Enzimología - Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ 

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS 

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS 

PROGRAMA DE BIOLOGÍA 

MANUAL DE PRÁCTICAS 

ENZIMOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE ENZIMOLOGÍA 

COMPILADORES: 

Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega 

Colaboradores: Dra. Florinda Jimenez Vega 

Revisado por: Academia de Biologia 2011 

Ciudad Juárez, Chihuahua 

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 

2009 

p. 22

M. en C. Emilio Clarke Crespo 

Coordinador de la Academia de Biología 

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias 

Coordinador del Programa de Biología 

Dr. Alejandro Martínez Martínez 

Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas 

M.C. Hugo Staines Orozco 

Director del Instituto de Ciencias Biomédicas 

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

PRACTICA No. 1 

PREPARACION DE SOLUCIONES DE CONCENTRACION 

Objetivo 

DEFINIDA Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS 

(BUFFERS) 

El objetivo general de la siguiente practica es el estudiante aprenda a preparar 

disoluciones en concentraciones definidas en porciento, normalidad, molalidad y 

molaridad. 

Materiales 

NaCl Probeta Papel encerado Matraces volumétricos 

NaOH Pipetas Placa de agitación Vasos de precipitado 

HCL Balanza Barras magnéticas Fosfato de Na 

Procedimiento 

I. Disoluciones de concentración en peso 

A) Preparación de 50 mL de una solución de NaCl al 0.9% (p/v) 

• Pesar NaCl en la balanza 

• Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. 30 mL) 

• Colocar la disolución de NaCl en un matráz volumétrico de 50 mL y aforar 

con agua destilada. 

B) Preparación de 50 mL de una disolución de alcohol etílico al 70% (v/v) 

Manual de Prácticas Pag. 2 de 22 

Laboratorio de Enzimología 

Dra. Florinda Jiménez Vega.

• Con base a la concentración del alcohol etílico comercial determinar el 

volúmen necesario para tener 35 mL de alcohol etílico. 

• Medir el alcohol en una probeta 

• Colocar el alcohol etílico en un matráz volúmetrico de 50 mL y aforar con 

agua destilada. 

II. Disoluciones de Concentración molar 

A) Preparación de 200 mL una disolución de NaOH 1 M 

Nota: Los ácidos y los álcalis son agentes corrosivos. Extreme precauciones 

para su manejo, evite todo el contacto con la piel y ojos. 

• Encontrar el peso molecular de la sustancia. 

• Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar 200 mL de NaOH 

1M. 

• Pese el NaOH requerido y colocaro en un vaso de precipitado de 500 mL 

para su disolución con agua destilada (aprox. 150 mL). 

• Colocar la disolución en un matraz volúmetrico de 200 mL y aforar con agua 

destilada. 

B) Preparación de 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM a partir de la 

disolución de NaOH 1M 

• Aplicar la fórmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M 

necesarios para preparar 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM 

V1= (C2 x V2)/ C1 Donde: C1= Concentración inicial 

V1= Volumen inicial 

C2= Concentración final 

V2= Volumen final 




• Medir el volúmen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos en un 

matráz volúmetrico de 100 mL y aforar con agua destilada. 

A) Preparación de HCL 1N 

III. Disoluciones de Concentración Normal 

• Conocer la concentración del HCL concentrado comercial. 

• Calcular la cantidad de HCL conc. requerido para preparar 50 mL de HCl 1N. 

• Colocar el agua destilada (aprox. 30 mL) en un vaso de precipitado. 

• Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado 

requerido. 

• Nota: Siempre se agrega el ácido al agua nunca el agua al ácido. 

• Agitar en la placa de agitación 

• Colocar la disolución en un matráz volumétrico de 50 mL y aforar con agua 

destilada. 

Disoluciones de concentración en peso 

A1) Preparación de 200 mL de amortiguador de fosfatos 0.2 M (pH 7.0) 

Preparar las soluciones stock de fosfato monosódico y fosfato disódico (0.2 

M): 

• Disolver 27.6 g (0.2 moles) de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 

aforar a un litro con agua destilada (Solución X). 

• Disolver 28.4 g (0.2 moles) de fosfato de sodio dibásico y aforar a un litro de 

con agua destilada (solución Y). 

