Daniela del Pilar Fernandois Vicencio - Tesis Electrónicas ...

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Bloqueo farmacológico de los receptores
β-adrenérgicos en ratas en el periodo de
subfertilidad
Daniela del Pilar Fernandois Vicencio
Tesis para optar al grado académico de
Magister en Bioquímica, área de especialización en
Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular
Memoria para optar al título profesional de
Bioquímica
Director de tesis y Profesor patrocinante
Dr. Alfonso Paredes Vargas
Santiago de Chile
2011

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE MAGISTER
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas que la Tesis de Magister presentada por el candidato:
DANIELA DEL PILAR FERNANDOIS VICENCIO
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para
optar al grado de Magister en Bioquímica, área de especialización en
Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, en el examen de defensa de
Tesis rendido el día ……de Noviembre del 2011.
Director de Tesis:
Dr. Alfonso Paredes Vargas _____________________
Comisión Informante de Tesis:
Dra. Jenny Fiedler T. (Presidente) _____________________
Dra. María Cecilia Johnson P. _____________________
Dr. Guillermo Díaz A. _____________________
ii

“De nada vale la ciencia si
no se convierte en
conciencia”
Carlo Dossi (1849-1910)
iii

Agradecimientos
Quiero dedicarle este trabajo a mis padres, Mª Cristina y Jorge, por hacer de mí la persona
que hoy soy, por estar siempre, siempre conmigo y apoyarme de forma incondicional. A mi familia
completa, mis hermanos Lily y Coke, por todos los hermosos momentos que hemos compartido
juntos y por tener la suerte de tenerlos como hermanos, a mi adorada prima Mony por acompañarnos
siempre y en cada momento de nuestras vidas, a mi abuelita por consentirme cada vez que pudo,
darme amor y cariño incondicional, a mi sobrina Camila por traer alegría en el momento que más se
necesitaba.
A mi pololo Sergio, por quererme, apoyarme incondicionalmente, por todos los tecitos y
soportarme todo este tiempo que hemos estado juntos, porque quien me conoce, sabe que no ha sido
una tarea fácil. Te amo mucho cielo.
A todos los amigos que he cosechado durante el transcurso de mi carrera, a mis compañeros
de generación, por ser siempre una buena razón para ir a las clases y tener un buen día, especialmente
a mis amigas más cercanas, Michelle y Pao, gracias por darme su amistad y momentos geniales, que
espero sigan ocurriendo.
A mis compañeros de laboratorio, al Gonzalo, Rafa, Jonathan, Fabián, Daniel, Manuel,
Beatriz, Monika, Leticia, Sra Rafaela, gracias por los buenos momentos, dentro del laboratorio, así
como en “aquellas” salidas extraprogramáticas, gracias por la alegría del día a día, por sus consejos
y ayuda, sin los cuales este trabajo no sería el mismo, pero por sobre todo, muchísimas gracias por su
amistad y la confianza que me han demostrado en este tiempo.
Quiero agradecer de forma muy especial al Dr. Alfonso Paredes y al Dr. Hernán Lara, por
sus consejos, por acogerme en su laboratorio y hacerme parte de NBQ. Particularmente al Dr.
Alfonso, mi director de tesis, por darme su apoyo y confianza, escucharme siempre, darme consejos
y corregirme las mil y una veces que le pedí este trabajo.
Quiero agradecerle también a mi comisión, la Dra. Jenny Fiedler, la Dra. María Cecilia
Johnson y el Dr. Guillermo Díaz, por ser siempre amables y constructivos con las críticas para mí y
para este trabajo.
Finalmente a todos quienes estuvieron conmigo en estos años, o participaron en el desarrollo
de mi tesis, ¡muchísimas gracias!.
iv

Financiamiento
Este trabajo fue financiado por el proyecto FONDECYT 1090159
v

Presentaciones
Este trabajo dio origen a las siguientes presentaciones a congresos
Abril 2011 Envejecimiento Reproductivo: Participación del Sistema Nervioso en el
Desarrollo Folicular Ovárico al término del Periodo Reproductivo de la
rata. XI Jornada de investigación en ciencia y tecnología.
Instrumentación avanzada en el desarrollo de la investigación en la
facultad de ciencias químicas y farmacéuticas. Santiago, Chile.
Agosto 2011 Blocking of β-adrenergic receptors at the subfertility period inhibits
spontaneous ovarian cyst formation in rat. Society for the Study of
Reproduction, 44th Annual Meeting, Portland, Oregon, USA.
Agosto 2011 Blocking of β-adrenergic receptors at the subfertility period inhibits
spontaneous ovarian cyst formation in rats. US-South America
Workshop in Neuroendocrinology. Viña del Mar, Chile.
Premios
Abril 2011 Mejor Trabajo, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, XI
Jornada de investigación en Ciencia y Tecnología en la Facultad de
Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Santiago, Chile.
vi

Tabla de contenido
Índice
1 Introducción ........................................................................................................................... 1
1.1 Fertilidad ........................................................................................................................ 1
1.2 El ovario ......................................................................................................................... 3
1.2.1 La esteroidogénesis ................................................................................................ 3
1.2.2 La gametogénesis ................................................................................................... 5
1.2.3 Foliculogénesis....................................................................................................... 7
1.3 Participación del sistema nervioso simpático en la función ovárica ............................ 10
1.4 Actividad de los receptores β-adrenérgicos ................................................................. 11
1.5 El propranolol .............................................................................................................. 14
2 Hipótesis .............................................................................................................................. 16
2.1 Objetivo general ........................................................................................................... 16
2.2 Objetivos específicos. .................................................................................................. 16
3 Materiales y métodos ........................................................................................................... 17
3.1 Animales ...................................................................................................................... 17
3.2 Administración de propranolol .................................................................................... 17
3.3 Ciclicidad estral. .......................................................................................................... 18
3.4 Homogenización de las muestras de ovario. ................................................................ 19
3.5 Cuantificación del factor de crecimiento nervioso (NGF) ovárico. ............................. 19
3.6 Determinación de moradrenalina (NA) y de 3-metoxi-4-hidroxifenilglicol (MHPG) en
ovario. 20
3.7 Determinación de catecolaminas en la médula adrenal por fluorescencia. .................. 21
3.8 Cuantificación de hormonas esteroidales. .................................................................... 22
3.9 Análisis morfológico del ovario. .................................................................................. 23
3.10 Determinación de la concentración de receptores β-adrenérgicos ............................... 24
3.11 Análisis estadístico. ...................................................................................................... 25
4 Resultados ............................................................................................................................ 25
4.1 Objetivo 1.- .................................................................................................................. 25
4.1.1 Concentración de Receptores β-adrenérgicos durante la vida de la rata .............. 25
vii

4.1.2 Cambios en los receptores β-adrenérgicos durante el tratamiento ....................... 26
4.2 Objetivo 2.- .................................................................................................................. 28
4.2.1 Concentración de noradrenalina ovárica .............................................................. 28
4.2.2 NGF intraovárico ................................................................................................. 31
4.2.3 Concentración de Noradrenalina en la glándula adrenal ...................................... 32
4.3 Objetivo 3.- .................................................................................................................. 33
4.3.1 Peso de los animales y del ovario ........................................................................ 33
4.3.2 Ciclicidad estral.................................................................................................... 34
4.3.3 Hormonas esteroidales en plasma ........................................................................ 37
4.4 Objetivo 4.- .................................................................................................................. 39
4.4.1 Folículos antrales totales ...................................................................................... 39
4.4.2 Folículos antrales sanos ....................................................................................... 40
4.4.3 Folículos antrales atrésicos .................................................................................. 42
4.4.4 Folículos quísticos................................................................................................ 44
4.4.4.1 Folículos tipo III............................................................................................... 45
4.4.4.2 Prequistes ......................................................................................................... 48
4.4.4.3 Quistes .............................................................................................................. 50
4.4.5 Cuerpos lúteos ...................................................................................................... 52
4.4.6 Folículos luteinizados .......................................................................................... 53
4.4.7 Microfotografías representativas de ovarios de rata ............................................ 54
5 Discusión.............................................................................................................................. 55
5.1 Receptores β-adrenérgicos intraováricos ..................................................................... 56
5.2 Cambios sistémicos ...................................................................................................... 58
5.3 Morfología ovárica ....................................................................................................... 58
5.4 Hormonas ováricas ....................................................................................................... 61
5.5 Catecolaminas .............................................................................................................. 62
6 Conclusiones ........................................................................................................................ 66
6.1 Conclusiones específicas.............................................................................................. 66
6.2 Conclusión general ....................................................................................................... 67
7 Proyección ............................................................................................................................ 68
8 Referencias ........................................................................................................................... 69
viii

Tabla de figuras
Figura 1.- Ruta de síntesis de las hormonas esteroidales ováricas ................................................. 3
Figura 2.- Teoría de las dos células en la síntesis de hormonas ováricas.. .................................... 4
Figura 3.- Comparación del perfil hormonal entre ratas y humanos. ............................................. 6
Figura 4.- Diagrama del crecimiento folicular y la teoría de la aparición de estructuras
quísticas. ........................................................................................................................................ 9
Figura 5.- Ilustración representativa de la citología y gráfica de un frotis vaginal con
ciclicidad estral normal en la rata.. .............................................................................................. 18
Figura 6.- Cambios en la cantidad de receptores β-adrenérgicos durante el periodo
reproductivo hasta la pérdida de él en la ratas Sprague-Dawley ................................................. 26
Figura 8.- Concentración de NA ovárica ..................................................................................... 29
Figura 9.- Concentración de MHPG ovárica. .............................................................................. 29
Figura 10.- Razón MHPG versus NA ovárica.. ......................................................................... 30
Figura 11.- Concentración de NGF intraovárico. ....................................................................... 31
Figura 12.- Concentración de NA en la médula adrenal. ............................................................. 32
Figura 13.- Peso promedio de los animales por grupo experimental por semana. ....................... 33
Figura 14.- Peso del ovario. ......................................................................................................... 34
Figura 15. – Diagrama representativo de la ciclicidad estral de cuatro animales para cada
uno de los grupos tratados.. .......................................................................................................... 35
Figura 16.- Ciclicidad estral y ovulación durante el periodo de subfertilidad determinados
por análisis de frotis vaginal ........................................................................................................ 36
Figura 17.- Concentración de hormonas esteroidales en plasma. ............................................... 38
Figura 18.- Cantidad de folículos antrales totales ........................................................................ 39
Figura 19.- Cantidad de folículos antrales sanos en ovario de rata.. ............................................ 40
Figura 20.- Distribución de la población de folículos antrales sanos por tamaños en ovario de
rata. .............................................................................................................................................. 41
Figura 21.- Cantidad de folículos antrales atrésicos en ovario de rata. ........................................ 42
Figura 22.- Distribución de la población de folículos antrales atrésicos por tamaños en ovario
de rata. .......................................................................................................................................... 43
Figura 23.- Cantidad de folículos quísticos totales en ovario de rata. ......................................... 44
ix

Figura 24.-Diagrama de las etapas morfológicas de la formación de quistes .............................. 45
Figura 25.- Cantidad de folículos tipo III en ovario de rata. ........................................................ 46
Figura 26.- Distribución de la población de folículos tipo III por tamaños en ovario de rata.. ... 47
Figura 27.- Cantidad de prequistes en ovario de rata.. ................................................................. 48
Figura 28.- Distribución de la población de prequistes por tamaños en ovario de rata ............... 49
Figura 29.- Cantidad de quistes en ovario de rata. ....................................................................... 50
Figura 30.- Distribución de la población de quistes por tamaños en ovario de rata .................... 51
Figura 31.- Cantidad de cuerpos lúteos en ovario de rata. ........................................................... 52
Figura 32.- Cantidad de folículos luteinizados en ovario de rata. ................................................ 53
Figura 33.- Microfotografías representativas de los ovarios analizados.. .................................... 54
Figura 34.- Relación de la concentración de receptores β-adrenérgicos y la liberación de NA
según la edad. ............................................................................................................................... 57
Figura 35.- Dinámica folicular observada en condiciones fisiológicas en las ratas de 10 y 12
meses comprada con la dinámica de 6 meses o período de máxima fertilidad. ........................... 64
Figura 36.- Dinámica folicular de los ovarios con administración diaria de propranolol por ........
2 meses. ........................................................................................................................................ 65
x

ATP = Adenosina trifosfato
CG = Células de la granulosa
COMT = Catecol-o-metil transferasa
CT = Células de la teca
D = Diestro
DPBS = Buffer fosfato salino de Dulbecco
EIA = Enzimo inmuno ensayo
Abreviaturas
ELISA =Ensayo por inmuno absorción ligado a una enzima
FSH = Hormona folículo estimulante
FSHR = Receptor de la hormona folículo estimulante
GC = Ganglio celíaco
HPLC = Cromatografía líquida de alto rendimiento
ISO = Isoproterenol
LH = Hormona luteinizante
LHR = Receptor de la hormona luteinizante
MAO = Monoamino oxidasa
MHPG = 3-metoxi-4-hidroxifenilglicol
NA = Noaradrenalina
NGF = Factor de crecimiento nervioso
NPY = Neuropéptido Y
P2X2 = Receptor purinérgico 2 subtipo X2
PCO = Ovario poliquístico
PRO = Propranolol
PVDF = Polivinilideno de difluórido
SNS = Sistema nervioso simpático
SON = Nervio ovárico superior
TBST = Buffer-Tris salino con tween ® 20
VE = Valerato de estradiol
VIP = Péptido intestinal vasoactivo
xi

Resumen
En la actualidad la mujer ha decido posponer la maternidad hasta después de los 30 años.
El aplazar la maternidad hacia la ventana de subfertilidad (31 a 41 años), provoca una
disminución de la fertilidad y en el éxito de los programas de fertilización in vitro, los cuales
poseen estrechos márgenes de éxito, que se hacen cada vez más pequeños conforme va
aumentando la edad de las mujeres. Por esta razón es necesario conocer los mecanismos
involucrados en el envejecimiento ovárico, durante el periodo de subfertilidad femenino. Para
ello se ha utilizado el modelo múrido, debido a su similitud con procesos que regulan la función
del ovario en el ser humano, considerándose como un buen modelo para comprender los
mecanismos involucrados en el envejecimiento reproductivo.
Se ha demostrado que durante el periodo de sub-fertilidad y en mujeres menopáusicas,
los ovarios presentan características fisiológicas similares a las encontradas en el Síndrome de
ovario poliquístico, patología de alta prevalencia en mujeres durante edad fértil. Estas
observaciones se basan en el hecho de que en ambas condiciones existe un retraso en el
desarrollo folicular, disminución del número de folículos antrales y la aparición de estructuras
quísticas, que prevalecen incluso después de la menopausia. Se ha descrito que uno de los
factores que participa en la aparición de estas condiciones es el aumento del tono nervioso
simpático y del contenido de noradrenalina (NA) intraovárica, la que ejerce su función a través
de la activación de los receptores β2-adrenérgicos. Este aumento en la actividad nerviosa
simpática del ovario se ha relacionado con un aumento en la secreción de hormonas esteroidales
y la mantención y/o aparición de las estructuras quísticas, lo que conduce a problemas de
fertilidad.
Para disminuir la estimulación del sistema nervioso simpático sobre el ovario en el
periodo de subfertilidad de la rata (8 a 10 meses), y para determinar si la NA participa en el cese
de la función ovárica y/o formación de los quistes foliculares, se propuso bloquear la acción de
los receptores β-adrenérgicos. Para ello, se administró una inyección diaria de propranolol
(antagonista β-adrenérgico), durante 2 meses a ratas que se encuentran en el periodo de
subfertilidad.
xii

