Electroforesi discontinua desnaturalitzant. SDS-PAGE - CRBReus

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 0
Laboratoris Clínics – CRB Data: 1/1/94
Electroforesi discontinua
desnaturalitzant.
SDS-PAGE
Pàg. 1 de 6
B 4.1.1.
1.- Fonament i objectiu de la prova
1.1. Fonament:
Separació de proteïnes en un gel vertical de poliacrilamida discontinu. Les proteïnes són
tractades amb un detergent aniònic (SDS) que els dóna càrrega (la quantitat de càrregues
és constant per unitat de pes molecular de la proteïna). En el gel les proteïnes corren de
manera inversament proporcional al seu pes (com més petites més corren).
1.2. Objectiu:
La finalitat d'aquesta prova és la separació d'una barreja de proteïnes en funció del seu
pes molecular, amb la possibilitat d'esbrinar-ne el valor en cas de que sigui desconegut.
1.3. Utilitat:
Sovint una electroforesi és un pas previ a una altra tècnica, com per exemple l'immunoblot.
2.- Espècimen
Sol ser una suspensió aquosa de proteïnes soles o amb altres substàncies. Per exemple:
plasma, orina, homogenat cel·lular, medi de cultiu, proteïnes d'un procés de purificació,
fraccions d'una cromatografia etc.
Cal tenir present que el procés de tractament de les mostres desnaturalitza les proteïnes i
per tant aquestes perden les propietats depenents de llur estructura.
3.- Reactius, controls i altres materials
- Tris
- glicina
- HCl
- SDS
- DTT (Ditiotreïtol)
- Iodoacetamida
- glicerol
- blau de bromofenol
- acrilamida i bisacrilamida
- TEMED
- persulfat amònic
- pipetes, vidres, suport del gel, pintes etc.
4.- Instrumentació
- Aparell d'electroforesi (MIGHTY SMALL). Consta d'una font d'alimentació i d'una cubeta
amb suport per al gel
5.- Control de qualitat
No hi ha control de qualitat.
6.- Procediment
6.1. Muntatge dels vidres de suport
6.1.1. Netejar els vidres primer amb aigua i després amb etanol absolut.
6.1.2. Muntar el "sandwitch" amb els separadors i colocar-lo en el suport adequat
(veure Figura 1).

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 0
Laboratoris Clínics – CRB Data: 1/1/94
Electroforesi discontinua
desnaturalitzant.
SDS-PAGE
Pàg. 2 de 6
B 4.1.1.
6.2. Muntatge del gel d’acrilamida
6.2.1. Preparar el gel separador “resolving” al percentatge necessari en funció
del tamany del fragment en què treballem (veure annex)
6.2.2. Omplenar l’espai entre els vidres d’acrilamida fins a una alçada suficient
perquè ens càpiga posteriorment la pinta dels pouets (fer-ho ràpid perquè
no polimeritzi).
6.2.3. Acabar d’omplir fins a dalt amb aigua per evitar el contacte amb l’aire que
impedeix la polimerització (el temps aproximat de polimerització és de
30').
6.2.4. Preparar el gel concentrador (“stacking”), 3 mL de solució per dos gels
prims (10x7,5x 0,1), deixar polimeritzar 15' aprox.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 0
Laboratoris Clínics – CRB Data: 1/1/94
Electroforesi discontinua
desnaturalitzant.
SDS-PAGE
Pàg. 3 de 6
B 4.1.1.
6.3 Preparació de les mostres
6.3.1. Les mostres cal preparar-les amb tampó de mostra diluït en proporció 1x.
6.3.2. Diluir les mostres si cal amb 0.4 M Tris.
6.3.3. Diluir les mostres 1/5 amb el tampó desnaturalitzant (amb o sense DTT).
6.3.4. Escalfar les mostres 10 minuts a 100 ºC (només les que tenen DTT).
6.3.5. A les mostres escalfades afegir-hi 1/10 del volum de iodoacetamida i
deixar-les 30 minuts a temperatura ambient.
6.4. Carregament de les mostres
6.4.1. Muntar els gels en la cubeta d’electroforesi.
6.4.2. Omplenar la cubeta interior i exterior amb tampó d’electroforesi.
6.4.3. Carregar les mostres (20 mL en cada pouet com a màxim).
6.4.4. Connectar els electrodes a la font d’alimentació i córrer el gel a 150-200 V.
Quan el front del colorant blau de bromofenol ha arribat a l’extrem del gel
parar l’electroforesi.
7.- Informe dels resultats
8.- Anotacions i limitacions del procediment
Si les mostres són pel fenotip de Lp (a) cal una electroforesi de 6 hores perquè la proteïna
és molt gran i sinó no ens arribaria a entrar dins el gel. Per tant doncs canvien les
condicions de manera que la primera hora es fa passar un voltatge de 100 V a través del
gel i les 5 hores restants s’aplica un voltatge de 300. Cal tenir amb compte que aquesta
electroforesi s’escalfarà molt de manera que cal connectar-la a un sistema de refrigeració,
per exemple un MultiTemp II de Pharmacia.
9.- Bibliografia
10.- Distribució de resultats
Annex
Solució d’acrilamida al 30%(29,2% T, 0,8% C)
58,4 g d’acrilamida
1,6 g de bisacrilamida
fins a 200 mL d’aigua
Filtrar. Guardar protegit de la llum i a 4ºC.
Tampó del gel separador (Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8)
36,3 g Tris
fins a 200 mL d’aigua
Filtrar. Ajustar el pH a 8,8 amb HCl, guardar a 4ºC.

