelapresènciadevitaminaCcontrarestal’efecte 

tòxicdelsantibiòticsenelsqualss’hapogutobservarmortd’embrionspertoxicitat. 

Apartird’aquestsprimersrecomptes,japodempreveureunamajortoxicitaten 

totselsaspectesenelsembrionsexposatsagentamicina,ihauremdetenirmolten 

compteelsproblemestingutsambladissoluciódelaclaritromicinaal’horad’analitzar 

lestaulesdelssegüentsapartats. 

 

 

5.2.EFECTEDELSOTOTÒXICSIDELSOTOPROTECTORSSOBRELESCÈLLULESCILIADES 

DELSNEUROMASTS 

 

Primerament, hem observat que l’azitromicina i la claritromicina, a les 

concentracionsaplicades,tenenefecteototòxic,jaqueprodueixenunadestrucció 

64

evidentdecèllulesciliadesencomparacióambelgrupdecontrol.Noobstant,l’efecte 

ototòxicd’ambdósmacròlidsésmoltinferioraldelagentamicina,quehamostratel 

granefecteototòxicqueesperàvem,tantenlamortd’embrionsalaFigura1comen 

elrecomptedecèllulesciliadesalaTaula1.Finshitotlagentamicina5Mtéuna 

ototoxicitatsuperioraladelsmacròlidsaconcentracionsde10M. 

AlaTaula1ialaTaula2,veiemquelesxifresobtingudesperlaclaritromicina5 

Miperlaclaritromicina10MambvitaminaC200Msóninferiorsalesesperades, 

jaquehauriendesersuperiorsalesobtingudespelspousdeclaritromicina10Mide 

claritromicina10MambvitaminaC400Mrespectivament.Aixòesdeusegurament 

alsproblemesjacomentatssobreladissoluciódel’antibiòtic.Amésamés,lamortde 

toteslescèllulesciliadesdedosdelssisembrionsagafatspelrecomptedelsexposatsa 

claritromicina5M,dadareflectidaalanotadelaTaula1,ensfapensarquela 

destrucciódecèllulesciliades,olatoxicitatgeneral,haaugmentatmoltpelsembrions 

ques’hantrobatmésestonaalapartdebaixdelpouamblapolsdeclaritromicina 

acumulada. Si tenim en compte això, l’azitromicina és més ototòxica que la 

claritromicina. 

ComesmostraalaTaula2,enstrobemambunefecteinesperatdelavitamina 

C.Encomptesd’haverevitatladestrucciódelescèllulesciliadesod’haverdisminuït 

l’efectecausatsobreaquestescèllules,engeneral,haincrementatladestrucció. 

Probablement,lesconcentracionsquehemaplicatd’aquestantioxidant,sónmassa 

elevadesipodenaccentuarladestrucciódelescèllulesqueenunprincipihaurien 

d’haverprotegit. 

L’incrementdeladestrucciódelavitaminaCsemblaestarrelacionatamb 

l’efecteototòxicobservatalsdiferentsantibiòtics.Sicalculemladiferènciaentrela 

mitjanadecèllulesciliadesenantibiòticssenseotoprotectordelaTaula1,ielnombre 

decèllulesciliadesquans’afegeixlavitaminaCadosisde200Mi400M(Taula2), 

obtenimlessegüentsxifres:enelcasdelagentamicina5Mladiferènciaésde0,2i 

0,4respectivament;perlagentamicina10Mésde0i0,07respectivament;ienels 

pousdeclaritromicina10Mésde1,67i0,87respectivament.Enaquestúltimcas, 

però, el de claritromicina 10 M amb vitamina C 200 M és com si tingués una 

concentraciósuperiordelmacròlidqueeldeclaritromicina10MambvitaminaC400 

65

M degut als problemes esmentats amb la dissolució. Segurament, en ser molt 

ototòxicalagentamicina10M,l’efecteaddicionaldelavitaminaCnos’apreciaoés 

nul, mentre que amb la gentamicina 5 M es comença a apreciar i amb la 

claritromicina, molt menys ototòxica que la gentamicina, l’efecte addicional de la 

vitaminaCespotapreciarmoltmés.Aixídoncs,podemdeduirquecommésefecte 

ototòxic té l’antibiòtic, menys destrucció addicional es produirà en afegirse la 

vitaminaC. 

