IMMUNOHISTOQUÍMICA Protocol general. Microscopia òptica.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
Pàg. 1 de 8
C 5.1.3
1.- Fonament i objectiu de la prova
1.1. Fonament:
La tècnica està basada en la unió específica d’un anticòs (monoclonal o policolnal) a un antígen
determinat que es troba “in situ” en un teixit que l’expressa. Posteriorment es visualitza aquesta unió
a través de la utilització d’un sistema de detecció.
1.2. Objectiu:
Visualització i quantificació, si s’escau, d’un antígen determinat en un teixit concret.
1.3. Utilitat:
2.- Espècimen
L’espècimen inicial per fer una tinció immunohistoquímica serà un teixit determinat que hagi estat
fixat e inclòs en parafina o fixat i criopreservat. Posteriorment s’obtindran seccions o crioseccions
d’aquests teixits per realitzar la tècnica. El tractament serà l’adequat en cada cas.
3.- Reactius, controls i altres materials
Segons sigui el protocol a realitzar podem necessitar alguns reactius més específics.
Reactius i material indispensables:
- Cambra humida.
- Paper d’alumini.
- Paper de filtre.
- Solució PBS 100 mM – Glicina 20 mM.
- Solució PBS 100 mM.
- Aigua oxigenada (Peròxid d’hidrògen al 3%) (Cuve, 702373).
- Anticòs primari.
- Anticòs secundari i sistema de detecció.
- Substrat - Cromogen: generalment 3,3’ diaminobenzidine (D.A.B.) (Dako, K3466).
- Flascons de Coplin
- Xilol.
- Alcohol absolut.
- Alcohol de 96º.
- Aigua corrent.
- Aigua desionitzada.
- Cistelles per cubetes.
- Cubetes de tinció amb tapa.
- Medi de muntatge D.P.X.
- Cubreobjectes de vidre.
Reactius opcionals:
- BSA : Albúmina Bovina (Sigma, A-3803).
- Tritó X 100 (Merck,11869.1000).
- Sèrum de ratolí o sèrum humà.
- Estreptavidina conjugada amb peroxidasa (BioGenex, HK330-9K).
- Proteinasa K.
- Tampó citrat.
- H2O2.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
4.- Instrumentació
Segons el protocol concret podem necessitar:
- Estufa a 37ºC.
- Microscopi òptic (Nikon, Eclipse E600).
- Agitador magnètic Heidolph.
- Microones.
Pàg. 2 de 8
C 5.1.3
5.- Control de qualitat
És totalment recomanable, cada cop que es vol fer una tècnica immunohistoquímica, reservar un tall
per a realitzar un control negatiu de l’anticòs primari.
Procediment: En aquest cas, s’han de seguir tots els passos del protocol exceptuant que en el pas
d’incubació de l’anticòs primari en els controls negatius NO S’AFEGEIX AQUEST ANTICÒS (sinó
que s’afegeix una solució de BSA 1% sense l’anticòs).
Resultats: El tall ha de quedar completament negatiu i no ha de presentar senyal positiva, doncs ens
assegurem que la unió de l’anticòs secundari al primari és totalment específica.
6.- Procediment
El procediment a seguir consta bàsicament dels següents passos que es presenten tot seguit
de forma esquemàtica:
- Preparació de la mostra.
- Pretractament de la mostra.
- Bloqueig de llocs inespecífics.
- Incubació amb l’anticòs primari.
- Incubació amb l’anticòs secundari.
- Detecció.
- Contratinció.
- Deshidratació i muntatge.
A continuació es desenvoluparan més detalladament cadascun dels passos i les seves
opcions:
6.1. Preparació de la mostra:
A. Crioseccions de mostres en fresc:
- Descongelar els portaobjectes durant 5 min aproximadament a Tª ambient.
- Portar els portaobjectes a l’estufa de 37ºC i incubar durant 15 min. Aquest pas
és opcional, en alguns casos serà útil fer-lo mentre que en altres no caldrà.
Aquesta opció haurà de ser testada en les proves de posta a punt de
cadascuna de les tècniques en concret.