• Mezclar cantidades necesarias según la tabla para preparar 200 mL de 

amortiguador de fosfatos (0.2 M) pH 7.0 




Cantidades que deben mezclarse de las soluciones “X” y “Y” para obtener el 

pH deseado en el amortiguador de fosfatos. 

pH requerido mL de 

X 

mL de Y 

5.8 92.0 8.0 

6.0 87.7 12.3 

6.2 81.5 19.5 

6.4 73.5 26.5 

6.5 68.5 31.5 

6.6 62.5 37.5 

6.8 51.0 49.0 

7.0 39.0 61.0 

7.2 28.0 72.0 

7.5 18.0 84..0 

ß Checar el pH de la disolución resultante y ajustar si es necesario. 

Resultados 

Desarrollar los cálculos que realizaron para preparar las soluciones. 

Discusión 

Bibliografía 





Objetivo 

CENTRIFUGACIÓN 

Conocer el fundamento de la centrifugación como técnica básica en la 

separación y separar fracciones de extractos biológicos variando la Fuerza de 

Centrifugación (RFC). 

Materiales y Reactivos 

Tubos Eppendorf para microcentrifuga refrigerada de 1.5 mL de capacidad 

Tubos cónicos para centrifuga clínica de 15 mL de capacidad 

Tubos para ultracentrifuga de 10 mL de capacidad 

Pipetas de transferencia desechables 

Material biológico 

Extracto de Higado de pollo 

Procedimiento 

Centrifugación bajo condiciones constantes de muestras de diferente origen. 

1. Descongelar los homogenados obtenidos por diferentes tratamientos 

(mortero, perlas de vidrio, sonicación y homogenizador de tejidos 

“POLYTRON”) de higado de pollo. 

2. Agitar los homogenizados y colocar 1.2 mL de muestra en tubos de 

microcentrifuga de 1.5 mL (preparar un tubo del mismo peso para 

equilibrar los tubos en la centrifuga). 

3. Colocar los tubos de centrifuga (previamente marcados) en el rotor de la 

microcentrifuga refrigerada Eppendorf (cuidando equilibrar todos los tubos 

correctamente). 

4. Colocar la tapa y establecer las condiciones de centrifugación a 10,000 

rpm, durante 5 minutos a 5 ºC. 




5. Iniciar la centrifugación y recuparar el sobrenadante en recipientes limpios 

y desechar el sedimento. 

6. Determinar densidad óptica del sobrenadante a 580 nm. 

Centrifugación bajo diferentes condiciones de un extracto biológico. 

1. Colocar 3 mL de extracto de higado de pollo en tubos cónicos para 

centrifuga de gabinete Beckman refrigerada. Siguiendo las 

recomendaciones anteriores, centrifugar esta muestra a 3500 rpm, 10 min 

y 5ºC. 

2. Colocar 3 mL (1.5 mL por tubo) de de higado de pollo en tubos (2) para 

microcentrifuga (Eppendorf). Siguiendo las recomendaciones anteriores 

centrifugar esta muestra a 15,000 rpm por 10 min a 5ºC. 

3. Colocar 3 mL de extracto de de higado de pollo en tubos para la 

ultracentrifuga Beckman refrigerada. Siguiendo las recomendaciones 

anteriores, centrifugar esta muestra a 30,000 rpm, por 10 min a 5º. 

4. Una vez centrifugados los extractos de de higado bajo las diferentes 

condiciones, recuperar el sobrenadante de la manera anteriormente 

descrita y medir su densidad óptica a 580 nm utilizando agua destilada 

como blanco, para calibrar el espectrofotómetro. 

5. Reportar los resultados en un cuadro comparativo entre el método de 

centrifugación y la densidad óptica a 580 nm. 

6. Calcular las unidades de RFC gravitacionales alcanzadas para cada caso, 

Resultados 

de acuerdo al nomograma que se anexa. 

Conclusiones 

Bibliografía 





DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE 

LA TECNICA DE BRADFORD 

Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de elaborar una curva 

de calibración para cuantificar la concentración de una proteína. 

Materiales 

Reactivo de Bradford 

Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol por agitación 

con un magneto, cuando este perfectamente disuelto adicionar 100 mL de 

ac.fosfórico 85% y aforar a un 1Lt CUIDADO!!! (ácido + agua) 

Filtrar con papel (Listo para ser empleado). 

Almacenar a temperatura ambiente. 

