Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares
Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares
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<strong>Metodología</strong> y <strong>técnicas</strong> <strong>para</strong> <strong>el</strong> <strong>estudio</strong> <strong>de</strong> enfermeda<strong>de</strong>s <strong>musculares</strong><br />
Dolores Moreno León.<br />
Técnico Superior Anatomía Patológica y Citología<br />
INP (Instituto Neuropatología)<br />
IDIBELL<br />
HUB (Hospital Universitari <strong>de</strong> B<strong>el</strong>lvitge).<br />
L´Hospitalet <strong>de</strong> Llobregat.<br />
CIBERNED
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Anatomía d<strong>el</strong> músculo esqu<strong>el</strong>ético<br />
Músculo esqu<strong>el</strong>ético<br />
Fascículo<br />
Fibra muscular<br />
(varios mm a varios cm)
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Anatomía d<strong>el</strong> músculo esqu<strong>el</strong>ético<br />
Motoneurona<br />
Tipo I Miofibrillas<br />
Motoneurona<br />
Tipo II<br />
Fibra muscular<br />
Tipo I<br />
Fibra muscular<br />
Tipo II<br />
Miofibrillas<br />
Fibras tipo I y tipo II, y contracción muscular<br />
Tipo I rojas +++ lenta,<br />
+++ mitocondrias<br />
+++ actividad oxidativa<br />
+++ mioglobina<br />
+++ gotas lipídicas<br />
Tipo IIb blancas +++ rápida,<br />
+++ glucógeno<br />
+++ miofibrillas<br />
IIa intermedias ++ rápidas<br />
IIIc regenerativas
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Esquema fibra muscular<br />
Miofibrillas<br />
Mitocondrias<br />
Complejo<br />
Sarcoglicanos<br />
Distrofina<br />
Actina asociada<br />
al esqu<strong>el</strong>eto<br />
δ γ α β<br />
α B-cristalina<br />
Miotilina<br />
T<strong>el</strong>etonina<br />
lípidos<br />
β1 Laminina 2<br />
Glucógeno<br />
Desmina<br />
α 2<br />
α<br />
β<br />
γ 1<br />
sarcómero<br />
Complejo<br />
Distroglicano<br />
Miosina<br />
Titina<br />
Sarcoplasma<br />
Caveolina<br />
Actina<br />
Troponina<br />
Tropomiosina<br />
Nebulina<br />
Banda Z<br />
α-actina<br />
Lamina A/C<br />
B T<br />
B T<br />
T B<br />
Núcleo<br />
Emerina<br />
Sarcolema
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Miofibrillas<br />
Mitocondrias<br />
Complejo<br />
Sarcoglicanos<br />
Distrofina<br />
Actina asociada<br />
al esqu<strong>el</strong>eto<br />
δ γ α β<br />
α B-cristalina<br />
Miotilina<br />
T<strong>el</strong>etonina<br />
lípidos<br />
β1 Laminina 2<br />
Glucógeno<br />
Desmina<br />
α 2<br />
α<br />
β<br />
γ 1<br />
sarcómero<br />
Complejo<br />
Distroglicano<br />
Miosina<br />
Titina<br />
Sarcoplasma<br />
Caveolina<br />
Actina<br />
Troponina<br />
Tropomiosina<br />
Nebulina<br />
Proteínas membrana:<br />
Patrón distrófico<br />
Banda Z<br />
α-actina<br />
Lamina A/C<br />
B T<br />
B T<br />
T B<br />
Núcleo<br />
Emerina<br />
Sarcolema
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Miofibrillas<br />
Mitocondrias<br />
MFM= miopatia miofibrilar<br />
Complejo<br />
Sarcoglicanos<br />
Distrofina<br />
Actina asociada<br />
al esqu<strong>el</strong>eto<br />
δ γ α β<br />
α B-cristalina<br />
Miotilina<br />
T<strong>el</strong>etonina<br />
lípidos<br />
β1 Laminina 2<br />
Glucógeno<br />
Desmina<br />
α 2<br />
α<br />
β<br />
γ 1<br />
sarcómero<br />
Proteínas<br />
<strong>de</strong> sostén:<br />
patrón MFM<br />
Complejo<br />
Distroglicano<br />
Miosina<br />
Titina<br />
Sarcoplasma<br />
Caveolina<br />
Actina<br />
Troponina<br />
Tropomiosina<br />
Nebulina<br />
Banda Z<br />
α-actina<br />
Lamina A/C<br />
B T<br />
B T<br />
T B<br />
Núcleo<br />
Emerina<br />
Sarcolema
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Miofibrillas<br />
Mitocondrias<br />
Fallo en <strong>el</strong><br />
metabolismo<br />
<strong>de</strong> la fibra:<br />
enfermeda<strong>de</strong>s<br />
metabólicas<br />
Complejo<br />