Finalment, haver elaborat la Figura 3, ens ha servit per deduir que les 

concentracions triades de vitamina C han estat tòxiques a nivell de les cèllules 

ciliades,jaquehihaembrionsambmortcompletad’aquestescèllules.Ésprobable 

quel’efectedelavitaminaCsiguibendiferentd’unacèllulaal’altra,jaquehatingut 

unefectepositiupelquefaalasupervivènciadel’embriómentrequehaaccentuatla 

destrucciódelsmecanoreceptorsdelalínialateraldelpeixzebra. 

 

 

5.3.REGENERACIÓDELESCÈLLULESCILIADESDELSNEUROMASTSAPARTIRDELES 

CÈLLULESDESUPORT 

 

Primerdetot,compodemveurealaTaula3,laproliferaciódecèllulesciliades 

algrupdecontrolcontinuadeformanaturalsil’embriónohaestatexposatacap 

compostototòxic.Noobstant,aquestaproliferaciónaturalésmoltméslentaquela 

regeneraciódelescèllulesciliadesapartirdelescèllulesdesuport,compodem 

veurealaTaula5,comparantlarespostadelescèllulesdesuportenelgrupcontrol 

amblarespostaenelsgrupsdegentamicina5M,claritromicina5Miazitromicina5 

M.Amblagentamicina10M,laclaritromicina10Mil’azitromicina10M,la 

respostadelescèllulesdesuportés,obénulla,obémoltreduïda. 

EncaraquenomésesvantenyirlescèllulesenfaseSdurantl’horaquevam 

aplicarelBrdU,iquealgunesmostresenlesqualsnomésquedaunembriónosón 

representatives,podemextreureconclusionssobreelsmecanismesderegeneracióila 

respostaperpartdelescèllulesdesuport.Perunabanda,l’embrióoembrionsdels 

grups de gentamicina 10 M i d’azitromicina 10 M, no mostren resposta de les 

66

cèllulesdesuport,fetqueensfapensarenelpuntd’irreversibilitatdeladestrucció 

decèllulesciliadesaconcentracionsmoltelevadesd’ototòxics.Seguramentenelcas 

d’aquestsdosgrups(gentamicina10Miazitromicina10M),l’ototoxicitatnoserà 

irreversible ja que a cadascun hi ha 2 cèllules ciliades regenerades en un dels 

neuromasts,però,elqueéssegur,ésquelarespostadelescèllulesdesuportes 

produeixméstardqueaconcentracionsmésbaixes.Aixòesdeuprobablement,aque 

commésaltessiguinlesconcentracions,icommésagressiul’ototòxicdelstres 

ototòxicsprovats,laclaritromicinaéslamenysototòxica,lescèllulesdesuportes 

veuenmésafectades,icomaconseqüència,larespostaésmoltmenoriméslenta. 

Pel que fa als antibiòtics a concentracions de 5 M, també confirmen aquesta 

deducció,semprequetinguemencomptequelamostrad’azitromicina5Mnoés 

representativaiqueelsproblemesambladissoluciódeclaritromicinaalpoude5M 

fanlaconcentraciód’ototòxicmoltmajordelquehauriadeser,iquepertantla 

respostadelescèllulesdesuporthauriadesersuperiorquepelcasdel’azitromicina. 

Lamortcompletadecèllulesciliadesenelcasdemoltsembrions,enspot 

suggerirquel’efecteototòxicidetoxicitatgeneralques’observaenelsprimers 

recomptes,permésqueesbandimelsembrions,provocaundeterioramentdeles 

cèllulesciliadesamesuraquepassaeltemps.Perdemostrarhos’haelaboratlaTaula 

4,onescomparenelsrecomptesdecèllulesciliadesobtingudesinicialment(Taula1) 

amblesmitjanesobtingudesdesprésdelBrdU(Taula3).Noobstant,aquestasegona 

mitjanaésmoltpocrepresentativaenalgunscasos,jaquenomésdisposemd’un 

embrióenalgunsgrups. 

Algrupdecontrol,ladiferènciad’unamitjanaal’altra,ésnomésde0,02queés 

normaldegutalspetitscanvisdecèllulesciliadesquehihad’unembrióaunaltre. 