Agua 

Albúmina 

Celdas para luz visible 

Procedimiento 

Elaboración de curva patrón 

1. A partir de una alícuota de proteína de aproximadamente 4 mg/mL (C1), 

realizar las diluciones necesarias para tener alícuotas de 500 uL con las 

siguientes concentraciones (0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0, 1.2, 1.4 mg/mL) 

Conc 

(mg/mL) 

C2 

0.2 

0.4 

0.6 

0.8 

1.0 

1.2 

1.4 

Microlitros 

alícuota 4 

mg/ml V1 

Microlitros 

agua 

Volumen 

final 500 

µL V2 

2. Para la cuantificación, se realizara, cada determinación por duplicado. 

3. Marcar para cada concentración 2 tubos 




4. Adicionar 100 µL de la proteína de cada una de las concentraciones 

conocidas 

5. Incluir un par de tubos sin muestra, intercambiar por agua (será el control) 

6. Adicionar 1 mL de reactivo 

7. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente 

8. Determinar absorbancia a 595 nm 

9. Graficar la concentración de proteína (mg/mL) en el eje X y lectura de 

absorbancia (595nm) eje Y. 

10. Utilizando el programa Excel, realizar una regresión lineal de los datos y 

determinar la curva estándar para cuantificar. 

Información Adicional 

Verificar que el material empleado se encuentre perfectamente limpio ya que 

concentraciones muy bajas de detergentes pueden interferir en la reacción. 

Sustancias compatibles con Bradford NaCl, MgCl, KCl, (NH4)2SO4, Etanol 

Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M, Ac. Acético, 2- 

Mercaptoetanol 1 M, Sacarosa 1 M, Glicerol 99 %, EDTA 0.1 M, Triton X-100 ≧ 

0.1 %, SDS 1 %, Hemosol ≧ 0.1 % 

Resultados y Discusión 

Bibliografía 





ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA 

EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES SDS-PAGE 

Objetivo 

Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis. 

Materiales 

Soluciones proteícas 

Marcadores de peso molecular 

Fuente de poder 

Cámara de electroforesis 

Puntas de micropipeta 

Papel absorbente 

Soluc. Azul de Coomasie (tinción) (tabla anexa) 

Soluc. PAGE-SDS (Tabla anexa) 

Procedimiento 

Preparación del gel de corrimiento (10%) 

1. La preparación del gel de separación se efectúa de acuerdo a la tabla 

anexa 

2. Una vez polimerizado en el portagel, lavarlo y eliminar el exceso de agua 

usando tiras de papel Whatman. 

3. Preparar el gel de concentración (stacking gel) de acuerdo a la tabla 

anexa. 

4. Una vez llena la cámara, colocar el peine evitando la formación de 

burbujas. 




5. Una vez polimerizado el gel, lavarlo con agua destilada y llenarlo con 

buffer de corrimiento (running buffer). 

6. Resuspender la buffer muestra en proporción 1:4 (si es necesario agregar 

más azul de bromofenol y glicerol). 

7. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los carriles 

correspondientes. 

8. Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la muestra al 

gel de separación, una vez dentro, cambiar a 100-120 V (2 h) y vigilar que 

las muestras no salgan del gel. 

9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel. 

10. Teñir el gel utilizando Coomassie Blue, de acuerdo al protocolo anexo. 

11. Calcular el peso molecular de las proteínas problema. 

Determinación de la aparente masa molecular de las proteínas 

1. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido 

2. Mida la distancia del origen a cada uno de los estándares de peso 

molecular 

3. Mida la distancia de la proteína desconocida (X) 

4. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total, b / total 

Ejemplo a = 0.5cm, total = 4.9cm. 0.5/4.9 = 0.1 

5. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estándar 

6. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de los 

estándares 

7. Localizar la movilidad relativa de la proteína de la proteína desconocida, 

extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antiligaritmo. 





Bibliografía 

Log MW 

Movilidad 




ANEXO 

Preparación del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida 

(SDS-PAGE) (Laemmli) 

A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C) 

Acrilamida 146.0 g 

N’N 

4.0 g 

Bismetilenacrilamida 

500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4°C en la obscuridad. Vida 

media 30 días. 

B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 

Tris base 54.45 g 

Agua destilada 150 mL 

Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua destilada. 

Almacenar a 4 °C 

C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 


Agua destilada 60 mL 

Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua destilada y 

almacenar a 4°C. 

D) 10% (w/v) SDS 

Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y aforar a 100 

mL 

E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio 

100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en 

el momento. 

F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de SDS, pH 

8.3 


Glicina 216 .0 g 

SDS 15.0 g 

No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones 

nativas (PAGE). 




Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con acido o base. 