- Acabada la incubació, deixar refredar durant 15 min a Tª ambient. Si no s’ha
incubat a 37ºC es passa directament al següent pas.
- Hidratar la mostra: Submergir els portaobjectes en un flascó de Coplin que
conté una solució de PBS (100 mM) - Glicina (20 mM) durant 10 min a Tª
ambient i en agitació suau.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
B. Mostres parafinades
Pàg. 3 de 8
C 5.1.3
- Desparafinar e hidratar la mostra segons el protocol corresponent (20 minuts a
80ºC + 5 min atemperant-se + 10 min en xilol + 10 min en xilol + 5 min en
etanol absolut + 5 min en etanol 95º +5 min en etanol 70º + rentar en aigua
corrent + rentar en aigua destil·lada).
6.2. Pretractament de la mostra:
Segons siguin les característiques del teixit, l’antígen a determinar, l’anticòs 1ari, el sistema
de detecció, etc... pot ser necessari fer un pretractament determinat.
Per exemple: permeabilitzar les membranes per antígens citoplasmàtics o nuclears, fer un
desenmascarament de l’antígen, bloquejar la biotina endògena en teixits amb molta expressió
on ens provoca soroll de fons, etc...
En aquest apartat explicarem el procediment per fer tots els pretractaments possibles que
posteriorment aplicarem a les tècniques d’immunohistiquímica concretes.
A. Permeabilització de les membranes amb tritó:
Utilitat: Aquest tractament pot ser necessari quan pretenen detectar un antígen que
es troba a l’interior de la cèl·lula (p.e. al citoplasma).
Procediment:
- Submergir els portaobjectes en un flascó de Coplin que conté una solució de
PBS (100 mM) - Glicina (20 mM) – Tritó (0.5%) durant 10 min a Tª ambient i en
agitació.
- Rentar submergint dues vegades els portaobjectes en un flascó de Coplin que
conté una solució de PBS (100 mM) –Glicina (20 mM) 5 minuts en agitació a Tª
ambient.
B. Bloqueig de la peroxidasa endògena:
Utilitat: Aquest pas es necessari sempre que utilitzen un sistema de detecció basat en
la reacció d’una peroxidasa (unida a un anticòs) que provoqui la precipitació d’un
cromògen. Generalment utilitzem els sistema ABC que necessita indispensablement
d’aquest pas.
Procediment:
- Preparar una cambra humida protegida de la llum, per tal de poder portar a
terme les successives incubacions.
- Afegir prou H2O2 (al 3%) per cobrir completament el teixit.
- Incubar en cambra humida a temperatura ambient durant 25 min.
- Acabat el temps d’incubació, amb l’ajut de paper de filtre o xuclant, retirar el
líquid què cobreix la mostra.
- Rentar 2 cops durant 4 min a Tª ambient amb PBS (100 mM) - Glicina
(20 mM) en agitació suau.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
C. Bloqueig de la biotina endògena:
Pàg. 4 de 8
C 5.1.3
Utilitat: Aquest pas es necessari en aquells casos en que la biotina endògena del teixit
ens provoca soroll de fons degut a que s’utilitza un sistema de detecció basat en la unió
de la biotina amb l’estraptavidiva com son els sistemes ABC.
Procediment:
- Afegir sobre els teixit una solució bloquejant de la biotina e incubar a Tª
ambient durant 20 minuts en cambra humida. Explicar marca.
- Rentar amb PBS 2 vegades durant 4 minuts, a Tª ambient i en agitació
suau.
- Afegir sobre els teixit una solució bloquejant de l’avidina e incubar a Tª
ambient durant 20 minuts en cambra humida. Explicar marca..
- Rentar amb PBS 2 vegades durant 4 minuts, a Tª ambient i en agitació
suau.
D. Desenmascarament antigenic per calor
Utilitat: Aquest pas permet la exposició d’antigens que d’altra forma quedarien amagats
i generalment amb mostres parafinades. S’utilitza sempre que ho recomani l’anticòs
primari o també quan altres formes de permeabilització no donen el resultat desitjat. Es
tracta d’un mètode més agressiu que no pas la permeabilització amb tritó.