Aquestgrupensdemostraquesienelsaltresgrupss’haproduïtunadisminucióde 

cèllulesciliades,noésseguintunprocésnatural,sinóquehaestatproduïdaper 

l’efectedelototòxics.Entretsgenerals,enelsembrionsexposatsaconcentracionsde 

5 M, la diferència és molt menor, però podem veure que l’agressivitat de la 

gentamicina 5 M ha produït una diferència superior a la dels dos macròlids. Els 

embrionsexposatsaconcentracionsde10Menmacròlids,ladiferènciaésmoltgran, 

però sorprenentment, els embrions exposats a gentamicina 10 M no presenten 

67

gairebécapdiferència.Aixònoméspodemexplicarhosiconsideremquel’únicembrió 

delqualhempogutferrecomptealaTaula3noésrepresentatiuiquepotsereramés 

resistentquelaresta. 

Finalment, en observar les cèllules ciliades regenerades i en comparar els 

neuromastsenelsqualsaquestess’hanregeneratamblarespostaqueapreciemales 

cèllulesdesuportdecadaneuromast,hemvistqueenalgunscasoshihacèllules 

ciliadesregeneradesperòhihaunaabsènciadecèlluladesuportmarcadaambBrdU 

enelmateixneuromast.Tractantsed’unaproliferaciódelescèllulesdesuporten 

faseStenyidesambBrdU,tantlacèllulaciliadacomlacèlluladesuportdescendents 

queapareixenapartirdelaproliferaciód’unacèlluladesuport,hauriend’estar 

marcadesambfluorescència.L’absènciad’unacèlluladesuportaparegudaalmateix 

tempsquelacèllulaciliadaespotexplicardediferentsmaneres.Descarteml’opcióde 

latrandiferenciació(diferenciaciódirectad’unacèlluladesuportacèllulaciliada),ja 

queennotractarsed’unaproliferació,elBrdUnopothavertenyitlacèllulaenfaseS. 

Elmésprobableésquelacèlluladesuporthagimortoquehagiseguitproliferant(no 

necessàriamentperformarcèllulesciliades)iqueelBrdUs’hagianatdiluint.Unaaltra 

explicació, però menys probable ja que els embrions de peix zebra són molt 

transparents,ésquelacèlluladesuporthagiquedatenunaltreplainol’haguem 

detectatambelmicroscopi. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

68

6.CONCLUSIONS 

 

6.1.CONCLUSIONSSOBREELSOBJECTIUS 

 

6.1.1. Sobre el primer objectiu: demostració experimental de com diverses 

substànciesactuensobrelescèllulesciliadesdelsneuromastsdelpeixzebra 

 

Hem demostrat experimentalment que tant l’azitromicina com la 

claritromicina,ambdósantibiòticsdelgrupdelsmacròlidsisobreelsqualsnohiha 

gairesestudisquen’afirminambcertesaelseuefecteototòxic,causenladestrucció 

de les cèllules ciliades en els neuromasts del peix zebra. No obstant, el grau 

d’ototoxicitat d’aquests macròlids és molt menor que el de la gentamicina, 

aminoglicòsidquecomhempogutapreciaralapartexperimental,téunaelevada 

ototoxicitat,tantadosisde5Mcoma10M.Pelquefaal’otoprotecció,nohem 

pogutdemostrarexperimentalmentlacapacitatotoprotectoradelavitaminaC,queés 

unantioxidant,peròhemdemostratqueaquestasubstànciaqueenprincipihaviade 

disminuir l’efecte de substàncies ototòxiques sobre les cèllules ciliades, en pot 

accentuarladestruccióadosiscom200Mi400M.Tambéhemtrobatunaprobable 

explicaciódelperquèlavitaminaCnohaactuatcomaotoprotector.Creiemqueenser 

unantioxidant,noméspodràneutralitzarl’efected’ototòxicsquefacinaugmentarles 

espèciesreactivesdel’oxigen(veureexplicaciósobreagentsotoprotectorsalapart 

teòrica),inopodràactuarenelcasquel’ototòxicactuïperunaviacompletament 

diferent: induint les cèllules ciliades a l’apoptosi. Està comprovat que els 

aminoglicòsidscomlagentamicinaactuenperlesviesdel’apoptosi,ipertant,si 

aquestasuposicióquehemfetfoscerta,serialògicquelavitaminaCnohaguésimpedit 

ladestrucciódecèllulesciliadesalspousdegentamicina.D’altrabanda,noessap 

quinaviautilitzenelsmacròlidscoml’azitromicinailaclaritromicina,peròpodem 

deduirsegonsaquestaexplicació,quetambéactivaranelsmecanismesdel’apoptosi 

enlescèllulesciliades. 

