Manual de Biotecnologia - Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS
BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA
COMPILADORES:
Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez
Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez
Revisado por: Academia de Biologia 2011
Ciudad Juárez, Chihuahua
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
2009
p. 81

M. en C. Emilio Clarke Crespo
Coordinador de la Academia de Biología
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias
Coordinador del Programa de Biología
Dr. Alejandro Martínez Martínez
Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas
M.C. Hugo Staines Orozco
Director del Instituto de Ciencias Biomédicas
Aprobados por la Academia de Biología, 2011

Laboratorio de Biotecnología
CONTENIDO
Practica 1. Preparacion de las soluciones madre para Medios de Cultivos para
plantas………………………………………………………………………………………....…3
Practica 2. Preparacion de los Agares para cultivo de plantas in vitro....……………….10
Practica 3. Cutivo in vitro de plantas (semilla)………………………………...…..……….15
Practica 4: Cultivo in vitr de plantas (organos vegetales)……………………...………….19
Practica 5: Fermentaciones…………………………………………………………………..23
Practica 6: Glicolisis anaerobica y fermentación ……..……………………………………26
Practica 7: Fermentacion alcoholica……………………………….………………………..29
Practica 8. Fermentacion lactica……………………………………………………………..34
Practica 9: Analisis de tecinicas para deteccion de alimentos OGM
(documental)………………………..………………………………………………………….37
Practica 10: Extraccion de ADN eucariotico……………….……………………………….39
Practica 11: Extraccion de ADN procariotico……………………………………………….43
Practica 12: Electroforesis con geles de Agarosa………..………………………………..46
Practica 13: Reaccion en Cadena de la Polimerasa y sus variantes (PCR)
(Demostrativa y Documental)…………………………………………………………….….50
Practica 14. Secuenciacion de ADN (demostrativa, Documental)……………………….53
Practica 15. Prueba diagnosticos (ELISA)…………………………….……………………55
Practica 16: Bioinformatica y Biotecnologia………………………………………………...58
Practica 17. Biorremediacion (documental)……………………...…………………………60
Practica 18. Fitorremediacion……………..……………………………..…………………..62
Practica 19. Biocombustibles………………………………………………………………...64
Practica 20. Analisis de contaminacion del agua………………………….……………….67
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 1: Preparación de soluciones madre para los medios de cultivo
Que el alumno obtenga un conocimiento práctico sobre los diversos métodos de
preparación de medios de cultivo para propagar in vitro.
Introducción:
Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro":
por ejemplo, se encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementos
esenciales tanto micro como macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina,
tiamina, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico, biotina, y ácido fólico.
Aminoácidos tales como L-glutamina, asparragina y cisteína, los hexitoles como mioinositol,
hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un agente
gelificante.
Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se
conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones
tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la
concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que
pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la
pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la
pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las
balanzas de precisión.
Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color ámbar durante algunos
meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos,
hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente
gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se
conservan bien en solución.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de
ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos.
Materiales:
Botes de cristal o de plástico (preferiblemente de los primeros por su
transparencia), que en algunos casos habrán de ser de color ámbar para proteger de la
luz determinados compuestos que son fotosensibles.
Balanza granataria
Balanza analítica
Espátulas de distinto tamaño para pesar
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Embudos de pesar
Agitador magnético
Imanes
Vasos de precipitados
Probetas
Matraces aforados
Eppendorf
Compuestos químicos
Agua destilada
Autoclave
Termoplato
Algodón
Gasas
Tape
Cajas petri estériles
Tubos de ensaye esmerilados con tapa
Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
Se establecerán 8 equipos de trabajo por cada grupo de prácticas (2 en cada lateral de
una mesa).
Normas generales a la hora de pesar
- Se debe comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las
soluciones madre están expresados para un litro
- Debe leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son
tóxicos por inhalación o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas
precauciones.
- Para medidas desde 0.01 g se utilizará la balanza granataria. Para valores
inferiores la balanza analítica.
- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada.
Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de
colocar pesa sustancias.
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Laboratorio de Biotecnología
- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que
asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la
contaminación de los reactivos.
- Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca
cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco
parte de lo que se tomó.
Normas generales a la hora de preparar las disoluciones
- Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente
es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un
erlenmeyer.
- Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen
total de agua
- Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a
uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté
totalmente disuelto.
- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta,
nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.
- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en
el que figuren los siguientes datos:
- Tipo de solución. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc
- Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la
solución final)
- Componentes con fórmula y peso en g/l
- Fecha de preparación
- Nombre de los integrantes del equipo
Equipo 1 Preparará 250 ml de la solución de macronutrientes del medio MS.
Equipo 2 Preparará 250 ml de la solución de Calcio MS y 250 ml de la solución de
Hierro y EDTA MS. En este segundo caso, se deberá poner en el recipiente
donde se prepara la disolución un volumen de agua de aproximadamente un
80% del final y adicionar la solución de hierro. Cuando se haya disuelto,
adicionar poco a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total disolución.
Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco
ámbar y colocar en refrigeración.
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Laboratorio de Biotecnología
Equipo 3 Preparará 250 ml de la solución de micronutrientes del medio MS.
Equipo 4 Preparará 250 ml de la solución de vitaminas del medio MS.
Equipo 5 Preparará 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A, B, C y D
del medio DKW.
Equipo 6 Preparará 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las
hormonas del medio DKW.
- La solución H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde
se prepara la disolución un volumen de agua de aproximadamente un 80% del
final y se adiciona la sal de hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco
a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total disolución. Si es
necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco ámbar
en refrigeración.
- Hormonas. Se prepararán 10 ml de cada una de las disoluciones.
Para cada una de ellas se procederá del siguiente modo: Se pesará la
hormona en el un tubo aforado. Se le añaden unas gotas de NaOH 1N y se
disuelve. A continuación se va añadiendo poco a poco y agitando, agua
destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf.
Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparará 250 ml de la solución E
Equipo 8 Preparará 250 ml de la solución F2. Primero se preparan 500 ml de la
solución de biotina. De estos 500 ml, se toman 250ml y se les añade la cantidad
correspondiente a 250 ml del resto de las vitaminas.
Después de la explicación anterior, se prepararan las soluciones madre de las sales,
vitaminas, aminoácidos y hormonas necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la
composición de cada uno de ellos:
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Sales mineralesMS (Murashige and Skoog,
1962)
(g/l)
(NH4 )NO3 1.650
KNO3 1.900
CaCl2.2H2O 0.440
MgSO4.7H2O 0.370
KH2PO4 0.170
FeSO4.7H2O 0.0278
Na2EDTA. 2H2O 0.0372
MnSO4.H2O 0.0169
ZnSO4.7H2O 0.0086
H3BO3 0.0062
KI 0.00083
Na2MoO4.2H2O 0.00025
CuSO4.5H2O 0.000025
CoCl2.6H2O 0.000025
Mioinositol 0.100
Tiamina HCl 0.0001
Acido nicotínico 0.0005
Piridoxina HCl 0.0005
Glicina 0.002
Laboratorio de Biotecnología
Sales minerales DKW modificado
(g/l)
(NH4)NO3 1.416
Ca (NO3)2 3H2O 1.811
CaCl2 2H2O 0.147
MgSO4 7H2O 0.74
KH2PO4 0.258
FeSO4 7H2O 0.00676
Na2 EDTA 2H2O 0.0908
K2SO4 1.56
Mn SO4 H2O 0.0338
Zn SO4 7H2O 0.0212
BO3H3 0.0124
KI 0.00166
Na2MoO4 2H2O 0.0005
Cu SO4 5H2O 0.00005
Co Cl2 6H2O 0.00005
Mioinositol 0.1
Tiamina H Cl 0.001
Ác. nicotínico 0.001
Piridoxina. HCl 0.001
Biotina D(+) 0.00001
Glutamina (base libre ) 0.001
L-Cysteína H Cl 0.001
Pantotenato de Ca 0.1
(1.960 si es 4 H2O)
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Laboratorio de Biotecnología
Lo más normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de
modo que la preparación de la solución final sea más rápida y tenga menos margen de
error.
Veamos la composición de cada una de las soluciones madre de ambos medios:
Soluciones madre del medio MS (g/l)
MACRONUTRIENTES (10 X)
NH4NO3 16.5
KNO3 19
MgSO4.7H2O 3.7
KH2PO4 1.7
CALCIO, (10 X)
CaCl2.2H2O 4.4
MICRONUTRIENTES (100 X)
MnSO4.H2O 1.69
ZnSO4.7H2O 0.86
H3BO3 0.62
KI 0.083
Na2MoO4.2H2O 0.025
CuSO4.5H2O 0.0025
CoCl2.6H2O 0.0025
HIERRO Y EDTA (10 X)
FeSO4.7H2O 0.278
Na2EDTA.2H2O 0.372
VITAMINAS (20 X)
Mioinositol 2
Tiamina HCl 0.002
Acido nicotínico 0.01
Piridoxina HCl 0.01
Glicina 0.04
Soluciones madre del medio DKW modificado (g/l)
A (10 X)
NH4NO3 14.16
CaCl2 2 H2O 1.47
Ca (NO3)2 3 H2O 18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )
B (10 X)
C(10 X)
D (10 X)
E (50 X)
F1 (100 X)
F2 (100 X)
KH2PO4 2.58
K2SO4 15.6
Mg SO4 7 H2O 7.4
Mn SO4 7H2O 1.69
Zn SO4 7H2O 1.06
BO3H3 0.6.2
KI 0.083
Na2MoO4 2H2O 0.025
Cu SO4 5 H2O 0.0025
Co Cl2 6H2O 0.0025
Glutamina (base libre ) 0.1
L-Cisteína HCl 0.1
Biotina D(+) 0.001
Tiamina H Cl 0.1
Ác. Nicotínico 0.1
Piridoxina 0.1
Pantotenato de Ca 0.1
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Referencias:
Laboratorio de Biotecnología
Álvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prácticas
de Biotecnología Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)
Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut
rootstock. Hort. Science, 19(4).
Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiología Plantarum, 15, 473-497.
Revilla Bahillo, Ángeles y Ordás, Ricardo. Guiones de prácticas de Biotecnología
Vegetal. Universidad de Oviedo
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Conclusiones:
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 2: Preparación de los Agares para cultivar in vitro.
El estudiante tendrá conocimiento de la preparación de los agares para cultivar plantas
in vitro a partir de las soluciones madre (practica 1), para con ello tenga mas claro el
concepto de micro propagación de plantas para mejora biotecnológica.
Introducción:
El término “cultivo de tejido vegetal” implica una amplia gama de técnicas de cultivo
tanto de órganos, como de tejidos y células e incluso plantas completas, entre las que
se encuentra la micro propagación; la recuperación de embriones; la regeneración de
plantas a partir del callo y la suspensión de células, así como el cultivo de protoplasma,
anteras y microsporas, que se utilizan sobre todo para la multiplicación de plantas en
gran escala (Segretin, 2006).
Materiales:
Autoclave Sacarosa
Algodón Agar-Agar
Frascos gerber
Tubos de cultivo
Ligas
Papel aluminio
Matraz de 1000ml
Moscas magneticas
Termoplato
Campana de flujo laminar
Agua destilada
Etanol
Soluciones madre del MS
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Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
Para la preparación de los Agares para medio de cultivo para plantas:
El medio de cultivo es el Murashige & Skoogque que consta de una amplia cantidad de
nutrientes los cuales se muestra en la siguiente figura:
Para su preparación en 1000 mL se pesan las cantidades de cada uno de los
compuestos o en su defecto si estos ya se tienen pre-pesados y en un frasco limpio por
separado solo se agrega la cantidad adecuada según el volumen a preparar.
Agrega el agua destilada al matraz en que se preparara, disolver el medio ya pesado,
agitar muy bien hasta observar cierto grado de solubilización. Agregar la sacarosa
Ajustar el pH a 5.8 y agregar el agar-agar.
11

