Caracterización y respuesta biológica de nanoceramicas de óxido ...

Superficies y Vacío 23(S) 27-30, agosto de 2010
©Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales
Caracterización y respuesta biológica de nanoceramicas de óxido de circonio sintetizado
por el método de rocío pirolítico ultrasónico
Janeth Serrano Bello, Javier de la Fuente Hernández, Marco Antonio Álvarez-Pérez *
Laboratorio de Bioingeniería Celular, Facultad de Odontología, UNAM
Coyoacán 04510, México, D.F.
Manuel García-Hipólito, Carlos Hernández-Pérez, Alejandro Arellano-Riasgo,
Julio Alberto Juárez-Islas, Octavio Álvarez-Fregoso
Instituto de Investigaciones en Materiales, UNAM
Coyoacán 04510, México, D.F.
José Luis Suárez-Franco
Facultad de Odontología Río Blanco, Universidad Veracruzana
C.P. 94730, Río Blanco Veracruz.
(Recibido: 18 de febrero de 2010; Aceptado: 04 de mayo de 2010)
Películas delgadas de ZrO 2 fueron sintetizadas en función de la temperatura de substrato, por la técnica de rocío
ultrasónico para determinar su biocompatibilidad celular in Vitro. La estructura cristalina del ZrO 2 depende de la
temperatura de substrato y los patrones de difracción de rayos X indican que a bajas temperaturas < 400°C, su estructura
es de carácter amorfo mientras que a mayores temperaturas, su estructura es tetragonal con una dirección preferencial de
crecimiento (101). Para determinar la biocompatibilidad celular de estas cerámicas se hicieron pruebas de adhesión celular
sobre la superficie del ZrO 2 , así como, pruebas de citotóxicidad celular. Los resultados indican que las células presentan
una adhesividad mayor al 100% respecto a la adhesividad celular de la superficie de vidrio corning 7059 utilizado como
referencia patrón. Por otro lado, no se detecto ningún efecto citotóxico de las cerámicas de ZrO 2 sobre las células
osteoblásticas, en consecuencia se determinó que el ZrO 2 es un buen candidato para usarse como biomaterial en diversos
aspectos dentales.
Palabras clave: Rocío pirolítico ultrasónico; ZrO 2 ; Biocompatibilidad celular
ZrO2 thin films were synthesized by ultrasonic spray pyrolysis process as a function of deposition temperature for study
their cellular biocompatibility in vitro. The crystal structure of ZrO2 films are dependent of temperature of deposition
process and X-ray diffraction studies showed that a low temperature < 400°C the films have poor cristallinity, but for
higher temperatures of deposition, the patterns indicate a tetragonal crystalline structure with a preferential orientation of
growth (1 0 1). For biocompatibility studies of these films we evaluated the cellular adhesion process and cytotoxicity
assays over the surface of ZrO2 thin films. The results indicate that cells showed a good adhesion respond enhanced over
100 % with respect to control corning glass 7059. The cytotoxicity assay showed no effects of the surface ZrO2 ceramics
over the cellular behavior of the osteoblastic cells; in addition ZrO2 thin films can be used as good candidate as
biomaterial coating on diverse dental and orthopedic applications.
Key words: Ultrasonic spray pirolysis; ZrO 2 ; Biocompatibility
1. Introducción
El incremento en la demanda de prótesis ortopédicas y
dentales en los últimos años ha estimulado la investigación
de nuevas técnicas de recubrimiento y depósito para
modificar la superficie del implante y así otorgarle nuevas
propiedades fisicoquímicas, de protección a la
degradación, a la corrosión y al control de la fricción en las
interfaces de interacción celular, incrementando la
respuesta biológica y de integración del tejido con la
superficie del implante [1-3]. Esto ha dado lugar a la
aparición de múltiples técnicas de depósito desarrolladas en
función de las propiedades específicas que se espera de los
recubrimientos a base de materiales cerámicos [4, 5]. La
técnica de rocío pirolítico ultrasónico es una técnica de
bajo costo que permite la obtención de películas delgadas
* marcoalv@servidor.unam.mx
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en rangos nanométricos con buenas propiedades físicas con
una alta velocidad de depósito, con mayor control y calidad
sobre grandes áreas superficiales en un corto periodo de
tiempo [6]. Esta técnica ha sido empleada en el depósito de
diversas películas delgadas tales como Al 2 O 3 , ZnAl 2 O 4 ,
ZrO 2 y HfO 2 [7-10]. De entre las anteriores películas
delgadas la que mayor aplicación presenta en el área de
ingeniería de tejidos óseos es la referente a la del oxido de
circonio (ZrO 2 ). Esto es debido a que el oxido de circonio
es ampliamente utilizado para el diseño y recubrimientos
de materiales de implante por sus excelentes propiedades
fisicoquímicas, tales como una alta estabilidad química,
baja conductividad iónica y térmica, su alta resistencia
mecánica, su alta resistencia a la fractura y por
considerarse bioinerte y biocompatible [11]. Por otro lado,
el ZrO 2 exhibe excelentes propiedades ópticas,

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XRD intensidad (u. a.)