Ésimportantremarcarquetoteslessubstànciesutilitzadeshanproduïtobéla 

mortd’algunsembrionsobélapèrduadelafluorescènciaoladestrucciódetotesles 

69

cèllulesciliades.Podemdeduirqueaquestesmortsgeneralsocellularshanestat 

causadesperunatoxicitatgeneral,degudaseguramentalnombred’horesd’exposició 

delsembrionsatotesaquestessubstànciesoaleselevadesconcentracionsalesquals 

hanestatexposats.FinsitothemobservatquelavitaminaChacausatlamortdetotes 

lescèllulesciliadesenmoltsembrions.Finalment,gràciesalsembrionstractatsamb 

BrdU, hem pogut apreciar que les dosis aplicades d’ototòxics han tingut efectes 

perjudicialssobrel’embriódiesdesprésdelasevaaplicació,jaquemoltsdelsembrions 

queesvolienobservarpresentavenunadestrucciógeneraldelescèllulesciliades. 

D’aquesta manera, podem concloure que el grau d’ototoxicitat està 

estretamentrelacionatamblaconcentracióaplicadadelasubstància,peròquehiha 

altres factors a tenir en compte, com l’agressivitat d’un antibiòtic a l’hora de 

compararl’efected’unsoaltressobrelescèllulesciliades.Nosaltreshemaconseguit 

demostrarl’ototoxicitatdelaclaritromicinaidel’azitromicina,peròalhorahempogut 

comparar l’efecte d’aquests dos macròlids amb la destrucció ja demostrada en 

bastantsarticlescientíficsproduïdaperlagentamicina,queindependentmentdesila 

sevaconcentracióera5Mo10M,superavademanerapronunciadaladestrucció 

produïdapelsdosanteriors. 

 

 

6.1.2. Sobre el segon objectiu: comprovació experimental dels mecanismes de 

regeneraciódelescèllulesciliadesdelpeixzebradesprésdelasevadestrucció 

 

Laregeneraciódelescèllulesciliadesdesprésdel’exposicióaototòxicsde 

concentracionsaproximadesde5Mi10Mcomença,aproximadament,24hdesprés 

d’esbandirelsembrionsdepeixzebradelscompostosenelsqualsestrobaven.Hem 

observatlarespostadelescèllulesdesuport48hdesprésd’esbandirelsembrions, 

encaraqueperunamostrabastantreduïdadegutalamortdelescèllulesciliadesper 

toxicitatgeneral.Tambéenshaestatpossibledistingiraquellescèllulesjaregenerades 

ilescèllulesdesuportenfaseSquepodendonarllocanovescèllulesciliades. 

Primerament,gràciesalgrupcontrol,hemobservatqueenembrionsnotractats 

existeixunaproliferaciódelescèllulesciliades,encaraquearitmemoltinferioralde 

70

egeneració.Pertant,hempogutdemostrar,finsuncertpunt,quelarespostadeles 

cèllulesdesuportalaototoxicitatéssuperioralaproliferaciónaturaldelescèllules 

ciliades. 

Ensegonlloc,sabentquelescèllulesdesuportenvoltenelsgrupsdecèllules 

ciliades,vampoderdistingirfàcilmentambdóstipusdecèllules,jaquelescèllulesde 

suportestrobavenalaperifèriadelsneuromastsmentrequelescèllulesciliadesja 

regeneradesestavenalcentre.Noobstant,lescèllulesciliadesregeneradesapartirde 

lescèllulesdesuport,tambéestaventenyidesdevermellcomhaviaestattenyidala 

sevaprogenitoraenfaseSdelciclecellular.Lesnovescèllulesdesuportformades 

tambéesdisposenalaperifèriadelsneuromasts,ipodranproliferar,formantobédues 

cèllulesdesuport,obéunacèllulaciliadaiunacèlluladesuport,jaqueperla 

regeneraciódecèllulesciliades,lescèllulesdesuportduenatermeunaproliferació, 

formantunaaltracèlluladelseumateixtipusiunacèllulaciliada. 

Engeneral,vampoderobservarque48hdesprésd’esbandirelsembrionsdels 

ototòxics,jaespodiaapreciariambcertesa,larespostaperpartdelescèllulesde 

suportdelsneuromastsdelpeixzebra,ialgunesd’ellesjahavienproliferat,formant 

novescèllulesciliades.Noobstant,disposantdemésembrionsid’unabonatincióde 

lescèllulesenfaseM,podríemhaverestudiatambmésdetalllaregeneraciódeles 

cèllulesciliades. 