Procediment:
- Posar els portaobjectes amb la mostra dins d’una cubeta de plàstic (el vidre
es pot trencar) amb tampó citrat 1X i tapar-ho una mica (no del tot).
- Incubar-los durant 3 minuts al microones a la potència intermitja (vigilant que
no es vessi tot el líquid).
- Destapar la cubeta i deixar refredar durant 1 minut.
- Tornar a incubar al microones 3 minuts més dues vegades, reposant
entremig 1 minut.
- Deixar atemperar la mostra, aproximadament 20 minuts. Podem afegir
tampó citrat fred per accelerar el procés de refredament.
- Rentar amb PBS 2 vegades durant 5 minuts en agitació suau.
E. Digestió amb proteinasa K
Utilitat: Aquest mètode serveix per exposar antígens que quedarien amagats i es basa
en la digestió proteica per part de la proteinassa K. Es més agressiu que altres mètodes
i hi ha antígens que no resisteixen aquest tractament.
Procediment:
- Disposar els portaobjectes en una cambra humida i afegir damunt del teixit
una solució de proteinasa K a una concentració de 20 µM en PBS 1X.
- Incubar-ho a Tª ambient durant 15 minuts.
- Rentar dues vegades els portaobjectes dins d’una cubeta copplin amb PBS
en agitació suau 5 minuts.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
6.3. Bloqueig de llocs inespecífics:
Pàg. 5 de 8
C 5.1.3
Desprès que les mostres hagin rebut el seu pretractament adequat es procedeix a la
incubació amb l’anticòs primari (específic per l’antígen que volem detectar), però abans cal fer
un pas extra per bloquejar els llocs inespecífics.
Aquest bloqueig es realitza seguint el mateix procediment però poden utilitzar-se diferents
agents bloquejadors en funció de les característiques de la mostra o del sistema de detecció
que farem servir desprès.
El procediment és el següent:
• Eixugar l’excés de líquid dels voltants del teixit.
• Afegir damunt del teixit la quantitat suficient de l’agent bloquejant.
• Incubar durant un temps variable entre 15 minuts i 1 hora (a testar). A Tª ambient i en
cambra humida. També es pot deixar over nigh a 4ºC.
Els agents bloquejants a utilitzar poden ser:
BSA:
Es tracta d’albúmina sèrica bovina. Aquest és l’agent més utilitzat per bloquejar la unió de
llocs inespecífics. S’utilitza a una dilució del 2% en PBS 1X.
Sèrum:
Moltes vegades, sobretot quan es treballa amb teixits animals, podem trobar-nos amb
problemes de soroll de fons. Algunes de les unions inespecífiques responsables del soroll
poden eliminar-se incubant la mostra amb el sèrum de la seva mateixa espècie, que conté
immunoglobulines. Així, si determinem un antígen en teixit de ratolí afegirem sèrum de ratolí i
si ho fem en rata sèrum de rata.
Aquest sèrum es fa servir dissolt al 10% en PBS 1X.
Agents comercials:
La majoria de sistemes de detecció comercials que s’utilitzen actualment disposen ja dels
seus propis reactius per fer el pas del bloqueig. Generalment també a base de BSA o similars.
6.4. Incubació amb l’anticòs primari:
Immediatament desprès de retirar el bloquejador cal afegir l’anticòs primari. Aquest estarà
dissolt en una solució variable, generalment BSA al 1% tot i que també pot diluir-se en una
solució comercial. Algunes vegades serà necessari afegir altres reactius en aquesta dilució
per exemple sèrum de l’espècie del teixit on volem determinar l’antígen (aquest sèrum pot
ajudar a reduir el soroll de fons bloquejant llocs inespecífics que encara estan descoberts).
Els elements claus d’aquest pas són:
La dilució:

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
Pàg. 6 de 8
C 5.1.3
La dilució de l’Ab 1ari pot ser molt variable, des de 1/25 a 1/10000, en funció de les
característiques d’aquest i de la mostra. Aquest és un dels paràmetres que són testats
a posar un tècnica d’immunohistoquimica a punt (i generalment es comença a testar
segons les recomanacions del fabricant).