Después de los dos meses de tratamiento se analizó la ciclicidad estral de la rata por
medio de la observación microscópica del frotis vaginal, se determinaron las hormonas
esteroidales en plasma mediante EIA, la concentración de NA y su metabolito MHPG en ovario
mediante HPLC; además se realizó análisis morfológico de los ovarios.
Los resultados muestran que el bloqueo β-adrenérgico con propranolol permite reactivar
el desarrollo folicular. Esto evidenciado por: a) el aumento en el número de folículos antrales
sanos y cuerpos lúteos, b) el aumento del porcentaje de ovulación y los niveles de hormonas
esteroidales en el plasma, c) la disminución en el número de folículos quísticos (quistes y
prequistes) y el tamaño de los folículos tipo III y prequistes.
Considerando que durante el envejecimiento existe un aumento del tono adrenérgico
sobre el ovario, que podría resultar perjudicial, hemos logrado, mediante el bloqueo β-
adrenérgico, mejorar la funcionalidad ovárica. Este tratamiento reactivó el desarrollo folicular,
evidenciado en la recuperación de la esteroidogénesis y foliculogénesis, dando a este fármaco
expectativas para su uso a nivel clínico como terapia de ayuda, para poder expandir o retrasar la
ventana de subfertilidad en la mujer.
xiii

Abstract
Blockade of β-adrenergic receptor during subfertility period
Today women have decided to postpone childbearing even after their thirties. The delay
of the motherhood towards the subfertility period is associated to diminished fertility and a
decreased success rate in in vitro fertilization programs, the latter being rarely successful and
even less successful as women get older. For this reason it became necessary to understand the
mechanisms related to ovarian ageing during the subfertility period. To accomplish this, the
murine model has been used, because it describes almost all the process that regulates the
ovarian function in humans, therefore is a good model for understanding the mechanisms
involved in the reproductive aging.
It has been show that during the sub-fertility and the menopausal period in woman, the
ovaries present physiological characteristics similar to those found in the polycystic ovarian
syndrome, the pathology with the highest prevalence in women during the fertility age. The
observations are based, for example, in the delay in follicular development, decreased number of
antral follicles and the spontaneous generation of cystic structures, that prevail until the
menopausal age.
Today we know one of the factors that participates in the generation of this condition is
the rise in the sympathetic tone and the noradrenaline (NA) released in the ovary, which exerts
his function through the β2-adrenergic receptor activation. That is correlated with the steroid
hormone secretion and the maintenance or generation of the cystic structures, leading to fertility
issues.
To inhibit the effect in the rise of the sympathetic tone in the ovary during the sub
fertility period, and to determine if the NA participates in the cessations of the ovarian function
and/or follicular cyst formation and maintenance, we propose a pharmacological block the β-
adrenergic receptors. To achieve this we administered propranolol, a β-adrenergic receptors
antagonist, in a daily injection for 2 months, to rats that have reached the sub fertility period (8
and 10 months old).
xiv

After 2 months of propranolol treatment, estrous cyclicity was analyzed through vaginal
smear, steroidal hormones were analyzed in plasma through EIA, the NA content and one of its
metabolites was measured in HPLC and finally we performed a morphological analysis of the
complete ovary.
The results show that the β-adrenergic blockade allows reactivation of the follicular
development, which is evidenced by an increase in: a) healthy antral follicles and corpora lutea
amount, b) ovulation percentage and esteroidal hormones levels in plasma, and c) decreased
amount of cystic follicles (cyst and precyst) and in the follicles size (type III follicles and
precyst). Therefore we can observe an activation in follicular development that leads to
ovulation and inhibits the cyst formation pathway.
During aging there is an increase in the ovarian adrenergic tone. After the β-adrenergic
blockade, we could see the improvement of the ovarian function and follicular development, as
evidenced by the rise in the steroidogenesis and folliculogenesis. These findings let us propose
propranolol for use in clinical trials as a clinical therapy help, to expand or delay the sub fertility
period in the woman.
xv

1 Introducción
1.1 Fertilidad
Es conocido mundialmente, que la tasa de natalidad y el aplazamiento de la misma en los
países desarrollados, así como en aquellos en vías de desarrollo como Chile, se ha convertido en
un problema social a resolver. Estudios han demostrado que la tasa global de fecundidad ha
disminuido, por ejemplo, en Chile en el año 2004 la tasa fue de 1,9 hijos por mujer, concibiendo
el 2º hijo a una edad de 36 años promedio (1). Esto de debe a que la mujer tiene actualmente
mayores posibilidades de desarrollo educacional, laboral y profesional, lo que sumado al fácil
acceso para el control de su fertilidad, le ha permitido postergar la maternidad. Un ejemplo de
esto lo vemos en el aumento de los años de escolaridad de la mujer, lo que se refleja en que el
74,4% de las mujeres en Chile, en el año 2003 poseen una educación de 13 o más años,
alcanzando así la anhelada estabilidad e independencia social y económica a la edad de 34
años (2)
El aplazamiento de la maternidad hasta edades tardías, no solo trae como consecuencias una
caída en la tasa de natalidad en el país, sino que además, aumenta el número de embarazos
riesgosos debido a los problemas asociados a la edad (3) como: hipertensión, diabetes, etc. lo
que puede conducir a abortos espontáneos, defectos fetales, daño por estrés prenatal (4;5) y que
la probabilidad de éxito en fertilizaciones in vitro disminuya desde un 40% en mujeres menores
de 35 años, a un 20-26% en mujeres de 38 a 40 años y finalmente a 10-13% en mujeres mayores
de 40 años (6).
Estos bajos porcentajes de éxito en los programas de fertilización in vitro se deben,
principalmente a que con la edad va disminuyendo la reserva folicular, proceso fisiológico que
comienza en la vida intrauterina y termina con la menopausia. La cohorte de folículos que
constituyen la reserva folicular en el momento del nacimiento son aproximadamente 1,5
millones y de estos, solo unos 500.000 folículos sobreviven hasta el inicio de la pubertad
(menarquía) (7). Luego de esta primera gran ola de pérdida folicular, la mujer sufre diversos

cambios, los que permiten que alcance su etapa de máxima fertilidad, o también llamada etapa
de “fertilidad óptima” entre los 18 y 32 años de edad (6;8;9), etapa durante la cual, con cada
ciclo menstrual se van reclutando y perdiendo más folículos de forma constante. Después de los
32 años se establece un período denominado de “sub-fertilidad” (7) y a partir de los 37 años, se
ha descrito un aceleramiento en la pérdida de la reserva folicular con cada ciclo, lo que hace que
en un período de 13 años la reserva disminuya desde unos 25.000 a 1.000 folículos, marcando el
establecimiento de la menopausia, a los 51 años (9). La menopausia se alcanza, debido a que el
reducido número de 1.000 folículos, no alcanza a sustentar el control hormonal hipotalámico. Lo
que sucede, en palabras sencillas, es que la falta de progesterona y estrógeno no alcanza a ejercer
la regulación por retroalimentación negativa sobre la hormona luteinizante (LH), lo que induce
un aumento de la hormona folículo estimulante (FSH) circulante, acelerando la pérdida folicular,
hasta alcanzar así, el fin de la etapa reproductiva de la mujer.
Estudiar este proceso, se hace aún más necesario, considerando las evidencias que relacionan
el hecho de que mujeres con menarquia precoz, relacionado con factores externos, como por
ejemplo el estrés medioambiental (10), pueden tener un adelanto de la menopausia, lo que se
traduce en un ingreso temprano en la ventana de sub-fertilidad. Hoy, aproximadamente un 10%
de las mujeres ingresan a la menopausia a los 45 años (9), esto implica que la perdida folicular
se acelera a partir de los 32 años, justo cuando la mujer actual comienza a pensar en la
maternidad.
Se ha demostrado que durante el periodo de sub-fertilidad y en mujeres menopáusicas, los
ovarios presentan características fisiológicas similares a las encontradas en el ovario poliquístico
(PCO), patología de alta prevalencia en mujeres durante edad fértil. Estas observaciones se
basan, por ejemplo, en el hecho de que en ambas condiciones existe un retraso en el desarrollo
folicular, disminución del número de folículos antrales, la aparición de estructuras quísticas
(11;12), que prevalecen incluso después de la menopausia (13). Hasta hoy los mecanismos
involucrados en esta alteración en el desarrollo folicular son desconocidos y requieren ser
estudiados.
2

1.2 El ovario
El ovario es la gónada femenina, y posee dos funciones trascendentales: la esteroidogénesis y
la foliculogénesis.
1.2.1 La esteroidogénesis
La esteroidogénesis es la síntesis ovárica de hormonas esteroidales que da lugar a dos
productos principales, progesterona y estradiol. Ambas hormonas, se secretan en diferentes
proporciones a lo largo del ciclo menstrual, y se sintetizan además a diferentes velocidades, esto
debido a que la progesterona puede obtenerse como el resultado de dos oxidaciones sucesivas
del colesterol, mientras que el estradiol requiere 5 oxidaciones hasta testosterona. La testosterona
es el sustrato de la aromatasa (enzima limitante de la reacción), que realiza la oxidación del
carbono 19, y que completa la reacción con la aromatización del anillo de la testosterona, y la
reducción del grupo 3-ceto a hidroxilo para producir estradiol (14) (Figura 1).
Figura 1.- Ruta de síntesis de las hormonas esteroidales ováricas. Imagen obtenida desde
(15)
Conforme se lleva a cabo la maduración y diferenciación de los folículos, las células de
la granulosa (CG) llegan a adquirir el receptor de la FSH (16). A partir de esta etapa, la
esteroidogénesis folicular se vuelve dependiente de ambas gonadotropinas, FSH y LH (17). La
3

LH incrementa la esteroidogénesis de novo a partir del colesterol en las células de la teca (CT),
produciendo andrógenos, principalmente androstenediona, como producto final. Estos difunden
a través de la lámina basal y se convierten en estradiol en las CG por la acción del complejo
enzimático de la aromatasa, estimulado por la FSH, lo que da origen a la acción sinérgica y
dependiente del sostén hormonal que conlleva al crecimiento y maduración del folículo apto
para la ovulación (17;18) (Figura 2)
Figura 2.- Teoría de las dos células en la síntesis de hormonas ováricas. Esta teoría
establece que las CT interna y las CG tienen funciones complementarias en la síntesis de
estrógenos. Las CT responden a la LH aumentando la concentración de AMPc, regulador
de la actividad enzimática que transformará el colesterol en testosterona. Las CG por los
receptores de FSH, responden a FSH, incrementando la síntesis de AMPc, lo que induce la
síntesis de Aromatasa. En el folículo dominante se expresan además los receptores de LH,
que incrementan la síntesis AMPc y de Aromatasa, activando la conversión de la
testosterona, aportada por las células tecales, a estradiol (15).
4

1.2.2 La gametogénesis
La Gametogénesis, por su parte, es el proceso mediante el cual los gametos, en este caso,
el óvulo, se diferencian y maduran con la capacidad de ser fecundados y de desarrollar un nuevo
organismo.
El proceso gametogénico tanto en humano como en rata involucra en primera instancia
una sucesión de divisiones mitóticas que tendrán como finalidad producir un número suficiente
de ovogonios. Finalizado este proceso, se da comienzo a la Meiosis I, donde las células
quedarán arrestadas en diploteno I, un estado de latencia hasta llegar al periodo fértil. Cuando
llega el momento de selección, el ovocito favorecido por el proceso de reclutamiento folicular,
crece y se desarrolla para finalmente ser ovulado, terminando así la fase de meiosis I; para el
ovocito, el proceso de la Meiosis II, sólo finalizará en caso de ser fecundado (19).
Los cambios gametogénicos, ocurren de forma paralela al crecimiento folicular. Estos
cambios foliculares durante el periodo de fertilidad, permiten la producción de hormonas
esteroidales que dan cuenta de los diferentes estadíos en el ciclo menstrual (en humano), y estral
(en la rata). El ciclo estral de la rata, dura en promedio 4 días, y se produce gracias al aumento
de estradiol y progesterona que promueven la proliferación de células del epitelio vaginal, que es
pluriestratificado. Estas células se mantienen así hasta que ocurre la caída de progesterona, la
que genera una descamación del epitelio vaginal.
Cada ciclo comprende 4 días, y se divide en 4 etapas (20):
- Proestro (P): Dura aproximadamente 12 horas, en esta etapa la vagina produce un
engrosamiento epitelial. Al microscopio se observan células epiteliales, muy pocos
leucocitos y muy escasas células cornificadas.
- Estro (E): Dura de 9 -15 horas, en el epitelio vaginal se ven más células cornificadas y
muy pocas células epiteliales.
5

- Metaestro (M): Se divide en 2 etapas. El metaestro I que dura 15 horas y el metaestro II
dura 6 horas, en esta etapa la vagina se ve húmeda, se inicia la regresión del epitelio
vaginal, por lo que las células cornificadas degeneran.
- Diestro (D): Dura 57 horas y se observan abundantes leucocitos y muy escasas células
epiteliales en el frotis vaginal (20)
Los cambio del epitelio vaginal observados, guardan una estrecha relación con los cambios
hormonales que sufre la mujer en su período menstrual, que a diferencia de la rata consta de 28
días (Figura 3), por lo que mediante un frotis vaginal diario, podemos determinar el
comportamiento de la ciclicidad de cada animal, y sus variaciones. La falta de ciclicidad estral se
relaciona con una disminución en la función reproductiva del animal.
Figura 3.- Comparación del perfil hormonal entre ratas y humanos. (a) El ciclo de 4 días de
la rata. Las barras grises consideran la noche (6 pm a 6 am) y las barras blancas
consideran el día (6 am a 6 pm). Se muestra en la imagen la fluctuación de las principales
hormonal sexuales en plasma. (b) El ciclo de 28 días en humanos. Imagen modificada desde
(21).
6