Sarcoglicanos<br />
Distrofina<br />
Actina asociada<br />
al esqu<strong>el</strong>eto<br />
δ γ α β<br />
α B-cristalina<br />
Miotilina<br />
T<strong>el</strong>etonina<br />
lípidos<br />
β1 Laminina 2<br />
Glucógeno<br />
Desmina<br />
α 2<br />
α<br />
β<br />
γ 1<br />
sarcómero<br />
Complejo<br />
Distroglicano<br />
Miosina<br />
Titina<br />
Sarcoplasma<br />
Caveolina<br />
Actina<br />
Troponina<br />
Tropomiosina<br />
Nebulina<br />
Banda Z<br />
α-actina<br />
Lamina A/C<br />
B T<br />
B T<br />
T B<br />
Núcleo<br />
Emerina<br />
Sarcolema
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Miofibrillas<br />
Mitocondrias<br />
Complejo<br />
Sarcoglicanos<br />
Distrofina<br />
Actina asociada<br />
al esqu<strong>el</strong>eto<br />
δ γ α β<br />
α B-cristalina<br />
Miotilina<br />
T<strong>el</strong>etonina<br />
lípidos<br />
β1 Laminina 2<br />
Glucógeno<br />
Desmina<br />
α 2<br />
α<br />
β<br />
γ 1<br />
sarcómero<br />
Complejo<br />
Distroglicano<br />
Miosina<br />
Titina<br />
Sarcoplasma<br />
Caveolina<br />
Actina<br />
Troponina<br />
Tropomiosina<br />
Nebulina<br />
Infiltrados<br />
Inflamatorios:<br />
miositis<br />
Banda Z<br />
α-actina<br />
Lamina A/C<br />
B T<br />
B T<br />
T B<br />
Núcleo<br />
Emerina<br />
Sarcolema
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Las enfermeda<strong>de</strong>s neuro<strong>musculares</strong><br />
- La mayoría son <strong>de</strong> carácter genético y generalmente hereditarias<br />
- Son enfermeda<strong>de</strong>s crónicas y progresivas<br />
- Afectan a la musculatura y al sistema nervioso periférico<br />
- Su aparición pue<strong>de</strong> producirse en <strong>el</strong> nacimiento o en otras etapas <strong>de</strong> la<br />
vida<br />
- Las características más importantes son la pérdida progresiva <strong>de</strong> fuerza<br />
muscular, y la <strong>de</strong>generación <strong>de</strong> los músculos y <strong>de</strong> los nervios periféricos
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Enfermeda<strong>de</strong>s neuro<strong>musculares</strong><br />
Motoneurona Periférica<br />
(Asta anterior <strong>de</strong> la<br />
médula espinal)<br />
Hereditarias:<br />
.-Amiotrófias espinales<br />
Adquiridas:<br />
.-Virales: poliomi<strong>el</strong>itis<br />
.-Degenerativas: Esclerosis<br />
lateral amiotrófica(ELA)<br />
Nervio periférico (fibra nerviosa) Unión<br />
Neuromuscular<br />
Neuropatías sensitivo-motora<br />
Hereditarias:<br />
.-Enfermedad Charcot-Marie-Tooth<br />
.-Leucodistrófias<br />
Adquiridas:<br />
.-Inflamatorias: S. Guillain Barré, polineuropatía<br />
<strong>de</strong>smi<strong>el</strong>inizante crónica inflamatoria (PCDI)<br />
.-Infecciosas<br />
.-Tóxicas<br />
.-Metabólicas (e.j. diabetes)<br />
Enfermeda<strong>de</strong>s<br />
<strong>de</strong> la unión<br />
neuromuscular<br />
Hereditarias:<br />
Síndromes<br />
miasténicos<br />
Congénitos<br />
Adquiridas:<br />
Miastenia gravis<br />
Fibra Muscular<br />
DISTROFIAS MUSCULARES CONGÉNITAS<br />
DISTROFIAS MUSCULARES<br />
GLUCOGENOSIS<br />
MITOCONDRIALES METABÓLICAS<br />
MIOPATÍAS LIPÍDICAS<br />
MIOSITIS<br />
MFM (Miopatia Miofibrilar)<br />
MIOPATÍAS CONGÉNITAS<br />
MIOPATÍAS DISTALES<br />
MIOTONÍAS CONGÉNITAS<br />
PARÁLISIS PERIÓDICA<br />
DISTROFIAS MIOTÓNICAS
BIOPSIA MUSCULAR Introducción<br />
Distrofias <strong>musculares</strong> I<br />
Distrofia muscular <strong>de</strong> Duchenne<br />
recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina)<br />
Distrofia muscular <strong>de</strong> Becker<br />
recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina)<br />
Distrofinopatías menores<br />
recesivas ligadas a X, Xp21,2(distrofina)<br />
Distrofia muscular con déficit <strong>de</strong> adhalina o<br />
<strong>de</strong> alfasarcoglicano (LGMD 2D)<br />
autosómica recesiva, 17q12-q21 (adhalina o<br />