Laboratorio de Biotecnología
Someter a calentamiento con agitación sin que llegue a la ebullición. Proceda a vaciar
el medio en frascos limpios y asegúrese de llenarlos con aproximadamente 50 mL, 2/4
del recipiente o según vea necesario. Meter a la autoclave para su esterilización
(250°F, 15 lb, 15 min). Pasado este periodo de esterilización, se sacan de la autoclave
y se dejan enfriar y se meten a refrigeración o bien a una alacena limpia.
Resultados:
Pesado y calentado
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Esterilizado
Laboratorio de Biotecnología
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Vaciado
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Conclusiones:
Laboratorio de Biotecnología
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Referencias:
Krikoria, A. (1990). Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación.
Universidad de Nueva York. New York, E.U. 1-19
Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de
investigación de Biotecnología. Cali, Colombia. 1-22
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 3: Cultivo in vitro de plantas (semillas)
Que el estudiante se familiarice con la siembra de semillas in vitro, que aprenda las
técnicas para cultivos de tejidos, órganos vegetales y la obtención de callos a partir de
secciones de zanahoria.
Introducción:
La biotecnología vegetal es “el cultivo in vitro de las plantas, en recipientes de vidrio”, y
supone mantener las plantas en laboratorio, fuera de su entorno natural, teniendo como
sustrato un medio de cultivo. En la composición del dicho medio se encuentran
elementos minerales, agua, hormonas, sustancias orgánicas y vitaminas, siendo su
porcentaje muy variable según las especies vegetales y pudiendo faltar alguno de estos
componentes. La biotecnología actual se centra en la obtención de fármaco y vacunas
y sobre todo en la obtención de nuevas especies y variedades con capacidad para
soportar ataque de microorganismos o situaciones de estrés (salino, hídrico, etc.). Es
de destacar la obtención de nuevos híbridos vegetales, por adición de ADN foráneo,
obteniéndose los conocidos “organismos transgénicos”.
Materiales:
Campana de flujo laminar
Estuche de disección; bisturí, pinzas grandes, pinzas pequeñas y tijeras.
Frascos gerber con agar para plantas
Tubos con agar para plantas
Vasos de precipitados (7)
Mecheros
Alcohol
Agua estéril
Cloro
Probetas
Cajas petri
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Laboratorio de Biotecnología
Procedimiento 1: desinfección de semillas
Para nuestra practica con semillas, se dispondrán de diversos tipos de semillas de
cereales y frutos cítricos completos. Las semillas que se extraigan de los frutos ya
están estériles (luego no hay que desinfectarlas), pero las semillas aisladas si que hay
que esterilizarlas (con dos agentes: cloro y alcohol).
Los pasos a seguir para la desinfección son:
1. se deben envolver las semillas en paquetes para poder manipular con las pinzas
y una vez hechos se procede a esterilizarlas.
2. Se sumergen en etanol durante 1 min
3. Se sumergen en solución de hipoclorito de sodio o cloro al 20% por 15 min.
4. Se enjuagan en tres vasos de precipitados con agua estéril, destilada,
desionizada durante un par de minutos por cada vaso (7).
Procedimiento 2: Siembra de semillas (área estéril)
Una vez que se tienen en el 7mo vaso de precipitado de agua estéril, las semillas ya
están listas para su siembra en tubos de ensayo o en frascos gerber, que tiene medio
de cultivo para plantas adecuado. Para sembrar las semillas en los medios de cultivo
se enciende el mechero, se lavan las manos hasta el medio brazo y después se
remojan en etanol al 10% hasta que se seque inician la manipulación o bien utilizar
guantes estériles. Después de eso toman el paquete de material estéril y las cajas de
petri de vidrio, que nos servirá como mesa de trabajo. Con la ayuda de unas pinzas, se
pone el paquete de semillas sobre una caja de precipitados y se abre, con las pinzas se
toman las semillas para depositarlas en el medio de cultivo.
En el caso de los frutos de cítricos completos se procede a esterilizar el fruto entero
pulverizando con alcohol y luego la flamea. En la campana de flujo laminar se abren los
frutos (limón, naranja o mandarina) y se extraen las semillas con unas pinzas. Tras
hacer una pequeña incisión en la cubierta se siembran en tubos o frascos gerber con el
medio de cultivo adecuado.
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Resultados:
Laboratorio de Biotecnología
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Conclusiones:
Laboratorio de Biotecnología
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Referencias:
Serrano G.M, Biotecnología vegetal, Madrid D.L
Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 4: Cultivo in vitro de plantas (órganos vegetales)
El alumno aprenderá a realizar el montaje de un cultivo de tejidos vegetales a partir de
explantes nodales.
Introducción:
El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de
cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas
de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y
otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio
nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo
conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy
también de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de
tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer
experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la
germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en
condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos
(hongos, virus y bacterias).
Materiales:
Microscopio de disección
Microscopio compuesto
Muestra de hongo desarrollado en la caja petri
Asa de platino Formol
Porta y cubre objetos Cutex
Azul o rojo colorantes
Fibra de vidrio
Etiquetas adheribles
Procedimiento:
Para la obtención de explantos nodales, se deben de lavar los tallos seleccionados con
abundante agua. Secar cuidadosamente con papel filtro. A continuación se pasa a
eliminar las hojas de los tallos, cuidado dejar 2 cm del peciolo unido al tallo. Igualmente
deben eliminarse las espinas (si las hubiera). Acto seguido se separa los entrenudos
(que deben contener al menos una yema axilar) con ayuda de unas tijeras. Debemos
conseguir porciones de tallo de unos 4-5 cm aproximadamente.
19

