Application Note 4 - IRMM - Europa

Application Note 4
Uso de materiales de referencia
certificados para la cuantificación de
OMG en alimentos y piensos
Esta nota de aplicación contiene indicaciones para el uso correcto de los
materiales de referencia del IRMM certificados en cuanto a su fracción
másica MG (de determinado evento de modificación genética).
Los detalles que se dan a continuación se refieren particularmente al uso
de los MRC ERM-BF410, ERM-BF411, ERM-BF412, ERM-BF413, ERM-
BF414, ERM-BF415, ERM-BF416, ERM-BF417, ERM-BF418 y ERM-BF423.
INTRODUCCIÓN
El Reglamento (CE) n° 1830/2003 exige etiquetar
los productos destinados a alimentos y piensos que
contengan o estén compuestos de más de un 0,9 %
de OMG (organismos modificados genéticamente),
siempre que los OMG se hayan comercializado en
Europa en conformidad con la legislación
comunitaria. Por este motivo es obligado cuantificar
de manera fiable los OMG en tales productos. Unos
materiales de referencia certificados (MRC)
adecuados son herramientas indispensables para
garantizar la calidad en este contexto.
CARACTERÍSTICAS DE ESTOS MRC
Los valores certificados de los MRC arriba
enumerados se basan en las masas de harina de
semillas desecadas modificadas genéticamente y no
modificadas genéticamente utilizadas en el
preparado gravimétrico. Las masas se corrigen en
función de su contenido de agua y pureza estimada.
La fracción másica MG se calcula de la siguiente
manera:
masa corregida de polvo MG
masa corregida de polvo MG + masa corregida
de polvo no MG
Cada MRC de OMG se certifica en relación con la
fracción másica de un evento de modificación
genético específico (que consta en el certificado).
Por tanto, el MRC solo puede usarse para
cuantificar el evento indicado, y el correspondiente
material en blanco solo para demostrar la ausencia
de este evento por debajo del umbral que figura en
el certificado.
ERM ® - BF418c
DRIED MAIZE POWDER
Certified value 1)
[g / kg]
Mass Fraction
Uncertainty 2)
[g / kg]
1507 maize 9.9 -0.6 ; +0.8
1) The certified value is based on the mass fraction of dried non-genetically modified powder and dried
genetically modified powder mixed and corrected for the water content. The certified value is traceable
to the SI.
2) The certified uncertainty is the expanded uncertainty estimated in accordance with the Guide to the
Expression of Uncertainty in Measurement (GUM) with a coverage factor k = 2, corresponding to a
level of confidence of about 95 %.
Figura 1: Parte del certificado del MRC de ERM-BF418c.
Los MRC de OMG presentados recientemente por el
IRMM han sido certificados usando un intervalo de
incertidumbre asimétrico. Si se usan estos MRC
para control del sesgo (véase la Nota de aplicación
1 del ERM), debe usarse, dependiendo del valor de
la incertidumbre, para una medida promedio
superior all valor certificado la «incertidumbre
positiva» y si el valor es inferior la «incertidumbre
negativa».
USO DE LA RCP EN TIEMPO REAL
En general se usa la reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real (RCP-tr) para cuantificar
fracciones MG en muestras de alimentos y piensos.
Esta técnica mide el cociente entre el ADN (ácido
desoxirribonucleico) transgénico (derivado de la
modificación genética) y el endógeno (propio de la
especie biológica).
Dado que las distintas partes de la semilla de
monocotiledónea (p. ej., el endosperma, la testa y el
embrión del maíz) tienen diferente composición
genética, el valor del cociente de ADN en el material
de referencia puede no coincidir con el de la fracción
másica de la harina certificada. De ahí que el
cociente ADN transgénico extraíble/ ADN endógeno
extraído no sea necesariamente igual al cociente
masa de maíz MG / masa de maíz total, incluso si
los rendimientos de extracción de ambas especies
de ADN son comparables.
Durante la preparación de MRC de OMG, se ha
procurado que las harinas MG y no MG sean
similares en cuanto a su granulometría. Esto es de
especial importancia a la hora de comparar la
cantidad de ADN extraíble en ambas harinas. Si la
eficiencia de extracción fuera diferente para el ADN
de la harina MG y de la no MG, estó influirían en el
valor de la concentración de MG medido obtenido
mediante RCP-tr. Por ello, sólo deben usarse
métodos de extracción validados en cuanto al
cumplimiento de este requisito.
Durante la certificación se verifica la fracción másica
MG del MRC utilizando un método de RCP-tr
específico al evento. No obstante, se impone la
prudencia a la hora de extraer conclusiones
cuantitativas de las medidas de muestras
desconocidas, pues la cuantificación de OMG
basada en el ADN puede variar en función de la
variedad sometida a ensayo. Si no hay datos
externos, conviene investigar el impacto de
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Septiembre de 2006
Autor: Stefanie Trapmann
Comisión Europea – Centro Común de
Investigación – Instituto de Medidas y
Materiales de Referencia (IRMM)
Retieseweg 111, 2440 Geel, Bélgica
Email: stefanie.trapmann@ec.europa.eu
www.erm-crm.org

diferentes variedades en los resultados de la RCP-tr
con una validación interna [1].
En la página web del Laboratorio Comunitario de
Referencia sobre alimentos y piensos MG se ponen
a disposición del público métodos de detección
mediante RCP-tr presentados y validados según el
Reglamento (CE) nº 1829/2003.