1.2.3 Foliculogénesis
La foliculogénesis en la rata se inicia en el período neonatal y se caracteriza por la
formación de folículos primordiales entre el día 1-4 de vida. El desarrollo folicular continúa en
la vida infantil (día 8 al 21), período durante el cual el ovocito aumenta de tamaño. La primera
ovulación se desarrolla aproximadamente el día 34, como respuesta a la ola de gonadotrofinas
preovulatorias marcada por el pico de LH.
Morfológicamente, en un principio existe un ensamblaje folicular, donde los ovocitos se
rodean de las células precursoras de la granulosa y se selecciona un ovocito desde los “nidos de
ovocitos” (22;23), formando así los folículos primordiales. Los ovogonios que han iniciado la
meiosis comienzan a organizar a las células estromáticas cercanas a ellas, las cuales darán origen
a células de tipo escamoso derivadas de las células epiteliales, por otro lado las células
pregranulosa en número de 6 o 7 células constituirán, junto con el ovocito, un folículo
primordial. Posteriormente, estas células se diferencian hacia CG, que proliferan hasta formar
una capa de células cuboidales que circundarán totalmente el ovocito, formando el folículo
primario. Este proceso ocurre como una migración de dichas células desde el estroma hacia la
corteza ovárica, lugar donde ocurrirá el proceso de ensamblaje folicular, que en humanos ocurre
durante el desarrollo fetal (24) y en rata durante los primeros dos días postnatal.
Ocurrido esto, las CG comienzan a proliferar dando origen a 2 o más capas celulares, lo
que permite que células mesenquimales se adhieran a la periferia y den forma a la membrana
basal, siendo éstas las primeras pecursoras de las CT, que darán origen en conjunto, al folículo
secundario. El folículo secundario es de vital importancia en la maduración folicular, ya que en
esta etapa la CG comienzan a adquirir los receptores de FSH, lo que hace al folículo desde este
punto, dependientes de gonodatrofinas (23). La importancia de la adquisición de los receptores
de FSH queda demostrada en ratones que poseen “knockdown” del gen para dicho receptor
(FSHR+/-). Estos animales responden menos frente al estímulo debido al reducido número de
receptores, alcanzando la madurez reproductiva con deficiente crecimiento folicular y camadas
más pequeñas. Estos animales no poseen diferencias con los wild type a los 3 meses de edad en
el número total de folículos, sin embargo, los ovarios de los grupos de ratas de 7 meses
7

contienen significativamente menos ovocitos, y un aumento en las gonodatrofinas plasmáticas
(25), acelerando el proceso de envejecimiento reproductivo.
Al inicio de la formación del folículo terciario, la capa de CG, que se encuentra
rodeando directamente al ovocito, dará origen a las células del cúmulo, mientras que las células
alejadas de éste comenzarán la formación de los cuerpos de Colexnert (19;26), espacios que
darán origen al antro. A partir de este momento, los folículos antrales (Figura 4) seguirán
creciendo hasta alcanzar su máximo tamaño, mientras que las CT gradualmente se irán
diferenciando en una capa interna y otra externa. Los folículos antrales completamente
desarrollados se denominan preovulatorios, y las CG que los conforman se encuentran
diferenciadas. En esta fase la presencia del pico de LH iniciará la ovulación, y la diferenciación
de las CG y las CT hacia células lúteas, la cual se completará una vez que haya ocurrido la
ovulación (Figura 4).
La etapa final del desarrollo folicular es la formación del cuerpo lúteo, que producirá
principalmente progesterona, aunque puede sintetizar también andrógenos y estrógenos. Este
cuerpo lúteo se considerará funcional mientras la producción de progesterona se mantenga
constante, lo que variará de acuerdo a cada especie. La disminución de la esteroidogénesis
promoverá la regresión lútea, a menos que la presencia de la gonadotrofina coriónica (hCG) de
origen placentario pueda mantener al cuerpo lúteo (16). Dado que la rata es un animal
poliovulatorio, el número de cuerpos lúteos da cuenta de la función reproductiva actual y pasada
del animal.
En la rata solo unos pocos folículos son seleccionados para ovular, la mayoría de ellos
(70%) degeneran y presentan atresia (apoptosis). El problema ocurre cuando por alguna razón,
en general exógena, la atresia de algunos de estos folículos no se logra y el folículo crece y
permanece un tiempo prolongado en el ovario, pudiendo así, dar origen a los quistes ováricos
foliculares (Figura 4)
8

Los quistes se pueden clasificar en dos tipos: los quistes ováricos no relacionados con
una patología, que desaparecen espontáneamente, y los quistes relacionados con alguna
patología que requiere tratamiento, como son los tumores ováricos o el PCO (26).
Histológicamente, un quiste folicular se caracteriza por poseer pocas capas o carecer de
CG, hiperplasia de las CT, del estroma y tener un gran tamaño, con respecto al resto de los
folículos. La hiperplasia de las CT, se produce como resultado de la hiperestimulación de la LH
y excesiva producción de andrógenos, debido a la poca o casi nula presencia de CG, que sumado
a la ausencia de folículos maduros, produce una disminución del estradiol. Las CG de estos
folículos al ser escasas poseen baja actividad de la aromatasa, o ésta está muy disminuida
(27;28).
Figura 4.- Diagrama del crecimiento folicular y la teoría de la aparición de estructuras
quísticas.
9

1.3 Participación del sistema nervioso simpático en la función ovárica
Evidencias muestran que el ovario no sólo funciona por medio del control hormonal,
establecido de forma pulsátil a nivel hipofisario, sino que también recibe inervación simpática y
sensorial, por neuronas que inervan diferentes estructuras del órgano, tales como vasos
sanguíneos, tejido conectivo y folículos en diversos estadíos del desarrollo.
Los neurotransmisores característicos del sistema nervioso simpático (SNS) son la
catecolaminas. Estos neurotransmisores actúan en el ovario vía la activación de los receptor β2
adrenérgicos, los cuales presentan cambios en su concentración durante el ciclo estral normal,
siendo su mayor expresión en la etapa de diestro y mínima en estro (29). Su compromiso en la
regulación del ovario se ha demostrado tanto a nivel esteroidogénico (principalmente secreción
de progesterona) (30;31) como folículogénico.
Las catecolaminas estimulan la liberación de progesterona en CG y CL, y por otro lado
estimulan la secreción de andrógenos en las CT. No influyen en la liberación de estradiol, debido
a que carecen de efecto directo en la actividad de la aromatasa (31). Además facilitan el efecto
estimulador de gonodatrofinas en la secreción de esteroides de manera aditiva, sugiriendo que
bajo circunstancias fisiológicas, los nervios simpáticos catecolaminérgicos contribuyen a
amplificar los efectos de las gonodatrofinas circulantes sobre la esteroidogénesis ovárica.
Se ha descrito que la inervación extrínseca del ovario regula funciones fisiológicas
específicas, como la esteroidogénesis (32) y el desarrollo folicular temprano (33), donde los
principales neurotransmisores involucrados son la noradrenalina (NA) y el péptido intestinal
vasoactivo (VIP) (31), siendo las fibras que contienen el VIP tanto simpáticas como sensoriales.
Además, se ha identificado que proviene por dos ruta diferentes, la 1º es la vía el plexo nervioso
del ovario por fibras noradrenérgicas hacia los vasos sanguíneos, y la 2º por el Nervio Ovárico
Superior (SON), el cual asociado al ligamento suspensorio ovárico también transporta fibras
noradrenérgicas, cuyos cuerpos celulares son proyectados desde el ganglio celiaco (GC) hacia
los folículos en crecimiento. El uso del trazado viral transneuronal permitió confirmar la
existencia de una vía nerviosa que nace en el hipotálamo, pasa por el GC y finalmente llega al
ovario mediante el SON (34).
10

La sección del SON produce disminución de la concentración de NA del ovario y un
aumento del número de receptores β-adrenérgicos, lo que provoca hipersensibilidad a la
secreción de esteroides estimulada farmacológicamente por agonistas β-adrenérgicos (29). Es
importante denotar que los receptores β2, son los de mayor importancia durante el ciclo estral,
esto debido a la poca influencia de los receptores α en el proceso y la escasa presencia de
receptores β1 en el ovario (35;36)
Junto a lo anterior, la sección del SON induce la ovulación en ratas que antes no
presentaban ciclos (37), sugiriendo que factores diferentes de los hormonales, quizá de
naturaleza neuronal, podrían estar involucradas en la etiología de PCO. En apoyo a esta idea es
importante considerar que en pacientes con PCO que son resistentes al tratamiento con citrato de
clomifeno (el citrato de clomifeno por su efecto anti-estrogénico, produce retroalimentación
negativa sobre el eje hipotálamo-hipófisis, estimulando la liberación de FSH y LH), utilizar la
resección en cuña (en donde quizá se estén cortando los nervios del ovario), resulta efectiva
como tratamiento para inducir, y recuperar la ciclicidad del ovario (37).
Otro ejemplo del control y de la activación simpática, hablando específicamente de la
activación de los receptores β2 adrenérgicos, es que su estimulación aumenta la secreción de
esteroides en presencia de gonadotropinas (30) lo que hace pensar que el efecto esteroidogénico,
y la inervación extrínsica, poseen un rol en la facilitación del crecimiento folicular (33). Esta
regulación nerviosa es mucho más específica si consideramos que además de la inervación
extrínsica (proyección de los cuerpos neuronales desde el GC al ovario), existe una inervación
simpática intrínsica en algunos modelos animales, demostrada por la presencia de cuerpos
neuronales en el interior del ovario (38).
1.4 Actividad de los receptores β-adrenérgicos
La idea que la inervación simpática juega un rol importante en la maduración de los
folículos, secreción esteroidal y ovulación, se refuerza por la presencia de adrenoreceptores β2 en
las CT y CG del ovario de rata, que fluctúan en relación al pico de LH y la formación del cuerpo
lúteo (31). La activación simpática de la vía, utilizando agonistas de los receptores β2 como
11

isoproterenol (ISO), induce cambios fisiológicos y funcionales, como el incremento de la
secreción de progesterona y andrógenos.
En el caso de la rata, como se ha explicado previamente, también ocurre una pérdida de
folículos así como de la fertilidad con el transcurso de la edad. La forma en que se puede
evidenciar la fertilidad de una rata es considerando el número de crías vivas por cada camada
con respecto a su edad, lo que da por resultado que el pico de su fertilidad se alcanza a los 6
meses, mientras que el período de subfertilidad se comprende entre los 8 y 10 meses, debido a
que en esta ventana el número de crías por camada disminuye a menos del 50% con respecto a
su máximo logrado. Desde los 12 meses de edad encontramos que la rata, en general, ha
alcanzado su período de infertilidad (11).
Durante esta ventana de vida del animal, un estudio realizado por nuestro laboratorio y
reafirmado por Chávez-Genaro y cols. (12), demuestra que el contenido y liberación de
catecolaminas en el ovario, aumentan progresivamente con la edad (desde 6 a 12 meses). Este
aumento en el tono simpático del ovario se correlaciona con el aumento de estructuras quísticas
observadas en los ovarios de ratas de la misma edad (11).
Por otro lado, como la liberación de NA varía a lo largo del ciclo estral, es probable que
las gonadotrofinas no solo actúen sobre las células ováricas para regular la secreción esteroidal,
sino que además ejerzan, a nivel local presináptico, la modulación de la liberación de NA (39).
Esto se observa, cuando se superfunden ovarios de ratas, en diferentes etapas del ciclo estral, con
FSH a concentraciones cercanas a los niveles plasmáticos reportados en cada etapa, demostrando
así, que el mayor efecto de la FSH en la liberación de NA se produce en el estadío de estro
temprano (39). Ésto sugiere que la vía simpática ayuda a amplificar los efectos de las
gonadotrofinas en la esteroidogénesis del ovario. Además, el contenido de receptores β-
adrenérgicos también varía a lo largo del ciclo estral. Los menores niveles de β-receptores
aparecen en estro cuando la liberación de NA es más alta, mientras que los niveles más altos de
β-receptores se observan durante el diestro cuando la liberación de NA fue baja (31). Este efecto
de una regulación a la baja de los receptores β-adrenérgicos parece obedecer a un efecto de
protección, ante la sobre estimulación de la NA sobre el ovario, de forma similar a lo que ocurre
12

en el caso del corazón, otro órgano regulado de forma importante por el tono simpático, así
como por su gran cantidad de receptores β2 (40).
Estudios preliminares llevados a cabo en nuestro laboratorio, indican que la cantidad de
receptores β2, pareciera ser constante desde los 8 a 12 meses, aumentado de forma significativa a
los 16 meses (resultados no publicados), y como ya se ha observado con anterioridad, con el
transcurso de la edad, existe un aumento sostenido en la liberación y contenido de NA en los
ovarios de ratas adultas de 6 a 12 meses de edad (11), lo que pareciera no estar respondiendo al
efecto de una regulación a la baja que ocurre de forma normal en ratas según sea su ciclo estral,
esto probablemente debido a la pérdida de ciclicidad normal y disminución de la fertilidad
observada en estas edades. En un estudio similar realizado en ratas CIIZ-V (12), demuestran que
el contenido de catecolaminas en ovario con la edad, también se encuentra aumentado, y que al
desnervar los ovarios de forma química con guanetidina monosulfato (para provocar un efecto
drástico de bloqueo catecolaminérgico en el ovario), se ve que aumentan los folículos sanos y
disminuyen los folículos atrésicos en ratas de 12 y 18 meses de edad, comparados con animales
controles. Algo similar ocurre cuando se administra propranolol para antagonizar el efecto del
ISO, en donde se ve una aparente reversión del efecto provocado por el ISO, como por ejemplo,
una disminución de las estructuras quísticas (41).
De forma opuesta, en situación de sobreestimulación adrenérgica, como se ha observado en
bovinos, que reciben como parte de su ingesta diaria 20 ug/kg de clenbuterol (agonista β2
adrenérgico), utilizado como anabolizante, presentan modificaciones de la cantidad de los
receptores β, lo cual puede estar relacionado a los cambios patológicos observados en terneras
tratadas de manera sistemática, tales como dilatación de las glándulas uterinas y quistes
ováricos, lo cual sumado al incremento en la concentración de los receptores de progesterona y
estrógeno, sugiere la existencia de un mecanismo subcelular regulado por la repetida
estimulación de los receptores adrenérgicos (42). Algo muy similar, se observa en cerdos
hembras juveniles, alimentadas de la misma forma (43). En este caso se han encontrado lesiones
histopatológicas que incluyen degeneración anormal de diversos folículos con presencia de
quistes, ausencia completa de cuerpos lúteos, sugiriendo, al igual que en el caso de terneras y
vacas, que la estimulación adrenérgica aumentada en el ovario altera el desarrollo folicular y la
esteroidegénesis (44).
13

Considerando todas estas evidencias, proponemos que el bloqueo farmacológico del receptor
β2-adrenérgico, evitará que se desencadenen las señales moleculares inducidas por la sobre-
estimulación catelocaminérgica en el ovario, que probablemente se relaciona estrechamente con
la formación y mantención de los quistes foliculares en el ovario. Un candidato para lograr este
efecto es el propranolol (PRO), un antagonista de los receptores β-adrenérgicos.
1.5 El propranolol
El PRO es un antagonista de los receptores β-adrenérgicos (β1/β2/β3), utilizado comúnmente
como tratamiento para ciertos tipos de enfermedades y condiciones cardiovasculares, tales como
arritmias, angina pectoris, hipertensión y ansiedad (45). En algunos pacientes, el PRO también
puede producir algunos efectos secundarios como insomnio, debido a su acción de bloqueo
sobre los β-adrenoreceptores. El PRO es un fármaco con propiedades lipofílicas, siendo capaz de
atravesar la barrera hematoencefálica.
Considerando todas las evidencias presentadas aquí, podemos resumir lo siguiente:
1. La postergación de la maternidad hace necesaria la búsqueda de métodos que amplíen y
retrasen la ventana de la sub-fertilidad en la mujer.
2. La declinación de la fertilidad en la mujer coincide con una acelerada pérdida en la reserva
folicular y en la menopausia, se ha observado un aumento en el número de fibras simpáticas
que inervan el ovario.
3. La inervación simpática participa activamente en la esteroidogénesis, en el desarrollo y
maduración folicular.
4. En la rata la activación de la inervación simpática ovárica, se refleja en un aumento en el
número de fibras simpáticas, aumento en el contenido y la liberación de NA, relacionado
con un aumento en el número de estructuras foliculares quísticas y prequísticas.
5. Las ratas a medida que envejecen disminuye su fertilidad, la reserva folicular y aumenta
espontáneamente el número de estructuras quísticas.
14