Laboratorio de Biotecnología
Para la estilización de los explantos nodales, se envuelven en una gasa y se introduce
en un bote que contenga 100 ml de la disolución desinfectante (hipoclorito de sodio o
cloro al 20%) durante 10 min (agitar esporádicamente). Después se lava 3 veces en
vasos de precipitado con agua estéril, ayudándose de unas pinzas largas. Una vez
desinfectado el material vegetal se procede a la siembra en los frascos gerber o en
tubos de ensaye con medio de cultivo.
Para la siembra de los explantos nodales se enciende el mechero (todo en esterilidad)
y se abre el paquete del material estéril y las cajas petri que nos servirá como mesa de
trabajo. Con ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de explantos nodales sobre la
caja petri, se abre y se toman con las pinzas, para depositarlas en el medio de cultivo.
La introducción del material vegetal en los frasco gerber debe ser muy cerca de la
llama y usando pinzas estériles.
Resultados:
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Conclusiones:
Laboratorio de Biotecnología
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Referencias:
Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P
Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de
investigación de Biotecnología. Cali, Colombia. 1-22
Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp.
22

Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 5: Fermentaciones.
El alumno entienda el concepto de fermentaciones, demostrar la formación del acido
piruvico durante la fermentación de la glucosa por levadura e identificarlo. .
Introducción:
La fermentación es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un
proceso de oxidación incompleta, típico de los organismos anaeróbicos. Se realiza,
pues, sin la intervención del oxígeno. Durante la fermentación, la energía obtenida
procede, igual que en la respiración aerobia, de las reacciones de oxido-reducción
habidas durante el catabolismo de la glucosa (glucólisis), pero en la fermentación las
coenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es el
oxígeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgánico que se reduce y es
el producto característico de cada fermentación (láctica, alcohólica...).
Materiales:
Tubos de ensaye de 13 x 100
Tubos de centrifuga
Tripie, rejilla, anillo, mechero.
Baño maría.
Pipetas de 5 ml. graduadas.
Centrifuga.
Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.
Pinzas para tubos de ensaye.
Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0, 2.0%
Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación antes
de su utilización).
Ácido tricloroacético al 10%
Nitroprusiato de sodio.
23

2,4 dinitrofenil-hidracina.
Hidróxido de amonio concentrado.
Hidróxido de sodio 0.1N
Sulfato de amonio sólido.
Laboratorio de Biotecnología
Nota: un día antes de la práctica llevar su levadura para fermentarla
Procedimiento:
Formación de Piruvato:
Se deben marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml. de las soluciones
de glucosa a las diferentes concentraciones 0.5, 1.0, 2.0% a ambas series. A una de
las series de tubos adicionarles 3 ml. de suspensión de levadura con fosfatos de
sodio(0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml. de la
suspensión de levadura con fosfatos de potasio(0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.
Posteriormente se colocar todos los tubos en baño maría a 37º.C por 30 minutos y
añadir posteriormente a cada tubo 1 ml. de TCA al 10% mezclado vigorosamente y
centrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Separar el sobrenadante y desechar el
precipitado.
Identificación de Piruvato:
Reacción con nitroprusiato de sodio
En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y hervirlo. Se le
adicionan 0.5 gr. de sulfato de amonio sólido y agitar. Posteriormente agregar dos
gotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo
unas gotas de hidróxido de amonio concentrado, hasta la formación de dos capas. La
formación de un anillo verde o azul en la interfase indica afirmativo para la prueba.
Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.
Reacción con 2,4 dinitrofenil-hidracina.-
En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml. del
reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla formada, y
adicionar 1 ml. de NaOH 0.1N. La aparición de un color rojo indica prueba afirmativa.
Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloración
e intensidad de la misma en cada caso.
24

Referencias:
Laboratorio de Biotecnología
Bamforth W. Charles. 2007. Alimentos, fermentación y microorganismos. Editorial
Acribia S.A.
Owen P. 1991. Biotecnologia de la fermentación Principios, procesos y productos.
Editorial Acribia.
Resultados:
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Conclusiones:
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 6: Glicolisis anaerobica y Fermentacion
Observar los efectos en una situacion simulada de la fermentacion anerobia que en la
realidad se efectua en los seres vivos y verificar la inhibicion ocasionada en la ruta
metabolica de la glicolisis por el NaF.
Introducción:
De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamente
anaerobicas, esto es, que solamente pueden vivir en ausencia de oxigeno. La mayoria
son microorganismos, en particular aquellas especies propias del amibiente que tiene
poco oxigeno o que carece de el, es decir, en los intesitnos de los animales, en el suelo
profundo, en sedimientos que se encuentran bajo los lagos y oceanos o en pantano
donde el oxigeno esta casi totalmente ausente. Un ejemplo de estas bacterias del suelo
Clostridium perfringens, que causa la gangrena gaseosa en infecciones de heridas.
El producto de la fermentacoin varia de un tipo de celula o microorganismo a otro.
Cuando se requiere concentracion repetida de celulas musculares, el suministro de
oxigeno no tiene capacidad para mantener el paso de las demandas metabolicas de la
celula. En estas condiciones ciertos tipos celulas musculares esqueleticas regeneran
NAD convirtiendo piruvato a lactato (fermentacion del acido lacatico). Las celulas de
levaduras han enfrentado el desafio de la vida anaerobia con una solucion metabolica
diferente, convierten el piruvato a etanol (fermentacion alcoholica).
Materiales:
Tubos de ensayo
Beakers de 300 ml
Baño maria
1 hoja de papel milimetrico
Levadura (fresca 5 a 10%)
Glucosa (5 a 10%)
Fluoruro de sodio (5 a 10%)
Agua destilada
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Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
Marcar tres tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera:
Tubo A:
Llene una tercera parte del tubo con suspesión de levadura y luego agregue agua
destilada hasta llenarlo totalmente.
Tubo B:
Llene una tercera parte del tubo con suspensión de levadura y agrege solucion de
glucosa hasta llenarlo totalmente.
Tubo C:
Llene una tercera parte del tubo con suspensión de levadura, agregue otra tercera
parte con solucion de glucosa y termine de llenarlo con solucion de fluoruro de sodio
(NaF).
Tomar cada tubo y taparlo con un tapon de caucho (tenga cuidado que no quede muy
apretado), invertir suavemente para mezclar. No debe quedar aire en la parte superior
del tubo.
Conectar por medio de la manguera del tapon al tuvo en U que contiene la columna del
liquido a desplazar.
Colocar en baño maria a 37C. Si el procediemitno estubo bien hecho, solo quedara una
columna de aire en la parte superior de la manguera.
Medir la altura del liquido en el tubo en U al conectar.
Examinar los tubos de la siguiente manera (si es posible durante 6 lecturas).
Tubo A: cada tres minuos
Tubo B: cada minuto
Tubbo C: cada 15 minutos
Anotar los resultados en el cuadro
Hacer una grafica con los datos anteriores, coocando en la ordenada el tiempo en
minutos y en la abcisa la produccion de CO2 en mL. Hacer el analisis de la grafica
(anovas).
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Referencias:
Laboratorio de Biotecnología
CORN Y STUMPF, Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 1998
DEVORE G. y Muñoz Mena, Química Orgánica, Editorial Publicaciones Culturales,
México 1992.
Resultados:
Tubo Contenido Desplazamiento del liquido (mL)
A Levadura y agua
B Levadura y glucosa
C Levadura, glucosa y
NaF
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Realizar la grafica en papel milimetrico.
Cuestionario:
1. El ATP da el impulso iicial para inicial al glucolisis, fosforilando la glucosa. ¿cuál
es la reacción?.
2. La fructosa 1-6 difosfato origina dos triosas que pueden convertirse una en otra.
¿cuáles son estas?
3. Estas triosas en ultimo termino se convierten en acido pirúvico o piruvato.
Represente las reacciones respectivas en esta conversión.
4. Los dos productos de la glucolisis piruvato y NADH, se pueden metabolizar
siguiendo dos vías muy diferentes según el tipo de célula en la cual se generan.
¿cuáles son estas dos vías?
5. Escriba la reacción de la fermentación del acido láctico. Y diga dos ejemplos de
células que la realizan.
6. Escriba la reacción de la fermentación alcohólica y diga dos ejemplos de células
que la realizan.
7. Escriba la reacción general de la respiración celular u oxidación aerobia.
28