alfasarcoglicano)<br />
Distrofia muscular con déficit en<br />
betasarcoglicano (LGMD 2E)<br />
autosómica recesiva, 4q12 (betasarcoglicano)<br />
Distrofia muscular con déficit en<br />
gammasarcoglicano (LGMD 2C)<br />
autosómica recesiva, 13q12 (gammasarcoglicano)<br />
Distrofia muscular con déficit en<br />
d<strong>el</strong>tasarcoglicano (LGMD 2F)<br />
autosómica recesiva, 5q33 (d<strong>el</strong>tasarcoglicano)<br />
Distrofia muscular <strong>de</strong> cinturas tipo “Erb”<br />
(LGMD 2A)<br />
autosómica recesiva, 15q15 (calpaina 3)<br />
Distrofias <strong>musculares</strong> <strong>de</strong> cinturas<br />
(LGMD 1A)<br />
autosómica dominante, 5q22-q34<br />
(LGMD 2B)<br />
autosómica recesiva, 2p13-p16<br />
Distrofia muscular facioescapulo-humeral<br />
(Miopatía <strong>de</strong> Landouzy-Déjérine)<br />
autosómica dominante, 4q35<br />
Distrofias <strong>musculares</strong> II<br />
Distrofia muscular <strong>de</strong> Emery-Dreifuss<br />
recesiva ligada a X, Xq28 (emerina)<br />
Miopatía <strong>de</strong> Bethlem<br />
autosómica dominante, 21q22,3 (sub-unida<strong>de</strong>s a1 y<br />
a2 d<strong>el</strong> colágeno VI) – 2q37<br />
Distrofia muscular congénita con déficit <strong>de</strong><br />
merosina<br />
autosómica recesiva, 6q22 – 23 (merosina)<br />
Distrofia muscular congénita <strong>de</strong> tipo<br />
Fukuyama<br />
autosómica recesiva, 9q31 – q32 (déficit parcial <strong>de</strong><br />
43 DAG y <strong>de</strong> merosina)<br />
Síndrome <strong>de</strong> Walker-Warburg<br />
autosómica recesiva<br />
Síndrome MEB (Músculo-Ojo-Cerebro o<br />
enfermedad <strong>de</strong> Santavuori)<br />
autosómic recesivo<br />
Distrofia muscular oculofaríngea<br />
autosómica dominante, 14q11.2q13<br />
Enfermeda<strong>de</strong>s <strong>musculares</strong><br />
inflamatorias<br />
Polimiositis<br />
adquiridas<br />
Dermatomiositis<br />
adquiridas<br />
Miositis por cuerpos <strong>de</strong> inclusión (IBM o<br />
inclusion body myositis)<br />
esporádica<br />
Miopatías metabólicas<br />
Miopatías mitocondriales<br />
transmisión materna, autosómica dominante,<br />
autosómica recesiva ligada a X, esporádica<br />
Lipidosis <strong>musculares</strong>:<br />
Miopatías con déficit <strong>de</strong> carnitina<br />
autosómica recesiva<br />
Miopatías con déficit <strong>de</strong> carnitina<br />
palmitiltransferasa <strong>de</strong> tipo II (CTP II)<br />
autosómica recesiva, 1p32<br />
(carnitina palmitiltransferasa)<br />
Lipidosis con déficit en acil CoA<br />
<strong>de</strong>shidrogenasa<br />
autosómica recesiva, 12q22-qter (acil CoA<br />
<strong>de</strong>shidrogenasa)<br />
Glucogenosis <strong>musculares</strong>:<br />
Enfermedad <strong>de</strong> McArdle<br />
autosómica recesiva, 11q13 (fosforilasa muscular)<br />
Enfermedad <strong>de</strong> Tauri<br />
autosómica recesiva, 12q13.3 (fosfofructoquinasa)<br />
Enfermedad <strong>de</strong> Pompe<br />
autosómica recesiva, 17q225 (maltasa ácida)<br />
Miopatias Miofibrilares (MFM)<br />
Desmina<br />
autosómica dominante 2q35<br />
Miotilina<br />
autosómica, dominante 5q31<br />
FLNC,<br />
autosómica dominante, 7q32.0<br />
Zasp<br />
autosómica dominante 10q22.3-23.2<br />
Alfa-B-cristalina<br />
autosómica dominante, 11q21-23
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Recepción <strong>de</strong> la biopsia muscular<br />
M.E.<br />
Estudio<br />
ultraestructural<br />
Historia clínica. Pruebas complementarias<br />
Biopsia muscular<br />
Cong<strong>el</strong>ación/OCT Reserva s/m<br />
Cortes criostato<br />
Estudio<br />
EHQ/HQ/IHQ<br />
Extracción <strong>de</strong><br />
proteínas<br />
western blotting<br />
DIAGNÓSTICO Consejo Genético<br />
Extracción ADN<br />
PCR<br />
Recepción<br />
Banco<br />
Tejidos<br />
Banco<br />
ADN
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Recepción <strong>de</strong> la biopsia muscular<br />