6. Debido a que las catecolaminas ejercen su efecto a través de los receptores β-adrenérgicos,
es probable que la activación de éstos, permita la formación y mantención de las estructuras
quísticas, que aparecen espontáneamente en el ovario de la rata, en el período de
subfertilidad.
Estos antecedentes nos permiten postular que el efecto del PRO puede bloquear la sobre
estimulación catecolaminérgicas observada en ovario de rata durante el período de subfertilidad,
evitando la aparición y/o mantención de las características de PCO que se presentan en la vejez
reproductiva
15

2 Hipótesis
“El bloqueo de los receptores β-adrenérgicos, retrasa la formación de quistes en el
ovario de ratas que han alcanzado el periodo de subfertilidad”.
2.1 Objetivo general
Estudiar los efectos del bloqueo de los receptores β-adrenérgicos en el ovario de rata
Sprague-Dawley durante el periodo de subfertilidad.
2.2 Objetivos específicos.
1. Determinar la densidad de los receptores β-adrenérgicos en ovarios de ratas en estado
fisiológico
2. Estudiar las concentraciones de las catecolaminas, producto del bloqueo β-adrenérgico
provocado por el propanolol en ratas de 10 y 12 meses
3. Determinar los cambios en la funcionalidad ovárica y sistémica, producto de la
reducción de la actividad simpática provocada por la utilización de propranolol.
4. Observar y determinar los cambios histológicos entre las ratas tratadas y control por
medio de la morfometría ovárica.
16

3 Materiales y métodos
3.1 Animales
Se utilizaron ratas hembras de 8 y 10 meses de edad, de la cepa Sprague-Dawley
suministradas por el biotereo de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la
Universidad de Chile. Los animales fueron mantenidos bajo condiciones regulares de luz (12
horas de luz y 12 horas de oscuridad) y temperatura (23 a 25ºC) con agua y alimento ad libitum.
Se utilizó un total de 40 animales en el experimento. Para la serie de inyección con vehículo se
utilizaron 8 animales inyectados desde los 8 a los 10 meses y 10 animales inyectados desde los
10 a 12 meses. Para el caso de la serie experimental con propranolol se utilizaron 10 animales
inyectados desde los 8 a 10 meses y 12 animales inyectados desde los 10 a 12 meses.
Para determinar el cambio de los recetores β-adrenérgicos en el estad fisiológico del
animal, durante su vida, desde los 3 hasta los 18 meses, se utilizaron en total 42 ovarios, que
eran propiedad del laboratorio de neurobioquímica, donados para la realización de este
experimento. Los tejidos se encontraban almacenados a -80°C hasta el momento de su
utilización.
Este trabajo se enmarca en el proyecto de Investigación Fondecyt 1090159 y cuenta con
la aprobación del Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la
Universidad de Chile y del Comité Asesor de Bioética de Fondo Nacional de Desarrollo
Científico y Tecnológico de Chile.
3.2 Administración de propranolol
Ratas de 8 y 10 meses de edad fueron tratadas durante 2 meses con una dosis diaria de 5
mg/kg de DL-Propranolol HCl (1-isoprilamino-3-naftiloxi-2-propanol HCl; Laboratorios Sigma
N° P-0884), administrado por vía intraperitoneal. Como control, se utilizó una serie de animales
bajo las mismas condiciones previas, pero con una inyección de suero fisiológico, que
corresponde al vehículo de administración del propranolol. La dosis de propranolol utilizada es
17

capaz de evitar la hipertrofia cardiaca inducida por isoproterenol en una dosis de 125µg/kg de
peso. La administración del fármaco durante dos meses, considera los días necesarios para
observar la aparición o en su defecto retraso de la formación espontánea de quistes y/o
estructuras quísticas, porque es un tiempo suficiente para observar al menos 2 cohortes de
folículos en la rata.
Luego del tratamiento y la eutanasia, los tejidos se guardaron a -80ºC; aquellos
seleccionados para histología fueron fijados en solución Bouin.
3.3 Ciclicidad estral.
Para determinar las variaciones del ciclo reproductivo de las ratas, se registra el ciclo
estral por observación microscópica del frotis vaginal de los 40 animales inyectados ya sea con
suero fisiológico o con propranolol. El ciclo estral de la rata depende de los cambios hormonales
de cada animal, y nos da un indicio del funcionamiento ovárico. Un ciclo normal de ovulación
será considerado como un paso de proestro (P) a estro (E) seguido de al menos un diestro (D)
como se ejemplifica en la Figura 5. Se analizó el frotis vaginal diariamente durante los 2 meses
de tratamiento del los animales.
Figura 5.- Ilustración representativa de la citología y gráfica de un frotis vaginal con
ciclicidad estral normal en la rata. Imágenes: a) proestro b) estro c) metaestro y d) diestro.
Las imágenes de citología fueron obtenidas desde (46).
18

3.4 Homogenización de las muestras de ovario.
En este experimento se utilizó un total de 16 mitades de ovarios con administración de
propranolol o suero fisiológico.
La mitad de un ovario fue homogenizado manualmente en un homogenizador vidrio-
vidrio, en 4 volúmenes de DPBS por peso de ovario, es decir 4 µl de DPBS por cada miligramo
de ovario (DPBS contiene KCl 2,68 mM, NaCl 136,89 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 8,1
mM, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,49 mM). Un cuarto de fracción del homogenizado se utilizó para
la cuantificación de NGF y las tres cuartas partes restantes se destinaron a la cuantificación de
NA. El homogenizado destinado a la cuantificación de NGF se diluyó en una razón 1:10 con
DPBS, se centrifugó a 10.000 rpm a 4ºC durante 15 minutos, se colectó el sobrenadante y se
conservó a -80ºC hasta el día del ensayo.
Por otro lado, el homogenizado en el que se cuantificó la NA ovárica se diluyó con HClO4
0,25N en una razón 1:5 para precipitar las proteínas. Luego se centrifugó a 13.000 rpm por 10
minutos a 4ºC, se colectó el sobrenadante y fue conservado a -80ºC hasta el día del ensayo para
evitar la oxidación de la NA.
3.5 Cuantificación del factor de crecimiento nervioso (NGF) ovárico.
Se realizó un inmunoensayo enzimático (EIA) para cuantificar NGF en la fracción soluble
del homogenizado de ovario de rata. Se utilizó el Kit NGF Emax de Promega y se procedió de
acuerdo a las instrucciones del Kit. Este se basa en un sistema que detecta NGF mediante una
reacción inmunológica de tipo sandwich. Los pocillos de la placa se cubren con un anticuerpo
policlonal contra NGF, y posteriormente se le une un anticuerpo monoclonal, este último
anticuerpo es reconocido en su fracción constante por un conjugado que contiene una enzima
que cataliza una reacción colorimétrica. La cantidad de NGF es por lo tanto proporcional a la
intensidad de color. El rango de sensibilidad permite detectar un mínimo de 7,8 pg/ml de NGF, y
en cuanto a especificidad, posee menos de un 3% de reacciones cruzadas con otros factores
neurotróficos.
19

El protocolo se resume como sigue:
1) Se agregaron 100 µl a cada pocillo del anticuerpo policlonal (Anti-NGF pAb) diluido
mil veces en buffer carbonato (25 mM NaHCO3, 25 mM Na2CO3, pH 9,7), y se incubó
la placa durante toda la noche a 4ºC.
2) Al día siguiente se lava una vez con buffer TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM
NaCl, 0,05% (v/v) Tween ® 20).
3) Se agregó 200 µl de buffer Block & Sample 1X por 1 hora a temperatura ambiente sin
agitación. Finalizado el proceso se lava con TBST.
4) Se agregaron 100 µl de estándar o muestra, la curva estándar considera un rango desde
250 a 3,9 pg/ml. Las muestras fueron diluidas 1:8000 para que los valores se interpolen
dentro del rango otorgado por la curva. La placa se incubó durante 6 horas a temperatura
ambiente y con agitación (500 rpm). Cumplido este tiempo se lavó 5 veces con TBST.
5) Se agregaron 100 µl de solución TMB One a cada pocillo. Se incubó durante 10 minutos
a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción adicionando 100µl de HCl 1N y se midió
la absorbancia en un lector de placas de ELISA a una longitud de onda de 450 nm.
3.6 Determinación de moradrenalina (NA) y de 3-metoxi-4-hidroxifenilglicol
(MHPG) en ovario.
Se cuantificó la concentración de NA y de su metabolito MHPG en el sobrenadante del
homogenizado de ovario obtenido según se describe previamente. La cuantificación se realizó
mediante la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a un detector
electroquímico EICOM ECD-700S. Una alícuota de 50 µl de sobrenadante fue mezclada con 50
µl de ácido perclórico (PCA) 0,2 N y fueron filtradas en filtros de PVDF desechables, marca
Millex de 0,22 µm de poro. 20 µl del filtrado fueron inyectados al sistema de HPLC Jasco PU-
2089s plus acoplado a la tarjeta digitalizadora Jasco LC-NetII/ADC. Para generar la integración
de los cromatogramas, se utilizó el programa computacional JASCO ChromPass
Chromatography Data System v1.7.403.1.
20

La fase móvil utilizada fue un buffer 0,1 M NaH2PO4, 0,107 mM de octil-sulfato, 0,02%
EDTA y 1,5% acetonitrilo con un pH de 2,6. La velocidad del flujo utilizada fue de 1ml/minuto.
el MHPG.
El potencial del detector amperométrico se fijó en 650 mV para la NA y de 850 mV para
Bajo estas condiciones el tiempo de retención fue de 3,5 minutos para la NA, y de 5,5
minutos para MHPG.
3.7 Determinación de catecolaminas en la médula adrenal por fluorescencia.
Como reflejo del nivel de catecolaminas sistémicas, se analizó su principal fuente, que es
la médula adrenal. Para realizar la determinación del órgano se utilizó una modificación del
protocolo de Campuzano y cols. (47) que se basa en la tautamerización de las catecolaminas y su
emisión de fluorescencia.
Para la ejecución de este protocolo se utilizaron un total de 26 adrenales de los animales
con inyección de propranolol o de vehículo.
Las dos glándulas adrenales fueron pesadas y homogenizadas en un homegenizador
vidrio-vidrio en 500 µl de HCl 0,15 M (esta operación se debió realizar en hielo para asegurar la
preservación de la NA). Se centrifugó a 13.500 rpm por 15 minutos y finalmente se filtró en
filtros de PVDF desechables Millex de 0,22 µm de poro.
La determinación de NA se realiza agregando 600 µL ml de buffer
Na2HPO4 0,011M /Na2HPO4 0,056 M y luego 50 µL de I2 0,02M / KI 0,3M, incubando por 3
minutos. Finalizado este tiempo se agregan 0,5 ml de buffer Na2SO3 (1,25 gr de Na2SO3, 0,876
gr EDTA y 10 gr NaOH en 100 ml agua bidestilada) incubando por 5 minutos. Se agregan 350
µl de ácido acético 6,3 M y se incuba por 40 minutos hasta la medición. La determinación
fluorimétrica se realizó con un filtro de λex405 nm/ λem495-505 nm en un espectrofluorímetro
Turner Biosystem, modulus microplate.
21

Cada determinación cuenta con una curva estándar de NA preparada en base a la sal
NA-bitartrato en concentraciones que van desde los 5-100 ng/ml, y cada muestra debe llevar su
propio blanco reverso, para así cuantificar los interferentes de cada tejido en forma
independiente.
3.8 Cuantificación de hormonas esteroidales.
Desde la sangre troncal, se separó el plasma centrifugando a 3500 rpm por 5 minutos para
cuantificar las hormonas esteroidales: androstenediona, estradiol, testosterona y progesterona por
kit de inmunoensayo enzimático.
Para la ejecución de este protocolo se utilizó el plasma un total de 30 animales con
inyección de propranolol o de vehículo.
La testosterona se cuantificó en plasma con un kit de inmunoensayo de la empresa DRG
instruments EIA-1559, el kit cuenta con un sensibilidad de 0.083 ng/ml y menos del 3,3% de
reacciones cruzadas con otros factores, la andostenediona en el kit de DRG EIA-3265, que posee
una sensibilidad de 0.019 ng/ml y menos de 0,01% de reacciones cruzadas con otros factores
hormonales. La progesterona en el kit DRG EIA-1292, que posee una sensibilidad de 0.034
ng/mL y menos de 1,4% de reacciones cruzadas con otras hormonas.
El ensayo consistió para la androstenediona, testosterona y progesterona como sigue:
− Agregar 20 a 25 µl de Standard o muestra a los pocillos recubiertos con anticuerpo
según se indique en cada protocolo
− Se agregó 200 µl de conjugado enzimático (hormona unida a peroxidasa de rábano), a
cada pocillo y se agita por 10 segundos la placa.
− Se incuba por 1 hora a temperatura ambiente sin agitación.
− Se lavan 3 veces los pocillos con solución de lavado y luego se secan golpeándolos
bruscamente sobre papel absorbente para asegurarse que estén secos.
22

− Se agrega 200 µl de sustrato en cada pocillo y se incuba por 15 minutos a temperatura
ambiente.
− Se agregan 100 µl de solución de detención para detener la reacción y se leen las placas
en un lector de placas de ELISA Asys Hitech Expert96 a 450 nm.
El Estradiol se determinó utilizando un kit de la empresa ALPCO Immunoassay N° 11-
ESTHU-E01, que posee una sensibilidad de 10 pg/mL y menos de 1,6% de reacciones cruzadas
con otras hormonas. El protocolo se realizó como sigue:
− Agregar 50 µl de Standard o muestra a los pocillos recubiertos con anticuerpo.
− Se agregó 100 µl de conjugado enzimático (estrógeno unido a peroxidasa de rábano) a
cada pocillo.
− Se incuba por 1 hora a temperatura ambiente con agitación de aproximadamente 200
rpm.
− Se lavan 3 veces los pocillos con solución de lavado y luego se secan golpeándolos
bruscamente sobre papel absorbente para asegurarse que estén secos.
− Se agrega 150 µl de sustrato en cada pocillo y se incuba por 15 minutos a temperatura
ambiente.
− Se agregan 50 µl de solución de detención para detener la reacción y se leen las placas
en un lector de placas de ELISA Asys Hitech Expert96 a 450 nm.
3.9 Análisis morfológico del ovario.
16 ovarios fueron inmersos en solución fijadora Bouin, seguido de una solidificación en
parafina, para ser cortados en láminas de 6µm de espesor. El tejido se tiñó con una solución de
Hematoxilina-Eosina para diferenciar los núcleos del citoplasma. Los folículos antrales sanos,
antrales atrésicos, quistes, prequistes y folículos tipo III, fueron medidos y contados según los
criterios descritos en (48-50).
El análisis morfológico se realizó contando todas las secciones del ovario, en un
microscopio óptico Olimpus CX31 acoplado a un programa Micrometric SE Premium V4.
23