Laboratorio de Biotecnología
8. En que lugar u organelo de las células procariotas y eucariotas se da la
fermentación (oxidación anaerobia del NADH) y la respiración celular (oxidación
aerobia) y bajo que condiciones se da cada una.
9. ¿Qué influencia tiene el NaF en el proceso de la fermentación y por medio de
que mecanismo lo hace.
Practica 7: Fermentacion alcoholica
Objetivo:
El alumno debe utilizar el metabolismo de las levaduras para producir alcohol etílico
(etanol), a partir de un jugo enriquecido con azúcares fermentables.
Introducción:
Para describir la palabra fermentación se refirió originalmente al metabolismo
anaeróbico de los compuestos orgánicos mediante microorganismos o sus enzimas
para dar lugar a productos más simples que la materia prima. La definición actual es:
“Cualquier acción microbiana controlada por el hombre para obtener productos útiles”.
Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y segregan
algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre; estas son las
características en las que se ha basado el uso de los microorganismos como
productores de fermentación, la que de una manera esquemática se puede
representar así:
Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Adecuadas -------
Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelurares.
La fermentación se puede clasificar de la siguiente manera:
Fermentación con base al substrato. Proteínas, Grasas, Carbohidratos.
Fermentación con base al producto. Alcohólica. Láctica, Acetonica, etc.
Materiales:
1 Agitador de vidrio 100 grs. Azúcar
1 Anillo de Fierro 250 grs. Cáscara de Piña
1 Cuchillo 200 ml de Jugo de Piña
1 Coladera grande 250 grs. de Piloncillo o azucar
1 Matraz de destilación 100 ml de solución de Hidróxido de Bario al 2%
1 Mechero Bunsen 6 ml de reactivo de Fehling A y B
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Laboratorio de Biotecnología
2 Pipetas graduadas de 5 ml 2 lts. De Agua
1 Pipeta graduada de 10 ml
1 Pinzas para tubo de ensayo
3 Pinzas universales
1 Pinzas Hoffman
1 Franela
1 Mortero con pistilo
1 Tela de alambre con asbesto
2 Tapones monohoradados
3 Tubos de ensayo de 16x150mm
1 Termómetro
1 Vaso de precipitado de 250 ml
45 cm de Manguera de látex de 4mm de diámetro
1 Refrigerante
2 Soportes universales
1 Frasco claro con tapa, de 3 a 5 litros, de boca ancha.
1 Frasco claro sin tapa de 200 a 300 m
Procedimiento:
DESARROLLO DE LA PRACTICA
Nota. Esta práctica se llevara a cabo en 3 sesiones de laboratorio.
Primera Sesión
1. Lavar, pelar y hacer trocitos de 2.5 cm aproximadamente de la cáscara y de la pulpa
de la piña.
2. Se comprime la pulpa de la piña hasta obtener un volumen aproximado de 200 ml
de jugo.
3. Lavar perfectamente 1 frasco claro de 3.5 lts. de boca ancha.
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Laboratorio de Biotecnología
4. Efectuar en el frasco anterior la siguiente mezcla: 200 ml de jugo de piña, toda la
cáscara de la piña en cuadritos, 250 grs. de piloncillo, 100 grs. de azúcar y 2 litros de
agua.
5. A la tapa del frasco anterior que hará las veces de un fermentador se le hará un
orificio para adaptar un tramo de 45 cm de manguera de látex de 4 mm de diámetro a
la cual se le coloca una pinza de Hoffman para evitar que escapen los gases que se
forman.
6. Agitar vigorosamente la mezcla anterior y del sobrenadante se extraen con la pipeta
6 ml, de los cuales se depositan 3 ml en un tubo de ensayo y los otros 3 ml en otro tubo
de ensayo.
7. Al primer tubo de ensayo se introduce una tira de papel ph, con el fin de determinar
el pH de la mezcla. pH= .
8. Al segundo tubo se le agregan 1.5 ml de reactivo de Fehling A y 1.5 ml de reactivo
de Fehling B.
9. Agitar, el segundo tubo.
10. Calentar suavemente con el fin de detectar la presencia de azucares reductores
(precipitado de color rojo ladrillo). Reportar positivo o negativo.
11. Tapar el frasco y cerrar la pinza de Hoffman.
12. Dejar fermentar durante 24 hrs.
Segunda Sesión
1. Transcurridas las 24 hrs. Sumergir la manguera de látex del frasco en 100 ml de
solución de hidróxido de Bario al 2%, dispuesta en un frasco de 200 a 300 ml de color
claro.
2. Se abre lentamente la pinza de Hoffman, con el objeto de que el gas producido
entre en contacto con la solución.
3. Anotar observaciones.
4. Se continúa la fermentación durante otros 6 días.
Tercera Sesión
1. Transcurridos los 6 días, se decanta el sobrenadante en un vaso de precipitado.
2. Se filtra el sobrenadante con una franela colocada en la coladera.
31