 

 

6.1.3.Sobreeltercerobjectiu:demostraciódelarelacióexistententrelarespostade 

lescèllulesdesuportdelsneuromastsdelpeixzebraielgraud’ototoxicitatdevàries 

substànciesadiferentsconcentracions 

 

Mitjançant la immunohistoquímica, aconseguim fer algunes observacions 

generalssobrelaregeneraciódelescèllulesciliadesenrelacióalesconcentracions 

delsototòxics.Primerdetot,podemdeduir–encaraqueelnombred’embrionsno 

siguisignificatiuqueaaltesconcentracions,algunsantibiòticspodentenirunefecte 

ototòxicirreversiblesobrelescèllulesciliades.Hemfetaquestaobservacióapartirde 

lesconcentracionsde10Mdegentamicinaid’azitromicina,jaqueelspocsembrions 

71

estantsdecadagrup,nomostrenpresènciadecèllulesdesuportenfaseSmentreels 

altresgrupsd’embrionsencomencenamostrarsignificativament.Noobstant,aixòpot 

serdegutaquel’altaconcentracióendarrereixmoltl’actuaciódelescèllulesdesuport 

quetambépodenhaverestatafectadesperlatoxicitat.Aixòensfapensarenuna 

possibleirreversibilitataconcentracionstanagressivescomhademostratser,sobretot, 

lagentamicinaa10M.Comparantamblaproliferacióqueencaraesprodueixalgrup 

decontrol,veiemqueelfetqueelspocsembrionsaconcentracionsde10Mtinguin 

demomentpresèncianullaomoltreduïdadecèllulesdesuportenfaseSalvoltant 

delsneuromasts,ensdemostraqueaaltesconcentracionsd’ototòxics,laregeneració,o 

béesprodueixaunritmemoltméslentqueaconcentracionsmenors,obés’arribaa 

unpuntenelqualladestrucciócausadaésirreversible. 

Amésamés,elsgrupsprovatsaconcentració5M,ensmostrenqueaquellsen 

elsqualss’haproduïtmajordestrucciódelescèllulesciliades,sónelsgrupsenelsquals 

lescèllulesdesuportofereixenunamenorrespostainicial,potserméslenta,enser 

tambéperjudicadesperlaototoxicitatdel’antibiòtic.Podemconcloure,doncs,quela 

respostadelescèllulesdesuportesprodueixabansiésmésevidentquanl’efecte 

ototòxicésmenoriquanlesconcentracionsd’ototòxicsnohanestatgaireelevades. 

 

 

6.2.CONCLUSIÓGENERALSOBRELESHIPÒTESIS 

 

En resum, la nostra part experimental ens permet confirmar i matisar la 

hipòtesiprincipal,idesmentirlahipòtesisecundàriaproposada.Enprimerlloc,hem 

demostratquetantl’azitromicinacomlaclaritromicinatenenunefecteototòxic 

sobrelescèllulesciliadesdelpeixzebra.Lasegonapartd’aquestaprimerahipòtesiha 

desermatisada,jaque,sibéésveritatqueengeneralladestrucciódelescèllules 

ciliades ésreversible,a concentracions molt elevades d’ototòxic, la destrucció pot 

esdevenirirreversible.Laconcentracióde10Mharesultatestarapropd’aquestpunt 

d’irreversibilitat en l’azitromicina, que com hem pogut comprovar, té un grau 

d’ototoxicitatsuperioralaclaritromicina. 

72

Ensegonlloc,hempogutdesmentirquelescèllulesdesuportprodueixinuna 

respostamésràpidacommajorhagiestatladestrucciódecèllulesciliades.Hem 

observat que succeeix el contrari: com major destrucció de cèllules ciliades s’ha 

produït,menoréslarespostaotrigamésenserdonadaperlescèllulesdesuport.Això 

ésdegutal’efectequeelsototòxicsnonomésprodueixensobrelescèllulesciliades, 

sinótambésobrelescèllulesdesuport.Ésadir,commajordestrucciódecèllules 

ciliades, més agressiu és l’antibiòtic, i més efecte té també sobre les cèllules 

responsablesdelaregeneració.Noobstant,nonoméshemdetenirencomptel’efecte 

ototòxic,jaquelaconcentraciódel’antibiòticjugaràunpapermoltimportant:amajors 

concentracions,menysrespostadelescèllulesdesuport. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

73

74

7.APLICACIÓPRÀCTICAIPOSSIBLESLÍNIESD’INVESTIGACIÓ 

 

Uncopacabadalanostrapartexperimental,veiemquehihadiferentsviesper 

lesqualshaguéssimpogutcontinuareltreball,obé,diferentspuntsquepodríem 

aprofundirsirepetíssiml’estudi. 