- Comprobación <strong>de</strong> datos d<strong>el</strong> paciente y número <strong>de</strong> registro<br />
- Se<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> diferentes fragmentos <strong>para</strong> sus diferentes <strong>estudio</strong>s:<br />
-OCT<br />
- Reserva sin montar <strong>para</strong> western blotting y/o ADN<br />
- PFA 4% (<strong>para</strong>formal<strong>de</strong>hído)<br />
- m.e. (microscopía <strong>el</strong>ectrónica)<br />
- Cong<strong>el</strong>ación <strong>de</strong> la biopsia muscular al corte transversal en isopentano<br />
enfriado en nitrógeno líquido y posterior montaje en OCT<br />
- Conservar la muestra a -80ºC<br />
- Cortes <strong>de</strong> criostato entre 6 y 8 μm. Montaje en portas pretratados<br />
Recepción
BIOPSIA MUSCULAR Recepción<br />
Recepción <strong>de</strong> la biopsia muscular<br />
Comprobarción <strong>de</strong> los datos y número<br />
<strong>de</strong> laboratorio<br />
Fibras sin orientar<br />
Orientar las fibras en la misma<br />
dirección<br />
S<strong>el</strong>eccionar los diferentes<br />
fragmentos<br />
Mantener <strong>el</strong> número asignado durante<br />
todo <strong>el</strong> proceso <strong>de</strong> cong<strong>el</strong>ación
BIOPSIA MUSCULAR Cong<strong>el</strong>ación<br />
Cong<strong>el</strong>ación <strong>de</strong> la biopsia muscular<br />
Diferentes pasos <strong>de</strong> la cong<strong>el</strong>ación <strong>de</strong> la muestra<br />
Cong<strong>el</strong>ación durante 10’’<br />
en metilbutano frio<br />
Inclusión en OCT con la<br />
orientación transversal al corte<br />
N 2<br />
Metilbutano<br />
Bloque<br />
<strong>de</strong> OCT<br />
Reserva<br />
sin montar
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Técnicas histológicas y EHQ <strong>de</strong> rutina en la biopsia muscular:<br />
-H-E (hematoxilina-eosina)<br />
-T. Gomori (Tricrómico <strong>de</strong> Gomori)<br />
-PAS, PAS+D (ácido periodico <strong>de</strong> Schiff, más diastasa)<br />
-NADH (nicotin-a<strong>de</strong>nina <strong>de</strong>shidrogenasa)<br />
-ATPasas (ATPasas miosínicas)<br />
-COX (citocromo oxidasa)<br />
-SDH (succinato <strong>de</strong>shidrogenasa)<br />
-Fosforilasa<br />
-Fosfofructocinasa<br />
-oil red/sudán negro<br />
Tinciones
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Hematoxilina-eosina<br />
(Tinción topográfica <strong>de</strong> rutina)<br />
Hematoxilina <strong>de</strong> Harris: Colorante natural (haematoxylon campechianum):<br />
- oxidación<br />
- mordiente (alumbre)<br />
Vacuolas festoneadas<br />
- progresiva/regresiva<br />
- diferenciación/viraje<br />
Eosina: Colorante artificial <strong>de</strong>rivado d<strong>el</strong> xanteno<br />
-regresiva<br />
-diferenciación<br />
Valoración:<br />
Forma y tamaño <strong>de</strong> las fibras,<br />
necrosis, atrofias, hipertrofias,<br />
inclusiones citoplasmáticas,<br />
infiltrados inflamatorios.<br />
Diferentes tamaños <strong>de</strong> fibras<br />
Músculo normal
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Tricrómico <strong>de</strong> Gomori (TG)<br />
Músculo normal<br />
(Técnica estructural)<br />
Tinción nuclear con Hx <strong>de</strong> Harris/Weigert<br />
Mezcla <strong>de</strong> colorantes citoplasmáticos:<br />
- Cromotopo 2R<br />
- Fast green<br />
- ácido fosfostúngstico<br />
Inclusiones citoplasmáticas<br />
Bastones Nemalínicos<br />
Bastones Nemalínicos<br />
Ragged-red<br />
Vacuolas rimmed<br />
Valoración:<br />
Las mitocondrias, las fibras “ragged-red” (rojo-rasgadas), las vacuolas “rimmed”<br />
(festoneadas), los cuerpos nemalínicos, la mi<strong>el</strong>ina y los nervios se tiñen <strong>de</strong> rojo. Resto d<strong>el</strong><br />
citoplasma <strong>de</strong> color ver<strong>de</strong> oscuro; los núcleos <strong>de</strong> color lila/negro.