Laboratorio de Biotecnología
3. El líquido obtenido contiene de 6.7 a 12 grados de alcohol etílico (tepache).
4. Se efectúa nuevamente la determinación de pH y azucares reductores (repetir los
pasos 7,8,9, y 10 de la primera sesión. PH = ; Azucares Reductores ( + o -)=
5. Para separar el alcohol del jugo fermentado se lleva a cabo una destilación (con
ayuda de tu maestro armar el dispositivo de destilación.
6. Desechar las primeras y las últimas gotas del destilado (cabeza y cola del
destilado).
Nota. El alcohol destila por encima de los 78 grados centígrados.
Referencias:
CORN Y STUMPF, Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 1998
DEVORE G. y Muñoz Mena, Química Orgánica, Editorial Publicaciones Culturales,
México 1992.
Resultados:
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Laboratorio de Biotecnología
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Conclusiones:
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Laboratorio de Biotecnología
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Objetivo:
Practica 8: Fermentacion láctica
Obtener el yogur por medio de la fermentación láctica y observar las bacterias
causantes de dicha fermentación..
Introducción:
Las fermentaciones son procesos de respiración anaerobia realizados por ciertas
bacterias y levaduras. En ellos, el aceptor de H+ y electrones cedidos por una molécula
orgánica no es el oxígeno sino otra molécula. Dependiendo de cuál sea esta molécula
se obtendrán distintos productos finales. En el caso de la fermentación láctica, la
molécula aceptora es el ácido pirúvico y el producto resultante es el ácido láctico. Esta
fermentación se emplea en la industria alimentaria para obtener derivados lácteos
como el yogur. El yogur es un producto producido por la fermentación natural de la
leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4
% de una asociación de dos cepas bacterianas. El Streptococcus thermophilus, poco
productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante.
En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas
distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas
arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30 ym de longitud) facilita la
observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio.
Materiales:
Microscopio
Portaobjetos
Asa de platino
Mechero Bunsen
Estufa de cultivo o cuarto de cultivo
Yogurtera
Matraz de 250 mL,
Pipeta de 5 mL,
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Varilla de vidrio
Papel indicador de pH
Xileno
Cristal violeta (o azul de metileno)
Frutos de hueso sanos y enfermos
Laboratorio de Biotecnología
Procedimiento 1: obtención del yogur por la fermentación láctica.
1. Se colocan 100 mL de leche en el matraz y añade 1 mL de yogur.
2. Se deja incubar el matraz en la estufa durante 24 horas a 37 ºC.
3. Saca el matraz y observa el contenido.
4. Mueve con la varilla para homogeneizarlo e introduce una tipa de papel indicador de
pH.
5. Describe lo observado en el matraz y en el papel indicador.
Para realizar este experimento también puedes utilizar un yogurtera doméstica.
Procedimiento 2: Observación de las bacterias causantes de la fermentación.
1. Con el asa de siembra toma una gota de yogur y deposítala sobre un portaobjetos
limpio. Añade una gota de xileno para desengrasar y mézclala con el yogur.
2. Extiende la mezcla y déjala secar completamente. Luego pasa el portaobjetos por la
llama del mechero 4 o 5 veces para fijar la preparación.
3. Aplica el colorante cristal violeta durante 2 minutos.
4. Lava después con abundante agua destilada hasta que el líquido no salga teñido y
deposita sobre ella un cubre cuidando que no se formen burbujas.
5. Observa al microscopio con el objetivo adecuado (utiliza los mayores aumentos)
6. Dibuja lo que has observado.
Referencias:
Murray, R. 1994. BIOQUIMICA DE HARPER. Manual Moreno S.A. de C.V
CORN Y STUMPF, Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 1998
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Resultados:
Laboratorio de Biotecnología
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Conclusiones:
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Laboratorio de Biotecnología
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Objetivo:
Practica 9. Analisis de técnicas para detección de alimentos genéticamente
modificados (practica documental)
Conocer las diferentes técnicas para determinar que un alimento ha sido modificado.
Introducción:
El muestreo y la preparación de la muestra son pasos cruciales en el proceso de
detección de OGM. La inspección de una muestra es menos costosa que la inspección
de todo un lote; sin embargo, el contenido de una muestra no siempre refleja el
contenido del lote de muestreo. El procedimiento de muestreo determina la
representatividad de un resultado mientras que la cantidad y calidad de los analitos
puede variar dependiendo de la preparación de la muestra. Una muestra al azar es
aquella seleccionada en el proceso en la cual cada posible muestra de un lote de
muestreo tiene la misma posibilidad de ser seleccionada. Esto significa que una
muestra al azar produce un estimado imparcial de la medida de interés. En la práctica
una muestra al azar no es siempre fácil de obtener a partir de un lote de muestreo (Asif,
2004).
Material:
Revistas científicas de alimentos
Revistas científicas de Biotecnología
Acceso a internet para accesar a las bases de datos
Procedimiento:
Leer y hacer ensayo de la importancia de realizar análisis a los alimentos transgénicos,
y dar cuenta del bien o del mal que hacen no solo a la sociedad, sino también al
ecosistema.
37

Laboratorio de Biotecnología
Leer y describir cada uno de los procedimientos biotecnológicos para la formación de
un alimento transgénico.
Leer y describir los fundamentos para el análisis molecular de OGM.
Leer y describir los protocolos para la detección molecular de OGM.
Referencias:
Asif M. 2004. Sampling for Detection of GMO. In: NIBGE-FAO Workshop on GMO
Detection. Capacity and Building in Biosafety of Genetically Modified Crops: GMOs
Detection.
Zafar Y. y Asif M. (ed). National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering.
Pakistan.
Resultados:
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Conclusiones:
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 10: Extracción de ADN eucariotico
Utilizar técnicas sencillas para poder extraer el ADN de un tejido animal y por el
aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar y confirmar que en el núcleo el
ADN se encuentra replegado.
Introducción:
El bioquímico suizo Friedrich Miesches fue el primero en descubrir sustancia, ácidos
asociados con las proteínas del núcleo celular. Al estudiarlas mejor, Miesches
comprendió que estas sustancias son bastante diferentes de las proteínas y de otros
compuestos conocidos. La unidad básica de un ácido nucleico es el nucleótido, cada
molécula de ácido nucleótido se forma como una larga cadena de 4 clases de
nucleótidos, a su vez lo nucleótidos pueden ser fragmentados en 3 partes; una de esas
partes es siempre un azúcar de 5 carbonos y que son la ribosa y la desoxirribosa, los
ácidos nucleicos que contienen ribosa se denomina ácido ribonucleico o ARN y los
ácidos nucleicos que contienen desoxirribosa se denominan ácido desoxirribonucleicos
o ADN.
Materiales:
Hígado de pollo
Probeta
Varilla de vidrio
Alcohol de 96
Mortero
Cloruro sódico 2M
Vasos de precipitado
SDS
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Pipeta
Arena
Portaobjeto
Trozo de tela para filtrar
Colorante básico
Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
1. Triturar medio higado de pollo en un mortero. Añadir arena para que al triturar se
puedan romper las membranas de y queden los núcleos sueltos.
2. Añadir al triturado, 50 centímetros cúbicos de agua. Remover hasta hacer una
especie de papilla.
3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan
quedado por romper.
4. Medir el volumen del filtrado con una probeta.
5. Añadir al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos
producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
6. A continuación se añade 1 centímetro cúbico de SDS. (Nota: Si no se dispone de
este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas. La acción de este
detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos
quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.
7. Añadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96. Hay que hacerlo de forma que el
alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase,
precipita el ADN.
8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla
se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la
agrupación de muchas fibras de ADN.
9. Esta práctica puede completarse con una tinción específica de ADN.
Tenemos que tomar una muestra de las fibras que se van depositando sobre la varilla
de vidrio y depositarlas sobre un portaobjeto.
10. Teñir durante unos minutos con un colorante básico.
11. Observar al microscopio.
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Referencias:
Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.
Laboratorio de Biotecnología
Carey, J., Bamshad M., Jorde L. 2010. Genética medica. Elsevier España S.A.
Resultados:
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Laboratorio de Biotecnología
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Conclusiones:
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 11: Extracción de ADN procariotico.
Que el alumno aprenda el fundamento para la obtención del ADN procariotico de la
técnica más sencilla.
Introducción:
Existen diferentes métodos para la obtención de ADN bacteriano que varían en
duración y complejidad del procedimiento en función de la calidad del ADN que
queramos obtener.
Materiales:
MÉTODO DE HERVIDO
Cultivo bacteriano en placa de agar
Asa de platino
Estufa a 37 C
Eppendorf de 1.5 mL esteriles
Pipetas y puntillas desechables esteriles
Temoplato con capacidad de alcanzar 100 C
Centrifuga
Soluciones
Agua molecular esteril
Procedimiento:
Preparar un eppendorf esteril por cada muestra al que se anaden 100 microlitros de
agua molecular estéril
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Laboratorio de Biotecnología
Tomar con un asa de platino unas colonias de la placa de agar e introducirlas en el
eppendorf, utilizando posteriormente la pipeta para obtener una suspensión
homogénea
Calentar a 100 C durante 15 min.
Anadir 900 microlitros de agua molecular estéril a cada eppendorf y homogenizar.
Centrifugar durante 5 min a 12000 rpm
Recoger el sobrenadante en un eppendorf estéril.
Referencias:
Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las técnicas de biología molecular.
Ediciones Pri.
Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.
Resultados:
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Laboratorio de Biotecnología
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Conclusiones:
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Laboratorio de Biotecnología
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Objetivo:
Practica 12: Electroforesis en geles de agarosa.
Que el estudiante se familiarice con la técnica de electroforesis en geles de agarosa
para la lectura de los ácidos nucreicos.
Introducción:
La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. A
diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los
ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos
fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo
positivo, es decir, el ánodo. La concentración de agarosa típicamente utilizada para
electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el
tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque la concentración de agarosa define
el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los
poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto
peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con
un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso
tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos
no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no
solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de
superenrrollamiento que éste poseea. Generalmente en una preparación de plásmido
se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma
superenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las
condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo
una (s).
Materiales:
Marcador de peso molecular.
Cámara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora,
burbuja niveladora, etc.
46