3.10 Determinación de la concentración de receptores β-adrenérgicos
Los receptores fueron determinados mediante la unión específica del ligando
Dihidroalprenolol-HCl, levo–[anillo-propil- 3 H(N)], laboratorios Perkin Elmer ® , sus
características son: 250µCi (9,25 MBq), 104,4 Ci/mmol (3,863 TBq/mmol) en 0,25 ml de etanol
un bloqueador β-adrenérgico marcado radioactivamente.
El ovario se pesó y se homogenizó en ultraturrax en 10 volúmenes de Tris-HCL 20mM /
Sacarosa 0,25 M pH 7,4. El homogeneizado se centrifugó a 13000 rpm por 30 minutos y se
descarta el sobrenadante, el precipitado corresponde a la fracción enriquecida de proteínas, la
cual se resuspende en 100 µl de buffer Tris-HCl 20 mM / MgCl2 10mM a pH 7,4 y cuantifica
utilizando el método de Bradford.
En ensayo de receptor-ligando se realizó incubando a 37°C por 30 min 20 µg de proteínas
en 200 µl de buffer Tris-HCl 20 mM / MgCl2 10mM a pH 7,4 y 3 H-dihidroalprenolol diluido
1:200 (para determinar la unión total). Para determinar la unión inespecífica, en otro tubo se
incuba lo mismo, pero en presencia de propranolol 1mM (unión específica).
Terminada la incubación la reacción se detiene adicionando 2 ml del buffer Tris-HCl con
propranolol. El contenido se vierte en un sistema de filtración conectado al vacío que contiene
filtros Whatman GF/C 1822-150 con un poro de 1,2 µm.
Para determinar la radioactividad se pone el filtro con las proteínas unidas en un vial de
centelleo, se adiciona 4 ml de mezcla de centelleo, biodegradable (ECOSCINT ® National
Diagnostic Atlanta USA) y 600 µl de H2Od. Posteriormente se mezcló la solución y se contó la
radioactividad en un contador beta (Packard Liquid Scintillation Analyzer 1600TR; 72) con un
50% de eficiencia para tritio ( 3 H).
24

3.11 Análisis estadístico.
Los resultados se expresan como el promedio ± error estándar. Para determinar diferencias
significativas entre distintos grupos se realizó un t-test de Student entre el grupo vehículo (como
control) y el grupo con administración diaria de propranolol. Para el análisis de la distribución de
tamaños, se realizó un test de χ 2 para tendencias, para evaluar si la distribución corresponde a
poblaciones relacionadas entre sí o no y análisis de Anova para grupos con post test de
Newman-Keuls.
4 Resultados
4.1 Objetivo 1.-
Determinar la densidad de los receptores β-adrenérgicos en ovarios de ratas en
estado fisiológico.
4.1.1 Concentración de Receptores β-adrenérgicos durante la vida de la rata
Para determinar la concentración de los receptores β-adrenérgicos en el ovario de rata,
durante el periodo de envejecimiento reproductivo, se realizó una curva desde los 3 a los 18
meses de edad. Como se observa en la Figura 6, existe un aumento de los receptores β-
adrenérgicos a los 6 meses, lo que coincide con la época de mayor fertilidad de la rata, y otro a
los 16 meses, edad en que la rata ha perdido casi la totalidad de su función ovárica. También, se
puede observar que seguido de un aumento de los receptores β-adrenérgicos a los 6 meses, existe
una disminución sostenida hasta los 10 meses, para mantenerse casi sin variaciones hasta los 14
meses de edad.
25

fmol receptor β/mg proteina
250
200
150
100
50
0
N=4
Concentración de receptores β-adrenérgicos
en el ovario por edad
*
N=4
N=8
N=4
*
N=4
N=3
N=9
3 6 8 10 12 14 16 18
Meses
Figura 6.- Cambios en la concentración de receptores β-adrenérgicos durante el periodo
reproductivo hasta la pérdida de él en la ratas Sprague-Dawley. Los resultados se grafican
como el promedio ± SEM. El número de experimentos (N) para cada grupo se encuentra
indicado dentro de cada barra. Análisis de datos corresponde a one-way anova,
exceptuando comparación entre 10 y 12 meses, la que corresponde a un t-test de student
p

fmol receptor/mg proteína
250
200
150
100
50
0
Receptores β-adrenérgicos
Vehículo
N=4 N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 7.- Concentración de receptores β-adrenérgicos en ovario de rata de 10 y 12 meses
de edad. La administración de suero fisiológico (vehículo) y de propranolol se realizó
durante los 2 meses previos a la determinación. Se grafica el promedio ± SEM. El número
N=4
de experimentos (N) para cada grupo se indica dentro de cada barra.
27

4.2 Objetivo 2.-
Estudiar las concentraciones de las catecolaminas, producto del bloqueo β-
adrenérgico provocado por el propanolol en ratas de 10 y 12 meses.
4.2.1 Concentración de noradrenalina ovárica
La regulación del ovario, posee un importante componente dado por el SNS, por tanto al
bloquear esta comunicación con el ovario, interviniendo los receptores β-adrenérgicos,
esperábamos observar cambios en la actividad del SNS que inerva el ovario, para ello se
determinó la concentración de NA y de su metabolito MHPG.
Como se observa en la Figura 8, el tratamiento con propranolol produce una disminución
significativa de la concentración de NA intraovárica a los 10 y 12 meses de edad (vehículo
256,6 ± 46,2 y propranolol 169,6 ± 28,9; vehículo 257,1 ± 3,8 y propranolol 162,5 ± 19,6
respectivamente). Considerando que la NA medida en este órgano corresponde a la que se
encuentra contenida en las vesículas de los terminales nerviosos simpáticos del ovario, quisimos
observar también, si la disminución de la concentración de NA en el ovario se debe a un
aumento en la liberación o bien a una disminución en la síntesis de catecolaminas. Para poder
observar este cambio (como reflejo de la actividad del terminal nervioso) se midió la cantidad de
3-metoxi-4-hidroxifenilglicol (MHPG), el principal metabolito formado por la acción secuencial
de las enzimas monoamino oxidasa (MAO) y catecol-o-metil transferasa (COMT) en el terminal
nervioso.
Como se muestra en la Figura 9 existe un aumento en la cantidad de MHPG a los 10
meses (vehículo 23,4 ± 2,9 y propranolol 48,1 ± 9,6) y una leve tendencia al alza a los 12 meses
de edad (vehículo 67,2 ± 8,3 y propranolol 79,3 ± 10,9). Al hacer la relación de MHPG versus
NA, observamos en la Figura 10, que el recambio nervioso del terminal se encuentra aumentada
de forma significativa a los 10 meses (vehículo 0,13 ± 0,01 y propranolol 0,42 ± 0,11), y una
clara tendencia al alza a los 12 meses de edad (vehículo 0,26 ± 0,04 y propranolol 0,54 ± 0,14
con un p = 0,057).
28

pg NA/mg ovario
400
300
200
100
0
Concentración de NA en ovario
N=4
Vehículo
*
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
**
N=4
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 8.- Concentración de NA ovárica, indicado como los pg totales de NA estandarizado
por el peso del ovario en mg. La barra representa el promedio ± SEM, el número de
experimentos para cada grupo se indica dentro de cada barra. La significancia se obtuvo
con un t-test de Student de dos colas; p < 0,05 = * y p < 0,01 = **.
pg MHPG/mg ovario
Concentración de MHPG en Ovario
100
80
60
40
20
0
N=4
Vehículo
*
Propranolol
10 meses
N=4
N=4
Vehículo
N=4
Propranolol
12 meses
Figura 9.- Concentración de MHPG ovárica, indicado como los pg totales de MHPG
estandarizado por el peso del ovario en mg. La barra representa el promedio ± SEM, el
número de experimentos para cada grupo se indica dentro de cada barra. La significancia
se obtuvo con un t-test de Student de dos colas; p < 0,05 = *.
29

MHPG / NA
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Recambio nervioso en el ovario
N=4
Vehículo
*
Propranolol
10 meses
N=4
N=4
Vehículo
Propranolol
12 meses
N=4
Figura 10.- Razón MHPG versus NA ovárica. La barra representa el promedio ± SEM, el
número de experimentos para cada grupo se muestra dentro de cada barra. La
significancia se obtuvo con un t-test de Student de una cola; p < 0,05 = *.
30

4.2.2 NGF intraovárico
El factor de crecimiento nervioso (NGF), es uno de los factores que jugan un rol
importante en la mantención, y reparación del tejido neuronal. Es por tanto de gran importancia
observar cómo afecta el bloqueo de los receptores β-adrenérgicos su concentración ovárico.
Como se puede observar en la Figura 11, existe una disminución significativa de la
concentración de NGF a los 10 meses de edad (vehículo 14,0 ± 2,5 y propranolol 5,3 ± 0,9), y a
los 12 meses (vehículo 10,3 ± 2,6 y propranolol 3,3 ± 1,0).
ng NGF/ mg Proteínas
20
15
10
5
0
Concentración de NGF ovárico
N=4
Vehiculo
*
N=4
Propranolol
N=4
Vehiculo
N=3
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 11.- Concentración de NGF intraovárico de una dilución de 1:8000 estandarizado
por los mg de proteína del ovario completo. La barra representa el promedio ± SEM, la
cantidad de mediciones para cada grupo experimental corresponde al número (N) indicado
dentro cada barra. La significancia se obtuvo con un t-test de Student de dos colas;
p < 0,05 = *.
*
31

4.2.3 Concentración de Noradrenalina en la glándula adrenal
La metodología utilizada en este trabajo, genera la distribución del β bloqueador por
todo el organismo, por lo cual es importante ver qué pasa con la cantidad de NA sistémica, para
ello se utilizó la cuantificación de la NA en la médula adrenal, por participación en la liberación
sistémica de las catecolaminas. Como se observa en la Figura 12 existe un aumento significativo
de la NA en la glándula adrenal a los 12 meses cuando la comparamos con el vehículo (vehículo
0,29 ± 0,1 y propranolol 0,75 ± 0,1). Las mediciones a los 10 meses no se pudieron realizar
debido a un inconveniente experimental que dio como resultado la pérdida de las muestras.
ng NA/mg proteínas/mg animal
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Concentración de NA en
médula adrenal
N=5
Vehículo
*
N=8
Propranolol
12 meses
Figura 12.- Concentración de NA en la médula adrenal, estandarizada por los mg de
proteínas de la glándula y por el peso del animal. Los datos se grafican como en promedio
± SEM, el N para cada grupo experimental corresponde al número indicado dentro cada
barra. La significancia se obtuvo con un t-test de Student de dos colas; p < 0,05 = *.
32

4.3 Objetivo 3.-
Determinar los cambios en la funcionalidad ovárica y sistémica, producto de la
reducción de la actividad simpática provocada por la utilización de propranolol.
4.3.1 Peso de los animales y del ovario
Como el propranolol es un bloqueador β-adrenérgico inespecífico, existía la posibilidad
de que éste pudiera modificar el peso de los animales, uniéndose a los receptores β3-
adrenérgicos, conocidos por su actividad lipolítica en el tejido adiposo.
Como se observa en la Figura 13 no existen cambios significativos en el peso de los animales ni
para sus ovarios (Figura 14) durante el transcurso del experimento (2 meses), para ninguno de
los grupos experimentales.
Peso (gr)
400
350
300
Peso promedio semanal de los animales
250
0 2 4 6 8 10
Semanas
Vehículo 10 meses
Propranolol 10 meses
Vehículo 12 meses
Propranolol 12 meses
Figura 13.- Peso promedio de los animales por grupo experimental por semana. Los
animales fueron pesados diariamente durante los dos meses que duró el tratamiento. Los
datos se grafican como el promedio ± SEM. El N varía entre 6 y 8 para cada grupo
experimental
33

mg ovario
80
60
40
20
0
N=4
Vehículo
Peso del Ovario
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
Propranolol
10 meses 12 meses
N=4
Figura 14.- Peso del ovario. Los datos se grafican como el promedio ± SEM. El N
corresponde al número de mediciones para cada grupo experimental
4.3.2 Ciclicidad estral
La ciclicidad estral de la rata es un muy buen parámetro del comportamiento de la
funcionalidad ovárica del animal, pues los cambios en el epitelio vaginal, suelen ser indicativos
de las variaciones hormonales propias de la ciclicidad estral. Al respecto se observa que el
tratamiento produjo cambios significativos al comparar el vehículo versus la inyección con
propranolol.
Como se observa en la Figura 16 A existe un aumento significativo en el número de los
ciclos (en ratas de 10 meses de edad: vehículo 0,78 ± 0,3 y propranolol 5,67 ± 0,8. En ratas de
12 meses de edad: vehículo 1,90 ± 0,8 y propranolol 4,86 ± 0,8. La estimación del porcentaje de
ovulación fue determinada por la regularidad observada en los cambios de proestro, a estro y
diestro. En los animales tratados con propranolol aumenta significativamente el porcentaje de
34

ovulación (Figura 16 B), en ratas de 10 meses de edad: vehículo 4,5 ± 1,9 y propranolol 37,8 ±
5,2 y en ratas de los 12 meses de edad: vehículo 13,3 ± 5,1 y propranolol 32,9 ± 5,4.
Se consideró como un ciclo estral exitoso, todos los pasos que siguieran la siguiente
línea: Proestro, estro y al menos un diestro.
La Figura 15 muestra un extracto representativo del diagrama de la ciclicidad estral
diaria de algunos de los animales durante los 60 días de tratamiento.
15P
E
D
P
10 E
D
P
E
D5
P
E
D
0
0
15P
E
D
P
10 E
D
P
E
D5
P
E
D
0
0
A B
Vehículo 10 meses
5
10
15
20
25
30
35
Días de Tratamiento
40
C Vehículo 12 meses
D
5
10
15
20
25
30
35
Días de Tratamiento
40
45
45
50
50
55
55
60
60
30
P
E
25 D
P
E
D
20
P
E
D
15 P
E
D
0
15P
E
D
P
10 E
D
P
E
D5
P
E
D
0
0
5
5
10
10
Propranolol 10 meses
15
20
25
30
35
Días de Tratamiento
Propranolol 12 meses
15
20
25
30
35
Días de Tratamiento
Figura 15. – Diagrama representativo de la ciclicidad estral de cuatro animales para cada
uno de los grupos tratados. Animales de 10 meses de edad (A) vehículo, (B) Propranolol;
animales de 12 meses de edad (C) vehículo y (D) propranolol. Se grafica como P = proestro,
E = estro y D = metaestro y diestro. La ciclicidad se obtuvo mediante frotis vaginal diario
con observación al microscopio. Un ciclo estral normal se considera como el paso de P a E,
seguido necesariamente por un D.
40
40
45
45
50
50
55
55
60
60
35

Nº Ciclos
% ovulación
8
6
4
2
0
50
40
30
20
10
A
0
N=8
Vehículo
B
Vehículo
***
Propranolol
Ciclos durante
el tratamiento
N=10
N=10
Vehículo
**
N=12
Propranolol
10 meses 12 meses
N=8
Porcentaje de ovulación
*** *
N=10
Propranolol
N=10
Vehículo
N=12
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 16.- Ciclicidad estral y ovulación durante el periodo de subfertilidad determinados
por análisis de frotis vaginal. A) Números de ciclos promedio de los animales por grupo
experimental y B) el porcentaje de ovulación, considerando como el 100% un ciclo que
ocurre cada 4 días, por los 60 días de tratamiento (aproximadamente 16 ciclos). Los datos
se grafican como el promedio ± SEM. El número de experimentos para cada grupo
experimental se muestra dentro de cada barra. La significancia se obtuvo con un t-test de
Student de dos colas. p