Almacenar a 4°C. Calentar a 37°C antes de usar en caso de precipitación. 

G) Sample Buffer 

Agua destilada 4.4 mL 

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 mL 

Glicerol 0.8 mL 

10 % SDS 1.6 mL 

0.5 (w/v) azul de 

bromofenol en agua 

0.2 mL 

8.0 mL 

Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer. 

*Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantesy reductoras, se debera 

adicionar 0.4 mL al sample buffer de beta-mercaptoetanol y posteriormente 

de diluir 1:4 habra que calentar las muestras a 95 °C por 4 min. 

*Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS, 

H) Preparación de PAGE-SDS 10% 

Volúmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR 

Gel Separador (Separating) (10 mL) 

Agua destilada 

4.0 mL 


Acrilamida 3.3 mL 

10 % SDS 0.1 mL 

Persulfato de amonio 10% 0.1 mL 

Temed 0.004 mL 

Gel Concentrador (Stacking) (4mL) 

Agua destilada 

2.7 mL 


Acrilamida 0.67 mL 

10 % SDS 0.04 mL 

Persulfato de amonio 0.10 mL 

Temed 0.004 mL 




Tinción de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue 

Soluciones Coomassie 

Coomassie Blue-R250 al 0.1% 

Disolver 0.1 g en solución de desteñido, dejar a temperatura ambiente hasta 

el siguiente día, agregar el agua. Filtrar siempre antes de su uso. 

Solución A Solución de fijado / desteñido (Metanol 50%, Ac. Acético 10%) 

Procedimiento 

1. Sumergir el gel por 10 minutos en solución A. 

2. Teñir con la solución de Coomassie. 

3. Desteñir con la solución A hasta que se observen las bandas. 

4. Enjuagar con agua destilada. 





COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LA CATALASA 

Objetivo 

Conocer los principios sobre el funcionamiento de una enzima y su actividad 

catalítica 

Materiales 

Mortero 

Hoja vegetal 

Fosfato de potasio 

Peroxido de Hidrógeno 

Celdas de cuarzo 

Espectrofotómetro 

Procedimiento 

1. Coloque una hoja en el mortero adicionando 2 mL de la solución de 

fosfato de potasio 0.1 M pH 7.4 (frio). 

2. Homogenizar 

3. Centrifuge a 10 000 x rpm durante 5 minutos 

4. Recupere la fracción sobrenadante 

5. Inicie sus mediciones 

6. Calibrar con un blanco de Fosfato de potasio 

7. Establecer la cinética, bajo las siguientes condiciones: 

8. Concentración de sustrato variable y enzima constante 

a. Concentración de enzima variable y sustrato constante 




a) b) 

Sustrato Enzima Sustrato Enzima 

18.75 µL 10 µL 75 µL 5 µL 

37.5 µL 10 µL 75 µL 10 µL 

75 µL 10 µL 75 µL 20 µL 

100 µL 10 µL 75 µL 40 µL 

150 µL 10 µL 75 µL 80 µL 

300 µL 10 µL 75 µL 160 µL 

9. Para cada uno de los casos, se adicionará un volumen de amortiguador 

de fosfato de potasio constante de 875 µL 

10. Posteriormente se adicionará el sustrato y enzima mezclando 

rápidamente con ayuda de un parafilm 

11. Determinar su cinética a 240 nm, 


Bibliografía 





CRISTALIZACIÓN DE LISOZIMA 

Objetivo 

Conocer los principios para la cristalización de proteínas puras 

Materiales 

Placas de 24 pozos 

Plastilina 

Cubreobjetos siliconizados 

Aire comprimido 

Vaselina o silicón en grasa 

Soluciones 

Lizosima 20mM en Acetato de sodio pH 4.6 

NaCl 12% en acetato de sodio 20 mM 

Acetato de sodio 20 mM pH 4.0, 4.6 y 5.0 

Procedimiento 

1. Con ayuda de una jeringa colocar silicon en el borde de la placa, evitando 

derramar material dentro del vaso precipitante. 

2. Realizar un screening con variaciones de la solución precipitante 

conteniendo una concentración de sales de 2, 4, 6, 8 y 10%. 