Laboratorio de Biotecnología
Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solución se prepara 5X y se
utiliza 0.5X. Para preparar 1 l de una solución 5X TBE mezclar: 54 g de Tris Base, 27.5
g de ácido bórico, 4.7 g de EDTA sódico, llevar a 1 l con agua y autoclavar.
Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaución: el bromuro de etidio
es un agente mutagénico, utilice guantes para manipular cualquier material o solución
que contenga este químico.
Amortiguador de muestra con azul de bromofenol
Tubos de 1.5 ml
Beaker o erlenmeyer de 125 ml
Micropipeta de 20 µl con sus respectivas puntas
Lámpara de UV. Precaución: la luz ultravioleta puede dañar sus ojos. NUNCA observe
un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz.
Guantes
Procedimiento:
Pesar la cantidad de agarosa requerida para obtener un gel de agarosa al 1%. El
volumen final es de 30 ml.
Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x. Calentar en el microondas por
45 s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las
partículas de agarosa translúcidas. Se debe tener precaución con los recipientes
calientes ya que pueden causar quemaduras.
Incorporar 1.25 µl de bromuro de etidio a 10 mg/ml en la solución caliente de agarosa y
agitando con movimientos circulares. Precaución: El bromuro de etilo es un
carcinógeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la
disolución o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidio
debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con
bromuro de etidio.
El soporte para “vaciar” el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o
tabla niveladora y se colocan los peines que generarán los pozos para aplicar las
muestras.
Cuando la agarosa alcanza los 50–60 °C aproximadamente se vierte en el centro de la
bandeja para gel evitando la formación de burbujas.
Se deja reposar, el gel tarda de 20–40 minutos para solidificar a temperatura ambiente.
47

Laboratorio de Biotecnología
Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetándolo con ambas manos y
jalando cuidadosamente hacia arriba.
Posteriormente se translada el soporte para el gel hasta la cámara de electroforesis,
colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro)
debido a que las muestras migrarán hacia el ánodo (de color rojo) durante la
electroforesis. Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.
Para preparar las muestras añada en un tubo de 1.5 ml:
5 µl de agua destilada desionizada
5 µl de su preparación de plásmido
2 µl de amortiguador de la muestra
Para preparar el marcador del peso molecular, añada en un tubo de 1.5 ml:
7 µl de agua destilada desionizada
3 µl del marcador de peso molecular (MPM)
2 µl de buffer de la muestra
Con una micropipeta de 20 µl con punta aspirar la muestra preparada previamente.
Colocar la micropipeta en forma perpendicular al gel de agarosa, e introducirla hasta el
fondo del pozo liberando su contenido mientras se va sacando lentamente la punta del
pozo. Tome nota del orden en que se colocaron las muestras y el marcador de peso
molecular.
Para iniciar la corrida electroforética, colocar la tapa, asegurándose que los electrodos
estén en contacto y conectados a la fuente de poder. Encienda la fuente de poder. La
Se electroforesis se realiza a 100 V, 50 miliamperios durante 30 minutos
aproximadamente.
Finalizada la electroforesis, apagar la fuente de poder, se destapa la cámara y se retira
el soporte para gel de la cámara, sosteniendo con los dedos los bordes para evitar que
el gel se caiga. Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la
posición de las bandas en el gel.
Referencias:
BioRad. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en
geles de agarosa. Rev A
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Laboratorio de Biotecnología
Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las técnicas de biología molecular.
Ediciones Pri.
Resultados:
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Conclusiones:
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Objetivo:
Practica 13: Reacción en Cadena de la Polimerasa (demostrativo)
Que el estudiante comprenda el fundamento y aplique los conceptos teóricos en los
cuales se basa la reacción en cadena de la polimerasa.
Introducción:
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue descrita por
primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. Esta invención lo hizo acreedor en 1993 del
Premio Nobel en Química, debido al gran impacto que ha tenido esta técnica en el área
de la bioquímica. Su objetivo y función es la de obtener mediante amplificación in
vitro cantidades “masivas” de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy pequeñas.
Para realizar el PCR más sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean la
región a amplificar, luego se producen oligonucleótidos complementarios a estas
secuencias mediante síntesis química automatizada y estos son utilizados como
cebadores (primers) en una reacción de polimerización cíclica catalizada por la ADN
polimerasa.
Material:
Gradilla para tubos de 0.5ml y un tubo de 0.5ml
Muestra que contenga ADN
Micropipetas de 10 µl y 100 µl con sus respectivas puntas
Mezcla maestra que contenga: amortiguador de reacción en cadena de la polimerasa,
mezcla de nucleótidos (dNTPs), Taq polimerasa y cebadores.
Agua libre de ADNasas
Termociclador
Procedimiento:
50

Laboratorio de Biotecnología
En un tubo de 0.5 ml, agregue las siguientes cantidades en el orden indicado (volumen
final de reacción: 50 µl):
1. Agua libre de ADNasas: 18.9 µl
2. Muestra: 5 µl (sobrenadante del lisado de colonias de Escherichia coli, muestras de
ADN obtenido en prácticas anteriores.).
3. Mezcla maestra (Fermentas buffer + primers): 27µl
Con la ayuda de su instructor, programe el termociclador según las condiciones
requeridas.
Cuando la reacción haya finalizado, analice el producto obtenido mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 2%.
Referencias:
Mathews, C.K, Van Holde, K.E y Ahern, K.G. Bioquímica. Pearson Educación. Tercera
edición, España, 2003.
Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las técnicas de biología molecular.
Ediciones Pri.
Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.
Resultados:
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Laboratorio de Biotecnología
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Conclusiones:
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 14. Secuenciador ADN (documental).
Describir el uso del secuenciador para fines prácticos de la biotecnología en la
medicina.
Introducción:
La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya
finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un
oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética
heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas)
que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues,
determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los
procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la
investigación forense.
Material:
Acceso a internet
Acceso a bases de datos
Acceso a Journals
Procedimiento:
Describir y desarrollar la utilización del secuenciador para análisis.
Describir y analizar la utilización del mismo en la actualidad.
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Referencias:
Laboratorio de Biotecnología
Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las técnicas de biología molecular.
Ediciones Pri.
Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.
Resultados:
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Objetivo:
Laboratorio de Biotecnología
Practica 15. Pruebas diagnostico, ELISAS
Que el estudiante se familiarice con una técnica básica en los estudios de inmunología
y que con ella se ha dado pauta a los avances biotecnológicos en la medicina como
ensayo de prueba.
Introducción:
Los ensayos inmunoenzimaticos, por su especificidad, sensibilidad y sencillez de
manipulación, son una técnica muy habitual en los laboratorios de investigación y de
análisis clínicos. En este ensayo, el anticuerpo que reconoce al antígeno esta unido a
una enzima con capacidad para catalizar una reacción que da un producto coloreado.
La técnica ELISA (enzyme linked immunodsorbent assay) en el ensayo se utiliza,
generalmente una membrana de nitrocelulosa sobre la que se fija el antígeno.
Posteriormente se anade sobre la membrana el anticuerpo que reconoce
específicamente a ese antígeno. Este anticuerpo tiene unida una enzima que al anadir
su sustrato generara un producto coloreado. Este procedimiento se denomina método
directo de detección.
Material:
Cajas de elisa. Soporte solido
Anticuerpo anti-albumina bovina
Ovoalbumina
Tampón fosfato salino
Sustrato cromógeno (4-cloro-1-naftol)
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Cubeta de lavado
Micropipetas
Puntillas
Frasco lavador
Control positivo de albumina bovina
Control negativo de albumina ovina
Muestras m1, m2. M3
Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
Tomar la caja de ELISA, aplicaar sobre cada pocillo una muestra de 2 microlitros de
muestra y de control positivo y negativo. Uno por cada división. Dejar secar de 5 a 10
min.
Durante ese tiempo se prepara la solución de bloqueo. Para ello anadir 2.5 gr de
ovoalbúmina en 100ml de tampón salino. Aguitar la mezcla hasta conseguir una
dilución homogénea 5%
Una vez pasado el tiempo de la solución de los pocillos, introducir la solución de
bloqueo y se deja durante 15 min.
Retirar la solución de bloqueo y lavar la caja elisa con agua destilada.
Anador sobre cada punto 20 microlitos de anticuerpo anti-albumina bovina conjugando
con peroxidasa, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
Lavar con agua destilada.
Anadir sobre cada pocillo 10 microlitros del sustrato cromógeno y dejar desarrollar el
color.
Referencias:
Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las técnicas de biología molecular.
Ediciones Pri.
Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.
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Resultados:
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Conclusiones:
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Objetivo:
Practica 16. Bioinformatica y Biotecnología.
Introducir las bases de datos accesibles a través de Internet de importancia en el área
biológica. Comprender la utilidad de las mismas como herramientas de acceso a
información y programas de cómputo actualizados.
Introducción:
En las últimas décadas, científicos alrededor del mundo se han dedicado a obtener las
secuencias tanto proteínas como de ácidos nucleicos. Aunque en sus inicios estos
esfuerzos fueron aislados, poco a poco la cantidad de datos generada se hizo excesiva
para ser manejada por laboratorios aislados. Además, con el advenimiento de nuevas
tecnologías de secuenciación, se generaron proyectos conjuntos entre laboratorios
cuyo objetivo único era la secuenciación de un genoma en particular. Se hizo
entonces necesaria la organización de bancos de datos donde las secuencias
generadas pudieran ser depositadas. Desde el inicio, la comunidad científica estuvo de
acuerdo en que estos bancos de datos deberían tener acceso libre a nivel mundial.
Mucho antes de que el genoma humano se completara en el año 2003,
(http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml), existían ya
decenas de este tipo de bancos de datos. Actualmente, existen bancos de datos
definidos, sumamente extensos de los cuales se derivan “secciones” donde se puede
tener acceso a información más específica.
Materiales:
Acceso a internet
Acceso a las bases de datos geneticos
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Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
Se visitarán diferentes sitios en Internet y su instructor le indicará las principales
características de los mismos. Dependiendo del tiempo y el acceso a Internet, se
revisarán los siguientes sitios:
Dirección de la página web Descripción
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pu
bmed
Base de datos general, no solo
de secuencias de
macromoléculas sino también
acceso a libros y revistas en el
área de ciencias de la salud.
Además, acceso a programas
de cómputo para análisis de
secuencias de proteínas, genes
o genomas.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Programa de cómputo que
encuentra secuencias similares
en proteínas y ácidos nucleicos
http://www.genome.jp/kegg/ Base de datos de Japón
http://www.ebi.ac.uk/embl/ Base de datos Europeo
http://www.webact.org/WebACT/home Banco de datos de comparación
de genomas de procariotas, que
permite la visualización “on
line” de hasta cinco genomas de
forma simultánea, utilizando el
herramienta de comparación
Artemis, desarrollada por el
Instituto Sanger.
http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/ Herramienta de comparación de
ADN Artemis
Referencias:
Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in
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Laboratorio de Biotecnología
fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero
C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.
Conclusiones:
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Objetivo:
Practica 17. Fundamentos de la Biorremediacion (documental)
Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Biorremediacion.
Que el estudiante explore las posibilidades de la biorremediacion, que se familiarize
con los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute en manera de las
posibilidades una propuesta basica de biorremedicaion de suelo y agua.
Introducción:
La biorremediación es el uso de seres vivos para restaurar ambientes contaminados.
Es un concepto que no se debe de confundir con depuración. La depuración es la
eliminación, ya sea por métodos físico/químicos o biológicos, de un contaminante antes
de que éste alcance el medio ambiente. Cuando la contaminación ya se ha producido,
se precisa restaurar el ecosistema contaminado, para lo que se pueden utilizar diversas
estrategias. Una de ellas es la biorremediación. Se pueden emplear diversos
organismos en los procesos de biorremediación. Los más usados son los
microorganismos (tanto bacterias, como algas y hongos) y las plantas (en procesos
llamados fitorremediación), pero también se pueden utilizar otros seres vivos tales
como los nemátodos (vermiremediación). Entre los microorganismos destacan
especialmente las bacterias, los seres vivos con mayor capacidad metabólica del
planeta. Las bacterias pueden degradar prácticamente cualquier sustancia orgánica. Si
la sustancia se degrada completamente se habla de mineralización; este es el proceso
ideal, pero no siempre ocurre. Algunas sustancias no son degradadas sino
transformadas en otras (biotransformación). La biotransformación puede ser peligrosa,
ya que la nueva sustancia formada puede ser tan nociva o más que la de partida.
Finalmente hay sustancias que no son degradadas y se las denomina recalcitrantes.
Éstas se acumulan durante mucho en el medio ambiente, especialmente si además son
60