4.3.3 Hormonas esteroidales en plasma
Una forma de determinar la función ovárica es midiendo los niveles de las hormonas
esteroidales producidas por el ovario a nivel plasmático. Considerando que la ruta metabólica de
hormonas esteroidales, usa como sustrato de partida la progesterona y que a partir de ella se
produce en primera instancia andostenediona, a partir de ésta testosterona, y desde ésta estradiol
(ver Figura 1) es que se decidió medir los niveles de las hormonas involucradas.
Como se puede observar en la Figura 17, no existen cambios significativos en los niveles
de progesterona (10 meses de edad: vehículo 5,4 ± 1,4 y propranolol 8,0 ± 2,41; 12 meses de
edad: vehículo 21,9 ± 6,9 y propranolol 19,5 ± 4,6). Pero sí se determinó un aumento
significativo de las hormonas plasmáticas androstenediona, testosterona y estradiol en el
tratamiento con propranolol, denotando un aumento plasmático en todos los productos de la vía
de síntesis que conlleva la producción del estradiol por las células de la granula ováricas.
Los valores para las otras hormonas de la vía son los siguientes: androstenediona (10
meses de edad: vehículo 0,11 ± 0,01 y propranolol 0,13 ± 0,01. 12 meses: vehículo 0,03 ± 0,01 y
propranolol 0,12 ± 0,01), testosterona (10 meses: vehículo 0,17 ± 0,02 y propranolol 0,23 ± 0,02.
12 meses: vehículo 0,18 ± 0,03 y propranolol 0,31 ± 0,05) y estradiol (10 meses: vehículo 34,36
± 4,6 y propranolol 53,87 ± 5,82. 12 meses: vehículo 38,97 ± 0,59 y propranolol 56,53 ± 7,07).
37

Progesterona (ng/ml)
A
40
30
20
10
Testosterona (ng/ml)
0
C
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
N=5
Vehículo
Progesterona plasmática
N=6
Propranolol
N=6
Vehículo
N=8
Propranolol
10 meses 12 meses
N=6
Vehículo
Testosterona plasmática
*
N=6
Propranolol
N=6
Vehículo
Propranolol
10 meses 12 meses
*
N=10
B
Androstenediona (ng/ml)
0.10
0.05
0.00
Vehículo
Androstenediona plasmática
0.15 * ***
80
60
40
20
0
N=5
N=4
Vehículo
N=8
Propranolol
N=5
Vehículo
N=10
Propranolol
10 meses 12 meses
Estradiol plasmático
* *
N=6
Propranolol
N=5
Vehículo
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 17.- Concentración de hormonas esteroidales en plasma. En A) se encuentran los
niveles de progesterona plasmática, en B) los niveles de androstenediona, en C) los niveles
de testosterona plasmática y en D) los niveles de estradiol. Dentro de cada barra se indica
en número de animales en cada medición. Se grafica el promedio ± SEM. La diferencia se
obtiene con un t-test de Student de dos colas, p

4.4 Objetivo 4.-
Observar y determinar los cambios histológicos observados entre las ratas
tratadas y control por medio de la morfometría ovárica
4.4.1 Folículos antrales totales
El número de folículos antrales totales se muestra en la Figura 18. El tratamiento con
propranolol aumenta significativamente el número de folículos antrales totales a los 12 meses de
edad (vehículo: 23,25 ±1,2 y propranolol: 32,8 ± 2,8) y no se observaron cambios significativos
en los ovarios de 10 meses de edad, sólo una pequeña tendencia al aumento.
n° estructuras
40
30
20
10
0
Folículos antrales totales
N=4
Vehículo
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 18.- Cantidad de folículos antrales totales. El número de folículos totales
corresponde a la suma de folículos antrales sanos más antrales atrésicos. La barra
corresponde al promedio ± SEM, el número de ovarios analizados se indica dentro de cada
barra. La diferencia se obtiene con un t-test de Student de dos colas, p

4.4.2 Folículos antrales sanos
Los folículos antrales sanos son estructuras que corresponden a aquellos folículos que
han sido sacados de su estado quiescente, para seguir el crecimiento y convertirse en un
candidato para la ovulación. La importancia hormonal de estas estructuras foliculares, radica en
que poseen una gran capa de G, las que son las responsables de la producción de estradiol en el
animal. Como se puede observar en la Figura 19 existe un aumento significativo en la cantidad
total de folículos antrales sanos en los ovarios de animales tratados con propranolol, cuando lo
comparamos con la inyección de vehículo (10 meses: vehículo 8,3 ± 1,3 y propranolol 12,3 ±
1,6. 12 meses: vehículo 9,5 ± 0,7 y propranolol 16,4 ± 1,9). Cuando agrupamos las estructuras
por tamaño, podemos observar que no existen cambios en su distribución (Figura 20).
n° estructuras
20
15
10
5
0
Folículos antrales sanos
**
N=4
Vehículo
*
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 19.- Cantidad de folículos antrales sanos en ovario de rata. La barra corresponde al
promedio ±SEM, el número de ovarios analizados se indica dentro cada barra. La
significancia se obtuvo con un test de Student de dos colas, p

n° estructuras
n° estructuras
10
5
0
15
10
A
C
5
0
100-199 um
100-199 um
Distribución folículos antrales sanos
por tamaño
200-299um
300-399um
400-499um
ND
500-599 um
600-699 um
100-199 um
200-299um
300-399um
400-499um
Vehículo Propranolol
Distribución folículos antrales sanos
por tamaño
200-299um
300-399um
400-499um
500-599 um
ND
600-699 um
100-199 um
200-299um
300-399um
400-499um
Vehículo Propranolol
500-599 um
500-599 um
600-699 um
600-699 um
Frecuencia de estructuras
B
25
20
15
10
5
Folículos antrales sanos
Vehículo
Propranolol
0
0 200 400 600 800
Rango de tamaño
D
50
40
30
20
10
Folículos antrales sanos
Vehículo
Propranolol
0
0 200 400 600 800
Rango de tamaño
Figura 20.- Distribución de la población de folículos antrales sanos por tamaños en ovario
de rata. A y B corresponden a distribución de los tamaños de los folículos antrales sanos a
los 10 meses de edad. A indica el número estructuras como el promedio ± SEM, mientras
que en B se grafica la frecuencia acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios
observados y su distribución gaussiana correspondiente. C y D corresponde a distribución
de los tamaños de los folículos antrales sanos a los 12 meses. C indica el número
estructuras como el promedio ± SEM, mientras que en D se grafica la frecuencia
acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios observados y su distribución
gaussiana correspondiente. ND = estructura no encontrada.
Frecuencia de estructuras
41

4.4.3 Folículos antrales atrésicos
Los folículos antrales atrésicos corresponden a la población folicular que detiene su
crecimiento y degeneran por lo que no son seleccionados para la ovulación en un ciclo estral.
Como podemos ver en la Figura 21 no existen cambios significativos en la cantidad de folículos
a los 10 meses de edad (vehículo 15,8 ± 3,2 y propranolol 16,5 ± 1,9) ni a los 12 meses de edad
(vehículo 13,8 ± 0,9 y propranolol 16,4 ± 2,0). Tampoco se observan cambios en su distribución
por tamaño (Figura 22).
n° estructuras
20
15
10
5
0
N=4
Vehículo
Antrales atrésicos
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 21.- Cantidad de folículos antrales atrésicos en ovario de rata. La barra
corresponde al promedio ± SEM, el número de ovarios analizados se indica dentro de cada
barra.
42

n° estructuras
n° estructuras
8
6
4
2
0
C
8
6
4
2
0
A
200-299um
200-299um
300-399um
Folículo antrales atrésicos
por tamaño
400-499um
500-599 um
ND
600-699 um
200-299um
300-399um
400-499um
Vehículo Propranolol
300-399um
Folículos antrales atrésicos
por tamaño
400-499um
500-599 um
600-699 um
200-299um
300-399um
400-499um
500-599 um
500-599 um
Vehículo Propranolol
600-699 um
600-699 um
Frecuencia de estructuras
B
30
20
10
Folículos antrales atrésicos
0
0 200 400 600 800
Rango de tamaño
D
30
20
10
Folículos Antrales Atrésicos
0
0 200 400 600 800
Rango de tamaño
Vehículo
Propranolol
Vehículo
Propranolol
Figura 22.- Distribución de la población de folículos antrales atrésicos por tamaños en
ovario de rata. A y B corresponden a distribución de los tamaños de los folículos antrales
atrésicos a los 10 meses. A indica el número estructuras como el promedio ± SEM,
mientras que en B se grafica la frecuencia acumulada de los folículos según tamaño en los
ovarios observados y su distribución gaussiana correspondiente. C y D corresponde a
distribución de los tamaños de los folículos antrales atrésicos a los 12 meses. C indica el
número estructuras como el promedio ± SEM, mientras que en D se grafica la frecuencia
acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios observados y su distribución
gaussiana correspondiente. ND = estructura no encontrada.
Frecuencia de estructuras
43

4.4.4 Folículos quísticos
Los folículos quísticos corresponden a un grupo de tres tipos foliculares, conocidos
como los quistes, los prequistes y los folículos tipo III, en cada una de estas estructuras podemos
encontrar características morfológicas diferentes, estandarizados según los criterios de (48-50).
Se ha visto en mujeres, que conforme al incremento de la edad, se encuentra un
aumento significativo de las estructuras quísticas en sus ovarios, lo que se relaciona en parte con
la pérdida de fertilidad. En nuestro modelo animal, cuando tratamos durante 14-15 ciclos un
animal con propranolol (2 meses), encontramos que existe una disminución significativa de las
estructuras quísticas totales en los animales respecto a su vehículo. 10 meses: vehículo 26 ± 4,3
y propranolol 12,3 ± 5,5. 12 meses: vehículo 19 ± 2,9 y propranolol 9,2 ± 2,4
n° estructuras
40
30
20
10
0
Folículos quísticos totales
(quiste, prequiste y tipo III)
N=4
Vehículo
*
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
*
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 23.- Cantidad de folículos quísticos totales en ovario de rata. El recuento de
folículos quísticos totales comprende la suma de los folículos tipo III, prequistes y quistes
propiamente tal. La barra corresponde al promedio ± SEM, el número de ovarios
analizados se indica dentro de cada barra. La significancia se obtuvo con un test de Student
de una cola, p

4.4.4.1 Folículos tipo III
Según se ha visto en nuestro laboratorio, la cinética de transformación de los folículos
antrales a quistes pareciera seguir el siguiente camino: Folículos tipo III a prequiste y finalmente
a quiste (
Figura 24).
Figura 24.-Diagrama de las etapas morfológicas de la formación de quistes. Se observa en
la figura que la primera estructura que creemos se forma son los folículos tipo III, para
luego genrar de forma secuancial los prequistes y finalmente los quistes
Los folículos tipo III se caracterizan por tener una gran capa de granulosa y un antro que
le otorga tamaños mucho mayores que un folículo pre-ovulatorio. Como se observa en la Figura
25 no existen cambios en el número de folículos tipo III a los 10 meses (vehículo 7 ± 2,0 y
propranolol 6 ± 2,5), ni a los 12 meses de edad (vehículo 5,5 ± 1,2 y propranolol 3 ± 1,4), pero si
podemos apreciar en que existen una disminución significativa del tamaño de la población de
folículos tipo III que corresponden al grupo tratado con propranolol (Figura 26).
45

n° estructuras
10
8
6
4
2
0
Vehículo
Folículos tipo III
N=4 N=4 N=4
Propranolol
Vehículo
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 25.- Cantidad de folículos tipo III en ovario de rata. La barra representa el
promedio ± SEM, el número de ovarios analizados se indica dentro de cada barra.
46

A
n° estructuras
n° estructuras
4
3
2
1
0
C
5
4
3
2
1
0
600-699 um
700-799 um
Distribución de folículos tipo III
por tamaño
800-899 um
900-999 um
< 1000 um
600-699 um
700-799 um
800-899 um
900-999 um
Vehículo Propranolol
Distribución de folículos tipo III
por tamaño
ND ND
600-699 um
700-799 um
800-899 um
900-999 um
< 1000 um
600-699 um
700-799 um
800-899 um
900-999 um
Vehículo Propranolol
< 1000 um
< 1000 um
Frecuencia de estructuras
B
15
10
5
Folículos tipo III
*
0
0 500 1000 1500
Rango de tamaño
D
10
8
6
4
2
Folículos tipo III
0
0 500 1000 1500
Rango de tamaño
**
Vehículo
Propranolol
Vehículo
Propranolol
Figura 26.- Distribución de la población de folículos tipo III por tamaños en ovario de rata.
A y B corresponden a distribución de los tamaños de los Folículos Tipo III a los 10 meses
de edad. A indica el número estructuras como el promedio ± SEM, mientras que en B se
grafica la frecuencia acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios observados y
su distribución gaussiana correspondiente. C y D corresponde a distribución de los
tamaños de los Folículos Tipo III a los 12 meses de edad. C indica el número estructuras
como el promedio ± SEM, mientras que en D se grafica la frecuencia acumulada de los
folículos según tamaño en los ovarios observados y su distribución gaussiana
correspondiente. En B y D se obtiene la significancia con un test de χ 2 , p

4.4.4.2 Prequistes
Los prequistes son estructuras que se encuentra en una estado intermedio entre la
formación del quiste, y lo que se propone como el inicio de éste, el folículo tipo III. En el
análisis se encontró que existe una disminución significativa de los prequistes a los 10 meses de
edad con el tratamiento con el propranolol (vehículo 3,8 ± 0,8 y propranolol 1 ± 0,4), y una
tendencia clara a la disminución cuando observamos los ovarios de rata de 12 meses edad
(vehículo 3 ± 0,9 y propranolol 1,2 ± 0,5), pero sin ser ésta estadísticamente significativa (p =
0,0514), como se observa en la Figura 27. Cuando vemos el análisis de la distribución de los
tamaños, observamos que existen cambios significativos en los tamaños a los 10 meses, pero
sólo se aprecia una tendencia a la separación de las poblaciones a los 12 meses (p= 0,0839).
n° estructuras
5 **
4
3
2
1
0
N=4
Vehículo
Propranolol
Prequistes
N=4
N=4
Vehículo
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 27.- Cantidad de prequistes en ovario de rata. La barra corresponde al promedio ±
SEM, el número de ovarios analizados se indica dentro de cada barra. La significancia se
obtuvo con un test de Student de dos colas, p

n° estructuras
n° estructuras
A
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
C
600-699 um
700-799 um
Distribución de prequistes
por tamaño
ND ND ND
500-699 um
700-999 um
800-899 um
900-999 um
< 1000 um
600-699 um
700-799 um
800-899 um
900-999 um
Vehículo Propranolol
Distribución de prequistes
por tamaño
1000 - 1299 um
< 1300 um
500-699 um
700-999 um
1000 - 1299 um
Vehículo Propranolol
ND
< 1300 um
< 1000 um
Frecuencia de estructuras
D
B
6
4
2
Prequistes
0
0 500 1000 1500
Rango de tamaño
5
4
3
2
1
*
Prequistes
0
0 500 1000 1500
Rango de tamaño
Vehículo
Propranolol
Vehículo
Propranolol
Figura 28.- Distribución de la población de prequistes por tamaños en ovario de rata. A y
B corresponden a distribución de los tamaños de los Prequistes a los 10 meses de edad. A
indica el número estructuras como el promedio ± SEM, mientras que en B se grafica la
frecuencia acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios observados y su
distribución gaussiana correspondiente. C y D corresponde a distribución de los tamaños
de los folículos prequistes a los 12 meses de edad. C indica el número estructuras como el
promedio ± SEM, mientras que en D se grafica la frecuencia acumulada de los folículos
según tamaño en los ovarios observados y su distribución gaussiana correspondiente. ND =
estructura no encontrada.
Frecuencia de estructuras
49

