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“Desarrollo y validación intra-laboratorio de una metodología para la detección Salmonella spp. en carne bovina molida.
Desarrollo de estrategias de prevención y control.”
INTRODUCCIÓN
En la PCR de punto final los productos de amplificación son analizados por
electroforesis en geles y visualizados mediante la utilización de colorantes como el
bromuro de etidio. Este proceso se realiza con el producto final de la PCR, que se obtiene
en la fase de plateau de la reacción.
En este punto, es extremadamente dificultoso realizar una adecuada cuantificación
porque la PCR genera la misma cantidad de producto independientemente de la cantidad
inicial de templados presentes. A su vez, la detección por punto final es muy costosa en
tiempo, dado que hay que esperar a que termine la reacción para cargar la muestra en el
gel y realizar la electroforesis.
Existen dos alternativas en cuanto a la química de fluorescencia de la RT-PCR:
1) utilización de moléculas que se unen al ADN de cadena doble como el Sybr Green.
2) utilización de oligonucleótidos fluorogénicos de secuencia específica.
Los colorantes (dyes) de unión al ADN son la base de los métodos inespecíficos de
detección de RT-PCR. La mayoría de las moléculas fluorogénicas utilizadas interactúan
con la hendidura menor de la doble hélice de ADN. Estos colorantes emiten una mínima
fluorescencia cuando se encuentran libres en la solución pero generan una fuerte señal
cuando se unen al ADN de cadena doble y son expuestos a una longitud de onda capaz
de excitarlos. Uno de los colorantes más utilizados en RT-PCR es el Sybr Green.
Los métodos inespecíficos de marcaje fluorescente son relativamente menos costosos, ya
que no requieren del diseño de oligonucleótidos o conjugados químicos y se encuentran
mínimamente afectados por pequeños cambios en la secuencia blanco que pueden
impedir la hibridación del oligo fluorescente. Sin embargo, los dímeros de cebadores
formados y otros productos de amplificación inespecíficos compiten por la unión a los
fluoróforos e interfieren en la interpretación de los resultados. Desafortunadamente, la
formación de dímeros es más frecuente cuando existe un reducido número de copias
Méd. Vet. Virginia Aliverti Página 34