Laboratorio de Biotecnología
resistentes a procesos físico/químicos como la radiación ultravioleta o la oxidación. Las
bacterias además pueden eliminar los contaminantes en ambientes donde hay oxígeno
(llamados aeróbicos), pero también en ambientes sin oxígeno (llamados anaeróbicos),
ya que pueden respirar otras sustancias diferentes al oxígeno (aceptores de
electrones), como por ejemplo el nitrato, el sulfato, el hierro (III), el manganeso, el
selenio y un largo etcétera.
Materiales:
Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion.
Acceso a las bases de datos.
Acceso a internet.
Trabajo en equipo.
Procedimiento:
La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran para
la busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto.
Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4 articulos
deacuerdo al tema (sin repetir). Se discutiran los articulos en clase y posteriormente
realizaran el proyecto escrito y una presentacion.
Referencias:
Breedveld, G.D and Sparrevik, M. 2001. Nutrient‐limited biodegradation of PAH in
various soil strata at a creosote contaminated site. Biodegradation 11: 391‐399
García H D, Sosa A, CR y Sánchez‐Yáñez, 2007. Biorremediación de agua domestica
contaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniería Hidráulica de México.
17:208‐219
Sánchez‐Yañez, JM et al., 2008. Biorremediación (Antología). Secretaría de Difusión
Cultural y Extensión Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo,
Centro de Investigación y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV.
Morelia, Mich, México. ISBN:978‐970‐95424‐2‐4.
Resultados:
Ensayos de los articulos.
Proyecto escrito.
Presentacion del proyecto.
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Conclusiones:
Laboratorio de Biotecnología
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Objetivo:
Practica 18. Fitorremediacion (documental).
Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Fitorremediacion.
Que el estudiante explore las posibilidades de la fitorremediacion, que se familiarize
con los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute una propuesta basica
a medida de sus posibilidades.
Introducción:
La fitorremediación podría ser definida como el conjunto de métodos para degradar,
asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados, compuestos orgánicos,
radioactivos y petroderivados por medio de la utilización de plantas que tengan la
capacidad fisiológica y bioquímica para absorber, retener, degradar o transformar
dichas sustancias a formas menos tóxicas. Asimismo, podría definirsela como la
capacidad de ciertas plantas (terrestres, acuáticas, leñosas, etc.) y los cultivos in vitro
derivados de ellas con el fin de remover, contener o transformar productos
contaminantes del entorno. Las bases conceptuales de la fitorremediación provienen
de la identificación de plantas que hiperacumulan metales. Existen vegetales que
tienen esta capacidad intrínseca pero también pueden obtenerse plantas con estas
capacidades por técnicas propias de la Ingeniería Genética. Promisoriamente, las
plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar
suelos y aguas contaminadas, además, algunos procesos degradativos ocurren en
forma más rápida con plantas que con microorganismos. Es un método apropiado para
descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas
restringidas en plazos medianamente largos. Sin embargo, es preciso considerar que el
proceso se limita a la profundidad de penetración de las raíces o aguas poco
profundas.
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Materiales:
Laboratorio de Biotecnología
Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion.
Acceso a las bases de datos.
Acceso a internet.
Trabajo en equipo.
Procedimiento:
La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran para
la busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto.
Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4-5 articulos
deacuerdo al tema (sin repetir).
Se discutiran los articulos en clase y posteriormente realizaran el proyecto escrito y una
presentacion.
Referencias:
García H D, Sosa A, CR y Sánchez‐Yáñez, 2007. Biorremediación de agua domestica
contaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniería Hidráulica de México.
17:208‐219
Sánchez‐Yañez, JM et al., 2008. Biorremediación (Antología). Secretaría de Difusión
Cultural y Extensión Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo,
Centro de Investigación y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV.
Morelia, Mich, México. ISBN:978‐970‐95424‐2‐4.
Resultados:
Ensayos de los articulos.
Proyecto escrito.
Presentacion del proyecto.
Conclusiones:
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Laboratorio de Biotecnología
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Objetivo:
Practica 19. Biodiesel a partir de aceite nuevo
Aprender la metodología general para la obtencion de biodiesel a partir de aceite
vegetal nuevo de cocina.
Introducción:
El biodiésel es un biocombustible que se fabrica a partir de cualquier grasa animal o
aceites vegetales, que pueden ser ya usados o sin usar. Se suele utilizar girasol,
canola, soja o jatropha, los cuáles, en algunos casos, son cultivados exclusivamente
para producirlo. Se puede usar puro o mezclado con gasoil en cualquier proporción en
motores diésel. El principal productor de biodiésel en el mundo es Alemania, que
concentra el 63% de la producción. Le sigue Francia con el 17%, Estados Unidos con
el 10%, Italia con el 7% y Austria con el 3%.
El sistema más habitual es la transformación de estos aceites a través de un proceso
de transesterificación. De este modo, a partir de alcohol metílico, hidróxido sódico
(soda cáustica) y aceite vegetal se obtiene un éster que se puede utilizar directamente
en un motor diesel sin modificar, obteniéndose glicerina como subproducto. La glicerina
puede utilizarse para otras aplicaciones.
Material:
Papel filtro
Termometro
Varita
Matraz de 500 ml
Vaso de precipitados
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Probeta
Mechero bunsen
Aceite nuevo de girasol
Hidroxido de sodio
Metanol
Agua destilada
Procedimiento:
Laboratorio de Biotecnología
1. medimos el numero de litros de aceite con los cuales queremos experimentar
(en este caso 1 litro).
2. Vertimos el aceite vegetal en el vaso de precipitados donde preparamos la
mezcla.
3. Si la temperatura es inferior a 21ºC o si el aceite vegetal se encentra en estado
solido o espeso, será necesario calentar los reactivos antes de mezclarlos.
4. Introducimos con mucho cuidado 3.5g de sosa caustica y 0.2 litros de metanol
dentro de un vaso de precipitados.
5. Removemos la mezcla hasta que la sosa haya disuelto en el metanol (se
produce metoxido sódico)
6. Vertimos seguidamente el metoxido de sodio dentro del aceite vegetal.
7. Mezclamos el conjunto de forma vigorosa durante una hora, manteniéndolo a
una temperatura constante de aproximadamente unos 4-50ºC. Para esto lo
colocamos sobre el bunsen siempre controlando la temperatura con un
termómetro.
8. Dejamos que la mezcla repose durante 12 horas.
9. Separamos las dos capas con ayuda de un embudo de decantación.
10. Dejamos que la glicerina, que aparece como capa oscura y espesa en la parte
inferior del recipiente, se deposite en el fondo durante una semana. Pasado este
tiempo se habrá evaporado el resto de metanol y se obtendrá un jabon de
gliceria.
11. Luego procedemos al lavado del biodiesel para eliminar cualquier resto de
glicerina u otras impurezas. Añadimos agua y agitamos, dejamos que esta se
asiente en el fondo y desaguamos.
12. Medimos el pH y repetimos el proceso hasta que el pH sea de 6-7.
13. Al final se ha de calentar lentamente para evaporar restos de agua.
Referencias:
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Laboratorio de Biotecnología
Aguejas D.L. 1996. Biocombustibles.ministerio de cultura, pesca y alimentacion.
Madrid.
Jarabo F.F.1999. La energia de la biomasa. SAPT Publicaciones tecnicas. Madrid.
Resultados:
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Conclusiones:
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Objetivo:
Practica 20. Análisis de contaminación de Agua
Que el estudiante comprenda el concepto microbiologico de indicador de
contaminacion.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante el recuento de
mesofilos aerobios y la busqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes
fecales y E. Coli
Aplicar tecnicas de cuantificacion de microorganismos totales y comparar con las
tecnicas de determinacion de viables.
Introducción:
La determinación de la calidad bacteriológica reviste gran importancia en el ámbito de
la salud pública ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo
evitando así epidemias gastrointestinales. El agua destinada al consumo humano
puede ser contaminada por las agua residuales o por desechos humanos y animales
que pueden contener microorganismos patógenos (principalmente intestinales) como
son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentería (Shigella dysenterieae)
o el cólera (Vibrio cholerae) entre otros).
Sin embargo, la detección de microorganismos patógenos es poco práctica por las
siguientes razones:
a) No siempre están presentes en la fuente de contaminación (material fecal), pero
pueden aparecer repentinamente
b) Al diluirse en el agua, pueden quedar en concentraciones no detectables por los
métodos de laboratorio
c) Sobreviven relativamente poco tiempo en el agua, por lo que pueden desaparecer
antes de ser detectados
d) Los resultados del análisis bacteriológico del agua se obtienen después que ésta ha
sido consumida por lo cual si hay patógenos, la población habrá estado expuesta a la
infección.
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Materiales:
Laboratorio de Biotecnología
Agua almacenada
Material por equipo
Frasco de boca ancha con tapón esmerilado
Papel Kraft
1 pipeta de 1mL
Solución de tiosulfato de sodio 10%
Etanol
Algodón
Hielo raspado (sin sabor)
Bolsa de plástico con cierre (ziploc)
1 pipeta de 1mL
Solución de tiosulfato de sodio 10%
Material por equipo para el análisis
2 mecheros
Tripié y tela de asbesto
Gradilla
Equipo Millipore estéril
Accesorios de equipo Millipore
1 matraz de 250mL con 150mL de Agar Cuenta Estándar.
5 tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentración (3X)
1 caja con Agar Bilis Rojo Violeta
3 tubos con 9mL de solución salina estéril
Pipetas serológicas de 10, 5 y 1mL estériles
10 cajas petri estériles de vidrio o plástico estériles
Agua de sabor (10mL)
Hielo raspado (600mL)
Procedimiento 1:
a) Preparación de los frascos
1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabón o detergente
2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL)
3. Colocar una tira de papel kraft de 1 x 5cm entre tapón y cuello (frascos refractarios
con tapón esmerilado)
4. Cubrir el tapón y el cuello del frasco con papel kraftin
5. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
b) Toma de la muestra
1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%
2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodón y etanol y dejar correr el
agua por 3 minutos.
68

