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“Desarrollo y validación intralaboratorio de una metodología para la detección Salmonella spp. en carne bovina molida.
Desarrollo de estrategias de prevención y control.”
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la amplificación se utilizó el programa Mx3005P Instrument Qualification Test
3, se selecciono PCR Sybr® (con una curva final de disociación). El perfil térmico
consistió en: un ciclo a 95ºC durante 10 min, 40 ciclos de 10 seg de desnaturalización a
95ºC, 30 seg de hibridación-extensión a 56ºC y un ciclo final de extensión de 1 min a
95ºC. Finalmente se realizó una rampa de disociación desde 55ºC a 95ºC, 30 seg. El
tiempo de análisis total fue de 1 h y 36 min (Figura 5).
3.1.7.- Estandarización
La estandarización de la técnica de RT-PCR desarrollada para la detección del gen
invA se realizó in vitro con cultivos puros de Salmonella enterica (Tabla 1) en diferentes
concentraciones. Se determinó el rango de trabajo, el límite de corte y la robustez de la
técnica desarrollada.
a) Rango de trabajo y límite de corte
Se determinó la probabilidad de detección del gen invA al comparar el número de
resultados positivos con la concentración de cada cepa analizada. Para ello, se utilizó el
ADN templado de cada una de las cepas analizadas en un rango de 10 4 a 10 1 UFC/20 l
de mezcla de reacción de PCR. Los ensayos se realizaron por triplicado, por un mismo
operador, en un intervalo de 1 a 2 días.
b) Robustez
Se utilizaron las 12 cepas enumeradas en la Tabla 1, además de los controles
positivo y negativo. Se identificaron aquellas variables que podrían afectar el desempeño
de la técnica, tales como realizar el ensayo en diferentes días y por diferente operador. Se
Méd. Vet. Virginia Aliverti Página 46