Enprimerlloc,ensagradariaferunestudimoltmésdetallatderegeneració, 

repetintlaimmunohistoquímicaambèxitentoteslestincions,iambunnombreelevat 

d’embrions,laqualcosanoenshaestatpossibledegutalamortd’unadelespostes. 

Aquestavegada,però,reduiríemelnombredegrupscontrolcreats,perexemple, 

nomésenposaríemunpercadaplaca,peraprofitarmésembrionsperlarestade 

grups. 

Tambépodríemduratermeelsexperimentsambconcentracionsd’ototòxics 

unamicaméselevadesiunamicapersotadelesprovades,jaquepodríemintentar 

observaraquinaconcentracióaproximadadecadaantibiòticladestrucciódecèllules 

ciliadesésirreversible,iaquinesl’efecteototòxicdelaclaritromicinaidel’azitromicina 

ésmínimoinexistent.Amésamés,repetirelsexperimentsambunotoprotectorcom 

lavitaminaE,sobrelaqualexisteixenmésestudis,enspermetriaobservarl’efecte 

otoprotectoradiferentsconcentracions. 

Ensagradariaestudiarambmésdetalllesdiferènciesexistentsentreototòxics 

antiapoptòticsiantioxidants,ipoderestudiarelsseusmecanismesd’actuacióamb 

mésdetall. 

Peraltrabanda,jaquelafinalitatdeltreballéslasevaaplicacióenl’espècie 

humana,haguésestatinteressantcompararunmodelderegeneracióambuncasde 

noregeneració(comsucceeixal’oïdahumana),experimentanttantambelpeixzebra 

comambunvertebratcomelratolí,perexemple.Tambéenspodríemorientarl’estudi 

enelcampdelagenètica,perintentarlocalitzarelsgensimplicatsenlaregeneració 

decèllulesciliadesperpartdelescèllulesdesuport. 

Elnostreestudifarmacodinàmic,téunaaplicaciópràcticaenl’espèciehumana, 

jaquehemidentificatdosfàrmacs,laclaritromicinailaazitromicina,ambefecte 

75

ototòxic sobre les cèllules ciliades dels neuromasts del peix zebra, que són les 

mateixes que a la nostra oïda. No obstant, és cert que les concentracions que 

produeixenunefectedestructiuenelpeixzebra,nosónequivalentsalesqueserien 

necessàriespercausarelmateixefecteenl’espèciehumana. 

Estudisderegeneraciódecèllulesciliadescomelnostre,sónelsquerealitzen 

elscientíficsperbuscarunamanerad’induirlaregeneraciódelescèllulesciliadesa 

través d’una proliferació de les cèllules de suport que envolten aquests 

mecanoreceptors.Elscientíficsestudienelstrasplantamentsdecèllulesmaresneurals 

ilateràpiagenèticaperinduircèllulesnosensorialsadiferenciarseacèllulesciliades. 

També s’intenten identificar aquells fàrmacs amb efecte ototòxic i possibles 

otoprotectorsperpoderadministrarenelspacientstractatsambototòxics.Lalluita 

contralasordesarequeriràuntreballconjuntentreclínics,científicsibioenginyers. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

76

8.BIBLIOGRAFIA 

 

ARTICLES 

 

1 BrigandeJV,HellerS.Quovadis,haircellregeneration?NatureNeuroscience 

2009;12(6):679685. 

2 BriggsJP.Thezebrafish:anewmodelorganismforintegrativephysiology.AmJ 

PhysiolRegulatoryIntegrativeCompPhysiol2002;282:R3R9. 

3 Coulston J, Balaratnam N. Irreversible sensorineural hearing loss due to 

clarithromycin.PostgradMedJ2005;81:5859. 

4 GoldsmithP.Zebrafishasapharmacologicaltool:thehow,whyandwhen. 

CurrentOpinioninPharmacology2004;4:504512. 