Laboratorio de Biotecnología
3. Generar zona aséptica cuando sea posible hacerlo.
4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente.
5. Para la recolección de agua a partir de depósitos naturales y cuerpos receptores,
retirar la cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua
30cm.
6. Destapar y llenar contra corriente o moviéndolo al frente, llenar hasta 2/3 del
recipiente y tapar inmediatamente.
7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos.
8. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes de
que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
Procedimiento 2:
a) Toma de la muestra
1. Comprar con un día de anterioridad 3 vasos de hielo raspado (1.5L) o granizado de los
carritos y colocarlo en la bolsa plástica.
2. Cerrar inmediatamente y refrigerar (no congelar).
3. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes de que
transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
Procedimiento para análisis de las muestras:
a) Determinación de mesófilos aeróbios
1. Homogenizar la muestra de agua de sabor.
2. Realizar 2 diluciones decimales en SSI.
3. Depositar con pipeta 1mL de muestra o dilución en cada caja de Petri estéril.
Realizar cada dilución por duplicado.
4. Verter en cada caja aproximadamente 20mL del medio agar cuenta estándar,
fundido y enfriado a 45°C, homogenizar y dejar solidificar.
5. Etiquetar cada una de las cajas.
6. Verter una en una caja medio de cultivo sin muestra como control.
7. Una vez solidificadas, incubar las placas a 35°C durante 24 horas.
8. Contar todas las colonias presentes, en las cajas que contengan de 25 a 250.
b) Prueba presuntiva. Determinación del NMP de coliformes en agua y hielo potables:
1. A partir de la muestra de agua inocular 20mL en cada uno de 5 tubos con caldo lauril
sulfato de sodio (CLSS) triple concentración. Rotular.
2. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
69

Laboratorio de Biotecnología
observa producción de gas, incubar 24 h. más.
c) Técnica de filtración:
1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta.
2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En condiciones
de asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de
pato, colocar una membrana de 0.45mm estéril sobre la base del filtro conector. Las
pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la
membrana.
3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra líquida
solicitada, si presenta partículas en suspensión filtrar previamente con algodón y gasa.
4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que hubo
pasado todo el medio cerrar el vacío.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja
de Petri con Agar Bilis Rojo Violeta. Presionar ligeramente la superficie para favorecer
la adherencia de la membrana.
7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar a
37ªC durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en
refrigeración.
Referencias:
Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American
Public Health Association. 20th edition. Washington.
Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la
cuenta de bacterias aerobias en placa.
Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de
bacterias coliformes. Técnica del número más probable.
Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo
para consumo humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias
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Resultados:
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Conclusiones:
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