Documento completo - SeDiCI - Universidad Nacional de La Plata

“Desarrollo y validación intra-laboratorio de una metodología para la detección Salmonella spp. en carne bovina molida.
Desarrollo de estrategias de prevención y control.”
INTRODUCCIÓN
que al absorber energía, pasan a un estado excitado, retornando al estado inicial
mediante la liberación de energía en forma de fluorescencia. Los "quenchers" son
moléculas que aceptan la energía emitida durante la des-excitación de un fluoróforo y la
disipan en forma de calor más que en fluorescencia.
Aunque las técnicas de RT-PCR basadas en sondas FRET son mucho más
específicas que los métodos de detección que utilizan Sybr Green, son más costosas y
requieren una mayor validación y optimización.
Los colorantes fluorescentes unidos a las sondas deben poseer ciertas
características para ser de utilidad en la RT-PCR:
Diferentes longitudes de onda de absorción y emisión de fluorescencia.
Fácil y fuerte unión al ADN de la sonda.
Señal detectable a bajas concentraciones.
Producción de una señal fluorescente diferencial cuando la sonda se encuentre
hibridada al producto de amplificación.
Resistencia a elevadas temperaturas.
Falta de inhibición de la actividad de la polimerasa.
Para el diseño de una sonda fluorogénica se deben tener en cuenta algunas
consideraciones generales:
Tamaño entre 15 a 35 nucleótidos.
Contenido en C+G de 40 a 60%.
No deben contener bases repetidas contiguas y en particular G.
No deben hibridar con los cebadores externos.
Poseer un Tm 5ºC mayor que los cebadores para permitir su unión al templado antes
del comienzo de la fase de extensión.
Méd. Vet. Virginia Aliverti Página 36