5 HarrisJA,Cheng AG, Cunningham LL, MacDonald G, Raible DW,Rubel EW. 

Neomycininducedhaircelldeathandrapidregenerationinthelaterallineof 

zebrafish(daniorerio).JARO04:219234(2003) 

6 HernándezPP,OlivariFA,SarrazinAF,SandovalPC,AllendeML.Regenerationin 

zebrafish lateral line neuromasts: expression of the neural progenitor cell 

markersox2andproliferationdependentandindependentmechanismofhair 

cellrenewal.DevelopmentalNeurobiology2007.DOI10.1002/dneu.20386. 

7 KimmelCB,BallardWW,KimmelSR,UllmannB,SchillingTF.Stagesof 

embryonicdevelopmentofthezebrafish.DevelopmentalDynamics1995;203: 

253310. 

8 KwanT,WhitePM,SegilN.Developmentandregenerationoftheinnerear.Cell 

cycle control and differentiation of sensory progenitors. International 

SymposiumonOlfactionandTaste:Ann.N.Y.Acad.Sci.(2009)1170:2833. 

9 MaEY,RubelEW,RaibleDW.Notchsignalingregulatestheextentofhaircell 

regenerationinthezebrafishlateralline.JNeurosci2008;28(9):22612273. 

10StreisingerG,WalkerC,DowerN,KnauberD,SingerF.Productionofclonesof 

homozygousdiploidzebrafish.Nature1981;291:293296. 

77

11TonC,ParngC.Theuseofzebrafishforassessingototoxicandotoprotective 

agents.HearingResearch2005;208:7988. 

12UzunC,KotenM,AdaliMK,YorulmazF,YagizR,KarasalihogluAR.Reversible 

ototoxic effect of azithromycin and clarithromycin on transiently evoked 

otoacusticemissionsinguineapigs.JLaringolOtol.2001;115:6228. 

LLIBRES 

13Campbell NA, Reece JB. Mecanismos sensitivos y motores. Biología. 7ª ed. 

Madrid.EditorialMédicaPanamericana;2007.p.10461054 

14CurtisH,BarnesNS.Ciclocelular:divisiónymuertedelascélulas.Biología.6ª 

ed.BuenosAires.EditorialMédicaPanamericana;2001.p.285288. 

15CurtisH,BarnesNS.Percepciónsensorialyrespuestamotora.Biología.6ªed. 

BuenosAires.EditorialMédicaPanamericana;2001.p.12721274. 

16GanongWF.Audiciónyequilibrio.FisiologíaMédica.14ªedición.MexicoDF. 

EditorialManualModerno;1994.p.181195. 

17GilbertSF.Lespremiersstadesdudéveloppementchezlesvertébrés:poisson, 

oiseauetmammifère.Biologiedudéveloppement.Gilbert2ªédition.Bruxelles. 

ÉditionsDeBoeck;2004.p.345355. 

18HickmanCP,RobertsLS,ParsonA.Coordinaciónnerviosa:Sistemanerviosoy 

órganosdelossentidos.Principiosintegralesdezoología.10ed.Madrid. 

McGrawHillInteramericana;2000.p.734741. 

19HickmanCP,RobertsLS,ParsonA.Lacélulacomounidaddelavida.Principios 

integralesdezoología.10ed.Madrid.McGrawHillInteramericana;2000.p.56 

61. 

20NetterFH.AtlasofHumanAnatomy.1989.Basel.CIBAGEIGYLimited.Plate87 

93. 

21OrtsLLorcaF.Nerviossensorialesespecializados.Nerviococlearyvíaacústica. 

AnatomíaHumana.TomoII.5ªedición.Barcelona.EditorialCientíficoMédica; 

1977.p.375390. 

78

22SilverthornDU.Fisiologíasensitiva.Fisiologíahumana:unenfoqueintegrado. 

BuenosAires.EditorialMédicaPanamericana;2008.p.347357 

23SobottaJ,BecherH.AtlasdeAnatomíaHumana.TomoIII.1ªedición.Barcelona. 

EdicionesToray,S.A;1974.p.160189. 

24SuárezC,GilCarcedoLM,MarcoJ,MedinaJE,OrtegaP,TrinidadJ.Otología. 

TratadodeOtorrinolaringologíayCirugíadecabezaycuello.TomoII.2ªedición. 

Madrid.EditorialMédicaPanamericana;2007.p.1647. 

25VelascoA,SanRománL,SerranoJ,MartínezSierraR,CadavidI.AntibióticosIV. 