Acetato de Sodio 

20mM pH 4.0 + 

NaCl 2 % 


20mM pH 4.6 + 


20mM pH 4.0 + 

NaCl 4 % 


20mM pH 4.6 + 


20mM pH 4.0 + 

NaCl 6 % 


20mM pH 4.6 + 


20mM pH 4.0 + 

NaCl 8 % 


20mM pH 4.6 + 


20mM pH 4.0 + 

NaCl 10 % 


20mM pH 4.6 + 




NaCl 2 % NaCl 4 % NaCl 6 % NaCl 8 % NaCl 10 % 

Acetato de Sodio Acetato de Sodio Acetato de Sodio Acetato de Sodio Acetato de Sodio 

20mM pH 5.0 + 20mM pH 5.0 + 20mM pH 5.0 + 20mM pH 5.0 + 20mM pH 5.0 + 

NaCl 2 % NaCl 4 % NaCl 6 % NaCl 8 % NaCl 10 % 

3. Aplicar 1 mL de solución precipitante conteniendo las concentraciones 

preestablecidas en cada pozo. 

4. Colocar el el cubreobjetos limpio 3 gotas conteniendo 2µL, 2µL y 1µL de 

la proteína y adicionar 1µL, 1µL y 2 µL de la solución precipitante. 

5. Invertir el cubreobjeto conteniendo 3 gotas de 3µL cada una sobre el pozo 

de la placa previamente engrasado procurando que selle perfectamente. 

6. Repetir todas las condiciones planeadas en el esquema. 

7. Incubar a temperatura ambiente y vigilar el crecimiento de los cristales por 

microscopia. 

8. Reportar sus observaciones 

9. Describa en que consiste el método de difracción de un cristal por rayos 

X, en el cual usted me describa el seguimiento que debería de realizar a 

su muestra una vez obtenido el cristal. 


Bibliografía 





PURIFICACIÓN DE LISOZIMA DE HUEVO BASADA EN 

EL CAMBIO DE FUERZA IÓNICA EN LOS 

AMORTIGUADORES 

Objetivo 

El alumno será capaz de aplicar los conocimientos básicos para la purificación 

de enzimas con actividad biológica. 

Materiales 

Bradford 

Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 

Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 + NaCl 0.5M 

Matriz de intercambio catiónico 

Procedimiento 

1. Separar la clara del huevo 

2. Filtrarla a través de tela para fibra cruda o gasa de poro fino (*) 

3. La clara diluirla con 200mL de amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 

4. Homogeneizar bien y filtrar nuevamente para eliminar partículas sólidas (*) 

5. Pasar esta solución a flujo lento a través de una columna de intercambio 

catiónico (10 a 20 mL matriz) previamente equilibrada con amortiguador 

Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 (*) 

6. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0. hasta que ya 

no se detecte concentración de proteína (*) 

7. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 con NaCl 

0.5M. hasta que ya no se detecte concentración de proteína (*) 

8. Determine actividad contra lisozima y concentración de proteína en todas 

las fracciones colectadas. 


Bibliografía 





Objetivo 

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LISOZIMA 

Evaluar la actividad enzimática de la lizosima purificada en el laboratorio 

Materiales 

Micrococcus luteus 

Amortiguador de fosfatos 50mM pH 6.5 

Espectofotómetro 

Procedimiento 

1. En un tubo de ensaye, adicionar 100uL de proteína purificada 

2. Adicionar 1mL de solución de M. Luteus (0.25 mg/mL) preparada en 

amortiguador de fosfatos 

3. Incubar a 37°C por 1hora 

4. Medir absorbancia a 540 nm 


Bibliografía 





USO DE LA BIOINFORMÁTICA PARA EL ANÁLISIS DE 

SECUENCIAS 

Objetivo 

Aplicación del uso de las herramientas bioinformáticas accesibles en el Internet 

para el estudio de proteínas y los genes que las codifican. 

Materiales 

Secuencias: AAS65790, NP_003113, Q39837, BAA99079, NP_035564 

Procedimiento 

1. Elija 3 secuencias de las proporcionadas 

2. Busque la secuencia que le fue asignada a través de su número de 

acceso del banco de datos NCBI. 

3. Asigne identidad a la secuencia. 

4. Determine 

i. Peso molecular 

ii. Punto isoeléctrico 

iii. Contenido de aminoácidos 

iv. Mencione en que ORF se localiza 

v. Describa que tipo de estructura secundaria presenta 

5. Determine el sitio de corte del péptido señal (si es que se presenta). 

6. Seleccione 3 secuencias similares a nivel de proteína y alinee por Clustal. 

i. Calcule el porciento de similitud entre ellas. 

ii. Muestre su árbol filogenético. 


Bibliografía

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