El temps d’incubació:
Aquest és l’altre paràmetre que s’ha de testar al posar a punt la tècnica. La variabilitat
pot ser també molt gran ja que alguns anticossos comercials donen bona senyal amb
només 30 minuts d’incubació a Tª ambient mentre que altres necessitaran incubacions
de fins a 24 hores a 4ºC. Altre cop començarem a testar segons les recomanacions del
fabricant.
Un cop s’ha complert el temps d’incubació previst es renten dues o tres vegades els
portaobjectes amb PBS-glicina durant 4 minuts en agitació suau.
6.5. Incubació amb l’anticòs secundari:
En aquest pas el més important és tenir en comte l’origen del l’anticòs primari. Cal que aquest
sigui reconegut per l’anticòs secundari, es a dir, si hem treballat amb un anticòs produït en
ratolí l’Ab 2ari ha de reconèixer les IgG de ratolí (ser anti-mouse) , etc.
Existeixen alguns anticossos 2aris que poden reconèixer diversos tipus d’Ab 1aris, degut a les
reaccions creuades entre diferents espècies. Aquests Ab es solen anomenar Broad spectrum i
molts cops formen part de sistemes de detecció comercials. Per aquest motiu el control que
l’investigador pot exercir sobre la seva dilució és molt menor.
La dilució de l’Ab 2ari també és un paràmetre a testar en la posta a punt. Els Ab de kits
comercials solen estar preparats per al seu us i en canvi altres s’han de diluir (generalment
amb PBS-BSA 1% o PBS-sèrum 10%).
El temps d’incubació també és un paràmetre a testar. Un cop completat el temps rentar
adues vegades amb PBS-glicina en agitació suau.
Les característiques del Ab 2ari utilitzat ens determinaran els següents passos a realitzar:
Anticòs 2ari Detecció Nota
Conjugat amb peroxidasa Directament afegir el substrat
cromògen de la peroxidasa, DAB
generalment.
Conjugat amb biotina Cal afegir el complex biotina
estreptavidina i desprès el substrat
cromògen.
Sistema de detecció que no
amplifica la senyal.
El complex estreptavidina
biotina forma una malla que
amplifica el senyal de
l’anticòs 1ari.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
No conjugat Cal afegir un Ab 3ari específic
contra les Ig de l’espècie on s’ha
generat l’Ab 2ari i desprès actuar
segons aquest Ab 3ari sigui
biotinilat o conjugat amb
peroxidasa.
6.6. Detecció:
Detecció en el cas d’Ab 2ari conjugat amb peroxidassa (Ab 2ari-Px):
Pàg. 7 de 8
C 5.1.3
Aquest sistema també
amplifica la senyal.
− Rentar els portaobjectes dues o tres vegades amb PBS en agitació suau.
− Mentre es renten, preparar la solució de treball del DAB (diaminobenzidina). Es
barregen 20 µL de cromogen DAB amb 1 mL de Buffer solution.
− Eixugar l’excés de PBS i afegir prou DAB per cobrir el teixit a tenyir. Cal
visualitzar el revelat al microscopi per aturar la reacció de precipitació del
cromògen quan calgui. Generalment el temps de revelat ha d’estar entre 1 i 6
minuts.
− Un cop el revelat sigui suficient submergir els portes en aigua destil·lada.
Rentar-los 1 minut dues vegades i 5 minuts més.
− Un cop acabat aquest pas es pot passar ja a fer la contratinció.
Detecció en el cas d’Ab 2ari conjugat amb biotina (Ab 2ari-Bio):
− Rentar els portaobjectes dues o tres vegades amb PBS-glicina en agitació
suau.
− Afegir prou quantitat del complexe avidina-streptavidina per cobrir tot el teixit.
Aquest complexe protèïc té gran afinitat per la biotina de l’Ab 2ari i s’uneix
fortament a ella creant-se un entramat que amplifica el senyal.
− Incubar-ho a Tª ambient entre 15 minut i 1 hora. L’estreptavidina està
conjugada amb peroxidasa i per tant desprès d’aquest pas haurem de
prosseguir tal com s’indica en el cas de la detecció amb Ab 2ari-Px.