300
250
200
150
100
500 °C
ZrO 2
(101)
(002)
Fase tetragonal
(112)
(103)
(202)
50
450 °C
400 °C
350 °C
0
10 20 30 40 50 60 70
2θ (grados)
Figura 1. Difractograma de Rayos X de la cerámica de óxido de
circonio depositada a diferentes Ts: 350, 400, 450 y 500°C.
Figura 2. Imagen de microscopia electrónica de barrido de la
morfología superficial de la cerámica de óxido de circonio depositada
en función de la Ts: 350 (a), 400 (b), 450 (c) y 500 (d). En la imagen se
aprecia la distribución de la morfología de aglomerados superficiales y
de las nanofibras porosas interconectadas. Barra = 10 µm.
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fotoluminiscentes, eléctricas, químicas y posee un amplio
rango de aplicaciones catalíticas y como biomaterial. Por
esta última razón, el interés de este trabajo radica en
caracterizar la morfología superficial y la composición
química de la película delgada de oxido de circonio
depositada por el método de rocío pirolítico ultrasónico y
evaluar el efecto en la biocompatibilidad celular de la
nanotopografía de las cerámicas de ZrO 2 en cultivos
celulares in vitro.
2. Procedimiento Experimental
2.1. Depósito y Caracterización de las Cerámicas
Nanoestructuradas
El proceso de elaboración de las cerámicas en película
delgada, se llevó a cabo por la técnica de rocío pirolítico
ultrasónico, utilizando como precursor Oxicloruro de
Circonio Octa-hidratado a una concentración de 0.05 M
disuelto en agua de-ionizada (ZrOCl 2 · 8H 2 O, Aldrich
Chemical Co.). Para el depósito de las películas de ZrO 2 se
utilizaron sustratos de vidrio de 1.5 cm 2 (Corning glass
7059), y se controló su temperatura (Ts) de 350ºC hasta
500°C. Esta técnica consiste en la generación de un fino
vapor desde la solución precursora por medio de un
generador ultrasónico que trabaja a 800 kHz,. El vapor es
dirigido a través de un tubo que contiene aire filtrado como
portador a una velocidad de flujo de 10L min -1 ; a la
superficie del sustrato caliente localizado sobre una base de
estaño fundido que es en donde se lleva a cabo la reacción
química depositando la película.
La estructura cristalina de las cerámicas fue analizada
por medio de difracción de Rayos X (XRD), utilizando el
equipo Siemens D-5000 con una longitud de onda de
radiación de 1.5406 Å (Cu k α ). Para caracterizar la
morfología superficial de las cerámicas se utilizó la técnica
de microscopia electrónica de barrido por medio del
microscopio SEM: Leica-Cambridge 440. Por último, para
caracterizar la composición química de las cerámicas se
usó la técnica de dispersión de energía (EDS) por medio
del microscopio SEM acoplado con el detector Pentafet
con microsonda marca Oxford.
Los sustratos cerámicos de ZrO 2 y los sustratos control
(vidrio) utilizados en los estudios de la respuesta biológica,
fueron sometidos a luz ultravioleta durante 24 horas, para
garantizar su esterilidad y evitar contaminaciones con
microorganismos como bacterias y hongos.
2.2. Ensayo de Biocompatibilidad celular
Figura 3. Adhesión celular de las células osteoblásticas en las
superficies de oxido de circonio a una Ts = 500°C después de un
periodo de incubación de 6 y 12 h.