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Oil red O/ sudán negro (Tinción <strong>de</strong> lípidos)<br />
- Colorante Oil Red O o Sudan negro a<br />
saturación en solución alcohólica.<br />
- Capacidad <strong>de</strong> tinción por “comodidad”<br />
d<strong>el</strong> colorante.<br />
- Contraste nuclear con H. <strong>de</strong> Harris<br />
Valoración:<br />
Las vacuolas lipídicas y los lípidos neutros se tiñen <strong>de</strong><br />
rojo o <strong>de</strong> negro <strong>de</strong>pendiendo d<strong>el</strong> colorante (Oil Red O o<br />
sudán negro)<br />
Oil Red Con contraste nuclear<br />
Sudan Black
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
PAS y PAS + diastasa (Técnica histoquímica)<br />
Oxidación <strong>de</strong> los grupos hidroxilo d<strong>el</strong> glucógeno con ácido periódico<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
CH 2<br />
OH<br />
OH<br />
Valoración:<br />
Núcleos lilas y <strong>de</strong>pósitos <strong>de</strong> glucógeno<br />
fucsia.<br />
PAS+diastasa: diferencia glucógeno vs<br />
mucinas: <strong>el</strong> glucogeno se va<br />
OH<br />
CH2 OH CH2 OH<br />
O O O O<br />
O<br />
CH 2<br />
H H OH H<br />
H<br />
OH<br />
OH<br />
H<br />
O<br />
C<br />
H O<br />
O<br />
C H<br />
O<br />
C<br />
HO<br />
CH 2<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
C<br />
C H
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ (ATPasas miosínicas, NADH, COX, SDH, fosforilasa, fosfofructocinasa)<br />
Técnicas que ponen <strong>de</strong> manifiesto si existe la actividad d<strong>el</strong> enzima en <strong>estudio</strong><br />
S<br />
E= Enzima<br />
S= sustrato<br />
P= Producto<br />
MO= Microscópio óptico<br />
EHQ= enzimohistoquímica<br />
E<br />
Solución tamponada<br />
pH<br />
Sustrato<br />
Capturdor <strong>de</strong> color<br />
P<br />
Capturador<br />
<strong>de</strong> color<br />
Producto<br />
Visible al<br />
MO
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ: ATPasa miosínica<br />
- Sustrato: A<strong>de</strong>nosina-trifosfato<br />
- Acetato sódico/ácido acético; veronal/cloruro cálcico<br />
- Incubación a 3 pH diferentes<br />
- El capturador <strong>de</strong> color es cloruro <strong>de</strong> cobalto y sulfuro <strong>de</strong> amonio<br />
ATP=ADP+P<br />
P+ClCo=Co3(PO4)2<br />
Co3(PO4)2+(NH4)2S =CoS<br />
Tipo I rojas, lentas, +++ mitocondrias+++actividad oxidativa<br />
Tipo II blancas, rápidas, +++ glucógeno<br />
Valoración:<br />
pH 4.35 fibras tipo I, IIc<br />
pH 4.63 fibras tipo I, IIb, IIc<br />
pH 9.4 fibras tipo II<br />
pH4.35<br />
pH 4.63<br />
pH 9.4
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ: NADH (NAD Diaforasa)<br />
- Sustrato: Nicotinamida-a<strong>de</strong>nina-dinucleótido<br />
- Capturador <strong>de</strong> color: NBT (cromógeno)<br />
- Solución tampón: Tris<br />
-pH7.4<br />
NADH=NAD+H H + NBT = NBT -<br />
Targets: fibras en diana Lesión tipo core<br />
Central core<br />
Membrana<br />
interna<br />
Citoplasma<br />
Membrana Externa<br />
NADH +<br />
Espacio intermembrana<br />
Normal<br />
C-I C-II C-III C-IV<br />
Succinato<br />
NAD Fumarato<br />
Refuerzo<br />
subsarcolémico<br />
Fosforilación Oxidativa<br />
Transporte <strong>de</strong> Electrones<br />
Normal<br />
Cit C<br />
½O 2<br />
H 2O 2<br />
Valoración:<br />
Actividad mitocondrial lila.<br />
Complejo I <strong>de</strong> la respiración<br />
mitocondrial. Diferenciación<br />
<strong>de</strong> tipos <strong>de</strong> fibras.
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ: COX (citocromo oxidasa)<br />
- Sustrato: Citocromo C + catalasa<br />
- Capturador <strong>de</strong> color: DAB (cromógeno reducido)<br />
- Solución tampón: tampón fosfato<br />
-pH7.4<br />
Valoración:<br />
Actividad mitocondrial marrón pardo.<br />
complejo IV <strong>de</strong> la respiración mitocondrial<br />
diferenciación <strong>de</strong> tipos <strong>de</strong> fibras<br />
Membrana<br />
interna<br />
Actividad COX -<br />
Citoplasma<br />
Membrana Externa<br />
NADH +<br />
Espacio intermembrana<br />
Normal COX<br />
C-I C-II C-III C-IV<br />
Succinato<br />
NAD Fumarato<br />
Fosforilación Oxidativa<br />
Transporte <strong>de</strong> Electrones<br />
COX<br />
Cit C<br />
½O 2<br />
H 2O 2
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ: SDH (succinato <strong>de</strong>shidrogenasa)<br />
- Sustrato: Succinato sódico<br />