4.4.4.3 Quistes
Cuando realizamos un análisis segmentado de los folículos quísticos, encontramos que
en el caso de los quistes existe una disminución significativa con respecto al vehículo a los 10
meses (vehículo 15,3 ± 2,7 y propranolol 5,5 ± 3,2) y 12 meses de edad (vehículo 10,5 ±2,6 y
propranolol 5,0 ± 1,3), mientras que cuando analizamos los tamaños vemos que no existen
diferencias significativas en las distribuciones.
n° estructuras
20 *
15
10
5
0
N=4
Vehículo
Propranolol
Quistes
N=4
N=4
Vehículo
*
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 29.- Cantidad de quistes en ovario de rata. La barra corresponde al promedio ±
SEM, el número de ovarios analizados se indica en cada barra. La significancia se obtuvo
con un test de Student de dos colas, p

n° estructuras
n° estructuras
A
8
6
4
2
0
4
3
2
1
0
C
200-299um
200-299um
300-399um
300-399um
400-499um
400-499um
500-599 um
600-699 um
Distribución de quistes
por tamaño
700-799 um
800-899 um
< 900 um
200-299um
300-399um
400-499um
500-599 um
600-699 um
Vehículo Propranolol
500-599 um
600-699 um
Distribución de quistes
por tamaño
700-799 um
800-899 um
< 900 um
Vehículo Propranolol
200-299um
300-399um
400-499um
500-599 um
600-699 um
700-799 um
700-799 um
800-899 um
ND
800-899 um
< 900 um
< 900 um
Frecuencia de estructuras
B
40
30
20
10
Quistes
Vehículo
Propranolol
0
0 500 1000 1500
Rango de tamaño
D
20
15
10
5
Quistes
Vehículo
Propranolol
0
0 500 1000 1500 2000
Rango de tamaño
Figura 30.- Distribución de la población de quistes por tamaños en ovario de rata A y B
corresponden a distribución de los tamaños de los quistes a los 10 meses. A indica el
número estructuras como el promedio ± SEM, mientras que en B se grafica la frecuencia
acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios observados y su distribución
gaussiana correspondiente. C y D corresponde a distribución de los tamaños de los quistes
a los 12 meses. C indica el número estructuras como el promedio ± SEM, mientras que en
D se grafica la frecuencia acumulada de los folículos según tamaño en los ovarios
observados y su distribución gaussiana correspondiente. ND = estructura no encontrada.
Frecuencia de estructuras
51

4.4.5 Cuerpos lúteos
Los cuerpos lúteos corresponden a una de las poblaciones foliculares más importantes en
el ovario, esto debido a que son los principales productores de progesterona y son un reflejo de
la funcionalidad cíclica del ovario, ya que si no existe ovulación no debieran existir cuerpos
lúteos, y viceversa, si existe ovulación encontraremos una gran cantidad de cuerpos lúteos en la
rata.
Según lo que se observa en la Figura 31 existe un aumento significativo de la cantidad
de cuerpos lúteos a los 10 meses de edad (vehículo 2 ± 1,8 y propranolol 20 ± 2,2) y 12 meses
con propranolol (vehículo 11 ± 5,1 y propranolol 25,2 ± 2,1), lo que se correlaciona con el
aumento en la ciclicidad estral evidenciada en la Figura 16.
n° estructuras
30
20
10
0
N=5
Vehículo
Cuerpos lúteos
***
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
*
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 31.- Cantidad de cuerpos lúteos en ovario de rata. La barra representa el promedio
± SEM, el número de ovarios analizados se indica dentro de cada barra. La significancia se
obtuvo con un test de Student de dos colas, p

4.4.6 Folículos luteinizados
Los folículos luteinizados corresponden a la población folicular con células luteinizadas,
sin corresponder a cuerpos lúteos; es decir, folículos antrales que han luteinizado sus CG, pero
que no han pasado por el proceso de ovulación.
Como se puede observar en la Figura 32, no existen diferencias significativas en el
número de folículos luteinizados a los 10 meses de edad (vehículo 13,5 ± 1, 01 y propranolol
10,25 ± 2,3), y tampoco a los 12 meses de edad (vehículo 14,5 ± 3,12 y propranolol 10,25 ±
1,3), pero pareciera existir una tendencia a la disminución.
n° estructuras
20
15
10
5
0
Vehículo
Folículos luteinizados
N=4
N=4
Propranolol
N=4
Vehículo
N=5
Propranolol
10 meses 12 meses
Figura 32.- Cantidad de folículos luteinizados en ovario de rata. La barra representa el
promedio ± SEM, el número de ovarios analizados se indica en cada barra.
53

4.4.7 Microfotografías representativas de ovarios de rata
A) Vehículo 10 meses
C) Vehículo 12 meses
Q
TIII
Q
TIII
A
Q
TIII
B) Propranolol 10 meses
D) Propranolol 12 meses
Figura 33.- Microfotografías representativas de los ovarios analizados. A) Ovario de rata
de 10 meses de edad tratada con vehículo, B) ovario de rata de 10 meses de edad tratada
con propranolol, C) ovario de rata de 12 meses de edad tratada con el vehículo y D) ovario
de rata de 12 meses de edad tratado con propranolol. CL = cuerpo lúteo, Q = quistes,
TIII = folículo tipo III y A = folículo antral.
Q
TIII A
TIII
Q
Q
Q
A
CL
CL
CL
Q
CL
A
CL
CL
54

5 Discusión
Una de las características propias del envejecimiento reproductivo es la pérdida paulatina
de la fertilidad, en parte producto del cese de la funcionalidad ovárica. En este sentido, nuestro
laboratorio ha desarrollado una línea que apunta hacia la comprensión de los mecanismos que
participan en el cese de la función ovárica, principalmente relacionando la actividad del SNS con
el envejecimiento ovárico. Dentro de las evidencias encontradas en este ámbito, vemos que el
ovario asume características funcionales y morfológicas que se parecen en gran parte a la
condición de ovario poliquístico (26;27;37) que en mujeres en edad fértil, genera anovulación e
infertilidad (26). Parte de estas similitudes se basan en el hecho de que el ovario poliquístico
genera aparición de quistes foliculares y un aumento en el tono adrenérgico que inerva el ovario,
tanto en ratas como en mujeres (11;12;29-31;38;43;44;50).
Para realizar este estudio hemos utilizado un modelo animal que está bien caracterizado
por nuestro laboratorio y otros autores (11;21). La rata Sprague-Dawley presenta fertilidad
óptima entre los 5 y 6 meses de edad, mientras que desde los 8 meses comienza el periodo
denominado de sub-fertilidad, que es el equivalente al periodo que sobrellevan las mujeres desde
aproximadamente los 32 a 42 años de edad. En este modelo animal se ha demostrado que existe
un aumento espontáneo de estructuras quísticas con la edad, lo que se correlaciona con el
aumento en la liberación y contenido de NA ovárica (11). Es por tanto que nuestra hipótesis
quiere demostrar que el bloqueo de los receptores β-adrenérgicos, por los cuales la NA realiza su
efecto, permitiría una recuperación o aplazamiento del envejecimiento ovárico, y la consiguiente
reducción de las estructuras quísticas en el órgano.
Los resultados obtenidos en esta tesis avalan la hipótesis planteada, ya que cuando
observamos el comportamiento del ovario al final de 2 meses de administración del bloqueador
β-adrenérgico (propranolol), se observa una reactivación del desarrollo folicular dado por un
aumento de los folículos antrales sanos y de los cuerpos lúteos, una disminución de las
estructuras quísticas (los quistes, prequistes y folículos tipo III), indicando que el ovario vuelve a
ciclar y a ovular.
55

5.1 Receptores β-adrenérgicos intraováricos
El bloqueo de los receptores β-adrenérgicos permite disminuir el efecto de la NA dado
por el tono simpático del ovario, que se encuentra aumentado durante el cese de la función
ovárica. Fue por tanto, importante conocer como variaban los niveles de los receptores β-
adrenérgicos con la edad, debido a que no se ha descrito dicho comportamiento, y se asumía que
los cambios serían muy similares a los que ocurren en la época de fertilidad del animal, es decir:
que la presencia de adrenoreceptores β2 en las CT y CG del ovario de rata fluctúan en relación al
pico de LH y la formación del cuerpo lúteo (31), y además los receptores β-adrenérgicos varían a
lo largo del ciclo estral: los menores niveles de receptores β-adrenérgicos aparecerían en estro
cuando la liberación de NE es más alta, mientras que los niveles de receptores β-adrenérgicos
sería más alta en el diestro cuando la liberación de NE es más baja (39), lo que presenta un
comportamiento de “up y down regulation” de receptores en presencia de su ligando (NA).
Cuando se evaluó el cambio en la cantidad de receptores β-adrenérgicos en ovario de
ratas viejas, se observó que existe una probable pérdida de la regulación de los receptores β
según el ciclo estral, esto en parte, puede deberse a la pérdida de la ciclicidad regular que le
ocurre de forma natural al animal, producto del envejecimiento. Según nuestros datos, el perfil
que presentan los receptores β-adrenérgicos durante la vejez del animal (Figura 6), poseen un
comportamiento inverso respecto a los datos de liberación de NA, lo que es indicativo de un
efecto depresor de la NA sobre los recetores β-adrenérgicos, como se observa en la Figura 34.
Es por tanto, muy probable que este efecto sea provocado por la internalización de los receptores
ante la elevada y sostenida estimulación de NA (51), observada con el aumento de la edad. Es
importante, para poder afirmar esta observación aumentar el número de mediciones
experimentales catalogadas por ciclo estral, lo que no se pudo realizar en este trabajo, debido a
que el animal a medida que envejece, pierde la capacidad de ciclar regularmente, y tienden a
quedarse estancadas en un ciclo, generalmente en D o E, por lo que la recolección de las
muestras presenta un desafío importante.
56

fmol receptor β/mg proteína
200
150
100
50
0
6 8 10 12 14 16
Edad (meses)
25
20
15
10
5
0
Receptores β
Liberación NA
Figura 34.- Relación de la concentración de receptores β-adrenérgicos y la liberación de
NA según la edad. Los datos se grafican como el promedio ± SEM. El N para la liberación
de NA se utilizan los datos publicados en (11) y para los receptores β-adrenérgicos los
citados en la Figura 6.-
Cuando aplicamos el β bloqueador, vemos que la cantidad de receptores no varía con el
tratamiento, es más, la razón 10:12 meses entre vehículos y entre el grupo propanolol, es similar
a la razón 10:12 meses observada en condiciones fisiológicas.
Datos previos en la literatura, nos indican que existen un aumento de los receptores β-
adrenérgicos a nivel de membrana con el bloqueo farmacológico (52) , pero estos estudios
utilizan dosis mayores del ligando (53;54) o lo hacen en un cultivo in vitro (55;56), por lo que
es probable que la dosis utilizada en este trabajo sea baja y no permita que exista un aumento de
receptores en la membrana, pero sí pudiera haber sensibilizado los receptores β, traslocando la
β-arrestina al citoplasma, como se ha visto ocurre en otros estudios (57).
Dado que el propranolol es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, existe también
la opción que el propranolol pudiera mediar su acción por un efecto central a nivel hipotalámico-
hipofisiario, lo que requerirá de estudios futuros. Es importante destacar que el bloqueo β-
adrenérgico, si bien no cambia la cantidad de receptores, sí generó cambios funcionales,
morfológicos, en la esteroidogénesis y en la liberación de NA desde los terminales nerviosos del
órgano.
% liberación NA
57

5.2 Cambios sistémicos
Cuando se evaluaron los cambios del animal durante la administración del propranolol, no
hubo cambios en el peso en los animales de ninguna de las series, demostrando que la dosis
aplicada de propranolol no afectó la lipólisis ni el metabolismo de ellos, como si ha ocurrido en
otros experimentos (58-60). Esto probablemente obedeció a que el animal durante la edad del
tratamiento ya había cesado su crecimiento, y producto de la mantención típica de bioterio,
algunos poseían un grado de sobrepeso, producido por la poca movilidad y a que su
alimentación es de tipo ad-libutum.
Otro efecto sistémico, de gran importancia para nosotros, consistió en la observación de la
ciclicidad estral por frotis vaginal diario, en este caso encontramos una recuperación del
porcentaje y número de ovulaciones alcanzadas por las ratas, mayores aún que las existentes
para animales sin inyección de la misma edad (61). Evidencias señalan que la disminución de la
fertilidad y el comienzo de la aciclicidad menstrual (mujeres) y estral (ratas) tienen relación no
solo con el aumento de la edad y la pérdida folicular que ésta produce (8;9;13), sino que
también con el aumento del tono simpático que inerva el ovario (11;12), característica que
comparte con el PCO (29;50). En este sentido el bloqueo de los receptores β-adrenérgicos
tendría un efecto similar a la denervación del SON en un animal acíclico (37), lo que reafirma la
idea de que el aumento de la concentración de NA durante el envejecimiento ovárico favorece la
formación de las estructuras quísticas.
5.3 Morfología ovárica
El análisis de la morfología ovárica en ratas con la actividad β-adrenérgica bloqueada,
permitió detectar un aumento en el número de los folículos antrales sanos (folículos secundarios
que han adquirido el antro y aumentan su tamaño), aun cuando no hay variaciones en el número
de folículos antrales atrésicos (población folicular que está en proceso degenerativo). Este
cambio en la población de folículos antrales denota un posible aumento del reclutamiento
folicular, un aumento de folículos preovulatorios (antrales sanos de más de 600 µm), y una
disminución de la atresia, ya que la administración de propranolol hace que la razón de folículos
sanos:atrésicos cambie de aproximadamente 0,6 a 1 respecto al control, para ambas edades.
58