Detecció en el cas d’Ab 2ari no conjugat:
− Rentar els portaobjectes dues o tres vegades amb PBS-glicina en agitació
suau.
− Eixugar l’excés de PBS-glicina.
− Afegir prou quantitat de Ab 3ari per cobrir tot el teixit e incubar-ho a Tª ambient
un temps variable entre 15 minuts i 2 hores.
− Un cop acabat el temps d’incubació procedir segons calgui en funció que
aquest Ab 3ari sigui conjugat amb peroxidasa o biotina.
6.7. Contratinció:
- Cobrir cada tall amb Hematoxilina de Mayer.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
- Incubar a temperatura ambient durant 1min.
- Rentar amb aigua corrent fins que el portaobjectes estigui net.
- Rentar amb aigua destil·lada.
6.8. Deshidratació i muntatge:
Pàg. 8 de 8
C 5.1.3
Passar la cistella amb el portaobjectes per la bateria de deshidratació que conté les
següents sol·lucions en aquest mateix ordre:
- Alcohol 96º, incubar uns 30 s.
- Alcohol absolut, incubar durant 30 s.
- Alcohol absolut-xilol (50%), incubar durant 3 min.
- Xilol 1, incubar durant 3 min.
- Xilol 2, incubar durant 3 min.
- Xilol 3, incubar durant 3 min.
- Submergir en una solució que contè xilol-eucaliptol durant un mínim de 5”. NOTA:
Aquest pas és opcional, doncs tant sols té per finalitat augmentar la lluentor de la
preparació.
- Afegir D.P.X. sobre la preparació, cobrir amb un cubreobjectes i retirar l’excés de medi
de muntatge.
7.- Informe dels resultats
8.- Anotacions i limitacions del procediment
9.- Bibliografia
10.- Distribució de resultats
Annex 1. Solucions
Solució de stock PBS (10x)
PBS 100 mM.
80 g NaCl
2 g KCl
14,4 g Na2HPO4
2,4 g KH2PO4
Enrasar fins a 1 L amb H2O MQ
Es pot comprovar el pH, però si s’ha fet bé ha de donar 7,4
100 mL solució de stock PBS (10x)
900 mL H2O MQ
PBS 100 mM – Glicina 20mM.
1.5 g. Glicina
1000 mL PBS 100 mM
PBS 100 mM – Glicina 20 mM- Tritó (0.5%)

BSA 2%
BSA 1%
Sèrum 10%
HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
100 mL PBS 100 mM – Glicina 20 mM
500 µL Tritó
10 mL. PBS 100 mM
0.2 g. BSA
Fer alíquotes de 1 mL. i emmagatzemar a –20ºC.
500 mL PBS 100 mM
500 mL BSA 2%
Emmagatzemar a –20ºC.
40 µL de sèrum
360 µL de PBS 100 mM – Glicina 20 mM.
Pàg. 9 de 8
C 5.1.3

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
Annex 2. Fitxa protocol-reduït IHQ
IMMUNOHISTOQUÍMICA DE......
Característiques de la mostra:
Tipus de teixit:
Crioseccions
Seccions parafinades
Tipus de fixació recomanada:
Característiques dels AB:
Procediement:
Gruix del tall:
AB 1ari: Indicar quin és.... FONT On es fa (hoste)?
AB 2ari: Quin? FONT CONJUGAT PX
Preparació i pretractament de la mostra
Bloqueig de llocs inespecífics e incubació AB 1ari
Bloquejar amb..................... TEMPS
Rentar desprès del bloqueig: SI NO
Incubar amb l’AB 1ari DILUCIÓ TEMPS
Rentar
AB 2ari i detecció
DILUENT
Incubar amb l’AB 2ari DILUCIÓ TEMPS
DILUENT
Pàg. 1 de 8
C 5.1.3

Rentar
HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 1
Laboratoris Clínics – CRB Data:
30/06/03
IMMUNOHISTOQUÍMICA
Protocol general. Microscopia òptica.
Detectar amb......
Contratinció i muntatge
Controls porsitius:
Pàg. 2 de 8
C 5.1.3