- Capturador <strong>de</strong> color: NBT (nitroblue tetrazolium)<br />
- Solución tampón: tampón fosfato<br />
-pH7.4<br />
SucNa = sucNa+H<br />
H + NBT = NBT -<br />
Valoración:<br />
Actividad mitocondrial lila<br />
Complejo II <strong>de</strong> la<br />
Respiración mitocondrial<br />
Diferenciación <strong>de</strong> tipos<br />
<strong>de</strong> fibras<br />
Refuerzo SDH<br />
Fibras “ragged-blue”<br />
Normal<br />
Membrana<br />
interna<br />
Citoplasma<br />
Membrana Externa<br />
NADH +<br />
Espacio intermembrana<br />
Normal<br />
C-I C-II C-III C-IV<br />
Succinato<br />
NAD<br />
Fumarato<br />
Normal<br />
Fosforilación Oxidativa<br />
Transporte <strong>de</strong> Electrones<br />
Normal<br />
Cit C<br />
½O 2<br />
H 2O 2
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ: fosforilasa<br />
- Sustrato: AMP, glucógeno, glucosa 1-fosfato<br />
- Capturador <strong>de</strong> color: Lugol<br />
- Solución tampón: tampón acetato sódico/<br />
ácido acético<br />
-pH 5.6<br />
La fosforilasa, activada por <strong>el</strong> AMP, actúa<br />
sobre la glucosa 1-fosfato en presencia <strong>de</strong><br />
glucógeno formando un polisacárido.<br />
El polisacárido formado reacciona con <strong>el</strong> lugol<br />
Valoración:<br />
Actividad fosforilasa lila<br />
Diferenciación <strong>de</strong> tipos <strong>de</strong> fibras<br />
NADPH<br />
Ribulosa-5-fosfato<br />
Ribosa-5-fosfato<br />
NADPH<br />
Ruta <strong>de</strong><br />
las pentosas<br />
Glucógeno<br />
ATP<br />
AMP<br />
Glucogenolisis<br />
Glucosa-6-fosfato<br />
Fructosa-6-fosfato<br />
ATP<br />
Fructosa-1,6-bifosfato<br />
2-NADH<br />
2-ATP<br />
2-ATP<br />
Ac. Pivúrico<br />
Glucolisis
BIOPSIA MUSCULAR Tinciones<br />
Técnicas EHQ: fosfofructocinasa<br />
- Sustrato:Arsenato sódico<br />
ATP<br />
B-nicotinamida a<strong>de</strong>nina dinucleótico (B-NAD)<br />
- Capturador <strong>de</strong> color: NBT<br />
- 2 Soluciones incubación: fructosa 1,6 difosfato pH 8.6<br />
fructosa 6 fosfato<br />
sulfato <strong>de</strong> magnesio pH 7<br />
Valoración:<br />
Actividad fosfofructocinasa lila<br />
Diferenciación tipos <strong>de</strong> fibras<br />
Fosk 6<br />
NADPH<br />
Ribulosa-5-fosfato<br />
NADPH<br />
Ribosa-5-fosfato<br />
Ruta <strong>de</strong><br />
las pentosas<br />
Fosk 1-6<br />
Glucógeno<br />
ATP<br />
AMP<br />
Glucogenolisis<br />
Glucosa-6-fosfato<br />
Fructosa-6-fosfato<br />
ATP<br />
Fructosa-1,6-bifosfato<br />
2-NADH<br />
2-ATP<br />
2-ATP<br />
Ac. Pivúrico<br />
Glucolisis
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Resultados<br />
Técnicas histológicas y EHQ <strong>de</strong> rutina en la biopsia muscular: utilidad en las<br />
diferentes patologías<br />
MFM= miopatia miofibrilar<br />
-H-E (Hematoxilina-eosina)<br />
-T. Gomori (Tricrómico <strong>de</strong> Gomori)<br />
-PAS, PAS + D<br />
-NADH<br />
-ATPasas<br />
-COX (citocromo oxidasa)<br />
-SDH (succinato <strong>de</strong>shidrogenasa)<br />
-fosforilasa<br />
-fosfofructoquinasa<br />
-oil red/sudán negro<br />
7<br />
Patrón distrófico<br />
6<br />
1<br />
2<br />
Patrón MFM<br />
4<br />
Denervación<br />
Glucogenosis<br />
3<br />
Mitocondrial<br />
Miopatías lipídicas<br />
5<br />
Patrón inflamatorio:<br />
Miopatías inflamatorias
BIOPSIA MUSCULAR<br />
1. Denervación<br />
H-E Gomori<br />
NADH: targets (fibras en diana) ATPasa 4.35: agrupación por tipos<br />
Resultados<br />
ATPasa 4.35 músculo normal
BIOPSIA MUSCULAR Resultados<br />
2. Glucogenosis IV: McArdle<br />
H-E<br />
Vacuolas subsarcolémicas<br />
PAS NADH<br />
Depósito <strong>de</strong> glucógeno<br />
subsarcolémico<br />
Fosforilasa<br />
Negativa<br />
Vacuolas subsarcolémicas<br />
Control<br />
Fosforilasa<br />
m.e.: Depósito <strong>de</strong> glucógeno subsarcolémico<br />
NADPH<br />
Ribulosa-5-fosfato<br />
NADPH<br />
Ribosa-5-fosfato<br />
Ruta <strong>de</strong><br />
las pentosas<br />
Glucógeno<br />
ATP<br />
Glucosa-6-fosfato<br />
Fructosa-6-fosfato<br />
ATP<br />
Fructosa-1,6-bifosfato<br />
2-NADH<br />
2-ATP<br />
2-ATP<br />
Ac. Pivúrico<br />
AMP<br />
Glucogenolisis<br />
Glucolisis
BIOPSIA MUSCULAR Resultados<br />
3. Miopatía mitocondrial<br />
H-E TG/ Ragged Red<br />
m.e.: megamitocondrias con inclusiones<br />
Refuerzo SDH Actividad COX-<br />
Refuerzo<br />
NADH<br />
Membrana<br />
interna<br />
Citoplasma<br />
Membrana Externa<br />
NADH +<br />
Espacio intermembrana<br />
Normal<br />
C-I C-II C-III C-IV<br />
Succinato<br />