Esta diferencia de la población folicular, no sólo ocurre a nivel de la cantidad y
distribución de folículos antrales, sino que también se ve una disminución de las estructuras
quísticas (quiste y prequistes), acompañado de aumento de la cantidad de cuerpos lúteos, lo que
hace pensar en la redirección de la población folicular, favoreciendo la vía de la ovulación, más
que la vía de la generación de quistes. Estos datos concuerdan con los encontrados por Juan
Collao y cols. donde se observa que la administración diaria de ISO durante diez días en ratas
jóvenes, es capaz de generar quistes, mientras que se observa una reversión al administrar
propranolol conjunto con el ISO. Por otro lado, se ha demostrado que el aumento de folículos
tipo III en ovario de rata, se ve favorecido por un previo aumento de la actividad del SNS del
ovario, ya sea inducido por estrés (4;62) o por administración de VE (29;37;48;50). La
disminución de la actividad del SNS durante el envejecimiento ovárico, inducido por el bloqueo
de los receptores β-adrenérgicos no produce cambios en el número de folículos tipo III, pero sí
vemos diferencias significativas en la disminución en la distribución de sus tamaños, cuando se
compara con el control. La disminución también es apreciable en el caso de los prequistes, no así
en los quistes, apoyando la idea que la sobre estimulación noradrenérgica que ocurre
espontáneamente con la edad, tiene un importante rol en el crecimiento observado en los
folículos tipo III y prequistes (11). Una de las razones por las que esto puede estar ocurriendo es
que morfológicamente los folículos tipo III se caracterizan por poseer una gran capa de CG y
una capa de CT hipertrofiada, las cuales poseen, dentro de muchas moléculas, receptores β2
adrenérgicos y el receptor a LH (LHR) (63). Los LHR en un folículo normal, permitirán en parte
la acción endocrina hipofisiaria por medio de la LH, y la facilitación de la secreción de
hormonas esteroidales por medio de los receptores β-adrenérgicos (39). Se ha demostrado en
ratas jóvenes ovulatorias, que cuando ocurre el pico de LH, disminuyen los receptores β-
adrenérgicos en la CG, lo que coincide con el estro en un animal joven, esto permite que las
células se luteinizen y se genere la aparición del cuerpo lúteo que es productor de progesterona.
Cuando a ratas se les administra clenbuterol (un agonista β2 adrenérgico) durante 21
días, se observan alteraciones en el sistema reproductor de las ratas adultas, como por ejemplo
alteraciones histológicas en útero y ovario, presencia de quistes, ausencia de cuerpos lúteos y
una disminución de las concentraciones plasmáticas de estradiol y progesterona (64), lo que se
asimila al comportamiento en la vejez de la rata (11); por otro lado, se ha visto que cuando se le
administra VE a ratas para inducir PCO, se generan ovarios con una gran cantidad de estructuras
59

como los folículos tipo III, los que al ser incubados en presencia de ISO aumentan la secreción
de progesterona en el medio (27). Si llevamos este fenómeno a nuestro modelo, es probable que
esta sensibilidad de los receptores β en los folículos tipo III genere un efecto acumulativo
autocrino de la progesterona en el líquido folicular, como se ha observado en los quistes de
vacas (65). Considerando las siguientes tres condiciones, que aparecen en la literatura: 1) que la
estimulación de NA sobre los receptores β-adrenérgicos permite un aumento en la liberación de
progesterona, 2) que ésta podría acumularse si no se tiene la cantidad suficiente de aromatasa en
las CG, como se ha visto en otros modelos animales (66), y 3) que la progesterona posee
actividad anti-mitogénica y anti-apoptótica sobre las CG de manera dosis dependiente (67),
pensamos que cuando el folículo pre-ovulatorio se encuentra en crecimiento, y aumenta de
tamaño, aumenta también la expresión de LHR (63), haciéndolo más susceptible a la acción de
la NA, por lo que si se produce la sobre-estimulación del folículo preovulatorio, en una primera
instancia éste va a aumentar la secreción de progesterona y otras hormonas en el líquido
folicular. Como la estimulación es sostenida en el tiempo, es probable que se disminuyan o
desensibilicen los receptores β-adrenérgicos, disminuyendo así la secreción de hormonas como
la progesterona.
La acumulación de estas sustancias intracrinas, facilitarán en un inicio el crecimiento
folicular y luego dificultarán la ovulación, permitiendo un aumento de los folículos tipo III,
caracterizados por su gran tamaño (más de 700 µm). Esta hipótesis se apoya también en que los
ovarios de 10 y 12 meses presentan una razón del ARNm paraBcl-2/Bax mayor a uno, lo que nos
indica que la apoptosis aparentemente se encuentra frenada (11), obstaculizando así la ovulación.
Dado que nosotros hemos bloqueado los receptores β-adrenérgicos, al menos parcialmente, es
probable que estemos modulando la acción de la NA y de la secreción de hormonas foliculares
(como progesterona), facilitando así los cambios morfológicos observados.
Con estos cambios en la morfología ovárica, se sugiere que el ovario recupera parte del
desarrollo folicular, observado con el aumento de las estructuras sanas y disminución de los
quistes. Sin embargo, siendo más estricto, éstos cambios no son suficientes para generar
cambios en la fertilidad, entendida como la mayor capacidad generar descendencia, ya que al
intentar cruzar ratas de 12 meses, posterior al tratamiento de 2 meses con una inyección diaria de
propranolol, el cruce fue infructuoso por el rechazo de las hembras por el macho (resultados no
60

mostrados), este comportamiento no fue tan sorpresivo para nosotros, ya que aun cuando los
ovarios de estas ratas presentaban una morfología acorde con un aumento de fertilidad, la falta
de progesterona produce una disminución del reflejo de lordosis en las ratas (68), aún en
presencia del macho, por lo que es muy probable de que ésta sea la causa del rechazo de las
hembras a la cruza.
5.4 Hormonas ováricas
Respecto a lo anterior no se detectaron cambios en los niveles de progesterona plasmática,
esto puede deberse en parte, a que los cuerpos lúteos al tener sus receptores β-adrenérgicos
parcialmente bloqueados, no son capaces de secretar la suficiente progesterona como para que se
detecte un alza en el plasma, aún cuando exista una mayor cantidad de cuerpos lúteos. Pues
debemos recordar que existe un efecto estimulante de la secreción de progesterona, ante la
estimulación de los receptores β-adrenérgicos. Por otro lado, existe la opción de que
sencillamente a edades tan avanzadas (como 10 y 12 meses), el eje hipotálamo-hipófisis se
encuentre alterado, por un envejecimiento natural de las células hipotalámicas y/o hipofisiarias
(69;70) generando cambios en los niveles hormonales de sus productos de secreción, pero esta
idea requiere futuros análisis.
Dado que la población folicular se correlaciona con las hormonas esteroidales circulantes,
cuando analizamos a la androstenediona, testosterona y estradiol, observamos un aumento
significativo de ellas con el bloqueo de los receptores β-adrenérgicos. Es probable que este
aumento se deba al incremento de los folículos antrales sanos, lo que nos otorga una mayor
cantidad de CG y CT sanas que trabajen en conjunto (teoría de las dos células Figura 2),
generando mayor cantidad de estradiol, hormona que clásicamente se utiliza como parámetro de
la pérdida folicular y envejecimiento ovárico. Por otro lado, si bien se ha reconocido la
condición de PCO en humanos y otras especies, como una condición hiperandrogénica (71), el
aumento observado de androstenediona en las ratas que recibieron el tratamiento, no supera los
límites normales encontrados en una ratas de 6 meses (6 meses: androstenediona = 0,32 ± 0,2
(61) y propranolol 10 meses = 0,13 ± 0,01 y 12 meses = 0,12 ± 0,01). Por tanto este aumento
hormonal de androstenediona representa una tendencia hacia la recuperación de la funcionalidad
ovárica, no hacia la androgenización.
61

5.5 Catecolaminas
La medición de catecolaminas se realizó como un control del cambio que experimentarían
los animales en respuesta al bloqueo β-adrenérgico.
El aumento de la concentración de NA observado en la médula adrenal de ratas de 12
meses de edad tratadas con propranolol, nos indica un posible aumento de la síntesis de
catecolaminas, o bien sugiere una disminución en la liberación de la NA. La última suposición
concuerda con lo visto por Orts y col (72), donde se observó que el propranolol en dosis
cercanas a 5mg/kg peso es capaz de inhibir parcialmente la liberación de NA, sin influir
mayormente sobre su recaptación. Es probable que este aumento en la concentración de NA en
adrenal no esté afectando la función ovárica, pues vemos a nivel local, que en el terminal
nervioso del ovario, la actividad metabólica se encuentra aumentada.
Con respecto a la determinación de NA en ovario de ratas tratadas con propranolol,
observamos que en el terminal nervioso ovárico pareciera existir un mayor recambio, o una
mayor actividad, observado con el aumento en la razón de MHPG / NA. Este aumento de
recambio podría estar ocasionado por diversos factores, uno de ellos es el posible aumento del
tiempo de la NA en el espacio sináptico, producto del bloqueo de los receptores β-adrenérgicos
por el fármaco, lo que podría relacionarse también con la disminución que hemos encontrado en
la concentración de NGF.
Contrario a esto, se ha demostrado que el aumento de la actividad simpática del ovario
inducida por estrés, aumentó la concentración de NGF introvárico a las 4 semanas (73), y la
administración de EV también induce un aumento de NGF a los 30 días post administración,
para luego volver a valores normales a los 60 días (50). Por otro lado, cuando se observa el NGF
en ovarios sin comunicación con el SNS, a los que se les ha administrado guanitidina o
seccionado el SON, vemos un aumento del NGF ovárico, posiblemente porque como se ha
cortado el transporte reverso de la neurotrofina, ésta se acumula en el terminal nervioso. La
acumulación del NGF en el terminal favorecerá la reinervación (74); pero en nuestro modelo
sólo hemos bloqueado la comunicación de la NA con el ovario, sin perder ni dañar el terminal
62

nervioso, por lo que el SNS podría seguir comunicándose por vías alternativas a la NA con el
ovario.
La liberación de vesículas catecolaminérgicas desde el terminal nervioso simpático, no
es exclusiva para un determinado neurotransmisor, si no que una misma vesícula libera varias
moléculas como por ejemplo: NA, NPY y ATP. Se ha demostrado que el aumento o
estimulación mediada por NGF produce un aumento en la transcripción y traducción de los
receptores para NPY (75;76) y para ATP (receptores P2X2) (77), y se ha descrito que ambos
tipos de receptores se encuentran en el ovario de rata. Según estos antecedentes, es probable
que al liberar mayor cantidad NA, estemos también liberando alguna de estas moléculas que
acompañan a la NA en la vesícula. Este probable aumento de NPY, ATP y otros en el espacio
sináptico, podría estar sobrestimulando sus respectivos receptores, generando una comunicación
entre el terminal nervioso y las células blanco del ovario, el que podría a su vez responder
disminuyendo sus niveles de NGF, como mecanismo compensatorio a la sobre estimulación de
vías secundarias (ATP, NPY etc).
Finalmente, y en resumen, podemos ver en la Figura 35, un diagrama del desarrollo
folicular observado en condiciones fisiológicas en la vejez del animal, mientras que en la Figura
36, vemos un diagrama con los cambios observados en el desarrollo folicular, producto del
bloqueo de los receptores β-adrenérgicos con propranolol.
63

Figura 35.- Dinámica folicular observada en condiciones fisiológicas en las ratas de 10 y 12
meses comparada con la dinámica de 6 meses o período de máxima fertilidad. Se
representa un aumento importante de las estructuras quísticas, y un estancamiento de la
ovulación. E2 = estradiol plasmático y P4 = progesterona plasmática. Figura modificada
desde (78)
64

Figura 36.- Dinámica folicular de los ovarios con administración diaria de propranolol por
2 meses. Se representa un aumento de las estructuras antrales sanas y del proceso de la
ovulación, acompañada de una disminución de las estructuras quísticas, de los cuales los
folículos tipo III y prequistes son más pequeños que el control de vehículo. E2 = estradiol
plasmático y P4 = progesterona plasmática.
65

6 Conclusiones
6.1 Conclusiones específicas
− En condiciones fisiológicas del envejecimiento encontramos una sobrestimulación del SNS
sobre el ovario, lo que genera una disminución de los receptores β-adrenérgicos en el ovario
en respuesta al aumento de la NA desde el terminal nervioso. Este aumento del SNS genera
una pérdida de la ciclicidad estral y de la regulación hormonal comandada por el ovario,
derivando en una pérdida de la relación ciclo estral-cantidad de receptores β-adrenérgicos.
− El bloqueo β-adrenérgicos con propranolol probablemente aumenta el tono del SNS sobre el
ovario, esto sin cambiar la cantidad de los receptores β-adrenérgicos. Sin embargo, podría
estar modificada la sensibilidad y/o afinidad de ellos, lo que requiere futuros estudios.
− El bloqueo de los receptores β-adrenérgicos, genera un aumento del número de los folículos
antrales totales, y particularmente de los folículos antrales sanos, lo que sugiere un aumento
del reclutamiento folicular. Esto reafirma la idea de que la NA apoya y modula procesos que
van más allá de la ovulación y secreción esteroidal.
− El aumento de las estructuras foliculares sanas se correlaciona con la recuperación de la
función hormonal del ovario (posible aumento en la vía de síntesis de hormonas esteoidales).
Esta recuperación de la función esteroidogénica del ovario estaría favoreciendo el rescate de
la ciclicidad estral.
− El aumento del número de cuerpos lúteos y del porcentaje de ciclicidad estral, sugiere una
reactivación del proceso de la ovulación. En el caso de las estructuras quísticas vemos una
disminución del número (prequistes y quistes) y el tamaño de algunas de ellas (folículo tipo
III y prequiste). Estos cambios en la población folicular nos permite proponer un retraso o
detención en la cinética de la formación quística y un favorecimiento de la ovulación.
66

6.2 Conclusión general
Durante el envejecimiento reproductivo existe un aumento del tono adrenérgico sobre el
ovario, y con el bloqueo β-adrenérgico se ha logrado mejorar la funcionalidad ovárica,
evidenciado en la recuperación de la esteroidogénesis y foliculogénesis de la gónada, dando a
este fármaco expectativas para su uso a nivel clínico como terapia de ayuda, para favorecer la
función ovárica perdida en la etapa de sub-fertilidad.
67

7 Proyección
Los cambios sociales que ha experimentado la mujer en este último tiempo, le ha dado
una mayor cabida en el mundo laboral, generando como consecuencia una postergación de la
maternidad (1) hacia mas allá de los 36 años, periodo en donde comienza la subfertilidad (8).
Este periodo se caracteriza, dentro de otras cosas, por la dificultar de concebir naturalmente
(3;5), y por la disminución del porcentaje de éxito en la fertilización asistida o in vitro (5;6).
Considerando estas dificultades se hace necesario comprender cuales son los cambios
que gatillan el cese de la fertilidad, para poder diseñar posibles ayudas farmacológicas, que
permitan tener un mejor desempeño ovárico y hormonal en el periodo de la subfertilidad
femenina. Una de estas estrategias fue la que se quiso investigar en este trabajo, al bloquear la
comunicación del SNS con el ovario, y podemos concluir en base a nuestros resultados, que el
uso de propranolol es de gran ayuda en la recuperación de la función ovárica, pero como único
fármaco no es suficiente considerando los resultados observados de la progesterona plasmática.
Pero es probable que con estudios futuros, se aclaren algunos puntos no resueltos en este trabajo,
lo que nos podría decir si el bloqueo β-adrenérgico, pudiera llegar a ser una buena alternativa
farmacológica de asistencia que genere: un aumento en la ovulación y un retraso en la aparición
de las estructuras quísticas, que en mujeres, al igual que en ratas, aparecen con la edad
68

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