FarmacologíaFundamental.Madrid.McGrawHillInteramericana;2003.p.804 

807. 

26WesterfieldM.Thezebrafishbook.Aguideforthelaboratoryuseofzebrafish 

(Daniorerio).UniversityofOregon.Edition3;1995. 

27YoungJZ.Dominiodelagua:pecesóseos.Lavidadelosvertebrados.3ªedición. 

PÀGINESWEB 

 

 

 

 

 

 

 

 

Barcelona.EdicionesOmegaSA;1980.p.189208. 

 

28GleasonMR,NagielA,JametS,VologodskaiaM,LópezSchierH,HudspetchAJ. 

Thetransmembraneinnerear(Tmie)proteinisessentialfornormalhearingfor 

normalhearingandbalanceinthezebrafish.PNASEarlyEdition2009. 

Referència:www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0911632106.Datade 

consulta:15demaigde2010. 

29VogtR.Zebrafishbionetmethodsarchive.Referència:http://zebra.sc.edu.Data 

deconsulta:Datadeconsulta:2d’abrilde2010. 

79

80

9.ANNEX 

 

CÀLCULSPERPREPARARLESDISSOLUCIONSIDILUCIONSSTOCK 

DELSFÀRMACS 

 

Lesmassesmolarsón:C=12,01g/molH=1,0079g/molN=14,01g/molO=16g/mol 

 

Gentamicina 

Gevramycin®injectable,1ampollade2ml.Laboratori:ScheringPlough.Composició:80 

mgdesulfatdegentamicinaperampolla.Excipients:bisulfitsòdic,edetatdisòdic, 

metilparabè,propilparabèiaiguaperinjectables. 

 

LasevafórmulaésC21H43N5O7ipertantlasevamassamolarés477,5997g/mol. 

Volem una dissolució stock a 500 M= 5*(10^4) M, i calculem la quantitat que 

agafaremdelasegüentmanera: 

(5*(10^4)mol/L)*(1L/1000ml)*(477,5997g/mol)=2,4mg/ml 

Entenirlalíquida,hohemdepassaraml: 

Comquealpottenim40mg/ml,perunaregladetresobtenimque2,4mgequivala 

0,06mldegentamicina.Al’stockposarem0,06mldegentamicinai0,94mldeSystem 

water. 

 

Claritromicina 

Klacid®ensobresde500mg.Laboratori:Abbot.Composició:500mgdeclaritromicina 

persobre.Excipients:sacarosa,olidericí,aromesialtres. 

 

LasevafórmulaésC38H69NO13ipertantlasevamassamolarés747,9351g/mol. 

Volemunadissolucióstockde500M=5*(10^4)M,icalculemlaquantitatque 


(5*(10^4)mol/L)*(1L/1000ml)*(747,9351g/mol)=3,739*(10^3)g/ml3,7mg/ml 

Noobstant,quanpreparemunstockamb7,4mgi2mldeSystemwater,veiemquela 

claritromicinanoesdissol,iprepareml’stockenrasantfinslamarcade40mldelfalcon. 

81

Ésadir,l’stockcontindrà7,4mgdeclaritromicinaigairebé40mldeSystemwater, 

quedant l’stock a 0,185 mg/ml, que és 20 vegades menys que els que voliem 

inicialment.L’stockésde25M. 

 

Azitromicina 

AzitromicinaratiopharmEFGensobresde250mg.Composició:250mgd’azitromicina 

persobre.Excipients:sacarosa,aromesialtres. 

 


Volemunadissolucióstockde500M=5*(10^4)M,icalculemlaquantitatque 



Noobstant,quanprepareml’stockamb3,4mgi1mldeSystemwater,veiemque 

l’azitromicinanoesdissol,iafegim1mldemedi.Finalment,l’stockconté3,4mgde 

claritromicinai2mldeSystemwater,quedanta250M. 

 

VitaminaC 

Redoxon® en comprimits efervescents de 1000 mg. Composició: 1000 mg d’àcid 

ascòrbic(vitaminaC)percomprimit.Excipients:bicarbonatdesodi,carbonatdesodi 

anhidre,clorurdesodi,aspartamialtres. 

 


Volem una dissolució stock de 20 mM= 2*(10^2) M, i calculem la quantitat que 



L’stockéspreparatamb3,5mgdevitaminaCi1mldeSystemwater. 

82

Les cèl·lules ciliades ototoxicitat i regeneració - Silvia Asenjo - Aula

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?