NAD Fumarato<br />
Fosforilación Oxidativa<br />
Transporte <strong>de</strong> Electrones<br />
Cit C<br />
½O 2<br />
H 2O 2
BIOPSIA MUSCULAR<br />
4. Miopatías lipídicas<br />
H&E NADH<br />
Sudan<br />
black<br />
Oil Red O<br />
m.e.<br />
Resultados
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Técnicas histológicas y EHQ <strong>de</strong> rutina en la biopsia muscular<br />
MFM= miopatia miofibrilar<br />
DM= Dermatomiositis<br />
IBM= Inclusión Body Miositis<br />
-H-E (Hematoxilina-eosina)<br />
-T. Gomori (Tricrómico <strong>de</strong> Gomori)<br />
-PAS, PAS + D<br />
-NADH<br />
-ATPasas (Atpasa miosínicas)<br />
-COX (citocromo oxidasa)<br />
-SDH (succinato <strong>de</strong>shidrogenasa)<br />
-fosforilasa<br />
-fosfofructoquinasa<br />
-oil red/sudan Black<br />
7<br />
Patrón Distrófico<br />
6<br />
Patrón MFM<br />
5<br />
Técnicas <strong>de</strong> IEHQ<br />
Patrón inflamatorio<br />
Miopatías inflamatorias<br />
Resultados
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Técnicas IEHQ en la biopsia muscular:<br />
Técnica Strep-ABC<br />
- Fijación con acetona-metanol<br />
- Bloqueo <strong>de</strong> la peroxidasa endógena<br />
-Bloqueos <strong>de</strong> las uniones inespecíficas con<br />
suero normal<br />
- Incubación en primario especifico<br />
- Incubación en secundario biotinilado<br />
- Incubación Strep-ABC<br />
- Rev<strong>el</strong>ado con diaminobencidina: DAB<br />
IEHQ= inmunoenzimohistoquímica<br />
H 2 O 2 +DAB - = DAB + =COLOR<br />
Anti-human ma<strong>de</strong> in mouse<br />
anti-mouse ma<strong>de</strong> in goat<br />
biotilinado<br />
IEHQ
BIOPSIA MUSCULAR IF<br />
Técnicas inmunofluorescencia<br />
- Fijación con acetona-metanol<br />
- Bloqueos <strong>de</strong> las uniones inespecíficas<br />
con suero bovino fetal 10%<br />
- Incubación en anticuerpo primario especifico<br />
- Incubación en secundario marcado con fluorocromo<br />
IF= inmunofluorescencia<br />
<strong>de</strong>smina miotilina<br />
anti-humano hecho en ratón<br />
anti-ratón hecho en cabra<br />
conjugado con fluorocromo
BIOPSIA MUSCULAR IF Confocal<br />
Técnicas IF confocal<br />
-Fijación con acetonametanol<br />
- Bloqueos <strong>de</strong> las uniones<br />
inespecíficas con SBF10%<br />
- Incubación con 2 primarios específicos<br />
- Incubación con 2 secundarios marcado con fluorocromos<br />
<strong>de</strong> diferentes longitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong> ondas <strong>de</strong> emisión<br />
- Análisis con microscopio confocal<br />
Anti-human ma<strong>de</strong> in rabbit<br />
anti-rabbit ma<strong>de</strong> in goat<br />
conjugado con<br />
fluorocromo Y<br />
<strong>de</strong>smina miotilina merge<br />
anti-mouse ma<strong>de</strong> in<br />
goat conjugado con<br />
fluorocromo X<br />
Anti-human ma<strong>de</strong> in mouse
BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado<br />
7<br />
MFM= miopatia miofibrilar<br />
DM= Dermatomiositis<br />
IBM= Inclusión Body Miositis<br />
Marcadores<br />
Distrofias:<br />
Dys 1, Dys 2, Dys 3<br />
utrofina: DRP1, DRP2<br />
α-sarcoglicano<br />
β-sarcoglicano<br />
δ-sarcoglicano<br />
γ-sarcoglicano<br />
β-distroglicano<br />
emerina<br />
merosina (laminina alfa-2)<br />
laminina β1<br />
disferlina<br />
caveolina<br />
Patrón distrófico<br />
6<br />
Western-Blot<br />
Marcadores MFM:<br />
miotilina<br />
<strong>de</strong>smina<br />
ubiquitina<br />
αB-cristalina<br />
filamina C<br />
Dys1<br />
g<strong>el</strong>solina<br />
Patrón MFM<br />
5<br />
Diagnóstico<br />
Marcadores linfocitarios:<br />
CD4, CD8, MHC clase I<br />
Patrón inflamatorio:<br />
miopatías inflamatorias
BIOPSIA MUSCULAR<br />
5. Miopatías Inflamatorias: <strong>de</strong>rmatomiositis, polimiositis<br />
Dermatomiositis<br />
Polimiositis MHC clase I Control -<br />
DM= Dermatomiositis<br />
IBM_ Inclusión Body Miositis<br />
Dermatomiositis<br />
IEHQ Resultado<br />
Polimiositis<br />
Polimiositis: atrofia perifascicular
BIOPSIA MUSCULAR<br />
6. Miopatía miofibrilar (MFM)<br />
m.e. <strong>de</strong>sminopatía<br />
H-E Gomori<br />
IEHQ Resultado<br />
<strong>de</strong>smina<br />
αB-cristalina miotilina ubiquitina<br />
C-filamina miotilina<br />
BF-10
BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado<br />
7. Patrón distrófico<br />
H-E<br />
Gomori<br />
ATPasa 4.35<br />
COX<br />
NADH<br />
PAS
BIOPSIA MUSCULAR<br />
7. Patrón distrófico<br />