(http://gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm).
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS EN
NÚMERO RELATIVO DE COPIAS DE ADN
Como en Europa la metodología más habitual para
cuantificar OMG es la RCP-tr, una reciente
Recomendación de la Comisión (2004/787/CE)
propone expresar los resultados de las medidas
efectuadas con muestras de OMG en función del
número de copias de ADN. Si se utilizan MRC de
OMG certificados con respecto a su fracción másica
MG para calibrar las medidas y se expresa el
resultado final en número relativo de copias, debe
precisarse que los MRC de maíz se producen
utilizando maíz MG heterocigótico para el transgén.
El correspondiente informe de certificación contiene
EJEMPLO
información sobre la cigosidad de las semillas
utilizadas para producir los MRC. Además, hay que
saber que los números relativos de copias MG de
maíz vienen influidos por cómo se produce la
variedad híbrida MG y por la endorreduplicación de
las semillas, que realza el efecto de la distribución
genómica del tejido endospérmico. En los casos
extremos, el número relativo de copias MG puede
ser o el 33 % (evento transgénico procedente del
padre utilizado para cruzar la semilla heterocigótica)
o el 66 % (evento procedente de la planta madre
utilizada para cruzar la semilla heterocigótica)
suponiendo una endorreduplicación tan intensa que
el impacto del endosperma se acerca al 100 %. Los
demás casos (impacto menor de la
endorreduplicación y mayor del tejido embrionario)
generarán valores comprendidos entre el 33 y el 66
%, suponiendo que pueda despreciarse el impacto
de la (testa cubierta de la semilla).
Véase el siguiente ejemplo de como el resultado de
una medida y su incertidumbre se convierten de
g/kg obtenidos en número relativo de copias.
Al calibrar una muestra de maíz con MRC certificados con respecto a su fracción másica MG, se han obtenido 65 ± 20 g/kg del
evento de maíz 1507. La incertidumbre ampliada de la medición de 20 g/kg se calculó utilizando un factor de cobertura de 2 y
una incertidumbre de la medida del método de cuantificación del 15 %, estimada en la validación interna. Para convertir el
resultado obtenido en un cociente de números de copias, es preciso dividir por 10, así se transforma en porcentaje el resultado
esto es g/kg. Considerando que los MRC de maíz OMG usados en la calibración se han producido a partir de semillas de maíz
heterocigóticas, es preciso dividir por 2 el resultado:
x 65
= = 3,
3 siendo x = promedio del contenido en OMG hallado en g/kg
10 × 2 20
Nótese que, cuando se observa una extraibilidad del ADN distinta para los materiales básicos MG y no MG usados para producir
los MRC, hay que aplicar un factor de corrección. El informe de certificación contiene datos sobre la extraibilidad del ADN.
Mediante CTAB se encontró un cociente de 0,7 ± 0,3 entre la extraíbilidad del ADN de la harina MG y la de la harina no MG. Por
tanto, el contenido de MG de la muestra investigada está sobreestimado en cuanto al número de copias y debe ser corregido:
3 , 3*
f = 3,
3*
0,
7 = 2,
3 siendo f = factor de corrección relacionado con la distinta extraibilidad del ADN de la harina MG y
no MG usado como MRC
Es preciso considerar el efecto de la endorreduplicación y la hibridación del evento de maíz heterocigótico para determinar la
incertidumbre de los resultados de la medición. La incertidumbre debe cubrir el intervalo del 33 % (66 % menos 33 %) y el valor
medido podría diferir en un 16,5 %. Para estimar el cociente del número de copias, hay que cuantificar el ADN extraído de la
muestra investigada y estimar el número de genomas de maíz (lo que se efectúa dividiendo la concentración de ADN por el
tamaño del genoma del maíz). Por tanto, para calcular la incertidumbre hay que considerar aquella relacionada con la
cuantificación del ADN en adicción a la relacionada con la estimación del tamaño del genoma. La bibliografía indica que el
tamaño del genoma del maíz puede varíar hasta un 36 % [2]. En la validación interna se halló que la reproducibilidad del método
de cuantificación era del 22 %. Por tanto, la incertidumbre combinada ampliada del resultado expresado en cociente de números
de copias (Ucc) puede calcularse:
U = k u + u + u + u
U
cc
cc
2
m
2
gs
2
Dq
2 ⎛ 18 ⎞
= 2 15 + ⎜ ⎟ +
⎝ 3 ⎠
2
2
e
22
2
2
⎛16,
5⎞
+ ⎜ ⎟ % = 60%
⎝ 3 ⎠
siendo k = factor de cobertura
um = contribución a la incertidumbre relacionada con el
método de cuantificación del número de copias
ugs = contribución a la incertidumbre relacionada con la
estimación del tamaño del genoma
uDq = contribución a la incertidumbre relacionada con la
cuantificación del ADN
ue = contribución a la incertidumbre relacionada con la
hibridación y la endorreduplicación
En número de copias, la muestra de maíz contiene 2,3 ± 1,4 secuencias transgénicas del evento 1507 por 100 secuencia endógena.
Frente al resultado expresado en fracción másica del 1507, 65 ± 20 g/kg, la incertidumbre ampliada relativa ha pasado del 30 al 60 %.
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[1] IUPAC Technical Report (2002): Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Methods of Analysis.
[2] Poggio et al., Annals of Botany 85 (1998),107-115.
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