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 0
Laboratoris Clínics – CRB Data: 1/1/94
Electroforesi discontinua
desnaturalitzant.
SDS-PAGE
Tampó gel concentrador (Tris-HCl 0,5 M , pH 6,8)
3 g Tris
fins a 50 mL amb aigua
Filtrar. Ajustar el pH a 6,8 amb HCl.
10% SDS
50 g SDS
fins a 500 mL amb aigua
10% Persulfat amoni (APS)
0,5 g APS
fins a 5 mL d’aigua
Cal preparar-ho al moment.
Pàg. 4 de 6
B 4.1.1.
Tampó pre-tractament de les mostres (Tris HCl 0,125 M , pH 6,8; 4% SDS, 20%
glicerol, 10% DTT)
2,5 mL de tampó de gel concentrador
4 mL de SDS 10%
2 mL glicerol
1 mL DTT
fins a 10 mL d’aigua
Es pot aliquotar i congelar.
4x Tampó d’electroforesi.
12 g Tris
57,6 g glicina
40 mL de SDS 10%
fins a 4 L d’aigua
No cal ajustar el pH.
Tampó desnaturalitzant reductor (Tris HCl 0,4 M. pH 8,0; 4% SDS, DTT 32 mM; blau
de bromofenol; orange G; 25% (v/v) glicerol)
0,97 g Tris dissolts en 15 mL d’aigua (ajustar el pH a 8,0 amb HCl concentrat)
0,8 g SDS
0,0098 g DTT
un polsim de blau de bromofenol i d’ orange G
afegir 5 mL de glicerol i barrejar bé (fer servir l’agitador magnètic a 50ºC)
. Aliquotar-ho i guardr-ho congelat
Tampó desnaturalitzant no reductor
Igual que l’anterior però sense DTT
Tampó de dilució de les mostres
Tris-HCl 0,4 M , pH 8,0

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 0
Laboratoris Clínics – CRB Data: 1/1/94
Electroforesi discontinua
desnaturalitzant.
SDS-PAGE
Iodoacetamida
20% iodoacetamida en Tris-HCl 0,4 M , pH 8,0 (0,2 g en 1 mL)
Cal preparar-ho al moment.
Pàg. 5 de 6
B 4.1.1.
Volum de reactius necessari per a dos gels separadors petits i prims (veure mides
al protocol)
Gel separador (5 mL):
6% 8% 10% 12% 15%
mL
aigua 2.7 2.3 2.0 1.7 1.2
30% acrilamid/bisac 1.0 1.3 1.7 2.0 2.5
Tris 1,5 M pH 8,8 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3
10 % SDS 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
10 % APS 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.004 0.003 0.002 0.002 0.002
Gel concentrador (3 mL) :
mL
aigua 2,1
30% acrilamid/bisac 0,5
Tris 1,0 M, pH 6,8 0,38
10% SDS 0,03
10% APS 0,03
TEMED 0,003

HOSPITAL UNIVERSITARI SANT JOAN DE REUS Revisió: 0
Laboratoris Clínics – CRB Data: 1/1/94
Electroforesi discontinua
desnaturalitzant.
SDS-PAGE
Protocol realitzat per: Elisabet Vilella
Pàg. 6 de 6
B 4.1.1.