DMB= Distrofia Muscular <strong>de</strong> Becker<br />
Dys1<br />
Dys2<br />
Dys3<br />
DMB<br />
Dys1<br />
Dys2<br />
Dys3<br />
Control<br />
IEHQ Resultado<br />
Distrofinas
BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado<br />
7. Patrón distrófico<br />
DMB Control DMB<br />
Control<br />
α α<br />
β β<br />
DMB= Distrofia Muscular <strong>de</strong> Becker<br />
δ<br />
γ<br />
Sarcoglicanos<br />
δ<br />
γ
BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado<br />
Marcadores<br />
Distrofias:<br />
Dys 1, Dys 2, Dys 3<br />
utrofina: DRP1, DRP2<br />
α-sarcoglicano<br />
β-sarcoglicano<br />
δ-sarcoglicano<br />
Γ-sarcoglicano<br />
β-distroglicano<br />
emerina<br />
merosina (laminina alfa-2)<br />
laminina beta 1<br />
disferlina<br />
caveolina<br />
7<br />
Patrón distrófico<br />
6<br />
western-blotting<br />
Marcadores MFM:<br />
Miotilina<br />
Desmina<br />
ubiquitina<br />
Alfa-Bcristalina<br />
Filamina C<br />
Dys1<br />
G<strong>el</strong>solina<br />
Patrón MFM<br />
5<br />
Diagnóstico<br />
Marcadores linfocitarios:<br />
CD4, CD8, MHC clase I<br />
Patrón inflamatorio<br />
Miopatías inflamatorias:<br />
DM, IBM, Polimiositis
BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot<br />
Técnica <strong>de</strong> western blotting<br />
1.-Extracción <strong>de</strong> proteínas<br />
(<strong>de</strong>snaturalización-estructura primaria)<br />
2.-SDS-PAGE ±% acrilamida<br />
+ Marcador con p.m. conocidos + <strong>el</strong>ectroforesis<br />
3.-Blotting + IEHQ<br />
4.- Rev<strong>el</strong>ado en un film<br />
1 2 3<br />
+<br />
PM= pesos moleculares<br />
SDS-PAGE=sodium do<strong>de</strong>cil sulfate polyacrilami<strong>de</strong> g<strong>el</strong><br />
-<br />
4<br />
quimioluminiscencia
BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot<br />
Técnica <strong>de</strong> WB en la biopsia muscular<br />
Mini-protean III. Electroforesis SDS-PAGE<br />
G<strong>el</strong>es teñidos con coomassie
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Técnica <strong>de</strong> western blotting<br />
Semy-dry<br />
Western-Blot<br />
Ponceau, tinción inespecífica <strong>de</strong> proteínas en<br />
las membranas <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la transferencia
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Técnica <strong>de</strong> western blotting en la biopsia muscular<br />
Cámaras <strong>de</strong> incubación <strong>para</strong> los anticuerpos<br />
Western-Blot<br />
Rev<strong>el</strong>ado en cámara oscura con luz <strong>de</strong> seguridad
BIOPSIA MUSCULAR<br />
Técnica <strong>de</strong> western blotting<br />
Western-Blot<br />
Diferentes exposiciones en dos films
BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot: resultado<br />
Técnica <strong>de</strong> western blotting: Distrofia <strong>de</strong> Becker<br />
Fig.1<br />
Fig.2<br />
400 kDa<br />
Coomassie<br />
Dys1 Dys2 Dys3 α β δ γ<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14<br />
Fig. 1 Extractos <strong>de</strong> proteínas <strong>de</strong> un músculo sano control (carril 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) y <strong>el</strong> probando (carril 2, 4, 6,<br />
8, 10, 12, 14) don<strong>de</strong> se observa una disminución en la inmunotinción <strong>de</strong> todas las proteínas y un ligero cambio<br />
<strong>de</strong> peso molecular en la Dys 1( patrón típico <strong>de</strong> la distrofia <strong>de</strong> Becker)<br />
Fig. 2 Control <strong>de</strong> carga teñido con coomassie<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Control<br />
Probando<br />
Dys 1 Dys2 Dys3 Alfa Beta D<strong>el</strong>ta Gamma<br />
50 kDa<br />
35 kDa<br />
200 kDa
BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot: resultado<br />
Técnica <strong>de</strong> western blotting<br />
Miosina<br />
Coomassie<br />
t<strong>el</strong>etonina<br />
1 2 3<br />
control probando control<br />
19 kDa<br />
Miosina<br />
Coomassie<br />
disferlina<br />
1 2 3<br />
control probando control<br />
210 kDa<br />
Carril 1 y 3: control <strong>de</strong> músculo sano. Carril 2: probando.<br />
Se aprecia la ausencia <strong>de</strong> t<strong>el</strong>etonina en una distrofia muscular autosómica recesiva tipo 2G<br />
causada por mutación en <strong>el</strong> gen <strong>de</strong> la t<strong>el</strong>etonina, y <strong>de</strong> disferlina en una disferlinopatía
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