Para establecer el efecto de la topografía de las cerámicas
depositadas a una Ts = 500°C sobre la biocompatibilidad
celular, se utilizaron células osteoblásticas, las cuales se
mantuvieron en un medio de cultivo Mínimo Esencial de
Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM) suplementado
con 10% de suero fetal bovino (SFB) y una solución de
antibióticos (penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100
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cultivo se le adiciona una solución con 0.04 M de ácido
clorhídrico (HCl) en isopropanol y la placa se lleva a un
lector de ELISA, para obtenerse la densidad óptica a una
longitud de onda de 570 nm.
3. Resultados y Discusión
Figura 4. Grafica de viabilidad celular de las células osteoblásticas en
las superficies de oxido de circonio a una Ts = 500°C después de un
periodo de incubación de 1, 3, 5 y 7 días.
μg/ml). La biocompatibilidad celular fue evaluada
analizando dos procesos importantes: 1) la adhesión y 2) la
viabilidad de los osteoblastos relacionada a la toxicidad del
material. Para la respuesta de adhesión celular; los
osteoblastos fueron cultivados a una densidad de 1x10 3
células/mL sobre las cerámicas de ZrO 2 a un tiempo de
cultivo de 6 y 12 horas. Pasado este tiempo, los sustratos
fueron lavados con buffer de fosfatos (PBS) para retirar las
células que no se adhirieron a las superficies.
Posteriormente las células adheridas se fijaron con 4% de
paraformaldehído por 5 minutos e incubadas con 0.1% de
toluidina por 4 horas. Para remover el colorante no
específico se realizaron 3 lavados con PBS y
posteriormente el colorante fue extraído con 500μL de
dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1%. De la solución
obtenida se tomaron 100μL que se colocaron en un pozo de
una placa de 96 pozos para obtener su absorbancia a una
longitud de onda de 605 nm. Los valores de la absorbancia
obtenidos fueron utilizados para obtener el porcentaje de
células adheridas a las cerámicas de ZrO 2 . Los cultivos
controles fueron las células sembradas sobre sustratos de
vidrio. Los experimentos de adhesión celular se realizaron
por triplicado.
Para evaluar el efecto de la topografía de las cerámicas
de ZrO 2 depositadas a una Ts = 350°C en la viabilidad
celular se llevo a cabo el ensayo de azul de triazol (MTT)
basado en la habilidad de la enzima deshidrogenada
mitocondrial para oxidar una sal de tetrazolio (3-[4,5-
dimetiltiazol-2-y]-2-5 bromuro difeniltetrazolio) a un
producto insoluble de color azul. La generación del
producto azul es directamente proporcional a la actividad
oxidativa de la enzima deshidrogenasa; por ello, una
disminución en los valores de absorbancia a 570 nm nos
indicará una medida de la viabilidad celular que puede ser
relacionada a la toxicidad del material.
Las células osteoblásticas se sembraron a una densidad
de 2x10 4 por triplicado por 1, 3, 5 y 7 días de cultivo sobre
las superficies de las cerámicas de ZrO 2 . Después de cada
periodo experimental, las células fueron incubadas con una
solución de MTT (120 mg/ml) a 37°C por 4 horas. Pasado
este tiempo, el sobrenadante es removido y a cada pozo de
Los patrones de difracción de rayos X (XRD) de las
muestras depositadas a Ts de 350 hasta 500°C; indican que
a temperaturas por debajo de

Tabla-1. Superficies Contenido y Vacío de 23(S) porcentaje 27-30, agosto atómico de de 2010 oxígeno, circonio y cloro de las ©Sociedad cerámicas Mexicana depositada de por Ciencia rocío pirolítico y Tecnología ultrasónico de Superficies dependiente y Materiales de la
temperatura de depósito analizadas por EDS.
superficie morfológicamente obtenida debido a una alta
porosidad y una excelente interconexión de fibras
superficiales- afecta la respuesta celular de los
osteoblastos, utilizando el sistema de cultivo celular in
vitro.
En la grafica de la Figura 3 se muestra la evaluación de
la adhesión de los osteoblastos después de un periodo de
incubación de 6 y 12 h. Los resultados se presentan como
porcentajes de células adheridas a la superficie de la
cerámica de ZrO 2 en relación al cultivo control que son las
células osteoblásticas adheridas a la superficie de vidrio
Corning 7059. La adhesión de las células osteoblásticas se
ve favorecida excediendo el 100% de adhesión
encontrándose diferencias estadísticamente significativas a
p